Trang 8 Hình 5 Khi đếm khuẩn lạc sẽ đếm những khuẩn lạc rờiƯu điểm :Cho phép xác định số tế bào sống Định lượng chọn lọc được vsvNhược điểm :Độ chính xác của việc tính mật độ vi khuẩn từ
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM -o0o -TIỂU LUẬN MƠN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: Định lượng Bacillus cereus phương pháp đếm KL Nhóm :08 Sinh viên thực :Mã số sinh viên 1.THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – THÁNG 10 NĂM 2022 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 NỘI DUNG Giới thiệu vi khuẩn Bacillus cereus .2 1.1 Đặc điểm 1.2 Nguồn thu nhập B cereus 1.3 B cereus thực phẩm ngành khác 1.3.1 Tác hại B cereus: 1.3.2 Vai trò B cereus nuôi trồng hải sản: Phương pháp đếm khuẩn lạc .4 2.1 Định nghĩa phương pháp: 2.2 Phương pháp thực 2.2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc thủ công: .5 2.2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc tự động: 2.3 Phương pháp áp dụng cho loại vsv : .6 Định lượng B cereus phương pháp đếm KI: 3.1 Mơi trường hóa chất: .7 3.1.1 Môi trường MYP: .7 3.1.2 Chuẩn bị đĩa thạch: .10 3.1.3 Thạch huyết cừu: .11 3.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm: .12 3.3 Quy trình thực hiện: 14 3.3.1 Sơ đồ thực hiện: 14 3.3.2 Giải thích quy trình 15 3.3.3 Đếm khuẩn lạc khẳng định 16 3.3.4 Khẳng định 17 3.4 Tính tốn kết .18 KẾT LUẬN .20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 MỞ ĐẦU Ngay có Pháp lệnh thực phẩm, hàng năm nước ta ghi nhận hàng vạn ca mắc bệnh truyền qua đường thực phẩm Đó vấn đề cấp thiết xã hội cần quan tâm nhiều Nguyên nhân việc ngộ độc thực phẩm ý thứccủa người thực phẩm sử dụng khơng an tồn Vi khuẩn nguồn gây bệnh qua đường thực phẩm (các vi sinh vật gây bệnh) mà quan thuốc thực phẩm Mỹ khuyến cáo dân chúng tác hại, cách phát hiện, chế lây nhiễm cách đề phòng Một số loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Bacillus cereus Là vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử Bacillus cereus làm người bị ngộ độc ói mửa tiêu chảy trường hợp nặng gây tử vong Bất có nguy lây nhiễm Bacillus cereus Thực phẩm nhiễm Bacillus cereus phổ biến Người ăn phải thực phẩm thường mắc hai bệnh điển hình tiêu chảy nôn mửa Dạng ngộ độc gây tiêu chảy bị gây loại vi khuẩn Bacillus cereus có cấu trúc phân tử protein lớn Loại vi khuẩn dễ dính lên nhóm thực phẩm thịt, sữa, rau cá Triệu chứng loại ngộ độc đại tiện nước bụng bị chuột rút khoảng sau 615 tiếng kể từ lúc ăn phải Triệu chứng kéo dài khoảng 24 tiếng Nôn mửa kèm thường gặp loại ngộ độc gây tiêu chảy Bacillus cereus trọng lượng phân tử lớn Vì cần định lượng để phát hiện, kiểm xoát loại bỏ B cereus Đối tượng nghiên cứu Bacillus cereus Hình thức nghiên cứu : định lượng Phương pháp nghiên cứu : Phương pháp đếm khuẩn lạc NỘI DUNG Giới thiệu vi khuẩn Bacillus cereus 1.1 Đặc điểm Bacillus cereus vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí dễ sinh độc tố B cereus phát triển khoảng từ 10 đến 50 ° C, với nhiệt độ tối đa từ 30 đến 40 ° C Tuy nhiên, chủng chịu lạnh nhân nhiệt độ từ đến ° C; trường hợp này, thời gian nhân thường dài đáng kể Dưới độ pH 4,8, dịng B cereus khơng thể nhân Tuy nhiên, dung nạp axit chủng thay đổi đáng kể Giá trị giá trị aw (sinh sôi nước) tối thiểu cho phép nhân xấp xỉ 0,92 Hình Cấu tạo B cereus 1.2 Nguồn thu nhập B cereus Nhiều loại thực phẩm coi môi trường lý tường B cereus Chúng bao gồm cơm luộc cơm chiên, nấu chín; rau thịt; mì ống; sốt vani; sữa trứng, thịt hầm, bánh ngọt, xà lách, súp, kem loại thảo mộc gia vị Hình B cereus hội chứng cơm chiên 1.3 B cereus thực phẩm ngành khác 1.3.1 Tác hại B cereus: Có hai loại bệnh đường ruột B cereus gây Loại đầu tiên, độc tố gây nôn, dẫn đến nôn mửa, loại thứ hai, độc tố ruột gây ra, gây tiêu chảy Trong số trường hợp, hai loại triệu chứng ghi nhận, sản sinh hai loại độc tố PGS Nguyễn Duy Thịnh đặc biệt nhấn mạnh, gạo có Bacillus cereus Bào tử chết nhiệt độ cao Tuy nhiên, bạn bảo quản cơm nguội nhiệt độ phòng bình thường tạo điều kiện cho bào tử vi khuẩn sinh sôi phát triển Khi nhiễm khuẩn, cơm nguội gây rối loạn tiêu hóa; nặng ngộ độc cấp; nhẹ rối loạn tiêu hóa “Người ăn phải cơm có chứa vi khuẩn Bacillus cereus buồn nơn nơn tiêu chảy sau khoảng từ đến tiếng Phần lớn triệu chứng mức độ tương đối nhẹ thường kéo dài khoảng 24 tiếng” Hình Các triệu chứng B cereus 1.3.2 Vai trò B cereus nuôi trồng hải sản: B cereus mạnh khả phân giải protein, tinh bột, cellulose… góp phần làm đáy ao, giúp tiêu hóa thức ăn Với nhiều nghiên cứu cho thấy số lượng vi khuẩn hữu ích nhân tố thúc đẩy làm tăng hiệu xử lý tăng trọng tỉ lệ sống tơm ni Hình Men vi sinh xử lí đáy ao tơm hiệu Phương pháp đếm khuẩn lạc 2.1 Định nghĩa phương pháp: Khuẩn lạc “tập đoàn” vi khuẩn, sinh khối vi khuẩn phát triển bề mặt giá thể cứng Trong trường hợp khuẩn lạc phát triển từ tế bào gốc nhất, gen chúng giống y hệt, chúng gọi dòng Phương pháp đếm khuẩn lạc: Một cách cổ điển để xác định mật độ vi sinh vật mẫu pha loãng mẫu, cấy lên đĩa thạch sau đếm khuẩn lạc mọc Vi khuẩn cấy đĩa phát triển hình thành khuẩn lạc từ vi khuẩn ban đầu Hình Khi đếm khuẩn lạc đếm khuẩn lạc rời Ưu điểm : Cho phép xác định số tế bào sống Định lượng chọn lọc vsv Nhược điểm : Độ xác việc tính mật độ vi khuẩn từ số khuẩn lạc thực có số hạn chế Đếm khuẩn lạc khơng tính tế bào chết 2.2 Phương pháp thực 2.2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc thủ công: Cách thức phương pháp đếm khuẩn lạc đếm chấm khuẩn lạc lần Một cách tiếp cận đặt đĩa petri lên lưới ô đếm khuẩn lạc Nhìn chung, bạn cần đếm ba đĩa; sử dụng đĩa chứa 30 tới 300 khuẩn lạc để giúp đưa kết luận tin cậy Các đĩa mà H nhiều q khuẩn lạc khơng thích hợp cần pha loãng cấy lại mẫu 2.2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc tự động: Máy đếm khuẩn chụp ảnh đĩa, tách khuẩn lạc khỏi sau sử dụng thuật tốn để đếm khuẩn lạc đĩa Thuật tốn gặp có khăn việc phân biệt khuẩn lạc hai nhiều khuẩn lạc chồng lấn vùng rìa, lĩnh vực phát triển phần mềm H 2.3 Phương pháp áp dụng cho loại vsv : Thường dùng cho mẫu thử nghiệm dạng rắn (thực phẩm, nguyên liệu thực phẩm…) Dùng cho mẫu thử nghiệm dạng dung dịch mẫu nước nuôi trồng thủy sản, nước trái cây… Định lượng B cereus phương pháp đếm KI: 3.1 Mơi trường hóa chất: TÊN Mục đích SPW dùng để pha lỗng mẫu thử Mơi trường thạch MYP ( Mannitol-Egg mơi trường cho việc nuối cấy Yolk- Polymixin) B.cereus Thạch huyết cừu thử hồng cầu xác định phản ứng Hóa chất phụ : NaCl, HCl Điều chỉnh pH Bảng Môi trường hóa chất ni cấy B.cereus 3.1.1 Mơi trường MYP: Mơi trường Môi trường thạch bao gồm Dung dịch polymyxin B Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng Thành phần Peptone Mục đích Cung cấp nitơ, vitamin yếu tố tăng trưởng Bột chiết thịt bò D-mannitol Đường lên men, D-mannitol tạo q trình lên men acid NaCl Duy trì trạng thái cân thẩm thấu Agar Làm chất đông tụ Cao nấm men Cung cấp vitamin, tạo điều kiện cho việc nuôi dưỡng vi sinh vật kỵ khí Bảng Thạch huyết cừu 3.1.3.1 Môi trường bản: Nguyên liệu Pepton proteoza pepton Sản phẩm thủy phân gan Cao nấm men Chuẩn bị Hịa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách đun sơi Chỉnh pH cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25 0C, cần Natri clorua (NaCl) Thạch Phân phối vào bình cầu khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực 121 0C Nước a) Tùy thuộc vào sức đông thạch Bảng Cách chuẩn bị môi trường Thạch huyết cừu 3.1.3.2 Mơi trường hồn chỉnh: Ngun liệu Chuẩn bị Môi trường Sau làm nguội đến nhiệt độ từ 44 0C đến 47 0C, bổ sung huyết cừu khử sợi huyết vào môi trường Trộn Huyết cừu khử sợi huyết Rót phần 12 ml mơi trường hồn chỉnh sang đĩa Petri đông đặc Bảng Mơi trường hồn chỉnh 3.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm: Thiết bị dụng cụ thí nghiệm Thiết bị để khử trùng khơ (lị sấy) để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Tác dụng Khử trùng môi trường nuôi cấy, Thiết bị quy định cho phép nhiệt độ buồng trì vịng ± °C 11 nhiệt độ đích (để tính đến độ không đảm bảo đo kết hợp với cặp nhiệt đo) Tủ sấy tủ ấm, Được thơng gió đối lưu, để làm khơ đĩa thạch, có khả hoạt động 37 0C ± 0C 55 0C ± 0C Tủ ấm, Có thể làm việc 30 0C ± 0C Nồi cách thủy, Có thể trì nhiệt độ 44 0C đến 47 C pH met, Có độ xác ± 0,1 đơn vị pH 25 C Đĩa Petri, Bằng thủy tinh chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm, 140 mm, cần Pipet chia vạch, Được hiệu chuẩn dùng cho vi khuẩn học, có dung tích danh định 10 ml ml, chia vạch 0,5 ml 0,1 ml tương ứng có lỗ xả với đường kính danh định từ mm đến mm Dụng cụ dàn mẫu (dạng que gạt) Que thủy tinh chất dẻo có đường kính khoảng 3,5 mm dài 20 cm, đầu uốn thành góc vng với đoạn dài khoảng cm; đầu làm nhẵn nhiệt Lấy mẫu Điều quan trọng phòng thử nghiệm nhận mẫu đại diện không bị hư hỏng biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Xem tiêu chuẩn riêng lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng 12 bên liên quan tự thỏa thuận với vấn đề Bảng Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 3.3 Quy trình thực hiện: 3.3.1 Sơ đồ thực hiện: Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng Pha loãng mẫu Cấy ủ Đếm khuẩn lạc khẳng định 3.3.2 Giải thích quy trình 3.3.2.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) tiêu chuẩn riêng liên quan tới sản phẩm Cân xác 10g mẫu rắn đong 10ml mẫu lỏng, sai số cho phép ± %, cho vào túi nhựa vơ trùng Cho dung dịch pha lỗng SPW 90ml (sai số cho phép ± %) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu SPW NaCl 1g Peptone 8,5g Nước cất vừa đủ lí t Bảng 10 Lượng pha SPW ( thay đổi tùy theo cách pha phịng thí nghiệm) 13 3.3.2.2 Pha loãng mẫu Hút 1ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha lỗng SPW vơ trùng nhiệt độ thích hợp Trộn kỹ máy vortex -10s để thu dung dịch pha lỗng 10 -2 (độ pha lỗng thích hợp để ni cấy) Nếu cần, lặp lại thao tác để có dung dịch pha lỗng 10-3, 10-4,… thu lượng vi khuẩn thích hợp Để định lượng bào tử Bacililus cereus giả định, cần làm nóng dung dịch pha lỗng ban đầu 800C 10 phút nồi cách thủy sau tiến hành cấy 3.3.2.3 Cấy ủ Lấy hai đĩa thạch (5.2.5), dùng pipet vô trùng cho vào đĩa 0,1 ml mẫu thử sản phẩm dạng lỏng huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác Lặp lại qui trình với dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, cần Đối với số sản phẩm định, tốt để ước tính B cereus với số lượng nhỏ, tăng giới hạn phát lên 10 lần cách kiểm tra 1,0 ml mẫu thử sản phẩm ban đầu dạng lỏng, 1,0 ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác Phân phối ml dịch cấy lên bề mặt đĩa Petri lớn (140 mm) lên khắp bề mặt ba đĩa nhỏ (90 mm) sử dụng dụng cụ dàn mẫu vô trùng hai trường hợp, chuẩn bị cho phép xác định kép sử dụng hai đĩa lớn sáu đĩa nhỏ (2) Cẩn thận dùng que dàn mẫu dàn dịch cấy khắp bề mặt đĩa thạch nhanh tốt mà không chạm vào mép đĩa Sử dụng que dàn mẫu vô trùng cho đĩa Để đĩa có đậy nắp khoảng 15 phút nhiệt độ phòng để chất cấy bám vào thạch Lật úp đĩa chuẩn bị để 18 h đến 24 h tủ ấm 30 0C Nếu nhìn thấy rõ khuẩn lạc ủ đĩa thêm 24 h trước đếm Hình Mơ hình cấy ủ Bacililus cereus 14 3.3.3 Đếm khuẩn lạc khẳng định Sau giai đoạn ủ, chọn đĩa, tốt hai độ pha loãng liên tiếp, có 150 khuẩn lạc Đếm khuẩn lạc B cereus giả định đĩa Các khuẩn lạc giả định khuẩn lạc lớn, màu hồng (cho thấy khơng lên men mannitol, xem thích 1) thường bao quanh vùng kết tủa (cho thấy hình thành lexitinase xem thích 2) Nếu có 15 khuẩn lạc đặc trưng đĩa cấy sản phẩm dạng lỏng sản phẩm dạng khác độ pha loãng thấp nhất, lấy số đếm ước tính mơ tả điều 10 CHÚ THÍCH 1: Nếu đĩa chứa nhiều vi sinh vật lên men mannitol dẫn đến sinh axit, màu hồng đặc trưng khuẩn lạc B cereus bị nhạt biến hồn tồn CHÚ THÍCH 2: Một số chủng B cereus sinh khơng sinh lexitinase Các khuẩn lạc thuộc chủng khơng có vùng kết tủa bao quanh Các khuẩn lạc cần thử khẳng định Nếu 1,0 ml dịch cấy dàn khắp ba đĩa [xem (2)], xử lý đĩa qui trình đếm khẳng định 3.3.4 Khẳng định 3.3.4.1 Chọn lọc khuẩn lạc để khẳng định Từ đĩa chọn theo 3.2.3, lấy năm khuẩn lạc giả định Nếu đĩa có năm khuẩn lạc, lấy tất khuẩn lạc giả định có mặt Khẳng định khuẩn lạc theo qui định 3.2.4.1 3.2.4.2 Nếu đĩa, khuẩn lạc mọc dày khơng thể chọn khuẩn lạc phân lập tốt, cấy ria năm khuẩn lạc giả định lên đĩa đựng mơi trường hồn chỉnh Để từ 18 h đến 24 h tủ ấm 300C Chọn đĩa khuẩn lạc có màu hồng phân lập tốt Khẳng định khuẩn lạc qui định 3.2.4.1 3.2.4.2 3.3.4.2 Thử hồng cầu thạch huyết cừu Cấy ria, cấy đâm sâu chấm khuẩn lạc chọn (3.2.4) lên mặt thạch huyết cừu theo cách cho thể tốt phản ứng hồng cầu Ủ 300C 24 h ± h giải thích phản ứng hồng cầu 15 3.3.4.3 Giải thích phản ứng sinh hóa Phép thử Kết khẳng định Bacillus Thạch Cách tiến hành cereus Chúng có màu hồng đỏ Kết thể sau MYP thẫm có quầng kết tủa bao ni cấy B.Cereus thành quanh (phản ứng lịng đỏ công Thử hồng trứng) rộng đến mm Phản ứng dương tính a Khẳng định B.Cereus cầu mơi trường thạch huyết cừu phản ứng Haemolysin (ủ 300C vòng 24h) a độ rộng vùng hồng cầu thay đổi 3.4 Tính tốn kết 3.4.1.1 Cơng thức tính số khuẩn lạc: ❑ X= C R ∑ (CFU/g hay CFU/ml) ❑ ❑ *Trong đó: ∑C tổng số khuẩn lạc hai đĩa petri có độ pha loãng liên tiếp VD 10−1, 10−2 n1,n2 số hộp petri hai độ pha loãng liên tiếp chọn V thể tích mẫu đưa vào đĩa, đơn vị ml d độ pha loãng tương ứng với n1 (độ pha loãng nhỏ hơn) R tỉ lệ khẳng định dương tính 3.4.1.2 Giới hạn cho phép Bảng 11 giới hạn cho phép B.cereus sản phẩm ST T SẢN PHẨM GIỚI HẠN (trong 1g 1ml sản phẩm ) 102 Sữa dạng bột 16 Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ : bột, miến, mỳ sợi ( có xử lý nhiệt trước sử dụng ) 102 Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ : bột, miến, mỳ sợi ( dùng trực tiếp, không xử lý nhiệt trước sử dụng ) 10 Rau muối, rau khô 102 Thức ăn khô thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay đặc biệt ( phải xử lí nhiệt trước sử dụng ) 102 Thức ăn khô thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay đặc biệt ( dùng trực tiếp, không xử lý nhiệt trước sử dụng ) 10 3.4.1.3 Biểu thị kết quả: Đối với độ pha lỗng mơi trường tăng sinh lỏng chọn lọc cấy, ghi lại số lượng ống nghiệm có mặt Bacillus cereus giả định khẳng định Chỉ rõ ống ống dương tính Chọn đĩa có từ 15 đến 300 khuẩn lạc đậm độ pha lỗng liên tiếp để tính kết Nếu chênh lệch giá trị đậm độ nhỏ lần 17