BÁO cáo THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA - - BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM GVHD : NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT SVTH : Lê Văn Phú NHÓM : 19H2CLC1 MSSV : 107190035 Huế, Tháng 07 năm 2021 CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC Nước dùng cho sản xuất, sinh hoạt thực phẩm Tùy theo mục đích sử dụng tiêu vi sinh vật cần kiểm soát thay đổi Đối với nước tự nhiên, nước sản xuất, nông ngư nghiệp nước sinh hoạt, cần phải đảm bảo không bị nhiễm phân, không mang mầm bệnh cách kiểm nghiệm vi sinh vật thị nhiễm phân ví dụ coliform, coliform phân Nước dùng cho mục đích sản xuất, sinh hoạt Các loại nước dùng cho mục đích gọi chung nước mặt, tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam ( TCVN 5942-1995) Nước uống TCNV 6096 – 1995, TCVN 5042 – 1994 CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM Các tiêu vi sinh vật thực phẩm quy định tiêu chuẩn Bộ Y tế bao gồm tiêu sau: tổng vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, E coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Streptococcus -faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, tổng số' nấm men, nấm mốc Quy định giới hạn cho phép tiêu thay đổi theo nhóm chủng loại thực phẩm Các mặt hàng thủy sản chế biến xuất quy định tiêu chuẩn quốc gia (TCVN) tiêu chuẩn ngành thị trường xuất Các tiêu thường quan tâm là: tổng vi khuẩn hiếu khí, Conforms,Coliforms phân, E coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp.,Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, tổng số" nấm men, nấm mốc, Clostridia, Listeria monocytogenes  Quy định giới hạn cho phép tiêu thay đổi theo nhóm, chủng loại thực phẩm PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MẪU Phương pháp thu mẫu bảo quản mẫu nước Về nguyên tắc cần thu mẫu cho mẫu thu có tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm Khi thu mẫu nước cần lưu ý : - Sử dụng bình thu mẫu loại dùng lần dùng nhiều lần Trường hợp dùng bình chứa dùng nhiều lần, chất liệu bình phải cho phép khử trùng lặp lại nhiều lần mà không tạo tạp chất ảnh hưởng đến tăng trưởng vi sinh vật - Khi cần thiết phải bổ sung tác chất vơ trùng để trung hịa dư lượng chất diệt khuẩn diện mẫu nước Tác chất trung hịa phải khơng ảnh hưởng đến sức sống tăng trưởng vi sinh vật Ví dụ mẫu nước có chứa dư lượng chlor nước máy, cần bổ sung 0,1ml dung dịch 1,8% sodium thiosulfate vào bình thu mẫu có dung tích 100ml trước khử trùng bình - Lưu ý tránh gây tạp nhiễm mẫu lúc thu mẫu, bảo quản vận chuyển mẫu Trường hợp nước mặt, mẫu nước thu vào bình thủy tinh dung tích 100 - 1000ml khử trùng, cần ý không để mẫu nước bị nhiễm tay hay dây sử dụng thu mầu Để thu mẫu nước độ sâu định người ta dùng bình thu mẫu chuyên dụng Trường hợp người ta thả bình thu mẫu xuống độ sâu cần thiết, dùng dây mở nắp bình thu mẫu Trường hợp nước ngầm, dùng bơm để thu mẫu Đối với hầu hết mẫu nước, cần chừa khoảng khơng khí đủ lớn mặt nước nắp bình Do chủng loại mật độ vi sinh vật nước thay đổi nhiều theo bề mặt, độ sâu chất lượng nước nên cần đánh giá chất lượng Khi thu mẫu nước cần chọn nhiều vị trí thu mẫu khác | Trường hợp nước mặt, vi sinh vật nước mặt có dịng chảy nước sơng có mật độ thay đổi nhiều theo lưu tốc, độ sâu Do để có mẫu có tính đại diện cần chọn nơi nước chảy (giữa dòng) độ sâu 20 - 30cm đế thu mẫu Thông thường cần thu mẫu nhiều điểm từ thượng lún xuống cửa sông Trường hợp nước ao hồ, để có số liệu phân bề mặt vi sinh vật, tùy kích thước ao hồ, cần chọn từ đến 10 điểm cách khoảng thích hợp Để có số liệu phân theo chiều sâu, thông thường người ta lấy mẫu đáy ao hồ sau thu | mẫu theo khoảng cách định từ điểm đáy Trường hợp nước ngầm, cần chọn | đến 10 địa điểm trở lên Trường hợp cần lưu ý đến yếu tố độ sâu, thành phần đất, khoảng cách từ nguồn nhiễm.Trên bình chứa mẫu cần ghi rõ ràng, đầy đủ thông tin cần thiết liên quan đến mẫu (địa điểm, thời gian, mục đích, người thu ) Mẫu nên phân tích vịng sau thu mẫu Do việc phân tích thường tiến hành phịng thí nghiệm nên cần vận chuyển mẫu từ nơi thu mẫu phịng thí nghiệm Trường hợp cán báo quán mẫu nhiệt độ 10°c nước đá đá khô vận chuyển Trường hợp khơng thực việc phân tích cần bao quán mẫu - 5°c tủ lạnh liên phân tích vịng từ 6-12 Chuẩn bị mẫu Trong đa số trường hợp, mẫu nước khơng cần xử lý đặc biệt trước phân tích vi sinh vật Khi cần thiết, mẫu cần pha loãng thập phân để độ pha loãng cần thiết nước cất, nước muối sinh lý hay mơi trường lỏng vơ trùng PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ Định nghĩa nguyên tắc Vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn tăng trưởng hình thành khuân lạc điều kiện có diện ơxi phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí xác định phương pháp đêm khuẩn lạc mọc môi trường thạch dinh dưỡng từ lượng mẫu xác định sở xem khuẩn lạc sinh khôi phát triển từ tế bào diện mẫu biểu diễn dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) đơn vị khối lượng thực phẩm Quy trình phân tích bao gồm bước: - Cân mẫu, - Đồng mẫu, - Pha loãng thành dãy nồng độ thập phân, - Chuyên phân phối thể tích xác định mẫu lên bề mặt môi trường rắn đĩa petri phương pháp hộp trải (spread plate) hay hộp đổ (pour plate) - Ủ điều kiện nhiệt độ thời gian quy định Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí dùng để đánh giá chất lượng mẫu vi sinh vật, nguy hư hỏng, thời hạn bảo quản sản phẩm, mức độ vệ sinh trình chế biến, bảo quản sản phẩm Mơi trường hóa chất - Mơi trường sử dụng Plate Count Agar (PCA) có pH 7,0 + 0,2 Ngồi mơi trường trên, cịn sử dụng mơi trường khác Tryptose Glucose Agar, Nutrient Agar Môi trường phân phối vào bình thủy tinh hay ống nghiệm hấp khử trùng 121°C 15 phút - Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) dùng để pha loãng chứa 8,5g NaCl 1g pepton 1000ml nước Dung dịch hấp khử trùng phân phối thành thể tích xác 9ml vào ống nghiệm vơ trùng Quy trình phân tích 3.1 Chuẩn bị mẫu trước phân tích - Đồng mẫu: Đối với mẫu dạng rắn, dùng dụng cụ khử trùng cân xác 10g (hay 25g) mẫu vào bao PE Tất thao tác cần phải tiến hành điều kiện vô trùng Thêm vào lượng mẫu 90ml (hay 225ml) dung dịch pha loãng SPW Thực đồng mẫu máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất lý mẫu, không 2,5 phút - Dịch mẫu đồng pha loãng vào ống nghiệm chứa 9mL dung dịch pha loãng đến độ pha loãng cần thiết Trộn mẫu ống nghiệm cho đồng máy rung (vortex) dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống - 10 lần Lưu ý: pipet đầu tip pipetman nguy bị nhiễm trình thao tác (chạm tay, chạm mặt ống nghiệm, mặt ngồi bình chứa ), cần phải thay pipet đầu tip vô trùng khác 3.2 Cấy mẫu Chọn hay độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25 - 250 tế bào vi sinh vật ImL để lên đĩa petri Dùng pipet vô trùng pipet man chuyến 1mL dịch mẫu pha loãng chọn vào đĩa petri vô trùng Tương ứng với độ pha lỗng cấy - đĩa (tức thực 23 lần lặp lại) Sau cấy, đổ vào đĩa 10+ 15mL môi trường PCA đun chảy ổn định 45°C Trộn dịch mẫu với mơi trường cách xoay trịn đĩa petri xuôi ngược chiều kim đồng hồ, chiều - lần sau đổ môi trường Đặt đĩa mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc Lật ngược ủ đĩa tủ ấm nhiệt độ 30+1°C 72 3.3 Tính kết Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn đĩa có số đếm từ 25 + 250 để tính kết Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí lg hay 1mL mẫu tính sau: Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc vi khuẩn lg hay 1mL mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn n: số lượng đĩa cấy độ pha lỗng thứ i V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào đĩa f: độ pha loãng tương ứng 3.4 Kết Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5 Đĩa X X X Đĩa X X X  Kết luận: Khơng có đĩa đếm - Trong q trình cấy bị nhiễm vi sinh vật lạ khơng đảm bảo quy trình - Mẫu vật có nhiều vi sinh vật hiếu khí khơng đảm bảo vệ sinh an tồn cho phép - Thao tác cấy sai sót dẫn đến mẫu vật bị hư Hình ảnh kết thí nghiệm ĐỊNH LƯỢNG COLIFOMRS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Nguyên tắc Mẫu đồng hóa cấy lượng định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose sinh acid sau ủ 37+1°C 24 - 48 Ngồi lactose, mơi trường chọn lọc cho Coliforms chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương chất thị pH neutral red, crystal violet Trên môi trường khuấn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật Mật độ Coliforms tính dựa số lượng khuẩn lạc điển hình đêm được, tỉ lệ khẳng định độ pha loãng mẫu trước cấy vào đĩa Mơi trường hố chất - Mơi trường Tryptone Soya Agar (TSA) chuẩn bị bình hay chai thủy tinh, hấp khử trùng bảo quản - 8°C Trước sử dụng, môi trường đun chảy làm nguội 45°c bế điều nhiệt - Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) phân phối 10ml vào ống nghiệm vô trùng chứa ống Durham úp ngược Hấp khử trùng Sau hấp kiểm tra ông để đảm bảo khơng có bọt khí ống Durham Dụng cụ - đĩa petri - ống nghiệm chứa 9ml nước cất  Hấp khử trùng tất - ống nghiệm + ống durham Quy trình phân tích - Mẫu phân tích: Sữa - Đồng mẫu pha loang tương tự phần định lượng vi khuẩn hiếu khí cho chứa