Định lượng enterobacteriaceae bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Trang 1 KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMTIỂU LUẬN HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨMTÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠCGVHD: Nhóm: 1 Trang 2 KHOA CÔNG NG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

GVHD:

Nhóm: 1

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi cam đoan rằng báo cáo bài tiểu luận này là do chính chúng tôi thực hiện dưới

sự hướng dẫn của cô Đinh Thị Hải Thuận Các số liệu và kết quả phân tích trong báo cáo

là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào

TP.HCM, tháng 10 năm 2022

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bài tiểu luận này, trước hết chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đếnquý thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại học Công nghiệp thựcphẩm Tp Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho chúng emtrong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường

Trong quá trình thực hiện đề tài chúng em đã gặp không ít khó khăn Nhưng với sự độngviên giúp đỡ của quý thầy cô, người thân và bạn bè, chúng em cũng đã hoàn thành tốt đềtài nghiên cứu của mình và có được những kinh nghiệm, kiến thức hữu ích cho bản thân.Đặc biệt chúng em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đinh Thị Hải Thuận, người đã trựctiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ chúng em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Dù đã cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những sai sót Rất mong sự thông cảm vàđóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn để bài tiểu luận được hoàn thiện

Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô và các bạn sức khỏe, luôn thành công trong côngviệc và cuộc sống

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

TP HỒ CHÍ MINH, Tháng 10, 2022

MỤC LỤC

1 MỞ ĐẦU

1.1 Lý do chọn đề tài

Tình trạng kháng kháng sinh tại các cơ sở y tế đang gia tăng một cách đáng báo độngtrong những năm gần đây Ths Nguyễn Quốc Thái, Phó trưởng phòng Truyền nhiễm Cấp

cứu (Trung tâm Bệnh Nhiệt đới) đã đề cập đến Enterobacteriaceae, một họ vi khuẩn

trong các vi khuẩn gây kháng sinh phổ biến trong cộng đồng và bệnh viện Chúng có mặtchủ yếu ở đường tiêu hoá dưới, ngoài ra có trong đường sinh dục, tiết niệu và cả họngmiệng Tuy nhiên, vi khuẩn này có thể gây bệnh ở bất kỳ cơ quan nào của cơ thể, gâynhiễm khuẩn cả trong cộng đồng và trong môi trường bệnh viện Một số vi khuẩn hay

gặp và quan trọng trên lâm sàng như Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae….Những trường hợp người bệnh dễ mắc nhiễm khuẩn gây ra bởi họ vi

khuẩn này bao gồm người bệnh ghép tuỷ, suy gan, ghép tạng, đái tháo đường, bệnh phổi,thận nhân tạo chu kỳ, nhiễm HIV, đang điều trị thuốc corticoid… Các mầm bệnh gây lâynhiễm có thể có trong dịch truyền, ống thông (catheter) và các dụng cụ y tế khác Qua

đó, cho thấy sự nguy hiểm của vi khuẩn Enterobacteriaceae đối với con người chúng tanên nhóm em muốn tìm hiểu thêm về Enterobacteriaceae để giúp chúng em hiểu vềnguyên tắc, môi trường và hóa chất, định lượng được nó Đó là lý do nhóm em chọn đềtài định lượng Enterobacteriaceae

1.2 Mục tiêu của đề tài

Biết cách tiến hành định lượng Enterobacriaceae

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiêm cứu

Đối tượng nghiêm cứu: vi khuẩn Enterobacriaceae

Phạm vi nghiêm cứu: định lượng Enterobacriaceae trong các sản phẩm thực phẩm, thức

ăn chăn nuôi, các mẫu môi trường trong khu khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm

1.4 Phương pháp nghiên cứu chính

Phương pháp phân tích và tổng hợp lý thuyết: Tìm hiểu và thu thập thông tin qua sách, tàiliệu tham khảo và tổng hợp lại để hoàn chỉnh bài làm.

Phương pháp so sánh-đối chiếu: Nhóm tác giả đã đưa các nội dung nghiên cứu từ nhiềunguồn tài liệu tham khảo khác nhau liên quan đến vấn đề đang chứng minh, nhằm giúpcho bài luận thêm hấp dẫn và xây dựng nên cơ sở lý thuyết vững chắc cho vấn đề đangbàn luận

1.5 Ý nghĩa thực hiện của đề tài này

Giúp hiểu biết thêm một loại vi khuẩn Enterobacriaceae ( vi khuẩn đường ruột )

2 Tổng Quan Enterobacteriaceae

hình 1: Vi khuẩn Enterobacteriaceae

2.1 Nơi cư trú

Các vi khuẩn đường ruột thường sống ở ống tiêu hóa của người và động vật, có thể gâybệnh hoặc không gây bệnh Ngoài ra chúng có thể sống ở ngoại cảnh (đất, nước) và trongthức ăn

2.2 Hình thể

Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn gram âm, không sinh nha

bào Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi khuẩn

khác di động nhờ có lông ở xung quanh thân tế bào Một số giống có vỏ nhìn thấy được

nhờ kính hiển vi thường như Klebsiella.

Các khuẩn lạc của các vi khuẩn có vỏ như Klebsiella là khuẩn lạc nhầy, lớn hơn khuẩn

lạc dạng S và có xu hướng hòa lẫn vào nhau

Nghiên cứu các tính chất sinh vật hóa học giúp cho việc định loại vi khuẩn

2.4 Tính chất sinh vật hóa học

Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae lên men glucose, có sinh hơi hoặc không sinhhơi, oxidase âm tính, catalase dương tính, khử nitrate thành nitrite Lên men hoặc khônglên men một số đường (ví dụ lactose) Có hay không có một số enzyme như urease,

tryptophanase Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có

lưu huỳnh

2.5 Phân loại Có nhiều cách phân loại họ Enterobacteriaceae Theo cách phân loại của Bergey’s Manual (1984) chia Enterobacteriaceae làm 13 giống chính như sau: Các giống : I.Escherichia II.Shigella

III.Edwardsiella IV.Citrobacter

V.Salmonella VI.Klebsiella

VII.Enterobacter VIII.Serratia

IX.Proteus X.Providencia

XI.Morganella XII.Yersinia

XIII.Erwinia

Trong các giống kể trên thì các giống vi khuẩn có ý nghĩa y học nhất

là : Escherichia; Shigella; Salmonella; Klebsiella; Enterobacter; Proteus; Yersinia; còn

các giống khác ít ý nghĩa

3 Định lượng Enterobacteriaceae bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

3.1 Phạm vi áp dụng

Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae được tham chiếu theo TCVN 5518 – 2:2007ISO 21528 – 2:2004 dùng để định lượng Enterobacteriaceae mà không cần phải qua giaiđoạn tiền tăng sinh Phương pháp này có thể áp dụng cho:

- Các sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm

Việc định lượng được thực hiện bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường đặcsau khi ủ ấm ở 37oC (hoặc 30oC)

Khi số lượng khuẩn lạc dự kiến có mặt nhiều hơn 100 trong một mililit hoặc một gammẫu thử, thì nên dùng kỹ thuật này

3.2 Nguyên tắc

3.2.1 Chuẩn bị

- Chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo-Từ mẫu thử chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phântiếp theo

3.2.2 Phân lập

+ Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phùban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác vào hai đĩa petri (dùng kỹ thuật đổ đĩa) chứa thạchglucoza mật đỏ tím Phủ lên trên bằng một lớp môi trường thạch này

+ Chuẩn bị các cặp đĩa thạch khác trong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịchpha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu

+ Ủ các đĩa thạch này ở 37oC (hoặc 30oC) trong 24 h ± 2 h

3.2.4 Tính toán

Tính số lượng Enterobacteriaceae có trong một mililit hoặc trong một gam mẫu thử từ sốlượng khuẩn lạc điển hình đã khẳng định trên mỗi đĩa

Môi trường và hóa chất Mục đích

VRBG (Violet Red Bile Glucose) Nuôi cấy Enterobacteriaceae

Thạch glucoza Khẳng định EnterobacteriaceaseThuốc thử oxidase

3.4 Quy trình phân tích

Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giây

Pha loãng

(VRBG đã đun chảy và làm nguội đến 47℃)

Khẳng định sinh hóa thạch glucoza và oxidase

VRBG

Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật ngược

đĩa và ủ ở tủ ấm trong 24 giờ

Đọc kết quả Chọn các đĩa mọc khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả

3.5 Các bước tiến hành

Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lỏngcủa phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vô trùng (bìnhtam giác)

Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa(bình tam giác) chứa mẫu

Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đềubình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2-3 phút

Bước 2 Pha loãng mẫu

Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một ốngnghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp

Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2 (đối vớicác loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1) Nếu cần, lặplại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, cho đến khi thu đượclượng vi khuẩn thích hợp

Bước 3 Cấy và ủ mẫu

Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu đối vớisản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri Lặp lại qui trình với các dung dịch phaloãng thập phân tiếp theo, nếu cần Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2đĩa petri Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường VRBG, trộn đều bằng cách xoay nhẹ từng

đĩa Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10ml của cùng loại môitrường VRBG Để cho đông đặc lại Lật úp đĩa và ủ ở 37°C trong 24 giờ.

Bước 4 Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy Các khuẩn lạc đặc trưng cómàu hồng đến màu đỏ hoặc đỏ tía (có hoặc không có quầng tủa) trên môi trường VRBG.Đếm các khuẩn lạc Enterobacteriaceae trên những đĩa có số đếm phù hợp

Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy ria lên môi trường dinh dưỡng để thử khẳng định, ủ cácđĩa này ở 370C trong 24 giờ Sau 24 giờ nuôi cấy thực hiện các phép thử khẳng định sau:

- Phản ứng oxidase: dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh, lấy một phần sinh khối trênmôi trường dinh dưỡng và cấy ria lên giấy lọc đã được tẩm thuốc thử oxidase hoặc lêncác đĩa bán sẵn Không dùng que cấy bằng niken/crom Phép thử được coi là âm tính khimàu của giấy lọc không chuyển sang màu sẫm trong vòng 10s Cần theo hướng dẫn củanhà sản xuất khi sử dụng đĩa có bán sẵn

- Lên men glucoza: dùng que cấy lấy cùng một loại sinh khối đã được chọn trongphép thử oxidase, cấy đâm sâu vào các ống chứa thạch glucoza, ủ ở 370C trong 24 giờ.Nếu màu vàng lan rộng khắp ống thạch thì phản ứng được coi là dương tính

C1,2,4: Số khuẩn lạc Enterobacteriaceae đếm được tương ứng trên 4 đĩa cđộ pha loãngliên tiếp

V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit

n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại

n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại

d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại

R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp

4 Kết luận

Họ vi khuẩn Enterobacteriaceae là loại vi khuẩn phổ biến nhất ảnh hưởng đến ngành thựcphẩm Vi khuẩn trong nhóm này được phát hiện và đếm bằng các xét nghiệm và phân tíchthông thường được thực hiện trong phòng thí nghiệm Trong bối cảnh này, Số lượng vikhuẩn enterobacteriaceae là một nghiên cứu ngày càng quan trọng cho thấy chất lượngthực phẩm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Giáo trình phân tích vi sinh Khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Công

nghiệp Thực phẩm TP.HCM, 2002

[2] TCVN: 5518-2:2007 (ISO 21528-1:2004) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phương pháp phát hiện và định lượng Enterobactericeae-Phần 2: Ktx thuật đếm khuẩn lạc

CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM

Câu 1: Theo cách phân loại của bergey’s manual (1984) chia Enterobacteriaceae làm bao nhiếu giống chính?

A 11

B 12

C 13

D 14

Câu 2: chọn câu đúng nơi cư trú của enterobacteriaceae ?

A Ống tiêu hóa ở người và động vật

B Đất, nước

C Thức ăn

D Tất cả A B C đều đúng

Câu 3: Chọn câu phát biểu sai?

A Các vi khuẩn Enterobacteriaceae đều di chuyển được

B Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn gram âm, không sinh nha bào

C Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi khuẩn

khác di động nhờ có lông ở xung quanh thân tế bào

D Một số giống có vỏ nhìn thấy được nhờ kính hiển vi thường như Klebsiella.

Câu 4: các giống vi khuẩn họ Enterobacteriaceae có ý nghĩa y học nhất là?

A Escherichia

B Shigella

C Salmonella

D tất cả các đáp án trên

Câu 5: Vi khuẩn đường ruột là vi khuẩn?

A hiếu khí

B kỵ khí tùy tiện

C kỵ khí bắt buộc

D hiếu khí kỵ khí tùy tiện

Câu 6: Điền vào chỗ trống: Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae lên men glucose,

có sinh hơi hoặc không sinh hơi, oxidase … tính, catalase … tính, khử … thành nitrite

A Dương; âm; nitrate

B Âm; dương; nitrate

C Âm; dương; nitrite

D Dương; âm; nitrite

Phạm vi áp dụng của phương pháp định lượng Enterobacteriaceae?

A E.coli, Shigella, Proteus,Salmonella,V.cholerae.

B Liên cầu ruột, Shigella, Klebsiella, Yersinia.

C E.coli, Shigella, Salmonella, Klebsiella ,Yersinia pestis.

D Shigella, Klebsiella E.coli, Pseudomonas.

E Salmonella, Shigella, E.coli, Proteus, Brucella.

Những chủng thuộc họ Enterobacteriaceae có tính chất di động thì?

Có nhiều lông ở xung quanh thân tế bào vi khuẩn

Có một chùm lông ở một đầu tế bào vi khuẩn

Có lông ở 2 đầu tế bào vi khuẩn

Có một lông ở một đầu tế bào vi khuẩn

Trong định lượng Enterobacteriaceae,phép thử phản ứng oxidase xuất hiện màu gì thì

phản ứng được khẳng định là âm tính?

Màu của giấy lọc khổng chuyển sang màu sẫm trong vòng 10s

Màu của giấy lọc chuyển sang màu sẫm trong vòng 10s

Màu của giấy lọc giữ nguyên màu sẫm trong vòng 10s

Màu của giấy lọc chuyển sang màu đỏ tía trong vòng 10s

Khẳng định Enterobacteriaceae bằng môi trường và hóa chất gì?

Thạch glucoza và thuốc thử oxidase

Blood agar base

Arginine dehydrolase

Cả 3 môi trường trên

Câu 13: Mục đích của môi trường SPW là:

Cao nấm men, dịch thủy phân mô động vật bằng enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri Clorua

Cao nấm men, dịch thủy phân mô động vật bằng enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri Clorua, đỏ trung tính

Cao nấm men, dịch thủy phân mô động vật bằng enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri Clorua, đỏ trung tính, tím tinh thể(crystal violet)

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzyme, muối mật No.3, glucoza, Natri Clorua, đỏ trung tính

Câu 15: Mục đích của NA/TSA:

Pha loãng mẫu

Khẳng định

Nuôi cấy

Phục hồi

Câu 16: Mục đích thạch glucoza và oxidaza:

A.Pha loãng mẫu

Sắp xếp quy trình định lượng Enterobacteriaceae theo đúng thứ tự?

1/Cấy và ủ mẫu 2/Pha loãng mẫu 3/Khẳng định Enterobacteriaceae

4/Tính kết quả 5/Chuẩn bị mẫu 6/Đếm và chọn các khuẩn lạc

Trong phép thử khẳng định Enterobacteriaceae thì phản ứng lên men glucoza dương tính cho màu gì?

Âm tính oxidase, dương tính glucoza

Dương tính oxidase, âm tính glucoza

Âm tính oxidase và glucoza

Dương tính oxidase và glucoza

Câu 25 Đặc điểm của Enterobacteriaceae ?

A Cầu khuẩn, Gram (-)

A Có màu xanh đến màu vàng, có hoặc không có quầng tủa

B Có màu xanh đến màu vàng

C Có màu hồng đến màu tím hoặc đỏ tía

D Có màu hồng đến màu đỏ hoặc đỏ tía

Câu 27 Nguyên tắc định lượng Enterobacteriaceae

A VSV hình thành khuẩn lạc trên thạch glucoza mật đỏ tím,

phản ứng oxiase âm tính, lên men glucoza

B VSV hình thành khuẩn lạc trên thạch glucoza mật đỏ tím, phản ứng oxiase dương tính, lên men lactose

C VSV hình thành khuẩn lạc trên thạch glucoza mật đỏ tím,

phản ứng oxiase dương tính, lên men glucoza

D VSV hình thành khuẩn lạc trên thạch glucoza mật đỏ tím,

phản ứng oxiase âm tính, lên men lactose

Câu 28 Thứ tự các bước định lượng Enterobacteriaceae bằng phương