Định lượng e coli bằng phương pháp màng lọc

Phương pháp đếm khuẩn lạc- Khuẩn lạc của một loại vi khuẩn được định nghĩa là một cụm Colony, cóthể nhìn thấy được bằng mắt thường, sinh khối của vi khuẩn đó khi chúngphát triển trên bề

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên cho nhóm đề tài xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến Ban GiámHiệu và toàn thể quý thầy cô Trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM

Quý thầy cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm cùng với tri thức và tâm huyết của

mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian họctập tại trường Và trong học kỳ này Khoa đã tổ chức cho chúng em được tiếp cậnvới môn học rất hữu ích đối với sinh viên Đó là môn học “Phân tích vi sinh thựcphẩm”

Nhóm đề tài chúng em gửi lời cám ơn chân thành nhất đến GV Cô Đinh Thị

Hải Thuận đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học, từng buổi thảo

luận hết sức bổ ích và những kiến thức cần thiết mà Cô đã mang đến cho môn họcnày

Nhóm đề tài cũng xin cảm ơn bạn bè, anh chị đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡtrong quá trình hoàn thành bài tiểu luận, tạo cho chúng em hiểu thêm về nhữngkiến thức

Đề tài tiểu luận do nhóm chúng em tìm hiểu là “Định lượng E.coli bằng

phương pháp màng lọc” Do kiến thức còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ, khôngtránh khỏi những thiếu xót là điều chắc chắn Vì thế, nếu có thiếu xót mong quýThầy Cô và các bạn bỏ qua Nhóm đề tài rất mong nhận được những ý kiến đónggóp quý báu của Cô và các bạn để bài tiểu luận có thể hoàn thiện hơn

Lời cuối cùng, chúng em xin kính chúc Cô có thật nhiều sức khỏe, thànhcông trong mọi việc và luôn hạnh phúc

Nhóm chúng em xin chân thành cảm ơn!

1.1. Giới thiệu chung về độc tố E.Coli 7

1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm 7

2.1 Phương pháp phân tích truyền thống 8

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi cuộc sống của con người tiếp tục được cải thiện, vệ sinh khi ănuống là điều rất quan trọng đối với họ Hàng năm có hàng trăm vụ ngộ độc thựcphẩm xảy ra, để lại hậu quả nặng nề cho sức khỏe của người dân Điều này khôngchỉ phổ biến ở Việt Nam mà còn ở các nước khác trên thế giới Một trong nhữngnguyên nhân gây ra tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép các vi sinh vậtgây hại trong thực phẩm, tùy theo mức độ mà hậu quả của chúng để lại khác nhau

Vi khuẩn sinh sôi, phát triển với sức sống mạnh mẽ, trong ruột của người,một số động vật Theo nghiên cứu, hầu hết các dạng vi khuẩn E.coli không chỉ vôhại đối với sức khỏe mà còn góp phần giúp sức khỏe ổn định hơn Những vi khuẩnnày được coi là vi khuẩn có lợi, công việc chính của chúng là giúp hệ tiêu hóa hoạtđộng hiệu quả hơn, trong trường hợp này, các nhà khoa học nói đến mối quan hệcộng sinh Tuy nhiên, vẫn có một số dạng E.coli có khả năng gây bệnh cho chúng

ta Vì vậy, nếu không có những kiến thức cần thiết về cách phòng tránh cũng nhưcác biểu hiện triệu chứng và cách điều trị, mọi người sẽ gặp rất nhiều khó khăn

Vì những lý do trên mà suốt những năm qua con người luôn cố gắng nghiêncứu, sử dụng nhiều biện pháp khác nhau để định lượng E.coli, trong đó có phươngpháp được sử dụng phổ biến hiện nay là “Định lượng E.Coli bằng phương phápmàng lọc” Để có các biện pháp phòng tránh, ngăn chặn và làm giảm bớt số ca ngộđộc thực phẩm, chúng em sẽ tiến hành tìm hiểu sâu hơn về phương pháp địnhlượng này

1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặc điểm của E.Coli

- Là trực khuẩn nhỏ uốn cong gram âm, không sinh bào tử và di động, kỵ khíkhông bắt buộc, có mặt trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu

cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường, trong các loại thực phẩmnhư cá hồi, phô mai, thịt, sữa Chúng có khả năng tạo enterotoxin và có khảnăng gây bệnh rất nặng ở người Độc tố của chúng rất nhạy cảm với nhiệt.Ngoài độc tố nhạy cảm với nhiệt chúng còn có khả năng tạo ra loại độc tốbền nhiệt Chúng có nguy cơ rất lớn đối với trẻ em đặc biệt là những bệnhliên quan đến hội chứng dung huyết hoặc phân có máu Một nghiên cứu tạiViệt Nam cho thấy trên 80% số mẫu dụng cụ bát đũa thường dùng khôngđược vệ sinh đúng cách và do đó bị bẩn Trên 85% số mẫu tay người bán

hàng bị nhiễm khuẩn E.coli Liều gây khoảng 106-9 tế bào ở người trưởngthành sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm khuẩn

Coliform.

- E.Coli có khả năng sinh indole Không sinh H2S Không sử dụng đượcnguồn carbon cua citrate trong môi trường Simmons Có decarboxylase, vìvậy có khả năng khử carboxyl của lysin, ornithin, arginin và acid glutamic.Betagalactosidase dương tính Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24h

âm tính, sau 48 giờ có thể dương tính

1 ĐỘC TỐ VÀ CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ CỦA E.COLI

1.1 Giới thiệu chung về độc tố E.Coli

- Nhóm này không sinh độc tố ruột như nhóm sinh độc tố ruột Nhưng chúngxâm nhập và nhân lên ở các tế bào biểu mô ruột, rồi chúng lan sang các tếbào bên cạnh theo cách giống ngộ độc do lỵ trực khuẩn và gây ra tiêu chảynặng có thể không có máu hoặc có máu giống lỵ, viêm ruột tan huyết, có thểdẫn đến tử vong Nhóm này hay gây bệnh ở trẻ em và người già

1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm

- Trên thế giới, các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn chiếm tới 70% Tại các

nước châu Á, vi khuẩn Salmonella, E.coli, Listeria Monocytogenes và S.

aureus là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm Tại Việt

Nam, ngộ độc thực phẩm đang là vấn đề nóng bỏng của xã hội và đã trởthành mối lo cho sức khỏe cộng đồng và ngày càng diễn biến phức tạp Hơnthế nữa, theo thông báo của Bộ Y tế, tình trạng ngộ độc thực phẩm đang có

xu hướng gia tăng và ảnh hưởng không nhỏ tới sức khỏe cộng đồng Trongnăm 2021, toàn quốc ghi nhận 81 vụ ngộ độc thực phẩm làm 1942 ngườimắc và 18 trường hợp tử vong So với năm 2020, số vụ giảm 58 vụ (41,7%),

số mắc giảm 1152 người (37,2%), số tử vong giảm 12 người (40,0%) Tínhchung 7 tháng năm 2022, cả nước xảy ra 27 vụ ngộ độc thực phẩm với 357người bị ngộ độc, trong đó có 2 người tử vong

- Trong đó, rất nhiều người bị ngộ độc E.coli do sử dụng đồ uống và thực

phẩm có chứa loại vi khuẩn này Khi xâm nhập vào trong cơ thể, chúng sẽbám vào lớp tế bào của niêm mạc thành ruột và bắt đầu sinh trưởng Do vikhuẩn tăng sinh quá nhanh nên chúng sẽ giải phóng độc tố đủ mạnh để gây

ra sự tổn thương đối với niêm mạc ruột và gây tiêu chảy, đau quặn bụng Cụthể:

● Năm 2020: Giám đốc sở y tế tỉnh Bình Phước cho biết đã xác định đượcnguyên nhân vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra tại một tiệc cưới vào ngày 7.6khiến 150 người nhập viện (tại thôn Hưng Lập, xã Phước Tín, TX Phước

Long) là do vi sinh vật, vi khuẩn E.coli có trong thực phẩm.

● Năm 2021: Trung tâm Y tế huyện Pác Nặm đã gửi 11 mẫu phẩm để xétnghiệm, gồm: năm mẫu thực phẩm, một mẫu nước và năm mẫu bệnhphẩm Đến cuối giờ chiều 3-3 đã có kết quả xét nghiệm của Chi cục Antoàn vệ sinh thực phẩm tỉnh Theo đó, 5 mẫu thực phẩm đều có vi khuẩn

E.coli, Coliform và S.aureus (tụ cầu).

2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

2.1 Phương pháp phân tích truyền thống

2.1.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc

- Khuẩn lạc của một loại vi khuẩn được định nghĩa là một cụm (Colony), có

thể nhìn thấy được bằng mắt thường, sinh khối của vi khuẩn đó khi chúngphát triển trên bề mặt của một giá thể cứng

- Đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU (viết tắt từ chữ Colony form units) là đơn

vị được dùng để ước tính số lượng vi khuẩn hoặc tế bào nấm trong 1 mẫuthử nghiệm nhất định Khi kiểm tra vi sinh vật trong một mẫu thử nghiệmbằng cách đếm khuẩn lạc có trên đĩa petri hoặc đĩa môi trường chuẩn bị sẵn(ví dụ đĩa Compact Dry), đơn vị thể hiện khuẩn lạc thường là CFU/mL,CFU/g, CFU/25g

- Đơn vị CFU/g, CFU/25g thường dùng cho mẫu thử nghiệm dạng rắn (thựcphẩm, nguyên liệu thực phẩm…)

- Đơn vị CFU/mL dùng cho mẫu thử nghiệm ở dạng dung dịch như mẫu nướcnuôi trồng thủy sản, nước trái cây…

- Đếm khuẩn lạc là đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường, thườngchọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30 – 300, dùng bút để đếm các

khuẩn lạc đã đếm sau đó tính toán kết quả (dựa trên số khuẩn lạc đếm được

và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc vi sinh vật trong dung dịch ban đầu)

- Có 2 phương pháp đếm khuẩn lạc:

❖ Phương pháp đếm khuẩn lạc thủ công: Với phương thức đếm khuẩn lạc thủcông, mỗi chấm khuẩn lạc đặc trưng cho loại vi khuẩn đích được đếm mộtlần Để dễ kiểm soát quá trình đếm, người ta thường đặt đĩa petri lên mộtlưới ô Sau đó đếm các khuẩn lạc trong mỗi ô và đánh dấu khuẩn lạc đếmđược ở đằng sau của đĩa petri Để đảm bảo chính xác, mỗi mẫu thử nghiệmcần được nuôi cấy ít nhất 3 đĩa và lượng khuẩn lạc thích hợp cho đếm thủcông là 30 tới 300 khuẩn lạc Các đĩa có quá nhiều hoặc quá ít khuẩn lạc đềukhông thích hợp và cần pha loãng và cấy lại mẫu

❖ Phương pháp đếm khuẩn lạc tự động: Đếm khuẩn lạc thủ công thường mấtrất nhiều thời gian và có thể mắc phải sai số chủ quan của người đếm Để cảithiện tình trạng này, hiện nay các phòng lab đã trang bị thêm các thiết bịđếm khuẩn lạc tự động Nguyên lí cơ bản của máy đếm khuẩn lạc tự động làmáy đếm khuẩn lạc sẽ chụp một ảnh của đĩa (petri hoặc đĩa compact dry),ứng dụng sau đó sẽ sử dụng một thuật toán để tách và đếm các khuẩn lạc cótrên đĩa Thuật toán cũng có thể gặp khó khăn trong việc phân biệt các khuẩn

lạc khi có quá nhiều khuẩn lạc chồng lấn Trường hợp này cần môt ứng dụng

có khả năng phân tích hiệu quả và mạnh mẽ Đây cũng là thách thức của cácchuyên gia trong việc phát triển ứng dụng này

Figure 1: Máy đếm khuẩn lạc tự động

❖ Ưu, nhược điểm của phương pháp đếm khuẩn lạc:

● Ưu điểm

- Cho phép xác định số tế bào sống

- Định lượng chọn lọc vi sinh vật

● Nhược điểm:

- Độ chính xác của việc tính mật độ vi khuẩn từ số khuẩn lạc thực sự có một

số hạn chế Các đơn vị hình thành khuẩn lạc có thể là một tế bào đơn, mộtchuỗi tế bào hoặc cả một cụm tế bào Giả thiết rằng một khuẩn lạc đại diệncho một tế bào, như vậy mật độ tính toán được có thể thấp Các vi khuẩnkhác nhau cần các điều kiện sinh trưởng khác nhau, và khuẩn lạc trên đĩa chỉthể hiện những vi khuẩn mà phát triển trên môi trường cấy dưới những điềukiện ủ đó Hơn nữa, đếm khuẩn lạc không tính được tế bào chết, cần phảicân nhắc kỹ khi bạn cần mật độ tế bào trong mẫu ban đầu

2.1.2 Phương pháp MPN

- MPN là viết tắt của Most Probable Number, nghĩa là số có xác suất lớn nhất.MPN thường được dùng để biểu thị số lượng vi khuẩn có trong một thể tíchnhất định của mẫu chất lỏng.

- CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc có trong 1 mẫu thử nghiệm nhất định.CFU thường được tính từ phương pháp đổ đĩa hoặc cấy trang trong khi đóMPN thường được tính toán bằng phương pháp lên men Đối với CFU, vikhuẩn phát triển trên môi trường đặc (ví dụ như thạch), sau đó, các khuẩn lạcđược đếm thủ công bằng mắt hoặc ứng dụng hiện đại Đối với phép đoMPN, các mẫu được nuôi cấy trong môi trường lỏng, (ví dụ như lên men).Kết quả không dùng phương thức đếm mà là so sánh với bảng xác suất

- Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vi sinhvật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu Mỗi độ pha loãng được nuôicấy lập lại nhiều lần (3 – 10 lần) Các độ pha loãng được chọn lựa sao chotrong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính Sốlần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê

- Sự tạo hơi: Coliforms …

- Sự đổi màu: S aureus

- Cho phép định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích mẫu lớn

❖ Bước 3: Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp.

❖ Bước 4: Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của vi sinh vật cầnkiểm định

❖ Bước 5: Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng.Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ vi sinh vật

2.2 Phương pháp hiện đại

2.2.1 Kỹ thuật RPLA

- Kĩ thuật RPLA được ứng dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm rong kĩthuật này, hạt nhựa được phủ kháng thể của độc tố trước khi cho vào giếng.Cho mẫu vào để tạo phản ứng Nếu có độc tố trong mẫu thì phản ứng giữađộc tố và kháng thể sẽ tạo ra sự ngưng kết, tùy mức độ ngưng kết mà xác

định được lượng độc tố Bộ kit RPLA được giới thiệu bởi công ty DenkaSeiken, Niigata, Nhật Bản và được bán tại Mỹ (Merlin S Bergdoll, 2000).

2.2.2 Phương pháp Elisa

- Phương pháp elisa ( Enzyme – Linked Immuno Sorbent Assay)

Những tiến bộ của khoa học trong những năm gần đây đã thúc đẩy sự phát triển của các kỹ thuật chuẩn đoán bằng huyết thanh Các phương pháp này

tỏ ra rất hiệu quả trong việc chuẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh Ngày nay phương pháp này còn được phát triển để xác định chất độc hại trong môi trường như độc tố, dư lượng kháng sinh Nguyên tắc của phương pháp Elisa dựa trên phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu Phản ứng miễn dịch xảy ra được phát hiện bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu ( bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ, hay enzyme)

- Phương pháp Elisa là phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme( enzyme-linked immunosorbent assay) Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA là

sử dụng kháng thể đơn dòng ( kháng thể sơ cấy ) phủ bên ngoài những giếngwell ) nhỏ nhằm mục đích thu giữ những kháng nguyên mục tiêu Nhữngkháng nguyên thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ hai

có gắn với enzyme phát tính hiệu ( thường là horseradish peroxidase hayalkaline phosphatase ) Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệucủa enzyme, phản ứng xảy ra và tạo ra các sản phẩm làm đổi màu phản ứng Như vậy , chúng ta có thể phát hiện được sự hiện diện của kháng nguyên

- Hiện nay ELISA đã được sử dụng rộng rãi để phân tích Salmonella, E coligây bệnh ( các dòng EHEC , STEC ,IEHEC…) , Listeria , độc tốStaphylococus , thuốc trừ sâu, dư lượng kháng sinh … đối với vi sinh vật ,phương pháp Elisa có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thựcphẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của phương pháp

2.2.3 Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction )

- Phương pháp PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trênkhuôn là một trình tự đích DNA ban đầu , khuếch đại, nhân số lượng bản acủa khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzymepolymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này Kỹ thuật này đượcKarl Mullis phát minh vào 1985

- Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạnDNA riêng biệt Đây thực sự là phương pháp hiện đại vì thuận tiện cho việcxác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao

- Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao củaDNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sốngtrong các suối nước nóng) Phần lớn các DNA polymerase không có nhiềukhả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử Nhưng cácpolymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến

100oC Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính

❖ Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp PCR

● Ưu điểm

- Thời gian cho kết quả nhanh

- Có thể nhận diện những sinh vật khó nuôi cấy Việc nuôi cấy tăng sinh làđơn giản hơn và có khi không cần thiết

- Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trườnghợp huyết thanh học Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp,

có thể thực hiện ở hiện trường

- Ít tốn kém về mặt nhân sự Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phíphát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

● Nhược điểm

- Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase

- Mật độ vi sinh vật trong mẫu thấp, đôi khi cần tăng sinh

- Không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, có thể dẫn đến dương tínhgiả (tuy vậy, có thể phát hiện bào tử, tế bào đã chết của vi sinh vật gây độc)

- Ngày càng được quan tâm nhiều hơn đặc biệt phát hiện virus

3 ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC

3.1 Định nghĩa và nguyên tắc

- Phương pháp màng lọc là phương pháp thường được dùng để định lượng visinh vật ở mật độ thấp Bản chất của phương pháp này là tập trung số vi sinhvật ít ỏi trong một mẫu nước có khối lượng khá lớn trên màng lọc khuẩn vàđịnh lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên mộtmôi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vậtcần kiểm Dựa trên mẫu nước ban đầu và quy ra số lượng vi sinh vật cótrong một đơn vị thể tích nước

Hình 2 Vi sinh vật trên màng lọc

- Người ta thường dùng màng lọc với kích thước lỗ lọc: 0,45μm hoặc 2μm.Những vật liệu thường dùng để chế tạo màng lọc là sợi thủy tinh siêu mảnh,sợi amiante, sơi polypropylene,…là những vật liệu có khả năng chịu đượcnhiệt độ và áp suất cao của nồi hấp tiệt trùng Đường kính và hình dạng

màng lọc phụ thuộc vào đường kính phễu lọc, đường kính màng thường là45mm

- Hiện nay phương pháp màng lọc đang ngày càng cải tiến, thường dùngmàng lọc kỵ nước, màng lọc được in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan củakhuẩn lạc Số ô vuông có khuẩn lạc mọc được đếm và quy về số có xác suấtlớn nhất (MPN) của lượng vi sinh vật có trong một thể tích mẫu theo côngthức:

● Nhược điểm: không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn

3.2 Môi trường và hoá chất

- Môi trường canh Tryptone Soya Agar(TSA) và môi trường Violet Red BileAgar(VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh đun chảy và làmnguội ở nhiệt độ 45 độ C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng

- Môi trường canh Escherichia coli broth(EC Broth) được phân phối 10mltrong mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội

và kiểm tra không có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham

- Môi trường canh Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth (LST Broth) đượcchuẩn bị tương tự môi trường canh EC

- Môi trường canh Tryptone Broth được phân phối 5ml vào mỗi ốngnghiệmhấp khử trùng,

- Môi trường c anh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệmhấp khử trùng , để nguội và bảo quản ở 2 -8 0C cho đến khi sử dụng.

- Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạchnghiêng có màu xanh lục

- Agar là tác nhân làm cứng hóa môi trường

- Nước có tác dụng hòa tan các chất có trong môi trường

- Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Escherichia Coli

(E.coli) và vi khuẩn Coliform Phương pháp này sử dụng kỹ thuật lọc màng,

sau đó nuôi cấy trên môi trường thạch coliform sinh màu và tính toán sốlượng vi sinh vật đích có trong mẫu thử Vì môi trường thạch phân biệt có

độ chọn lọc thấp nên hệ vi sinh vật nền có thể phát triển gây nhiễm cho số

đếm E.Coli và vi khuẩn Coliform, ví dụ: phương pháp này không thích hợp

để áp dụng với mẫu nước bề mặt hoặc nước giếng nông

- Tiêu chuẩn này đặc biệt thích hợp cho những loại nước có số lượng tổng vikhuẩn dưới 100 khuẩn lạc trên môi trường thạch coliform sinh màu (CCA)bao gồm nước uống đóng chai, nước bể bơi khử khuẩn hoặc nước đã qua xử

lý làm nước uống

- Một vài chủng E.Coli âm tính với β-D-glucuronidase, như Escherichia

Coli O157, sẽ không phát hiện được là E.Coli Vì chúng có enzym

β-D-galactosidase dương tính nên sẽ giống như vi khuẩn Coliform trên môi

trường CCA

3.3.2 Quy trình

Quy trình Định lượng E.coli bằng phương pháp màng lọc

3.3.2.1 Chuẩn bị mẫu

- Chuẩn bị mẫu lọc và cấy trên môi trường phân lập, theo hướng dẫn TCVN

9716 (ISO 8199) Mẫu thử phải được vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ (5

± 3) °C theo hướng dẫn TCVN 8880 (ISO 19458) Trường hợp đặc biệt mẫu