ĐỀ TÀI ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM _ NHÓM 07 TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 11 NĂM 2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯƠNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC Nhóm: 07 Giảng viên hướng dẫn: Định Thị Hải Thuận Thành viên: Nguyễn Thị Trúc Linh 2005200559 Thông Hưng Long 2005200709 Lê Thị Mỹ Tuyên 2005201239 Lê Thanh Vy 2005201236 Bùi Thị Như Ý 2005200403 TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 11 NĂM 2022 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm đưa mơn học Phân Tích Vi Sinh vào chương trình giảng dạy Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên môn – Cô Đinh Thị Hải Thuận dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian học tập vừa qua Trong thời gian tham gia lớp học Phân Tích Vi Sinh cơ, em có thêm cho nhiều kiến thức bổ ích, tinh thần học tập hiệu quả, nghiêm túc Đây chắn kiến thức quý báu, hành trang để em vững bước sau Bộ mơn Phân Tích Vi Sinh mơn học thú vị, vơ bổ ích có tính thực tế cao Đảm bảo cung cấp đủ kiến thức, gắn liền với nhu cầu thực tiễn sinh viên Tuy nhiên, vốn kiến thức nhiều hạn chế khả tiếp thu thực tế nhiều bỡ ngỡ Mặc dù em cố gắng chắn tiểu luận khó tránh khỏi thiếu sót nhiều chỗ cịn chưa xác, kính mong xem xét góp ý để tiểu luận em hoàn thiện hơn.  Em xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 11 năm 2022 LỜI NĨI ĐẦU Phân tích vi sinh vật học thực phẩm môn học quan trọng hệ đại học ngành công nghệ thực phẩm Môn học giúp có kiến thức hữu ích việc phân tích tiêu vi sinh thực phẩm Hiên nay, việc phân tích vi sinh thực phẩm số sản phẩm thiết yếu thịt-các sản phẩm từ thịt, thủy sản, sữa,… tiêu chuẩn hóa, nên vấn đề đề cập tiểu luận vấn đề Những làm, làm lĩnh vực phải thường xuyên cập nhật thơng tin, tiêu chuẩn hóa kiến thức mình, phù hợp với thay đổi tiêu chí chất lượng thực phẩm ngày cao xã hội Mục Lục Chương 1: Tổng quan Định nghĩa Coliform .6 1.1 Phương pháp màng lọc Chương 2: Định lượng Coliform phương pháp màng lọc Môi trường 2.1.1 Quy định/TCVN/ISO 2.1.2 Quy trình phân tích 2.1.3 Mục đích bước 2.1.4 Mục đích môi trường bước 10 2.1.5 Màu khuẩn lạc .11 2.1.6 Màu phản ứng mơi trường khẳng định 12 2.2 Hóa chất 13 2.2.1 Môi Trường Trytose lauryl 13 2.2.2 Môi trường M-endo ( Môi trường phát Coliform) 14 2.2.3 Môi Trường CCA (Chromogenic Coliform Agar) .16 2.2.4 Môi Trường TSA ( Trypton Đậu nành) .18 2.3 Định lượng coliform phương pháp màng lọc 18 Kết Luận 20 Củng cố kiến thức .21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 Chương 1: Tổng quan Định nghĩa Coliform - Coliform gồm vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tuỳ ý, Gram âm, nhóm vi sinh vật thị, khơng sinh bào tử, hình que -Có khả sinh acid, sinh lên men lactose 37°C vò ng 24- 48 - Phân bố: nước thực phẩm có nhiễm phân - Nhóm Coliforms gồm giống Escherichia với loài E coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte (gồm loài E aerobacter E cloacae) Hình 1: Coliform 1.1 Phương pháp màng lọc - Phương pháp màng lọc thường dùng để định lượng vi sinh vật ( đặc biệt vi sinh vật thị) mẫu nước - Bản chất phương pháp tập trung số vi sinh vật ỏi mẫu có khối lượng lớn màng lọc khuẩn định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm sau đặt màng lọc lên môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp - Về thực chất kết hợp hai phương pháp phương pháp màng lọc phương pháp đếm khuẩn lạc đĩa Hình 2: Phiễu lọc  Kích thước lỗ lọc 0,47 μm hay 0,22 μm  Đường kính hình dạng màng lọc phụ thuộc vào đường kính phễu lọc  Đường kính thường 45mm Chương 2: Định lượng Coliform phương pháp màng lọc Môi trường 2.1.1 Quy định/TCVN/ISO - TCVN 6187-1:2019,ISO 9308-1:2014: CHẤT LƯỢNG NƯỚC, PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM ESCHERICHIA COLI VÀ VI KHUẨN COLIFORM (Phần 1), PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG ÁP DỤNG CHO NƯỚC CÓ SỐ LƯỢNG VI KHUẨN THẤP - TCVN 6187-1:2019 thay cho TCVN 6187-1:2009 - TCVN 6187-1:2019 hoàn toàn tương đương với ISO 9308-1:2014 - TCVN 6187-1:2019 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố 2.1.2 Quy trình phân tích Hình 2.1.1: Quy trình xác định coliform tổng số theo kỹ thuật màng lọc 2.1.3 Mục đích bước BƯỚC 1: Lựa chọn lượng mẫu - Lượng mẫu lấy phân tích phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn dự kiến mật độ vi khuẩn mẫu bị ảnh hưởng độ đục - Lượng mẫu lý tưởng lượng mẫu cho khoảng 50 khuẩn lạc coliform không 200 khuẩn lạc tất vi khuẩn BƯỚC 2: Lọc mẫu - Sử dụng thiết bị lọc vô khuẩn bắt đầu dãy lọc để giảm thiểu nhiễm bẩn ngẫu nhiên - Đặt màng lọc lên hấp thụ mặt thạch (tấm dinh dưỡng) theo cách trải thảm để tránh tạo bọt khí BƯỚC 3: Chọn kỹ thuật - Lựa chọn bước trực tiếp làm giàu bước để phù hợp trình lọc BƯỚC 4: Đếm khuẩn lạc có ánh kim BƯỚC 5: Tính mật độ Coliform - Báo cáo mật độ coliform tính theo số coliform (tổng số)/100 mL Tính số vi khuẩn coliform màng lọc có 20 khuẩn lạc coliform đến 80 khuẩn lạc coliform không 200 khuẩn lạc tất vi khuẩn - Mặc dù mức độ tin cậy kỹ thuật màng lọc theo thống kê lớn mức độ tin cậy kỹ thuật MPN, số đếm màng lọc số tuyệt đối Bảng minh họa số mức tin cậy 95 % 2.1.4 Mục đích mơi trường bước Để chuẩn bị mẫu lọc chủng cấy môi trường biệt lập, theo hướng dẫn ISO 8199 TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) Tốt bắt đầu phép thử sau lấy mẫu Nếu mẫu giữ nhiệt độ môi trường (trong tối không 25 °C) việc kiểm tra nên tiến hành vòng h kể từ lấy mẫu Trường hợp đặc biệt mẫu lưu giữ (5 ± 3) °C đến 24 h trước kiểm tra Lọc 100 ml mẫu (hoặc thể tích lớn hơn, ví dụ 250 ml cho nước đóng chai màng lọc Đặt lọc lên mơi trường thạch tương ứng, đảm bảo khơng có khơng khí phía Sau lọc đặt màng đĩa aga Lactoza TTC ủ (36 ± 2) °C (21 ± 3) h Kéo dài thời gian ủ đến (44 ± 4) h cho độ nhạy phép thử cao với đĩa khơng rõ khuẩn lạc điển hình sau (21 ± 3) h Dùng thêm màng lọc để ủ 44 °C khắc phục vấn đề phát triển mẫu Kiểm tra đếm tất khuẩn lạc đặc trưng dương tính với lactoza, khơng quan tâm đến kích thước, màu vàng môi trường màng lọc Đối với thử oxydaza indol cần cấy tiếp tất khuẩn lạc đặc trưng thu được, số đại diện (ít 10) thạch khơng chọn lọc tryptophan tương ứng Ủ aga không chọn lọc (36 ± 2) °C (21 ± 2) h tiến hành thử oxydaza sau – Nhỏ hai đến ba giọt thuốc thử oxydaza chuẩn bị lên giấy lọc – Dùng que cấy thủy tinh, gỗ, vòng dây plastic platin (không dùng dây cromniken) phần khuẩn lạc vi khuẩn lên giấy lọc chuẩn bị – Màu xanh đậm xuất 30 s phản ứng dương tính Ủ ống nghiệm chứa L-tryptophan (44,0 ± 0,5) °C (21 ± 3) h kiểm tra sinh indol cách thêm 0,2 ml đến 0,3 ml thước thử Kovac Mẫu đỏ thẫm bề mặt môi trường xác định sinh indol Một số chủng Klebsiella oxytoca cho phản ứng indol dương tính Để khắc phục kết dương tính này, cần thử thêm β- glucuronidaza (E coli cho phản ứng dương tính cịn K oxytoca cho phản ứng âm tính) Đếm khuẩn lạc có phản ứng oxydaza âm tính vi khuẩn coliform Đếm khuẩn lạc có phản ứng oxydaza âm tính phản ứng indol dương tính E.coli 2.1.5 Màu khuẩn lạc  Khuẩn lạc coliform đặc trưng có màu hồng đến đỏ thẫm với bề mặt ánh kim Vùng ánh kim có kích thước thay đổi từ chấm nhỏ đến phủ toàn bề mặt khuẩn lạc 2.1.6 Màu phản ứng mơi trường khẳng định 2.2 Hóa chất 2.2.1 Mơi Trường Trytose lauryl 2.2.2 Môi trường M-endo ( Môi trường phát Coliform) 2.2.3 Môi Trường CCA (Chromogenic Coliform Agar) 2.2.4 Môi Trường TSA ( Trypton Đậu nành) 2.3 Định lượng coliform phương pháp màng lọc Bước Tính tốn kết C s= Z ×V s V tot Trong C slà giá trị ước lượng cfu cfp thể tích chuẩn sử dụng Vs mẫu Z tổng số khuẩn lạc đếm đĩa màng từ độ pha loãng d1 ,d2 ,… ,di, từ thể tích riêng biệt phần mẫu thử (mẫu dung dịch pha loãng) V s thể tích chuẩn chọn để biểu thị nồng độ vi sinh vật có mẫu V tot thể tích tổng tính mẫu ban đầu bao gồm đĩa đếm Vtot tổng thể tích riêng biệt phần mẫu thử (mẫu dung dịch pha loãng) tính theo Cơng thức (2): V tot = (n1V1d1)+ (n2V2d2)+….+ (niVidi) (2) Trong Vtot thể tích tổng tính mẫu ban đầu bao gồm đĩa đếm; n1,n2,…,ni số lượng đĩa đếm độ pha loãng d1,d2,….,di V1, V2, …, Vi thể tích mẫu thử sử dụng với độ pha loãng d1,d2,….,di d1,d2,….,di độ pha loãng sử dụng thể tích thử V 1, V2, …, Vi (d = mẫu không pha loãng, d = 0,1 dung dịch pha loãng mười lần v.v )  Ví dụ biểu thị kết Trong nước khống đóng chai hai phần mẫu, phần 10 mL 100ml lọc hai màng lọc tương ứng có 11 82 khuẩn lạc coliform, báo cáo kết 84 khuẩn lạc coliform 100 mL nghĩa là: Z = 11 + 82 = 93 Vtot =(1 x 100 x 1)+ (1 x 10 x ) = 110 Và Vs 100 mL: Cs = 93/110 x 100= 84 cfu/100 mL (hoặc cfp/100 mL)  Kết luận: Với Cs= 84 cfu/100ml mẫu khơng đạt ( Vì theo số 46/2007/QĐ-BYT: giới hạn cho phép khơng có) Kết Luận Phương pháp màng lọc dùng để định lượng vi sinh vật mẫu nước tiến hành xét nghiệm môi trường, phương pháp phổ biến sử dụng rộng rãi Môi trường dùng để định lượng Coliform phương pháp màng lọc môi trường M-endo và Trytose lauryl cách nhận biết có khuẩn lạc coliform khuẩn lạc đặc trưng có màu hồng đến đỏ thẫm với bề mặt ánh kim Vùng ánh kim có kích thước thay đổi từ chấm nhỏ đến phủ toàn bề mặt khuẩn lạc Củng cố kiến thức Câu 1: Ở bước lựa chọn mẫu ta lựa chọn mật độ vi khuẩn dự kiến khoảng 50 khuẩn lạc không bao nhiêu? A 50 B 100 C 150 D 200 Câu 2: Khi mẫu phễu vừa cạn hết, để nguyên màng lọc chỗ, tráng phễu lần tráng ml nước pha lỗng vơ khuẩn? A lần, 10 ml đến 20ml B lần, 10ml đến 20ml C lần, từ 20ml đến 30ml D lần, từ 20ml đến 30ml Câu 3: Có bước chọn kĩ thuật? A B C D Câu 4: Chọn kĩ thuật bước trực tiếp ta sử dụng môi trường để tiến hành? A Trytose lauryl B Casiton C Blood agar D M-endo Câu 5: Với màng lọc đường kính lỗ lọc nên sử dụng bao nhiêu? A 0,45 ± 0,02 B 0,42 ± 0,02 C 0,45 ± 0,01 D 0,43± 0,02 Câu 6: Lượng mẫu lý tưởng phương pháp bao nhiêu? A Khoảng 40 khuẩn lạc coliform không 200 khuẩn lạc B Khoảng 50 khuẩn lạc coliform không 190 khuẩn lạc ... Luận Phương pháp màng lọc dùng để định lượng vi sinh vật mẫu nước tiến hành xét nghiệm môi trường, phương pháp phổ biến sử dụng rộng rãi Môi trường dùng để định lượng Coliform phương pháp màng lọc. .. Tổng quan Định nghĩa Coliform .6 1.1 Phương pháp màng lọc Chương 2: Định lượng Coliform phương pháp màng lọc Môi trường 2.1.1 Quy định/ TCVN/ISO ... màng lọc lên mơi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp - Về thực chất kết hợp hai phương pháp phương pháp màng lọc phương pháp đếm khuẩn lạc đĩa Hình 2: Phiễu lọc  Kích thước lỗ lọc