Định lượng staphylococus aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Trong 3 loại đó thì tụ cầu vàng Staphylococcus aureus là loại vi khuẩn gây nhiều bệnh nhất và có khả năng gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt, chúng có khả năng kháng lại nhiều loại kháng si

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

🙞🙞🙞

NHÓM 7

TIỂU LUẬN MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCUS AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾ

M KHUẨN LẠC

TP HCM, NĂM 2022

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

🙞🙞🙞

NHÓM 7

TIỂU LUẬN MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: Định Lượng Staphylococus Aureus Bằng Phương Pháp Đếm Khuẩ

n Lạc

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 7 Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome) 11 Hình 8 Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome) 12

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 Ví dụ về biểu thị cách tính kết quả S.aureus 18

CHƯƠNG 1 LỜI CẢM ƠN

Nhóm chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Cô Cảm ơn Cô vì đã hướng dẫn chúng e

m tận tình trong suốt quá trình học Trong quá trình thực hiện, nhóm chúng em sẽ khô

ng tránh khỏi những thiếu sót, mong cô góp ý để chúng em dần hoàn thiện hơn

Chúng em xin chân thành cảm ơn đến trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm T

P HCM đã tạo cho chúng em một môi trường học tập lành mạnh với đầy đủ các điều kiện để phục vụ cho quá trình học tập của chúng em tại đây

Chúng em xin cảm ơn đến thầy cô và các anh chị trong khoa đã hướng dẫn, hỗ trợcho sinh viên chúng em đầy sự tận tình

Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các bậc phụ huynh đã luôn âm thầm ở phía sauđồng hành, ủng hộ và quan sát sự trưởng thành của chúng con

Nhóm thực hiện

CHƯƠNG 2 MỞ ĐẦU1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus) có 3 loại -đó là tụ cầu vàng (S.aureus), tụ cầu

da (S epidermidis) và tụ cầu hoại sinh (S saprophyticus) Trong 3 loại đó thì tụ cầu và

ng Staphylococcus aureus là loại vi khuẩn gây nhiều bệnh nhất và có khả năng gây ng

ộ độc thực phẩm, đặc biệt, chúng có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh Gây bệ

nh của tụ cầu rất đa dạng, trong đó cần quan tâm đến một số bệnh mà tụ cầu gây ra haygặp trong mùa hè Vi khuẩn tụ cầu cũng có thể gây nên các bệnh nhiễm khuẩn (nhiễmkhuẩn bệnh viện) như nhiễm khuẩn vết mổ, nhiễm khuẩn bỏng, nhiễm khuẩn đường hôhấp (viêm họng, viêm phổi), nhiễm trùng tiết niệu (nhiễm khuẩn tiết niệu thường do tụcầu hoại sinh), nặng nhất và nguy hiểm nhất là nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn

Tụ cầu cũng có thể gây nên các bệnh nặng như viêm tủy xương (gặp trong trường hợpđóng đinh nội tủy do gãy xương), viêm tĩnh mạch xoang hang, viêm nội tâm mạc hoặcgây viêm màng não mủ

cus aureus rất cần thiết Chính vì thế trong bài tiểu luận này, nhóm chúng em xin giới t

hiệu tổng quan về vi khuẩn Staphylococus aureus và quy trình định lượng Staphylococ

us aureus.

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Thông qua đề tài “Định lượng staphylococus aureus bằng phương pháp

đếm khuẩn lạc” thì chúng em sẽ tìm hiểu:

⇨ Tổng quan về vi khuẩn Staphylococus aureus

⇨ Quy trình định lượng Staphylococus aureus.

1.3 BỐ CỤC TIỂU LUẬN NHÓM

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG

CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG3.1. Tổng quan về vi khuẩn Staphylococus aureus

3.1.1 Đặc điểm

Staphylococcus aureus là một khuẩn cầu Gram dương (+) mà có dạng hình cầu

những tế bào dạng trứng có đường kính khoảng 1µm Sự phân chia tế bào ở một mặt phẳng để tạo thành những khối tế bào không đồng đều giống như chùm nho Thành tế b

ào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentag

lycin của tụ cầu S.aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme c

atalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước:

H2O2catalase → H2O + O2

Hình 1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

S aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme c

oagulase Đây được xem là tính chất đặc trưng của S aureus, là tiêu chuẩn để phân biệ

t S aureus với các tụ cầu khác Có hai dạng coagulase: coagulase-cố định (-bound coa

gulase) gắn vào thành tế bào và coagulase-tự do (-free coagulase) được phóng thích kh

ỏi thành tế bào Có hai phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện tr

ên lam kính và trong ống nghiệm Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase-cố định bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm ph

át hiện những coagulase-tự do bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp v

ới những yếu tố khác trong huyết tương tạo thành từng khối hay thành cục

Huyết tương coagulase→ Khối Fibrin

Cơ chế thông thường biểu diễn quá trình đông tụ huyết tương như sau:

ProthrombinCa2+ ¿↓ → Thrombokinaseenzym Thrombin ↓ Fibrinogen→ Fibrin ¿

Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có khả năn

g lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S aureus đều nh

ạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% muối Na

Cl Một số dòng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu, vòng

tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu hẹp hơn so với đ

ường kính khuẩn lạc Hầu hết các dòng S aureus đều tạo sắc tố vàng, nhưng các sắc tố

này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường có hiện diện lactose haycác nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng

3.1.2 Nơi phân bố

S aureus là vi khuẩn gây bệnh cơ hội cư trú bình thường ở da và màng nh

ày ở người S aureus được ước tính cư trú thường xuyên ở 20-30% dân cư và cư trú k hông liên tục ở 60% dân cư nói chung S aureus thường có ở trên bề mặt da do khả nă

ng chịu được độ ẩm thấp và nồng độ muối cao lên đến 15% S aureus có khả năng s

ống sót trên các môi trường khô và có nhiều chất ức chế như mũi người, da và c

ác bề mặt môi trường, quần áo S aureus dễ lây truyền từ người sang người qua đường

tiếp xúc trực tiếp Nó có thể xâm nhập vào sâu trong tế bào da do bị bỏng, có các vết thương hở, có vết côn trùng cắn hoặc bị mắc các bệnh về da như trứng cá, vẩy nến, eczema tạo thành các mụn mủ trên da, các ổ apxe Khi mụn mủ hoặc ổ apxe vỡ sẽ giải p

hóng ra vi khuẩn và độc tố Vì S aureus không có tính cạnh tranh cao với hệ vi sinh vậ

t trong thực phẩm sống nên sự nhiễm vào thực phẩm chủ yếu là do bàn tay người chế biến thực phẩm, tiếp theo là do quá trình bảo quản không thích hợp giúp cho vi khuẩn p

hát triển và sinh độc tố Tuy nhiên, S aureus cũng có mặt trong các thực phẩm nguồn

gốc động vật, sữa động vật, đặc biệt sữa vắt từ các động vật bị viêm vú Không khí, bụ

i và các bề mặt tiếp xúc cũng là đường truyền S aureus vào thực phẩm.

Hình 2 Nơi phân bố S aureus trên cơ thể người Thực phẩm có nguy cơ cao ngộ độc thực phẩm do S aureus bao gồm thịt và sả

n phẩm thịt, gia cầm, trứng và sản phẩm từ trứng, sữa và sản phẩm sữa, salad, bánh ph

ủ kem, sandwich, những thực phẩm cần có giai đoạn chuẩn bị bằng tay và được giữ

ở nhiệt độ cao hơn 4°C trong một thời gian dài sau khi chế biến

4

3.1.3 Nguồn nhiễm

S.aureus có mặt ở khắp nơi, sự lây truyền trực tiếp từ các thương tổn mờ hoặc g

ián tiếp từ không khí, dụng cụ hoặc từ nhân viên y tế Các chủng S.aureus gây nhiễm tr ùng bệnh viện kháng với kháng sinh cao đặc biệt chủng S.aureus kháng methicillin (M RSA: Methicilline resistance Staphylococcus aureus).

Yếu tố nguy cơ: những người dễ nhiễm S.aureus là trẻ em, người già, suy dinh

dưỡng, suy giảm miễn dịch hoặc những người làm mất các phương tiện bảo vệ (chích,nặn non các mụn nhọt )

3.1.4 Khả năng gây bệnh

Staphylococcus aureus là một trong những nguyên nhân thường xuyên nhất trên

toàn thế giới gây ra bệnh tật và tử vong do một tác nhân truyền nhiễm Tác nhân gây bệnh này có thể gây ra nhiều loại bệnh, từ nhiễm trùng da vừa phải nghiêm trọng đến vi

êm phổi và nhiễm trùng huyết gây tử vong Điều trị nhiễm trùng S aureus rất phức tạp

do kháng thuốc kháng sinh và không có sẵn vắc xin hoạt động Người ta đang ngày cà

ng quan tâm nhiều đến số lượng độc tố và các yếu tố quyết định độc lực khác mà S au

reus tạo ra và cách chúng tác động đến bệnh tật Vi khuẩn này gây bệnh cho những ng

ười bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực Staphylococcus aureus là

vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau:

- Nhiễm khuẩn da: Do Staphylococcus ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên n

ó có thể xâm nhập qua lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da Sau đó gây n

ên các nhiễm khuẩn sinh mủ : mụn nhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu bối Mức độ cácnhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch Đinh râu c

ó thể gây nên những biến chứng nguy hiểm

Hình 3.

-Nhiễm khuẩn huyết: Staphylococcus aureus là vi khuẩn thường gây nhiễm kh

uẩn đường huyết nhất Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễ

m khuẩn ngoài da, từ đây vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường

huyết Ðây là một nhiễm trùng rất nặng Từ nhiễm khuẩn đường huyết Staphylococ

cus đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc

viêm nội tâm mạc Có thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch Một số nhiễm trùng khutrú này trở thành viêm mãn tính như viêm xương.

Hình 4 Nhiễm khuẩn huyết

-Viêm phổi: Do Staphylococcus aureus rất ít gặp Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đư

ờng hô hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết Tuy vậy cũng có viêm phổi tiênphát do tụ cầu vàng ở trẻ em hoặc người suy yếu Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhânnày khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nguy hiểm

Hình 5 Viêm phổi

-Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp: Ngộ độc thức ăn do Staphylococcus có t

hể do ăn uống phải độc tố ruột của Staphylococcus, hoặc do Staphylococcus cư trú

ở ruột chiếm số lượng ưu thế Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùn

g kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí bình thường của đường ru

ột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện cho Staphylococcus aureus

(kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do t

ụ cầu vàng thường rất cấp tính Sau ăn phải thức ăn nhiễm phải độc tố Staphylococ

cus 2-8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và

chất nôn chủ yếu là nước Do mất nhiều nước và chất điện giải nên có thể dẫn tới s

ốc Ngoài bệnh nguyên nhân do Staphylococcus một số trường hợp có thêm vai trò

của Clotridium diffiticile, sau khi dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng

6

Hình 6 Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp

-Nhiễm khuẩn bệnh viện do Staphylococcus: Thường rất hay gặp, nhất là đối

với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng từ đó đẫn tới nhiễm khuẩn đường huyết Các chủ

ng Staphylococcus này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh và phải dùng đến v

ancomycin Tỷ lệ tử vong ở bệnh này rất cao

- Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome): Một số chủng Staphyloc

occus aureus tiết ra độc tố exfoliatin, gây viêm da hoại tử và phồng rộp Bệnh này t

hường gặp ở trẻ em mới đẻ và tiên lượng xấu

Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome)

Hình 7 Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome)

-Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome): Hội chứng này thường gặ

p ở phụ nữ sử dụng bông gạc không sạch khi có kinh nguyệt Bệnh khư trú ở âm đạ

o và căn nguyên là Staphylococcus aureus Cấy máu không tìm thấy Staphylococc

us aureus Các dấu hiệu lâm sàng và vi khuẩn cho thấy rằng cơ chế của bệnh là sự

nhiễm độc ngoại độc tố sinh mủ Năm 1980, ở Mỹ có 940 trường hợp bị hội chứngnày, trong đó có tới 99% là phụ nữ và 98% có liên quan đến việc sử dụng bông gạckhông sạch khi có kinh nguyệt

Hình 8 Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome)

3.2. Quy trình định lượng Staphylococus aureus

3.2.1 Phạm vi áp dụng

- Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1:1999) dùng đ

ể định lượng S.aureus cho tất cả các loại thực phẩm.

- Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện và định lượng Staphylococcus au

reus trong phụ gia thực phẩm bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

- Phương pháp này thích hợp để phân tích mẫu dự kiến chứa trên 100 tế bào S aure

us trên gam Nếu nghi ngờ số lượng tế bào thấp hơn giới hạn nêu trên thì nên sử dụng

phương pháp đếm số có xác suất lớn nhất theo TCVN 11039-7:2015

3.2.2 Nguyên tắc

- Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc một lượng huyền phù quy định ban đầu (s

ản phẩm ở dạng mẫu hoặc huyền phù) Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch p

ha loãng thập phân của huyền phù ban đầu

- Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 37°C và kiểm tra sau thời gian từ 24h đến 48h.

- Tính số lượng Staphylococcus có phản ứng coagulase dương tính trong một mililit

hoặc một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên các đĩa ởcác độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả cố ý nghĩa và được khẳng định bằng kết quảthử coagulase dương tính

- Định lượng Staphylococcus aureus được thực hiện bằng cách cấy trang một lượng

mẫu đã biết lên môi trường thạch Baird Parker, vi khuẩn cho những khuẩn lạc đặc trưn

g và được xác định bằng phản ứng coagulase Một vài chủng cho coagulase âm tính nhưng cũng tạo độc tố đường ruột

3.2.3 Môi trường và hóa chất

Bảng 1 Môi trường và hoá chất

8

amino acid chuỗi dài, vitamin và các chấ

t dinh dưỡng cần thiết khác

(10g) Kích thích sự sinh trưởng của Staphyloco

ccus

Glycine (12g)

Lithium Chloride (5g) Ức chế sự sinh trưởng của các sinh vật k

hác không phải Staphylococcus

Agar (20g)

Tác nhân làm đông cứngNước cất (1000ml)

Egg yolk tellurite

emulsion

Môi tường cơ bản(100ml)

Nhũ tương lòng đỏ trứng (5ml)

Phân biệt vi khuẩn Staphylococcus dươn

g tính với coagulase dựa trên lòng đỏ trứng

Dung dịch Kali tellurite 3,5% vô trùng(1ml)

Ức chế sự sinh trưởng của các sinh vật khác

Sterile saline (64 ml)

Môi trường Trypti

case Soy Agar (T

SA)

Pancreatic Digest ofCasein (15g) Làm cho môi trường giàu dinh dưỡng bởi

cung cấp nitơ hữu cơ, đặc biệt amino aci

d và các peptide chuỗi dài

Peptic Digest of Soybean Meal (5g)

Sodium Chloride (5g) Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấuAgar (15g)

Tác nhân làm cứng môi trường

Brain heart broth

(BHI)

Tryptone (10,0g )

Cung cấp nitơ, vitamin, khoáng chất, axi

d amin cần thiết cho sự phát triển của hầuhết các vi sinh vật

Bột não bò (12,5g)

Bột tim bò (5,0g)

Natri clorua (5g)

Duy trì sự cân bằng thẩm thấu

Natri hydro phosphate (Na2HPO4) (2.5g) Duy trì hoạt động đệm của môi trường

HCl và NaOH 10

3.2.4 Quy trình phân tích

Chuẩn bị mẫu: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ

Phân lập trên môi trường chọn lọc: cấy trải trên đĩa thạch BPA, ủ ở 37

Cấy khuẩn lạc điển hình v

ào môi trường BHI, ủ ở 3

3.2.5 Các bước tiến hành

− Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong 10ml/25ml thẻ tích đối vớimẫu lỏng, cho vào túi nhựa PE vô trùng

Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml vô trùng túi nhựa chứa mẫu

Dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong 2-3 phút

− Bước 2: Pha loãng mẫu

Dùng pipet vô trùng hút 1ml huyền phù ban đầu cho vào một ống nghiệm chứa9ml SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp

Trộng đều bằng máy vortextrong 5-10 giây để thu được dịch pha loãng 10-2 Nế

u cần, lặp lại thao tác trên để được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5,… cho đến khi đ

ạt được độ pha loãng thích hợp

− Bước 3: Phân lập trên môi trường chọn lọc

Hút 0,1 ml dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng vào giữa đĩa môi trường BP

A đã được chuẩn bị trước, mỗi nồng độ lặp lại 2 đĩa, dùng que trang trải đều dịch mẫutrên mặt thạch Lật ngược các đĩa đã cấy và ủ ở 37 ±1℃, 24 ±3 giờ, hoặc 48 ±4 giờ

− Bước 4: Quan sát và đếm số khuẩn lạc

Sau 24 ±3 giờ, tiến hành đếm số khuẩn lạc S.aureus điển hình và không điển hì

nh trên môi trường thạch BPA Khuẩn lạc S.aureus điển hình có đường kính 1-1,5mm,

màu đen sang, lồi Mỗi khuẩn lạc có vầng sang rộng 1-2mm bao quanh Những khuẩnlạc điển hình được đánh dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa nữa Sa

u 48 ±4 giờ, Khuẩn lạc S.aureus dương tính có đường kính 1,5-2mm, màu đen, sang, l

ồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là vùng sáng, trong rộng 2-4mm.Còn những khuẩn lạc không điển hình thì không tạo vầng sáng bao quanh và cũng khô

ng tạo vùng đục bao quanh khuẩn lạc Những khuẩn lạc không điển hình này cũng đượ

c đánh dấu ở mặt sau của đĩa