Định Lượng Staphylococus Aureus Bằng Phương Pháp Đếm Khuẩn Lạc.pptx

Định lượng STAPHYLOCOCUS AUREUS bằng phương pháp đếm khuẩn lạc GVHD Định Thị Hải Thuận Nhóm 7 1 Nguyễn Thị Mỹ Chi – 2005202009 2 Nguyễn Huỳnh Như Ý – 2005208294 3 Võ Thị Như Huỳnh – 2005208324 4 Nguyễ[.]

1 Tổng quan về vi khuẩn Staphycoccus

Tổng quan về

Staphycoccus

aureus

Đặc điểm Cầu khuẩn gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm.

Có khả năng lên men và sinh sucrose, mannitol và sinh sắc tố vàng.

Không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý.

Có khả năng đông tụ huyết tương.

Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt Không di động, thường tụ thành chùm nho

Nơi phân bố

S.aureus phân bố khắp mọi nơi như: da,

mũi, tóc và lông của các động vật máu nóng

S.aureus là vi khuẩn gây bệnh cơ hội

cư trú bình thường ở da và màng nhày

ở người.

Thịt, sản phẩm sữa Thực phẩm đóng hộp

Bánh kẹo Tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến

Cá, thủy sản Ngoài ra còn có trên mụn nhọt, vết thương

Nguồn nhiễm

Viêm phổi

Khả năng gây bệnh

Nhiễm khuẩn bệnh viện

do tụ cầu

Hội chứng da phồng rộp Hội chứng sốc nhiễm độc

Khả năng gây bệnh

Quy trình định lượng

Staphylococus

aureus

• Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4830 -1: 2005 (ISO 6888-1:1999)

dùng để định lượng S.aureus cho tất cả các loại thực phẩm.

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện và định lượng S.aureus trong

phụ gia thực phẩm bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc

• Phương pháp này thích hợp để phân tích mẫu dự kiến chứa trên 100 tế bào S

aureus trên gram

Phạm vi áp dụng

Nguyên tắc Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc một

lượng mẫu quy định ban đầu (sản phẩm ở dạng mẫu hoặc huyền phù)

Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 37°C và kiểm tra sau thời gian từ 24h đến 48h.

Tính số lượng S.aureus trong 1mL hoặc 1g mẫu

từ số lượng khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên các đĩa ở các độ pha loãng đã khác nhau và khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính.

Môi trường và hóa chất Mục đích

Dung dịch Saline Peptone Water (SPW) Dung dịch đẳng trương dùng để pha loãng mẫu

Môi trường Baid-Parker Agar ( BPA) Môi trường chọn lọc để nuôi cấy S.aureus

Egg yolk tellurite emulsion Môi trường chọn lọc để nuôi cấy S.aureus

Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) Bảo quản và phục hồi vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy

Brain heart broth (BHI) Bảo quản và phục hồi vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy

Huyết tương thỏ đông khô Khẳng định S.aureus

HCl và NaOH 10% Chỉnh pH môi trường

Môi trường và hóa chất

Tryptone Nguồn carbon và nitơ Cao thịt bò Nguồn carbon và nitơ

Cao nấm men Cung cấp các vitamin B, kích thích sự sinh trưởng vi khuẩnNatri pyruvat Kích thích sự sinh trưởng của StaphylococcusGlycine Kích thích sự sinh trưởng của Staphylococcus Lithium Chloride Tính chọn lọc của môi trường

Môi trường BPA

Tryptone cần thiết cho sự phát triển của hầu hết các vi sinh Cung cấp nitơ, vitamin, khoáng chất, axid amin

Natri clorua Duy trì sự cân bằng thẩm thấu

Glucoza Nguồn năng lượng cacbon

Duy trì hoạt động đệm của môi trường

Nước cất

Môi trường BHI

Môi tường cơ bản

Nhũ tương lòng đỏ trứng Phân biệt vi khuẩn Staphylococcus dương tính với coagulase dựa trên lòng đỏ trứng

Dung dịch Kali tellurite 3,5% vô trùng Ức chế sự sinh trưởng của các sinh vật khác

Dung dịch Sulfamezathin (nếu cần)

Môi trường Egg yolk tellurite emullsion

(Nhũ tương lòng đỏ trứng)

NaCl Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu

Peptone Nguồn cung cấp nitrogen và carbon, các amino acid chuỗi dài, vitamin và các chất dinh dưỡng

cần thiết khác.

Nước cất

Môi trường SPW

Pancreatic Digest of Casein Làm cho môi trường giàu dinh dưỡng bởi cung cấp nitơ hữu cơ, đặc biệt amino acid và các

peptide chuỗi dài

NaCl Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu

Soy peptone Làm cho môi trường giàu dinh dưỡng bởi cung cấp nitơ hữu cơ, đặc biệt amino acid và các

peptide chuỗi dài

Môi trường TSA

Thuyết minh

quy trình

B1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu.

Đồng nhất bằng máy dập mẫu 30s (mẫu rắn) hoặc lắc đều (mẫu lỏng).

(hoặc túi PE vô trùng)

Cân chính xác 10 ± 0.1g mẫu (mẫu rắn) hoặc 10ml mẫu (mẫu lỏng) trong túi PE vô trùng

Thêm 90ml dung dịch pha

loãng SPW

B2 Pha loãng mẫu.

 

B3 Phân lập trên môi trường chọn lọc

Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 1°C trong 24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường

thạch máu.

Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã

pha loãng vào đĩa

Sau 24 giờ

B4 Quan sát đếm khuẩn lạc.

Đánh dấu khuẩn lạc điển hình

Sau 24 giờ tiếp theo Khuẩn lạc S aureus

dương tính, đánh dấu khuẩn lạc không điển hình

B5 Phục hồi

BPA

Cấy lên môi trường thạch BHI, ủ ở 37 ± 1°C trong 24 giờ

B6 Khẳng định S.aureus

Hút 0,1ml dịch

nuôi cấy BHI

Chứa 0,3ml  huyết tương 

thỏ

Kiểm tra sự đông tụ của huyết tương sau 2,4,6,8 giờ Phản ứng được coi là dương tính khi thể tích đông tụ chiếm ¾.

Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) =

 

B6 Tính kết quả

Mật độ S.aureus trong mẫu được tính như sau :

Ví dụ

Độ pha

loãng

Số khuẩn lạc thử nghiệm phản ứng coagulase

Số phản ứng coagulase

Ví dụ

Mật độ (CFU/g hay CFU/ml)

 

 

Kết luận

Phương pháp định lượng S.aureus có phản ứng với coagulase trên đĩa thạch

trong các sản phẩm dùng cho người hay thức ăn chăn nuôi, bằng cách đếm số khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc (môi trường thạch Baird Parker)

Thông qua việc định lượng S.aureus từ đó nâng khả năng kiểm soát, xác định

S.aureus có trong thực phẩm hay không nhằm đảm bảo sự an toàn của người

tiêu dùng thực phẩm.

CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM

1 Độc tố ruột

A Có ở tất cả các chủng tụ cầu

B Có ở chủng tụ cầu đề kháng với penicillin

C Chỉ có ở các chủng Staphylococcus saprophycoccus

D Do một số chủng Staphylococcus aureus tạo thành

2 S.aureus nuôi cấy trên môi trường?

A Môi trường BPA

B Môi trường BHI

C Môi trường TBX

D Môi trường DR18

3 Enzym coagulase do Staphylococcus tiết ra có tác dụng:

A Biến hydrogen peroxide thành nước và oxygen

B Làm đông huyết tương

C Làm tan sợi fibrin

D Phá hủy protein

4 Yếu tố nào giúp tụ cầu khuẩn lan tràn vào mô cơ thể

6 Tính chất nuôi cấy của Staphylococcus

A Tất cả các loại Staphylococci đều có khả năng tiêu huyết trên máu

B Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất là 20-25oC

C Mọc dễ dàng trên nhiều loại môi trường

D Khí trường nuôi cấy thường có 5-10% CO2

7 Thực phẩm có nguy cơ cao ngộ độc thực phẩm do S aureus:

C Viêm tủy xương

D Viêm não-màng não

9 S.aureus liên quan sốc nhiễm khuẩn có thể tìm thấy ở đâu Chọn câu sai:

A Âm đạo

B Nút gạc

C Vết thương

D Máu

10 Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) với mục đích

A Bảo quản và phục hồi vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy

B Môi trường chọn lọc để nuôi cấy S aureus

C Khẳng định S.aureus

D Dung dịch đẳng trương dùng để pha loãng mẫu

11 Chọn câu sai Liên quan đến Staphylococcus coagulase (-):

A Vi khuẩn thường trú trên da

B Có khả năng gây bệnh trong một số trường hợp nhiễm trùng cơ hội

C Không di động và không sinh nha bào

D Tiết sắc tố vàng trên môi trường nuôi cấy

12 Tăng trưởng của Staphylococcus

A Không lên men các loại đường

B Dễ bị ức chế bởi 3% Hexachlirophene, tím gentian

C Bị diệt ở 50°C trong thời gian 30 phút

D Kháng thuốc Methicillin, Nafcilllin, Oxacillin nhờ men β-lactamase

13 Staphylococcus aureus tạo sắc tố tốt trên nhiệt độ môi trường nào:

A ở 37OC

B ở 80oC

C ở 30oC

D ở 20oC

14 Vai trò của môi trường Brain heart broth (BHI) trong phương pháp này là gì?

A Bảo quản vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy

16 Hội chứng sốc nhiễm khuẩn liên quan tới Staphylococcus Chọn câu sai:

A Sốt cao

B Tiêu chảy

C Đau cơ

D Tăng huyết áp

17 Nhận định đúng liên quan đến Staphylococcus:

A Staphylococcus không xâm nhập qua đường máu

B Staphylococcus khả năng xâm lấn tốt nên gây nhiễm khuẩn ngoài da

C Môi trường nồng độ NaCl 7,5% có thể ức chế Staphylococcus

D Staphylococcus gây viêm cơ tim

18 Staphylococcus là những vi khuẩn:

A Cầu khuẩn, gram dương

B Trực khuẩn, gram âm

C Cầu khuẩn, gram dương, xếp thành đám giống chùm nho

D Trực khuẩn, gram dương

19 Vi khuẩn S.aureus là:

A Cầu khuẩn gram âm, di động

B Cầu khuẩn gram âm, không di động

C Cầu khuẩn gram dương, di động

D Cầu khuẩn gram dương, không di động

20 Ở bước quan sát và đếm khuẩn lạc

A Chỉ đếm khuẩn lạc điển hình

B Chỉ đếm khuẩn lạc không điển hình

C Cả A và B đều đúng

D Cả A và B đều sai

21 Phương pháp này thích hợp để phân tích mẫu dự kiến chứa trên:

A 100 tế bào S aureus trên 1gam

B 50 tế bào S aureus trên 1gam

C 70 tế bào S aureus trên 1gam

D 150 tế bào S aureus trên 1gam

22 Staphylococcus aureus :

a Có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%)

b Bị ly giải bởi mật hoặc muối mật

c Có kháng nguyên C đặc hiệu nhóm

d Mọc được ở môi trường chứa 40% muối mật

23 Trong quy trình định lượng Staphylococus aureus ủ các đĩa trong điều kiện:

25 Trong các bước tiến hành, bước phục hồi trên môi trường:

A Huyết tương thỏ đông khô

27 Khuẩn lạc S.aureus điển hình có đặc điểm hình thái:

A Đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng, lồi

B Không tạo vầng sáng bao quanh

C.Mỗi khuẩn lạc có vầng sáng rộng 1-2mm bao quanh

D A và C

28 Mục đích của HCl và NaOH 10% là gì?

A Phục hồi

B Khẳng định S.aureus

C Chỉnh pH môi trường

D Pha loãng mẫu

29 Staphylococus aureus sinh sắc tố màu?

THANKYOU