Định lượng bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Trang 8 Hình 5 Khi đếm khuẩn lạc sẽ đếm những khuẩn lạc rờiƯu điểm :Cho phép xác định số tế bào sống Định lượng chọn lọc được vsvNhược điểm :Độ chính xác của việc tính mật độ vi khuẩn từ

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 2

1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus cereus 2

1.1 Đặc điểm 2

1.2 Nguồn thu nhập B cereus 2

1.3 B cereus trong thực phẩm và trong các ngành khác 3

1.3.1 Tác hại của B cereus: 3

1.3.2 Vai trò của B cereus trong nuôi trồng hải sản: 4

2 Phương pháp đếm khuẩn lạc 4

2.1 Định nghĩa phương pháp: 4

2.2 Phương pháp thực hiện 5

2.2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc thủ công: 5

2.2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc tự động: 6

2.3 Phương pháp có thể áp dụng cho những loại vsv : 6

3 Định lượng B cereus bằng phương pháp đếm KI: 7

3.1 Môi trường và hóa chất: 7

3.1.1 Môi trường MYP: 7

3.1.2 Chuẩn bị các đĩa thạch: 10

3.1.3 Thạch huyết cừu: 11

3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: 12

3.3 Quy trình thực hiện: 14

3.3.1 Sơ đồ thực hiện: 14

3.3.2 Giải thích quy trình 15

3.3.3 Đếm khuẩn lạc và khẳng định 16

3.3.4 Khẳng định 17

3.4 Tính toán kết quả 18

KẾT LUẬN 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO 21

MỞ ĐẦU

Ngay cả khi có Pháp lệnh về thực phẩm, hàng năm nước ta vẫn ghi nhận đượchàng vạn ca mắc bệnh truyền qua đường thực phẩm Đó là một vấn đề cấp thiết của

xã hội cần được quan tâm nhiều hơn nữa

Nguyên nhân chính của việc ngộ độc thực phẩm là do ý thứccủa con người cònquá kém và thực phẩm được sử dụng không an toàn Vi khuẩn là nguồn gây bệnhchính qua con đường thực phẩm (các vi sinh vật gây bệnh) mà cơ quan thuốc vàthực phẩm Mỹ khuyến cáo dân chúng về tác hại, cách phát hiện, cơ chế lây nhiễm

và cách đề phòng Một trong số những loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm đó là

Bacillus cereus Là một vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử Bacillus cereus có thể làm người bị ngộ độc ói mửa tiêu chảy và trường hợp nặng hơn có thể gây tử vong Bất cứ ai cũng có nguy cơ lây nhiễm Bacillus cereus Thực phẩm nhiễm Bacillus cereus là rất phổ biến Người ăn phải thực phẩm này thường

mắc hai bệnh điển hình là tiêu chảy và nôn mửa

Dạng ngộ độc gây tiêu chảy bị gây ra bởi loại vi khuẩn Bacillus cereus có cấu

trúc phân tử protein lớn Loại vi khuẩn này rất dễ dính lên các nhóm thực phẩm nhưthịt, sữa, rau và cá Triệu chứng chính của loại ngộ độc này là đại tiện ra nước và cơbụng bị chuột rút khoảng sau 615 tiếng kể từ lúc ăn phải Triệu chứng này kéo dàikhoảng 24 tiếng Nôn mửa cũng có thể đi kèm nhưng thường hiếm gặp đối với loại

ngộ độc gây tiêu chảy bởi Bacillus cereus trọng lượng phân tử lớn Vì vậy chúng ta cần định lượng để phát hiện, kiểm xoát và loại bỏ B cereus.

Đối tượng nghiên cứu là Bacillus cereus

Hình thức nghiên cứu : định lượng

Phương pháp nghiên cứu : Phương pháp đếm khuẩn lạc.

B cereus phát triển trong khoảng từ 10 đến 50 ° C, với nhiệt độ tối đa từ 30

đến 40 ° C Tuy nhiên, các chủng chịu lạnh cũng có thể nhân bản ở nhiệt độ từ 4đến 6 ° C; trong những trường hợp này, thời gian nhân bản thường dài hơn đáng kể

Dưới độ pH 4,8, các dòng B cereus không thể nhân bản được Tuy nhiên, sự

dung nạp axit giữa các chủng thay đổi đáng kể Giá trị giá trị aw (sinh sôi trongnước) tối thiểu cho phép nhân bản là xấp xỉ 0,92

Hình 1 Cấu tạo B cereus 1.2 Nguồn thu nhập B cereus

Nhiều loại thực phẩm được coi là môi trường lý tường của B cereus Chúngbao gồm cơm luộc hoặc cơm chiên, nấu chín; rau và thịt; mì ống; sốt vani; sữatrứng, thịt hầm, bánh ngọt, xà lách, súp, kem và các loại thảo mộc và gia vị

1.3 B cereus trong thực phẩm và trong các ngành khác

1.3.1 Tác hại của B cereus:

Hình B cereus được và hội chứng cơm chiên

chảy Trong một số ít trường hợp, cả hai loại triệu chứng đều được ghi nhận, có thể

là do sản sinh cả hai loại độc tố

PGS Nguyễn Duy Thịnh đặc biệt nhấn mạnh, trong gạo có thể có Bacilluscereus Bào tử này sẽ chết ở nhiệt độ cao Tuy nhiên, nếu bạn bảo quản cơm nguội

ở nhiệt độ phòng bình thường sẽ tạo điều kiện cho bào tử và các vi khuẩn sinh sôi

và phát triển Khi nhiễm khuẩn, cơm nguội có thể gây rối loạn tiêu hóa; nặng thìngộ độc cấp; nhẹ thì rối loạn tiêu hóa “Người ăn phải cơm có chứa vi khuẩnBacillus cereus có thể buồn nôn và nôn hoặc tiêu chảy sau khoảng từ 1 đến 5 tiếng.Phần lớn các triệu chứng ở mức độ tương đối nhẹ và thường kéo dài trong khoảng

24 tiếng”

Hình 3 Các triệu chứng của B cereus

1.3.2 Vai trò của B cereus trong nuôi trồng hải sản:

B cereus mạnh về khả năng phân giải protein, tinh bột, cellulose… góp phần

làm sạch đáy ao, giúp tiêu hóa thức ăn Với nhiều nghiên cứu cho thấy số lượng vikhuẩn hữu ích là nhân tố duy nhất thúc đẩy làm tăng hiệu quả xử lý và tăng trọng

và tỉ lệ sống của tôm nuôi

Hình 4 Men vi sinh xử lí đáy ao tôm hiệu quả

2 Phương pháp đếm khuẩn lạc.

2.1 Định nghĩa phương pháp:

Khuẩn lạc là một “tập đoàn” vi khuẩn, một sinh khối của vi khuẩn phát triển trên bề mặt của một giá thể cứng Trong trường hợp khuẩn lạc phát triển từ 1 tế bào gốc duy nhất, thì bộ gen của chúng đều giống nhau y hệt, và chúng được gọi là một dòng.

Phương pháp đếm khuẩn lạc: Một trong những cách cổ điển để xác định mật độ vi sinh vật trong một mẫu là pha loãng mẫu, cấy lên đĩa thạch và sau đó đếm các khuẩn lạc mọc trên đó Vi khuẩn được cấy trên đĩa phát triển hình thành các khuẩn lạc từ một hoặc một số vi khuẩn ban đầu

Hình 5 Khi đếm khuẩn lạc sẽ đếm những khuẩn lạc rời

petri lên một lưới ô và đếm các khuẩn

lạc trong mỗi ô Nhìn chung, bạn sẽ cần

đếm ít nhất ba đĩa; chỉ khi sử dụng đĩa

chứa 30 tới 300 khuẩn lạc để giúp đưa

ra kết luận tin cậy Các đĩa mà quá

nhiều hoặc quá ít khuẩn lạc đều không

thích hợp và cần pha loãng và cấy lại

mẫu

H

2.2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc tự động:

Máy đếm khuẩn sẽ chụp một ảnh của đĩa, tách các khuẩn lạc khỏi nền và sau đó

sử dụng một thuật toán để đếm các khuẩn lạc trên đĩa Thuật toán có thể gặp có khăn trong việc phân biệt các khuẩn lạc khi hai hoặc nhiều khuẩn lạc chồng lấn ở vùng rìa, đây là một lĩnh vực của sự phát triển phần mềm hiện tại

2.3 Phương pháp có thể áp dụng cho những loại vsv :

Thường dùng cho mẫu thử nghiệm dạng rắn (thực phẩm, nguyên liệu thực phẩm…)

Dùng cho mẫu thử nghiệm ở dạng dung dịch như mẫu nước nuôi trồng thủy sản, nước trái cây…

3 Định lượng B cereus bằng phương pháp đếm KI:

3.1 Môi trường và hóa chất:

H

SPW dùng để pha loãng mẫu thử

Môi trường thạch MYP ( Mannitol-Egg

Yolk- Polymixin)

là môi trường chính cho việc nuối cấy

B.cereus

Thạch huyết cừu thử hồng cầu xác định phản ứng

Hóa chất phụ : NaCl, HCl Điều chỉnh pH

Bảng 1 Môi trường và hóa chất nuôi cấy B.cereus

Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng

Phenol đỏ Làm chất chỉ thị pH

Egg Yolk Lòng đỏ trứng có chứa lecithin,lecithin tạo vòng kết tủa

bằng enzyme Bacillus cereus xung quang khuẩn lạc.

Polymyxin B Ức chế sự phát triển vi khuẩn.

Bảng 2 Môi trường MYP 3.1.1.1 Môi trường cơ bản:

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng,

pH của môi trường hoàn chỉnh(1.2.4) đạt 7,2 ± 0,2 ở 25 0C, nếucần

Phân phối các lượng 90 ml môitrường vào các bình cầu dung tíchthích hợp

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áplực ở 121 0C

a : tùy vào sức sống của thạch

Bảng 3 Cách chuẩn bị môi trường cơ bản của MYP 3.1.1.2 Dung dịch polymyxin B:

và thêm bốn phần theo thể tích nước

vô trùng Chuyển một cách vô trùngsang bình cầu vô trùng và khuấymạnh

Đun nóng hỗn hợp 2 h trong nồi cáchthủy để ở 44 0C đến 47 0C Sau đó đểyên 18 h đến 24 h ở 5 0C ± 3 0C để tạokết tủa

Bằng cách vô trùng thu lấy nhũ tươngphía trên

Dung dịch nhũ tương này có thể bảoquản đến 72 h ở 5 0C ± 3 0C

Bảng 5 Cách chuẩn bị dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng

3.1.1.2.2 Môi trường hoàn chỉnh (thạch MYP):

Môi trường cơ bản (1.1.1)

Cho các dung dịch còn lại vào, trộn

kỹ sau mỗi lần thêm

Làm nguội môi trường hoàn chỉnhtrong nồi cách thủy để ở 44 0C đến

47 0C

Tạo môi trường kỵ khí

Peptone Cung cấp nitơ, vitamin và các yếu tố tăng trưởng

Thạch huyết cừu bao gồm

Môi trường

Cao nấm men Cung cấp vitamin, tạo điều kiện cho việc nuôi

dưỡng các vi sinh vật kỵ khí

Bảng 6 Thạch huyết cừu.

3.1.3.1 Môi trường cơ bản:

Pepton proteoza hoặc pepton

Sản phẩm thủy phân gan

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng

là 7,0 ± 0,2 ở 25 0C, nếu cần

Phân phối vào các bình cầu và khửtrùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở

121 0C

a) Tùy thuộc vào sức đông của thạch

Bảng 7 Cách chuẩn bị môi trường cơ bản của Thạch huyết cừu.

3.1.3.2 Môi trường hoàn chỉnh:

Môi trường cơ bản

Huyết cừu đã khử sợi huyết

Sau khi làm nguội đến nhiệt độ từ

44 0C đến 47 0C, bổ sung huyết cừu

đã khử sợi huyết vào môi trường cơbản Trộn đều

Rót các phần ít nhất 12 ml môitrường hoàn chỉnh sang các đĩa Petri

và để cho đông đặc

Bảng 8 Môi trường hoàn chỉnh.

3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm:

Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy)

hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp

lực)

Khử trùng môi trường nuôi cấy, Thiết

bị quy định cho phép nhiệt độ trongbuồng được duy trì trong vòng ± 3 °C

của nhiệt độ đích (để tính đến độkhông đảm bảo đo kết hợp với cặpnhiệt đo)

Tủ sấy hoặc tủ ấm, Được thông gió đối lưu, để làm khô

các đĩa thạch, có khả năng hoạt động

Pipet chia vạch, Được hiệu chuẩn chỉ dùng cho vi

khuẩn học, có dung tích danh định 10

ml và 1 ml, được chia vạch 0,5 ml và 0,1 ml tương ứng và có lỗ xả với đường kính danh định từ 2 mm đến 3 mm

Dụng cụ dàn mẫu (dạng que gạt) Que bằng thủy tinh hoặc bằng chất

dẻo có đường kính khoảng 3,5 mm vàdài 20 cm, một đầu được uốn thành góc vuông với đoạn dài khoảng 3 cm; các đầu được làm nhẵn bằng nhiệt

nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này Xem tiêu chuẩn riêng

bên liên quan tự thỏa thuận với nhau

3.3.2.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng liên quan tới sản phẩm.Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong 10ml đối với mẫu lỏng, sai sốcho phép ± 5 %, cho vào túi nhựa vô trùng

Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5 %) vô trùng vào túinhựa (bình tam giác) chứa mẫu

Pha loãng mẫu

Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung

dịch pha loãng

3.3.2.2 Pha loãng mẫu

Hút 1ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãngSPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp

Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 -10s để thu được dung dịch pha loãng 10-2 (độpha loãng thích hợp để nuôi cấy) Nếu cần, có thể lặp lại thao tác trên để có đượcdung dịch pha loãng 10-3, 10-4,… cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp

Để định lượng các bào tử Bacililus cereus giả định, cần làm nóng dung dịchpha loãng ban đầu ở 800C trong 10 phút trên nồi cách thủy sau đó tiến hành cấy

3.3.2.3 Cấy và ủ

Lấy hai đĩa thạch (5.2.5), dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 0,1 ml mẫu thửnếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác.Lặp lại qui trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần

Đối với một số sản phẩm nhất định, tốt nhất để ước tính B cereus với số lượng

nhỏ, là tăng các giới hạn phát hiện lên 10 lần bằng cách kiểm tra 1,0 ml mẫu thửnếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc 1,0 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ởdạng khác Phân phối 1 ml dịch cấy lên bề mặt của đĩa Petri lớn (140 mm) hoặc lênkhắp bề mặt của ba đĩa nhỏ (90 mm) sử dụng dụng cụ dàn mẫu vô trùng trong cảhai trường hợp, chuẩn bị cho phép xác định kép sử dụng hai đĩa lớn hoặc sáu đĩanhỏ (2)

Cẩn thận dùng que dàn mẫu dàn đều dịch cấy trên khắp bề mặt đĩa thạch càngnhanh càng tốt mà không chạm vào các mép đĩa Sử dụng một que dàn mẫu vôtrùng cho mỗi đĩa Để các đĩa có đậy nắp khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng để chấtcấy bám vào thạch

Lật úp các đĩa đã chuẩn bị và để 18 h đến 24 h trong tủ ấm ở 300C Nếu khôngthể nhìn thấy rõ các khuẩn lạc thì ủ các đĩa thêm 24 h trước khi đếm

3.3.3 Đếm khuẩn lạc và khẳng định

Sau giai đoạn ủ, chọn các đĩa, tốt nhất là ở hai độ pha loãng liên tiếp, có ít hơn

150 khuẩn lạc

Đếm các khuẩn lạc B cereus giả định trên mỗi đĩa Các khuẩn lạc giả định là

các khuẩn lạc lớn, màu hồng (cho thấy không lên men mannitol, xem chú thích 1)

và thường được bao quanh bởi một vùng kết tủa (cho thấy hình thành lexitinasexem chú thích 2)

Nếu có ít hơn 15 khuẩn lạc đặc trưng trên các đĩa được cấy sản phẩm ở dạnglỏng hoặc các sản phẩm ở dạng khác ở độ pha loãng thấp nhất, thì có thể lấy sốđếm ước tính như mô tả trong điều 10

CHÚ THÍCH 1: Nếu các đĩa chứa nhiều vi sinh vật lên men mannitol dẫn đến

sinh axit, thì màu hồng đặc trưng của khuẩn lạc B cereus có thể bị nhạt đi hoặc

biến mất hoàn toàn

CHÚ THÍCH 2: Một số chủng B cereus chỉ sinh ít hoặc không sinh lexitinase.

Các khuẩn lạc thuộc các chủng này sẽ không có vùng kết tủa bao quanh Các khuẩnlạc này cũng cần được thử khẳng định

Nếu 1,0 ml dịch cấy được dàn trên khắp ba đĩa [xem (2)], thì xử lý các đĩa nàynhư nhau ở các qui trình đếm và khẳng định

3.3.4 Khẳng định

3.3.4.1 Chọn và lọc khuẩn lạc để khẳng định

Từ mỗi đĩa đã chọn theo 3.2.3, lấy năm khuẩn lạc giả định Nếu trên đĩa có íthơn năm khuẩn lạc, thì lấy tất cả các khuẩn lạc giả định có mặt Khẳng định cáckhuẩn lạc này theo qui định trong 3.2.4.1 và 3.2.4.2

Nếu trên các đĩa, khuẩn lạc mọc quá dày và không thể chọn các khuẩn lạc phânlập tốt, thì cấy ria năm khuẩn lạc giả định lên các đĩa đựng môi trường hoàn chỉnh

Để từ 18 h đến 24 h trong tủ ấm ở 300C

Chọn trên mỗi đĩa ít nhất một khuẩn lạc có màu hồng phân lập tốt Khẳng địnhkhuẩn lạc này như qui định trong 3.2.4.1 và 3.2.4.2

3.3.4.2 Thử hồng cầu trên thạch huyết cừu

Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn (3.2.4) lên mặt thạchhuyết cừu theo cách sao cho thể hiện được tốt phản ứng hồng cầu

Ủ ở 300C trong 24 h ± 2 h và giải thích phản ứng hồng cầu

3.3.4.3 Giải thích phản ứng sinh hóa

Kết quả được thể hiện sau khi

được nuôi cấy B.Cereus thành

công

Thử hồng

cầu

Phản ứng dương tính a Khẳng định B.Cereus trên môi

trường thạch huyết cừu bằng phản ứng Haemolysin (ủ trong 30 0 C trong vòng 24h)

a độ rộng của vùng hồng cầu có thể thay đổi

∑C là tổng số khuẩn lạc trên hai đĩa petri có độ pha loãng liên tiếp VD 10 −1 , 10 −2

n 1 ,n 2 là số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn.

V là thể tích mẫu được đưa vào mỗi đĩa, đơn vị ml.

d là độ pha loãng tương ứng với n 1 (độ pha loãng nhỏ hơn).

2 Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu

đỗ : bột, miến, mỳ sợi ( có xử lý nhiệt trước

khi sử dụng )

102

3 Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu

đỗ : bột, miến, mỳ sợi ( dùng trực tiếp, không

quá xử lý nhiệt trước khi sử dụng )

10

5 Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ

em, thức ăn thay thế đặc biệt ( phải xử lí

nhiệt trước khi sử dụng )

102

6 Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ

em, thức ăn thay thế đặc biệt ( dùng trực tiếp,

không quá xử lý nhiệt trước khi sử dụng )

10

3.4.1.3 Biểu thị kết quả:

Đối với độ pha loãng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc đã được cấy, ghi lại

số lượng ống nghiệm có mặt Bacillus cereus giả định đã được khẳng định.

Chỉ ra rõ các ống này là các ống dương tính

Chọn những đĩa có từ 15 đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp

để tính kết quả Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần