Định lượng coliform bằng phương pháp màng lọc

Trang 2 BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINHKHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM----o0o----TÊN ĐỀ TÀIĐịnh Lượng Coliform Bằng Phương Pháp Màng LọcNhóm: 12 GVHD: ĐINH THỊ HẢI THUẬN

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

o0o TIỂU LUẬN HỌC PHẦN ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC

NHÓM: 12

Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

o0o TÊN ĐỀ TÀI

Định Lượng Coliform Bằng Phương Pháp Màng Lọc

Nhóm: 12 GVHD: ĐINH THỊ HẢI THUẬN

Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022

LỜI CAM ĐOAN

Chúng em xin cam đoan đề tài tiểu luận: Định lượng coliform bằng phương

pháp màng lọc do nhóm nghiên cứu và thực hiện.

Chúng em đã kiểm tra dữ liệu theo quy định hiện hành

Kết quả bài làm của đề tài Định lượng coliform bằng phương pháp màng lọc là

trung thực và không sao chép từ bất kỳ bài tập của nhóm khác

Các tài liệu được sử dụng trong tiểu luận có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng

Ký và ghi rõ họ tên

MỤC LỤC

2 Định lượng Coliform bằng phương pháp màng lọc 2

2.3 Môi trường, hóa chất Vai trò thành phần 3

3.1 Công thức tính kết quả, biểu thị kết quả 6

PHẦN MỞ ĐẦU

Coliform được xem là những vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh, bởi vì số lượng của

chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây

bệnh khác trong thực phẩm Các nhà nghiên cứu cho rằng số lượng Coliform trong

thực phẩm càng cao thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất lớn Coliforms phát triển tốt nhất trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm Có những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2℃ và cao đến

50℃ Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 5℃ tuy cũng có tài liệu ghi nhận sự phát triển của chúng ở 3-6℃ Việc định lượng vi khuẩn Coliform là rất cần

thiết

Phương pháp màng lọc hiện vẫn đang không ngừng cải tiến theo nhiều chiều hướng khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng Một trong những ví dụ điển hình cho các hướng cải tiến đó là phương pháp lọc qua màng lưới kỵ nước Về thực chất phương pháp màng lọc là sự kết hợp của hai phương pháp vốn được sử dụng rộng rãi trong công tác kiểm nghiệm vi sinh vật

Vì vậy với để tài “ Định lượng Coliform bằng phương pháp màng lọc” sẽ giúp

chúng ta nghiên cứu và hiểu rõ hơn về phương pháp cũng như là vấn đề trên

PHẦN NỘI DUNG

1.1.Giới thiệu về Coliform

Coliform thuộc họ Enterobacteriaceae, hình que, là một nhóm trực khuẩn gram âm,

không tạo bào tử, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, có khả năng lên men đường lactoza, sinh hơi trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ nuôi cấy thích hợp, thường là các giống Escherichia, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter

Coliform phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm Có những

nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2oC và cao đến 50oC Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 5oC tuy cũng có tài liệu ghi lại sự phát triển của chúng ở 3-6oC

Ngưỡng pH để Coliform có thể phát triển là 4,4-9 E.Coli có thể phát triển trên môi

trường tối thiểu chỉ chứa một nguồn carbon hữu cơ duy nhất (chẳng hạn glucose) và một nguồn nito duy nhất như (NH4)2SO4 cùng với vài loại khoáng khác

Coliform ưa nhiệt (còn gọi là coliform phân): Lên men đường lactoza ở nhiệt độ

44oC, E.Coli thuộc nhóm Coliform ưa nhiệt và là loại Coliform rất bền với phenol

0,085% và sinh indol ở nhiệt độ 42 – 44oC

1.2 Phương pháp màng lọc.

Dùng để đánh giá mức an toàn về vi sinh trong thực phẩm

Bản chất của phương pháp này là tập trung số vi sinh vật trong một mẫu nước có khối lượng khá lớn trên màng lọc khuẩn và định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên một môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm Dựa trên mẫu nước ban đầu và quy ước coi mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một vi khuẩn người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích nước

2 Định lượng Coliform bằng phương pháp màng lọc.

2.1 Phạm vi áp dụng:

- Được quy định theo TCVN 6187-1:2019 (ISO 9308-1:2014)

- Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Escherichia coli (E coli) và vi

khuẩn coliform Phương pháp này sử dụng kỹ thuật lọc màng, sau đó nuôi cấy trên môi trường thạch coliform sinh màu và tính toán số lượng vi sinh vật đích có trong mẫu

thử Vì môi trường thạch phân biệt có độ chọn lọc thấp nên hệ vi sinh vật nền có thể

phát triển gây nhiễm cho số đếm E coli và vi khuẩn coliform, ví dụ: phương pháp này

không thích hợp để áp dụng với mẫu nước bề mặt hoặc nước giếng nông

Tiêu chuẩn này đặc biệt thích hợp cho những loại nước có số lượng tổng vi khuẩn

dưới 100 khuẩn lạc trên môi trường thạch coliform sinh màu (CCA) bao gồm nước

uống đóng chai, nước bể bơi khử khuẩn hoặc nước đã qua xử lý làm nước uống

Một vài chủng E coli âm tính với -D-glucuronidase, như Escherichia coli O157, sẽ không phát hiện được là E coli Vì chúng có enzym -D-galactosidase dương tính nên sẽ giống như vi khuẩn coliform

2.2 Thiết bị và dụng cụ.

- Thiết bị hấp tiệt trùng

- Tủ ấm

- Máy đó pH

- Thiết bị lọc màng

- Màng lọc

- Kẹp gắp

2.3 Môi trường, hóa chất Vai trò thành phần.

2.3.1 Môi trường và hóa chất

Môi trường Lactose TTC Agar

Nuôi cấy Coliform

Thuốc thử oxidase

2.3.2 Thành phần

- Môi trường Lactose TTC Agar

Thành phần hóa chất Hàm lượng hóa chất (g)

Peptone 10

2.3.3 Vai trò từng thành phần

Peptone, Canh thịt và cao nấm mem nhằm cung cấp các thành phần dinh dưỡng như: nitơ, các hợp chất cacbon, vitamin và axit amin

Sodium heptadecyl sulfat (Tergitol 7) giúp ức chế hầu hết các vi khuẩn gram dương Bromothymol xanh là một chỉ thị thể hiển độ pH và tạo màu

Thạc Agar dùng tạo khuôn

2.4 Đặc tính hiệu năng.

Bảng 2: Đặc tính hiệu năng của CCA

Số mẫu = 220

Dải định lượng (khuẩn lạc

trên màng 47mm)

Độ không đảm bảo đo số

đếm (RSD)

Thời gian ủ bắt buộc Phải tăng thời gian ủ các khuẩn lạc giả đinh trong

khoảng từ 18-24h

2.5 Qui trình định lượng Coliform.

- B1: Chuẩn bị mẫu

- B2: Lọc

- B3: Ủ và phân biệt

- B4: Đếm vi khuẩn Coliform giả định.

- B5: Dùng phép thử oxidase để khẳng định vi khuẩn Coliform.

- B6: Đếm khuẩn lạc

- B7: Tính toán và kết luận

2.6 Mục đích từng bước

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu lọc và cấy trên môi trường phân lập, theo hướng dẫn TCVN 9716 (ISO 8199) Mẫu thử phải được vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ (5 ± 3) °C theo hướng dẫn TCVN 8880 (ISO 19458) Trường hợp đặc biệt mẫu có thể bảo quản ở (5 ± 3) °C đến 24 h trước khi kiểm tra.Trong trường hợp này, thời gian bảo quản mẫu phải được nêu trong báo cáo kết quả

Bước 2: Lọc

Lọc 100 ml mẫu (hoặc thể tích khác, ví dụ 250 ml cho nước đóng chai) qua màng lọc (5.5) Thể tích lọc tối thiểu là 10 ml mẫu ban đầu hoặc mẫu pha loãng để đảm bảo cho sự phân bố đồng đều của vi khuẩn trên màng lọc

Bước 3: Ủ và phân biệt

Sau khi lọc (8.2), đặt màng lọc trên địa thạch coliform sinh màu (CCA) (B.1), đảm

bảo rằng không tạo bọt khi phía dưới màng, lật ngược đĩa, và ủ ở (36 ± 2) °C trong (21

±3) h

Kiểm tra màng lọc và đếm tất cả các khuẩn lạc dương tính B-D-galactosidase (màu

hồng đến đỏ) là vi khuẩn coliform giả định, nhưng không phải E coli.

Bước 4: Đếm khuẩn lạc Coliform giả định.

Đểm tất cả các khuẩn lạc dương tính B-D-galactosidase và B-D-glucuronidase (màu xanh đậm đến màu tim) là E coli

Bước 5: Dùng phép thử oxidase để khẳng định vi khuẩn Coliform.

Để khẳng định vi khuẩn coliform giả định nhưng không phải E coli, sử dụng phép

thử oxidase Thử tất cả các khuẩn lạc đặc trưng thu được, hoặc ít nhất 10 khuẩn lạc

màu hồng đến đỏ được chọn theo TCVN 9716 (ISO 8199) Đối với phép thử khẳng định này, có thể sử dụng test thử oxidase thương mại phù hợp

Nếu không sử dụng que thử oxidase thương mại, thì phép thử oxidase được thực hiện bằng cách nhỏ hai đến ba giọt thuốc thử oxidase mới chuẩn bị (B.2) lên giấy lọc đặt trong đĩa petri Dùng que cấy vòng bằng nhựa hoặc platin chuyển một phần khuẩn lạc lên giấy lọc đã chuẩn bị Màu xanh đậm xuất hiện trong vòng 30 s là phản ứng

dương tính Vi khuẩn coliform âm tính oxidase nên không xuất hiện màu xanh đậm.

Nếu có nhiều khuẩn lạc phát triển trên màng lọc hoặc nếu khuẩn lạc giả định nằm sát các khuẩn lạc khác, có thể cấy truyền tiếp để chắc chắn rằng phép thử oxidase được thực hiện với các chủng cấy thuần Nếu khuẩn lạc giả định quá nhỏ thì cũng cần cấy truyền để thực hiện phép thử oxidase Việc cấy truyền tiến hành trên thạch không chọn lọc (ví dụ B.3) ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 3) h

Bước 6: Tính toán kết quả

3 Kết quả

3.1 Công thức tính kết quả, biểu thị kết quả.

3.1.1 Trường hợp khái quát

Đối với phương pháp màng lọc khi đọc kết quả chọn các đĩa có số đếm tổng các khuẩn lạc trong khoảng 10-200 hoặc lựa chọn các đĩa có số đếm khuẩn lạc điển hình trong khoảng 10-100

Tổng số khuẩn lạc trên màng lọc trong một đơn vị thể tích mẫu lọc sẽ được tính thức công thức:

Trường hợp chung

Cs = Z V x V s

tot

Trong đó:

Cs : số khuẩn lạc có trong thể tích mẫu Vs

Z : số khuẩn lạc trên màng ở độ pha loãng d1, d2,… di

Vs : thể tích được chọn để biểu diễn kết quả

Vtot : tổng thể tích tính được từ mẫu ban đầu trên các màng hoặc là tổng các phần riêng biệt từ mẫu thử , được tính theo công thức

V tot = n1×V1×d1+n2×V2×d2+… n i ×V i ×d i

Trong đó:

n1, n2, ni : số màng ở độ pha loãng d1, d2,… di

V1, V2, Vi : thể tích sử dụng ở độ pha loãng d1, d2,… di

d1, d2, di : độ pha loãng ở thể tích V1, V2, Vi

(d = 1 đối với không pha loãng, d = 0.1 là mẫu pha loãng 10 lần…)

Trường hợp khuẩn lạc sau khi được xác nhận lại hoặc khẳng định

Số khuẩn lạc trên màng ở các độ pha loãng được tính theo công thức sau:

Z=ka n Trong đó:

Z : Số khuẩn lạc trên màng

k : Số khuẩn lạc cho kết quả dương tính

n : Số khuẩn lạc được chọn để khẳng định

a : Tổng số khuẩn lạc nghi ngờ trên màn

Nếu sau khẳng định, ở nồng độ ban đầu (100), số khuẩn lạc Coliform/ E.coli đều

<10

Nếu sau khẳng định, không có khuẩn lạc đúng thì kết quả được báo cáo là < 1/Vtot

(CFU /Vs mL) hay bằng 0 khi không có khuẩn lạc ở nồng độ nguyên (100)

Thể hiện kết quả: Dựa vào số khuẩn lạc đặc trưng trên màng lọc tính số vi khuẩn E

coli, coliform

3.1.2 Trường hợp sau khi khẳng định.

Đối với trường hợp khẳng định Coliforms, kết quả khẳng định của từng đĩa sẽ được

tính theo phần trăm các khuẩn lạc nghi ngờ theo các tiêu chí xác định hoặc khẳng định:

Z= k × a

n Trong đó:

Z là số ước lượng các khuẩn lạc được khẳng định trên một đĩa

k là số các khuẩn lạc âm tính oxydase

n là số các khuẩn lạc được chọn để khẳng định

a là tổng số các khuẩn lạc giả định

PHẦN KẾT LUẬN

Coliform là một trong những chỉ tiêu quan trọng đối với các sản phẩm thực phẩm.

Do vậy, việc định lượng Coliforms là vô cùng quan trọng.

Trong thực tế nhiều trường hợp cần xác định nhanh chóng chất lượng vi khuẩn Vì vậy không thể thiếu phương pháp phát hiện nhanh, có độ tin cậy, độ nhạy đòi hỏi những thiết bị, vật liệu đặc biệt Kỹ thuật màng lọc là kỹ thuật thích hợp nhất

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Standard methods for Examination of Water and Wastewater, 15th ed

[2] Bordner, R H., et al., Microbiological Methods for Monitoring the Environment, Environmental Monitoring and Support Laboratory, U.S EPA, Cincinnati, OH, EPA-600/8-78-017, 1978

[3] TCVN 6187 – 1:2019 (ISO 9308 – 1:2014) Chất lượng nước – Phát hiện và đếm

Escherichia coli và vi khuẩn Coliform – Phần 1: Phương pháp lọc màng áp dụng cho nước có số lượng vi khuẩn thấp.

[4] Ronald f Turco, "Coliform Bacteria," America, 1994, p 145.

[5] Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm, NXB Trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm

TP HCM, 2016

[6] TCVN 9716:2013 (ISO 8199:2005) Chất lượng nước – Hướng dẫn chung về đếm

vi sinh vật trong nuôi cấy.

TRẮC NGHIỆM

1. Coliform có những đặc điểm nào?

D. Tất cả đáp án trên

2. Dụng cụ và thiết bị dùng để định lượng Coliform bao gồm:

3. Độ đặc hiêu của môi trường CCA đối với vi khuẩn Coliform

A. 94%

B. 97%

C. 90%

D. 95%

4. Các bước nào để tiến hành định lượng coliforms bằng phương pháp màng lọc

A. Chuẩn bị dụng cụ thiết bị, pha chế môi trường, lọc mẫu, ủ, thử nghiệm oxidase, tính toán kết quả

B. Chuẩn bị dụng cụ thiết bị, pha chế môi trường, hấp khử trùng, lọc mẫu, ủ, thử nghiệm oxidase, tính toán kết quả

C. Chuẩn bị dụng cụ thiết bị, pha chế môi trường, hấp khử trùng, lọc mẫu, ủ, đếm khuẩn lạc, tính toán kết quả

quả

5. Vai trò của Tergitol-7 là gì?

C. Ức chế vi khuẩn gram (+) và một số vi khuẩn gram (-)

6. Coliforms giả định có màu gì?

D. Hồng đến đỏ

7. Mục đích của thuốc thử oxidase là gì?

D Khẳng định coliforms

8. Những loại nào là thành phần của môi trường CCA?

D. Sorbitol, Tergitol-7, Peptic digest of animal tissue, Dextrose

9. Môi trường TSA tên đầy đủ là gì?

C. Tryptone Soya Agar

Oxydase?

C Không màu là âm tính có coliform

D Là một chỉ thị thể hiển độ pH và tạo màu

C Phép thử Oxy dase được thực hiện bằng cách nhỏ hai đến ba giọt thuốc thử oxidase lên giấy lọc sau đó sử dụng que cấy vòng bằng nhựa hoặc platin để thực hiện

B Có thể cấy truyền tiếp để chắc chắn rằng phép thử oxidase được thực hiện với các chủng cấy thuần

C. Bằng 0

D Cả đáp án A và C đều đúng

B 4.4-4.9

C 4-4.9

D 4.9-5.9

C. Chỉ thị thể hiện độ pH và màu

A. Xuất hiện màu xanh đậm

B. Không xuất hiện màu xanh đậm

C. Xuất hiện màu hồng

D. Không xuất hiện màu hồng

thế nào?

A. Phân tích mật độ vi khuẩn trong một thể tích lớn

D. a và b đều sai

22. Để khẳng định vi khuẩn coliform giả định nhưng không phải E Coli thì dùng phép thử nào?

C. 7

A. =

B. Z=×

C. ×

D. Z=

26 Vai trò của Peptone, Canh thịt và cao nấm mem là gì?

A. Cung cấp các thành phần dinh dưỡng như: nitơ, các hợp chất cacbon, vitamin và protein

axit amin

C. Cung cấp các thành phần dinh dưỡng như: nitơ, các hợp chất cacbon, vitamin và photpho

D. Cung cấp các thành phần dinh dưỡng như: nitơ, các hợp chất cacbon, photpho

và protein

27 Tổng số khuẩn lạc trên màng lọc trong một đơn vị thể tích mẫu lọc sẽ được tính thức công thức nào ?

A Cs =

B. Cs =

C Cs =

D. Cs =

B. Sodium heptadecyl sulfua

C. Sodium heptadexyl sulfat

D. Sodium heptadexyl sulfua

29 Có bao nhiêu thành phần hóa chất trong môi trường Lactose TTC Agar?

A. 5

B. 6

C. 7

D. 8

30 Colifrom phát triển tốt trong môi trường có nhiệt độ thấp và cao nhất bao nhiêu?

A. -5oC và cao đến 50oC

B. -4oC và cao đến 50o

C. -3oC và cao đến 50oC