Trong 3 loại đó thì tụ cầu vàng Staphylococcus aureus là loại vi khuẩn gây nhiều bệnh nhất và có khả năng gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt, chúng có khả năng kháng lại nhiều loại kháng si
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM 🙞🙞🙞 NHĨM TIỂU LUẬN MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCUS AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾ M KHUẨN LẠC TP HCM, NĂM 2022 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM 🙞🙞🙞 NHĨM TIỂU LUẬN MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: Định Lượng Staphylococus Aureus Bằng Phương Pháp Đếm Khuẩ n Lạc MỤC LỤC CHƯƠNG LỜI CẢM ƠN CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.3 BỐ CỤC TIỂU LUẬN NHÓM CHƯƠNG NỘI DUNG 3.1 Tổng quan vi khuẩn Staphylococus aureus 7 3.1.1 Đặc điểm 3.1.2 Nơi phân bố 3.1.3 Nguồn nhiễm 3.1.4 Khả gây bệnh 3.2 Quy trình định lượng Staphylococus aureus 12 3.2.1 Phạm vi áp dụng 12 3.2.2 Nguyên tắc 12 3.2.3 Môi trường hóa chất 12 3.2.4 Quy trình phân tích 14 3.2.5 Các bước tiến hành 16 3.2.6 Báo cáo kết CHƯƠNG KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 17 19 20 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Vi khuẩn Staphylococcus aureus Hình Nơi phân bố S aureus thể người Hình Nhiễm khuẩn da Hình Nhiễm khuẩn huyết Hình Viêm phổi Hình Nhiễm độc thức ăn viêm ruột cấp Hình Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome) Hình Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome) 10 10 10 11 11 12 DANH MỤC BẢNG Bảng Môi trường hố chất Bảng Ví dụ biểu thị cách tính kết S.aureus 13 18 CHƯƠNG LỜI CẢM ƠN Nhóm chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Cơ Cảm ơn Cơ hướng dẫn chúng e m tận tình suốt trình học Trong q trình thực hiện, nhóm chúng em khơ ng tránh khỏi thiếu sót, mong góp ý để chúng em dần hoàn thiện Chúng em xin chân thành cảm ơn đến trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm T P HCM tạo cho chúng em môi trường học tập lành mạnh với đầy đủ điều k iện để phục vụ cho trình học tập chúng em Chúng em xin cảm ơn đến thầy cô anh chị khoa hướng dẫn, hỗ trợ cho sinh viên chúng em đầy tận tình Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến bậc phụ huynh âm thầm phía sau đồng hành, ủng hộ quan sát trưởng thành chúng Nhóm thực Nhóm CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus) có loại -đó tụ cầu vàng (S.aureus), tụ cầu da (S epidermidis) tụ cầu hoại sinh (S saprophyticus) Trong loại tụ cầu ng Staphylococcus aureus loại vi khuẩn gây nhiều bệnh có khả gây ng ộ độc thực phẩm, đặc biệt, chúng có khả kháng lại nhiều loại kháng sinh Gây bệ nh tụ cầu đa dạng, cần quan tâm đến số bệnh mà tụ cầu gây hay gặp mùa hè Vi khuẩn tụ cầu gây nên bệnh nhiễm khuẩn (nhiễm khuẩn bệnh viện) nhiễm khuẩn vết mổ, nhiễm khuẩn bỏng, nhiễm khuẩn đường hô hấp (viêm họng, viêm phổi), nhiễm trùng tiết niệu (nhiễm khuẩn tiết niệu thường tụ cầu hoại sinh), nặng nguy hiểm nhiễm khuẩn huyết sốc nhiễm khuẩn Tụ cầu gây nên bệnh nặng viêm tủy xương (gặp trường hợp đóng đinh nội tủy gãy xương), viêm tĩnh mạch xoang hang, viêm nội tâm mạc gây viêm màng não mủ Đối với thực phẩm nhiễm Staphylococus aureus nhận biết cảm quan Vì nguy hiểm người tiêu dùng việc định lượng Staphyloco cus aureus cần thiết Chính tiểu luận này, nhóm chúng em xin giới t hiệu tổng quan vi khuẩn Staphylococus aureus quy trình định lượng Staphylococ us aureus 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Thông qua đề tài “Định lượng staphylococus aureus phương pháp đếm khuẩn lạc” chúng em tìm hiểu: ⇨ Tổng quan vi khuẩn Staphylococus aureus ⇨ Quy trình định lượng Staphylococus aureus 1.3 BỐ CỤC TIỂU LUẬN NHÓM CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG NỘI DUNG CHƯƠNG KẾT LUẬN CHƯƠNG 3.1 NỘI DUNG Tổng quan vi khuẩn Staphylococus aureus 3.1.1 Đặc điểm Staphylococcus aureus khuẩn cầu Gram dương (+) mà có dạng hình cầu tế bào dạng trứng có đường kính khoảng 1µm Sự phân chia tế bào mặt p hẳng để tạo thành khối tế bào không đồng giống chùm nho Thành tế b kháng với lysozyme nhạy với lysotaphin, chất phá hủy cầu nối pentag lycin tụ cầu S.aureus vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme c atalase phân giải oxy già giải phóng oxy nước: H2O2 catalase → H2O + O2 Hình Vi khuẩn Staphylococcus aureus S aureus cho phản ứng đơng huyết tương dương tính chúng tiết enzyme c oagulase Đây xem tính chất đặc trưng S aureus, tiêu chuẩn để phân biệ t S aureus với tụ cầu khác Có hai dạng coagulase: coagulase-cố định (-bound coa gulase) gắn vào thành tế bào coagulase-tự (-free coagulase) phóng thích kh ỏi thành tế bào Có hai phương pháp để thực thử nghiệm coagulase thực tr ên lam kính ống nghiệm Phương pháp lam kính giúp phát coagul ase-cố định cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm ph át coagulase-tự phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp v ới yếu tố khác huyết tương tạo thành khối hay thành cục Huyết tương coagulase→ Khối Fibrin Cơ chế thông thường biểu diễn q trình đơng tụ huyết tương sau: Prothrombin Ca2+¿↓ → Thrombokinaseenzym Thrombin ↓ Fibrinogen → Fibrin ¿ Ngồi ra, chúng cịn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có khả năn g lên men sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose Tất dòng S aureus nh ạy với Novobicine, có khả tăng trưởng môi trường chứa đến 15% muối Na Cl Một số dịng S aureus có khả gây tan máu mơi trường thạch máu, vịng 10 tan máu phụ thuộc vào chủng chúng có vịng tan máu hẹp so với đ ường kính khuẩn lạc Hầu hết dòng S aureus tạo sắc tố vàng, sắc tố thấy trình ni cấy cịn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày ni cấy n hiệt độ phịng Sắc tố tạo nhiều mơi trường có diện lactose hay nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật bẻ gãy sử dụng 3.1.2 Nơi phân bố S aureus vi khuẩn gây bệnh hội cư trú bình thường da màng nh ày người S aureus ước tính cư trú thường xuyên 20-30% dân cư cư trú k hơng liên tục 60% dân cư nói chung S aureus thường có bề mặt da khả nă ng chịu độ ẩm thấp nồng độ muối cao lên đến 15% S aureus có khả s ống sót mơi trường khơ có nhiều chất ức chế mũi người, da c ác bề mặt môi trường, quần áo S aureus dễ lây truyền từ người sang người qua đường tiếp xúc trực tiếp Nó xâm nhập vào sâu tế bào da bị bỏng, có vết t hương hở, có vết trùng cắn bị mắc bệnh da trứng cá, vẩy nến, ecz ema tạo thành mụn mủ da, ổ apxe Khi mụn mủ ổ apxe vỡ giải p hóng vi khuẩn độc tố Vì S aureus khơng có tính cạnh tranh cao với hệ vi sinh vậ t thực phẩm sống nên nhiễm vào thực phẩm chủ yếu bàn tay người chế b iến thực phẩm, q trình bảo quản khơng thích hợp giúp cho vi khuẩn p hát triển sinh độc tố Tuy nhiên, S aureus có mặt thực phẩm nguồn gốc động vật, sữa động vật, đặc biệt sữa vắt từ động vật bị viêm vú Khơng khí, bụ i bề mặt tiếp xúc đường truyền S aureus vào thực phẩm Hình Nơi phân bố S aureus thể người Thực phẩm có nguy cao ngộ độc thực phẩm S aureus bao gồm thịt sả n phẩm thịt, gia cầm, trứng sản phẩm từ trứng, sữa sản phẩm sữa, salad, bánh ph ủ kem, sandwich, thực phẩm cần có giai đoạn chuẩn bị tay giữ nhiệt độ cao 4°C thời gian dài sau chế biến 3.1.3 Nguồn nhiễm S.aureus có mặt khắp nơi, lây truyền trực tiếp từ thương tổn mờ g ián tiếp từ khơng khí, dụng cụ từ nhân viên y tế Các chủng S.aureus gây nhiễm tr ùng bệnh viện kháng với kháng sinh cao đặc biệt chủng S.aureus kháng methicillin (M RSA: Methicilline resistance Staphylococcus aureus) Yếu tố nguy cơ: người dễ nhiễm S.aureus trẻ em, người già, suy dinh dưỡng, suy giảm miễn dịch người làm phương tiện bảo vệ (chích, nặn non mụn nhọt ) 3.1.4 Khả gây bệnh Staphylococcus aureus nguyên nhân thường xuyên toàn giới gây bệnh tật tử vong tác nhân truyền nhiễm Tác nhân gây b ệnh gây nhiều loại bệnh, từ nhiễm trùng da vừa phải nghiêm trọng đến vi êm phổi nhiễm trùng huyết gây tử vong Điều trị nhiễm trùng S aureus phức tạp kháng thuốc kháng sinh khơng có sẵn vắc xin hoạt động Người ta ngày cà ng quan tâm nhiều đến số lượng độc tố yếu tố định độc lực khác mà S au reus tạo cách chúng tác động đến bệnh tật Vi khuẩn gây bệnh cho ng ười bị suy giảm đề kháng chúng có nhiều yếu tố độc lực Staphylococcus aureus vi khuẩn gây bệnh thường gặp có khả gây nhiều bệnh khác nhau: - Nhiễm khuẩn da: Do Staphylococcus ký sinh da niêm mạc mũi, nên n ó xâm nhập qua lỗ chân lơng, chân tóc tuyến da Sau gây n ên nhiễm khuẩn sinh mủ : mụn nhọt, ổ áp xe, eczema, hậu bối Mức độ nhiễm khuẩn phụ thuộc vào đề kháng thể độc lực vi khuẩn N hiễm tụ cầu da thường gặp trẻ em người suy giảm miễn dịch Đinh râu c ó thể gây nên biến chứng nguy hiểm Hình -Nhiễm khuẩn huyết: Staphylococcus aureus vi khuẩn thường gây nhiễm kh uẩn đường huyết Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt nhiễ m khuẩn da, từ vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường huyết Ðây nhiễm trùng nặng Từ nhiễm khuẩn đường huyết Staphylococ cus tới quan khác gây nên ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) Hình Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome) 3.2 Quy trình định lượng Staphylococus aureus 3.2.1 Phạm vi áp dụng - Phương pháp tham chiếu theo TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1:1999) dùng đ ể định lượng S.aureus cho tất loại thực phẩm - Tiêu chuẩn quy định phương pháp phát định lượng Staphylococcus au reus phụ gia thực phẩm kỹ thuật đếm khuẩn lạc - Phương pháp thích hợp để phân tích mẫu dự kiến chứa 100 tế bào S aure us gam Nếu nghi ngờ số lượng tế bào thấp giới hạn nêu nên sử dụng phương pháp đếm số có xác suất lớn theo TCVN 11039-7:2015 3.2.2 Nguyên tắc - Cấy lên bề mặt môi trường chọn lọc lượng huyền phù quy định ban đầu (s ản phẩm dạng mẫu huyền phù) Trong điều kiện, cấy dung dịch p loãng thập phân huyền phù ban đầu - Ủ đĩa điều kiện hiếu khí 37°C kiểm tra sau thời gian từ 24h đến 48h - Tính số lượng Staphylococcus có phản ứng coagulase dương tính mililit gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình khơng điển hình đĩa độ pha loãng chọn cho kết cố ý nghĩa khẳng định kết thử coagulase dương tính - Định lượng Staphylococcus aureus thực cách cấy trang lượng mẫu biết lên môi trường thạch Baird Parker, vi khuẩn cho khuẩn lạc đặc trưn g xác định phản ứng coagulase Một vài chủng cho coagulase âm tính nh ưng tạo độc tố đường ruột 3.2.3 Mơi trường hóa chất Bảng Mơi trường hố chất Mơi trường h óa chất Thành phần mơi tr ường Mục đích NaCl (8.5g) Duy trì cân áp suất thẩm thấu Dung dịch Saline Peptone (1g) Peptone Water (S PW) Nước cất (100ml) Nguồn cung cấp nitrogen carbon, amino acid chuỗi dài, vitamin chấ t dinh dưỡng cần thiết khác Tryptone (10g) Nguồn carbon nitơ thạch Baird Parker Agar Cao thịt bò (5g) Cao nấm men (1g) Natri (10g) Cung cấp vitamin B kích thích sin h trưởng vi khuẩn pyruvat Kích thích sinh trưởng Staphyloco ccus Môi trường Baid- Glycine (12g) Parker Agar ( BP Lithium Chloride (5 A) Ức chế sinh trưởng sinh vật k g) hác Staphylococcus Agar (20g) Tác nhân làm đông cứng Nước cất (1000ml) Môi tường (100ml) Nhũ tương lòng đỏ t Phân biệt vi khuẩn Staphylococcus dươn Egg yolk tellurite rứng (5ml) g tính với coagulase dựa lòng đỏ trứ emulsion ng Dung dịch Kali tell urite 3,5% vô trùng Ức chế sinh trưởng sinh vật k (1ml) hác Sterile saline (64 m l) Pancreatic Digest of Casein (15g) Làm cho môi trường giàu dinh dưỡng cung cấp nitơ hữu cơ, đặc biệt amino aci Peptic Digest of So d peptide chuỗi dài ybean Meal (5g) Môi trường Trypti case Soy Agar (T Sodium Chloride (5 g) Duy trì cân áp suất thẩm thấu SA) Agar (15g) Tác nhân làm cứng môi trường Tryptone (10,0g ) Bột não bị (12,5g) Cung cấp nitơ, vitamin, khống chất, axi d amin cần thiết cho phát triển hầu hết vi sinh vật Bột tim bò (5,0g) Natri clorua (5g) Duy trì cân thẩm thấu Brain heart broth (BHI) Natri hydro phosph ate (Na2HPO4) (2.5 Duy trì hoạt động đệm môi trường g) Glucoza (2g) Huyết tương thỏ đ ông khô Nguồn lượng cacbon Khẳng định S.aureus 10 HCl NaOH 10 % Chỉnh pH mơi trường 3.2.4 Quy trình phân tích 11 Chuẩn bị mẫu: đồng mẫu pha loãng mẫu thành dãy nồng độ Phân lập môi trường chọn lọc: cấy trải đĩa thạch BPA, ủ 37 24 Quan sát đếm số khuẩn lạc điển hình Quan sát đếm số khuẩn lạc khơng điển hình Khẳng định: Cấy khuẩn lạc khơng điển hình vào mơi trường BHI, ủ 37 , 24 Cấy khuẩn lạc điển hình v mơi trường BHI, ủ ±1℃, 24 Thử nghiệm ngưng kết coagulase (37 ±1℃) Tính kết Tính tỷ lệ khuẩn lạc điển hình phản ứng coagulase (+) tổng số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm Tính tỷ lệ khuẩn lạc điển hình phản ứng coagulase (+) tổng số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm Mật độ Staphylococcus aureus trung bình (CFU/g y CFU/ml) 12 3.2.5 Các bước tiến hành − Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Cân xác 10g/25g mẫu rắn đong 10ml/25ml thẻ tích mẫu lỏng, cho vào túi nhựa PE vô trùng Cho dung dịch pha lỗng SPW 90ml/225ml vơ trùng túi nhựa chứa mẫu Dập mẫu phút lắc bình tam giác 2-3 phút − Bước 2: Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng hút 1ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml SPW vô trùng nhiệt độ thích hợp Trộng máy vortextrong 5-10 giây để thu dịch pha loãng 10-2 Nế u cần, lặp lại thao tác để dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,… đ ạt độ pha lỗng thích hợp − Bước 3: Phân lập môi trường chọn lọc Hút 0,1 ml dung dịch mẫu nồng độ pha loãng vào đĩa môi trường BP A chuẩn bị trước, nồng độ lặp lại đĩa, dùng que trang trải dịch mẫu mặt thạch Lật ngược đĩa cấy ủ 37 ±1℃, 24 ±3 giờ, 48 ±4 − Bước 4: Quan sát đếm số khuẩn lạc Sau 24 ±3 giờ, tiến hành đếm số khuẩn lạc S.aureus điển hình khơng điển hì nh mơi trường thạch BPA Khuẩn lạc S.aureus điển hình có đường kính 1-1,5mm, màu đen sang, lồi Mỗi khuẩn lạc có vầng sang rộng 1-2mm bao quanh Những khuẩn lạc điển hình đánh dấu mặt sau đĩa tiếp tục ủ thêm 24 nữa Sa u 48 ±4 giờ, Khuẩn lạc S.aureus dương tính có đường kính 1,5-2mm, màu đen, sang, l ồi, quanh khuẩn lạc có vùng đục mờ hẹp, tiếp vùng sáng, rộng 2-4mm Cịn khuẩn lạc khơng điển hình khơng tạo vầng sáng bao quanh khô ng tạo vùng đục bao quanh khuẩn lạc Những khuẩn lạc không điển hình đượ c đánh dấu mặt sau đĩa − Bước 5: Phục hồi Cấy khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình từ BPA sang ống nghiệm tương ứng chứa 5ml môi trường BHI Ủ 37 ±1℃, 24 ±3 − Bước 6: Khẳng định phản ứng đông tụ huyết tương 13 Nguyên tắc: thử nghiệm khả số sinh vật làm đông tụ huyết tương hoạt động enzyme coagulase Coagulase S.aureus tiết bên tế bào chúng dễ dàng bất hoạt protease Coagulase enzyme đóng vai trị đơng tụ huyết tương, chúng kết hợp cấu t huyết tương thành khối hay cục Cách tiến hành: Hút 0,1ml dịch nuôi cấy BHI vào ống nghiệm 10mm × 75mm chứa 0.3ml huyết tương thỏ , ủ 37 ±1℃ Kiểm tra đông tụ huyết tương sau 4, 6, 8, 24 Phản ứng coi dương tính thể tích đơng tụ chiếm 3.2.6 Báo cáo kết 3.2.6.1 Tính tốn kết − Tính tỷ lệ số khuẩn lạc điển hình cho thử nghiệm phản ứng coagulase dươ ng tính (+) tổng số khuẩn lạc điển hình tỷ lệ khuẩn lạc khơng điển hình cho thử nghiệm coagulase dương tính (+) tổng số khuẩn lạc khơng điể n hình − Tính mật độ S.aureus trung bình 1g hay 1ml mẫu ban đầu: Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) ¿ 10×( N t × H t + N a × H a) F + F2 Trong đó: F1 F2: hai độ pha loãng liên tiếp Nt: tổng số khuẩn lạc điển hình đĩa độ pha lỗng F1 F2 Na: tổng số khuẩn lạc không điển hình đĩa độ pha lỗng F F2 Ht: tỷ lệ số khuẩn lạc điển hình cho thử nghiệm coagulase khẳng đị nh (+) so với khuẩn lạc điển hình Ha: tỷ lệ số khuẩn lạc khơng điển hình cho thử nghiệm coagulase kh ẳng định (+) so với số khuẩn lạc không điển hình 3.2.6.2 Biểu thị kết Ví dụ: 14 Bảng Ví dụ biểu thị cách tính kết S.aureus Độ pha l Số khuẩ Số khuẩ Số khuẩn Số phản ứ Ht oãng Ha n lạc điể n lạc khô lạc thử ng ng coagul n (Nt) hình ng điển h hiệm phả ase (+) ình (Na) gulase 5 47 5 30 10-2 10-3 n ứng coa Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) ¿ ay CFU/ml) 15 5/5 2/5 5/5 1/5 10×( N t × H t + N a × H a) =10 ׿ ¿ (CFU/g h F + F2