Định lượng e coli bằng phương pháp màng petrifilm

Màu khuẩn lạc và gải thích 10 Trang 4 MỤC LỤC HÌNH ẢNHHình 1: Vi khuẩn E.coli 6Hình 2: Đĩa Petrifilm 8Hình 3: Khuẩn lạc trên màng petrifilm 11Hình 4: Dụng cụ dàn mẫu 13Hình 5: Thiết bị

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN

TÊN ĐỀ TÀI : ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG

PETRIFILM

Trưởng nhóm: Nguyễn Như Mai Mssv: 2005200137

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN

TÊN ĐỀ TÀI : Định Lượng E.Coli Bằng Phương Pháp Màng Petrifilm

Trưởng nhóm: Nguyễn Như Mai Mssv: 2005200137

III ĐỊNH LƯỢNG E COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM 10

LỜI CAM ĐOAN

Chúng em xin cam đoan đề tài: “Định lượng E.Coli bằng phương pháp màn

Petrifilm” này là do chính chúng em thực hiện

Các nội dung trình bày trong tiểu luận là trung thực, không sao chép Các tài liệu thamkhảo sử dụng trong bài được trích dẫn nguồn và chú thích rõ ràng

TP.HCM, ngày 20 tháng 10 năm 2022 Sinh Viên Thực Hiện

Nhóm 11

 

Do chưa có nhiều kinh nghiệm về nội dung để tài cũng như những hạn chế về kiến thức, trong bài tiểu luận chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự nhận xét, ý kiến đóng góp, phê bình từ phía Cô và các bạn để bài tiểu luận của nhóm chúng em được hoàn thiện hơn.

Lời cuối, nhóm chúng em xin kính chúc Cô nhiều sức khỏe và thành công trên con đường giảng dạy

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 10 năm 2022 Sinh Viên Thực Hiện

Nhóm 11

 

LỜI MỞ ĐẦU

Escherichia coli (viết tắt: E coli) là một loài vi khuẩn gram âm, phân bố rất rộng

trong môi trường sống trên Trái Đất, hay có mặt ở thực phẩm, nguồn nước, thường kí sinh trong ruột già của người và hầu hết các loài thú đẳng nhiệt Đa số các chủng E coli là vô hại mặc dù kí sinh, chỉ một số dòng có thể gây ngộ độc thức ăn, gây bệnh đường ruột Trong những trường hợp nhất định, chúng còn giúp vật chủ nhờ sản xuất vitamin K2, và chống sự xâm lấn của một vài mầm bệnh khác, tạo nên một mối quan hệ cộng sinh

E coli thường được nhắc đến chủ yếu vì nó là loài sinh vật vô hình rất quan trọng trong sinh học hiện đại, đặc biệt trong di truyền phân tử Ngoài ra, sự có mặt của

chúng trong nguồn nước là một chỉ tiêu quan trọng để đo độ sạch của nước, do E coli bị thải ra môi trường qua phân, có khả năng tiếp tục tạo nên các quần thể sống tự

do, sinh trưởng mạnh trong phân tươi ở điều kiện hiếu khí vài ba ngày rồi mới giảm tăng trưởng

Để định lượng E coli có nhiều phương pháp như: Đếm khuẩn lạc, màng lọc, MPN,

màng petrifilm Bài cáo cáo này nhóm chúng em xin phép sẽ trình bày về đề tài:

“ĐỊNH LƯỢNG E COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM”

I TỔNG QUAN VI KHUẨN E.COLI

1 Đặc điểm vi khuẩn E.coli

Escherichia coli (còn được gọi là E coli) là một trong những vi sinh vật

thường gặp trong môi trường Nhiều người không coi E.coli là vi sinh vật gây bệnh do

thực phẩm song những nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng của chúng thực sự

có khả năng lây bệnh lây lan qua thực phẩm rất nghiêm trọng

E coli là dạng trực khuẩn gram âm kị khí tuỳ nghi, không sinh bào tử, khá phổ

biến trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hoá của người và động vật Chúng thuộc loại glucose và lactose dương tính, indol và methyl red dương tính song có phảnứng VP và citrate âm tính

Tế bào Escherichia coli thường rộng 1,1–1,5 μm, dài 2–6 μm và đường kính m, dài 2–6 μm, dài 2–6 μm và đường kính m và đường kính

0,25–1,0 μm, dài 2–6 μm và đường kính m, với thể tích tế bào là 0,6–0,7 μm, dài 2–6 μm và đường kính m3 tồn tại dưới dạng các que thẳng đơn

lẻ Chúng có thể di động hoặc không di động, và khi chuyển động sẽ tạo ra một bên, chứ không phải là lông roi phân cực Ngoài trùng roi, nhiều chủng tạo ra fimbriae hoặc pili, là những cấu trúc protein (hoặc phần phụ hoặc sợi) kéo dài ra ngoài từ bề mặt vi khuẩn và đóng vai trò gắn kết tế bào với các tế bào khác hoặc với mô vật chủ.

Hình 1: Vi khuẩn E.coli

Sáu chủng E coli khác nhau được biết là nguyên nhân gây tiêu chảy Các

chủng này là:

1 E coli sinh độc tố Shiga (STEC): Đây là loại vi khuẩn được biết đến

nhiều nhất đối với việc ô nhiễm thực phẩm do E coli Chủng này còn được gọi

là E coli sinh ruột (EHEC) và E coli sinh verocytotoxin (VTEC)

2 Enterotoxigenic E coli (ETEC): Chủng này thường được biết đến như

một nguyên nhân gây tiêu chảy cho khách du lịch

3 E coli tiêu hóa đường ruột (EAEC).

4 E coli xâm nhập (EIEC).

5 E coli sinh đường ruột (EPIC).

6 E coli bám dính phân tán (DAEC).

E coli là một nhóm vi khuẩn lớn và đa dạng Mặc dù hầu hết các chủng E coli đều vô hại, nhưng một số khác có thể gây bệnh cho người bệnh Một số loại E coli

gây bệnh bằng cách tạo ra một loại độc tố gọi là độc tố Shiga Vi khuẩn tạo ra các độc

tố này được gọi là “E coli sản xuất độc tố Shiga”, viết tắt là STEC, có thể phát triển ở

nhiệt độ từ 7°C đến 50°C, với nhiệt độ tối ưu là 37 °C Một số STEC có thể phát triển

trong thực phẩm có tính axit, độ pH xuống tới 4,4 và trong thực phẩm có hoạt độ nướctối thiểu (aW) là 0,95 STEC nổi tiếng nhất ở Bắc Mỹ và thường được gọi là E coli O157: H7, hoặc chỉ E coli O157.

Có những loại STEC khác được gọi là STEC không thuộc O157 Các chủng này gây bệnh tương tự như chủng O157 nhưng ít có khả năng dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng

2 Tính sinh hóa của E.coli

E coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi Hầu hết E coli đều lên men lactose và sinh hơi trừ E coli trơ (trong đó có EIEC) không hoặc lên men

rất chậm Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được gộp vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là Coliform

E coli có khả năng sinh indole, không sinh H2S Chúng thuộc loại glucose và

lactose dương tính indol và đỏ methyl, VP âm tính, citrat âm tính, urease âm tính, H2S âm tính

3 Nguồn lây nhiễm E coli

Một số thực phẩm bị ô nhiễm như:

Thịt: Thịt bị nhiễm vi khuẩn E coli trong quá trình giết mổ, khi vi khuẩn E coli trong ruột động vật dính vào các vết cắt của thịt và đặc biệt là khi thịt của nhiều con vật được xay cùng nhau Thịt chưa nấu chín (E coli bị giết khi thịt được nấu chín kỹ) có thể bị nhiễm E coli.

Sữa chưa tiệt trùng (nguyên liệu): E coli trên bầu vú của bò và / hoặc thiết bị

vắt sữa có thể xâm nhập vào sữa Uống sữa tươi bị ô nhiễm có thể dẫn đến nhiễm

khuẩn E.coli vì nó chưa được đun nóng để tiêu diệt vi khuẩn.

Phô mai mềm làm từ sữa tươi

Trái cây và rau: Các loại cây trồng gần các trang trại chăn nuôi có thể bị ô

nhiễm khi phân động vật chứa E coli kết hợp với nước mưa và nước chảy tràn vào

các cánh đồng và đất sản xuất

Nước bị ô nhiễm

Môi trường bị nhiễm phân hay chất thải hữu cơ

E coli trong phân của cả động vật và con người có thể tồn tại trong tất cả các

loại nguồn nước bao gồm ao, hồ, suối, sông, giếng, bể bơi trẻ em và thậm chí trong các nguồn cung cấp nước của thành phố địa phương chưa được khử trùng

II PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM

Môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định vào các màng mỏng gọi làPetrifilm Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào một 1ml dịch mẫu rồi đậy lại Một đĩa petri nhựa được đặt lên màng bảo vệ để tạo một khuôn tròn Môi trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian

ủ Có thể đếm trực tiếp số khuẩn lạc trên Petrifilm

Kỹ thuật màng pêtri (Petrifilm) là phương pháp có thể dùng để kiểm tra nhanh

vi sinh vật Trong kỹ thuật này môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định trên một giá thể mỏng và được phủ bằng một màng bảo vệ Môi trường dinh dưỡng sẽ

hỗ trợ cho sự tăng trưởng của vi sinh vật trong thời gian ủ và số khuẩn lạc xuất hiện cóthể được đếm trực tiếp Đây là phương pháp đang được áp dụng phổ biến tại các nước Châu Âu và đang được các nhà khoa học, các công ty trong nước đặc biệt quan tâm

Hình 2: Đĩa Petrifilm

Không như các phương pháp kiểm tra vi sinh khác, đĩa Petrifilm được chuẩn bịsẵn giúp cho quá trình kiểm tra đạt năng suất cao hơn Đặc điểm thiết kế chuyên biệt

của chúng như một tấm film được phủ chất dinh dưỡng và chất gel, đĩa Petrifilm sẵn sàng để sử dụng bất cứ khi nào.

Sử dụng đĩa Petrifilm sẽ tiết kiệm được công lao động, vì vậy sẽ có nhiều thời gian giám sát các điểm tới hạn CCP (Cretical Control Point) thường xuyên hơn Kết quả cuối cùng là kiểm soát quá trình sản xuất tốt hơn và chất lượng sản phẩm được nâng cao hơn

Quá trình thực hiện bao gồm 3 bước:

Bước 1: Cấy và trải đều 1 ml mẫu trên đĩa

Bước 2: Ủ ở nhiệt độ thích hợp

Bước 3: Đếm số khuẩn lạc

Vì đĩa Petrifilm được làm đồng nhất và dễ dàng sử dụng nên ít xảy ra sai sót so với các phương pháp khác Ngoài ra, đĩa có kẻ ô thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc Cho kết quả nhanh, chính xác và nhất quán Có thể sử dụng máy đếm khuẩn lạc Quebec-type hoặc nguồn sáng phóng đại

Đĩa Petrifilm là dụng cụ sẵn sàng lấy mẫu thay thế thạch thông thường, đĩa petri, miếng đệm môi trường và phễu lọc, dùng một lần và thường được sử dụng trongthử nghiệm vi sinh vật trong nước

Một số ưu điểm của đĩa Petrifilm:

- Dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản

- Thời hạn sử dụng lâu do dùng môi trường đông khô và không cần xử

lý nhiệt như phương pháp thông thường

- Có thể dùng nước cất vô trùng để làm ướt lại môi trường đông khô

- Sau khi môi trường đông lại, có thể dùng trực tiếp Petrifilm để đếm tạpkhuẩn bề mặt

III ĐỊNH LƯỢNG E COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG

PETRIFILM

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa đếm Petrifilm TM để định

lượng coliform và Escherichia coli trong thực phẩm.

Phương pháp này đã được đánh giá liên phòng thử nghiệm

2 Nguyên tắc

Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chấttạo đông tan được trong nước lạnh Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 20 cm2 Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lạnh Đĩa được ủ ấm ở 35°C ± 1°C trong thời gian thích hợp rồi đếm khuẩn lạc

3 Mục đích từng bước trong môi trường

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Mục đích: chuẩn bị trong quá trình phân tích thực hiện chính xác hơn

Bước 2: Ủ mẫu

Mục đích: phát hiện sự có mặt của VSV trong các nguyên liệu cần nghiên cứu

Tiến hành nhân giống VSV

Bảo tồn các giống VSV thuần khiết

Nghiêm cứu các đặc tính sinh học và hệ thống sinh học của VSV

Bước 3: Đếm số khuẩn lạc

Mục đích: tính toán và biểu diễn kết quả

4 Màu khuẩn lạc và gải thích

Hầu hết E.coli (khoảng 97%) sinh beta-glucuronidase, chất này tạo tủa màu

xanh gắn kết với khuẩn lạc

Tấm film phía trên giữ bọt khí sinh ra từ quá trình lên men lactose của E.coli Khoảng 95% E.coli có sinh bọt khí, cho khuẩn lạc có màu từ xanh đến xanh – đỏ kèm

theo bọt khí trên đĩa Petrifilm

Hình 3: Khuẩn lạc trên màng petrifilm

Không sử dụng đĩa này riêng rẽ để phát hiện E.Coli O157 như hầu hết các môi trường kiểm tra E.coli khác

5 Môi trường và hóa chất

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có chất lượngtương đương, trừ khi có quy định khác

Nước dùng để pha loãng (dung dịch nước đệm phosphat)

Hòa tan 34 g kali dihydro phosphat (KH2PO4) vào 500 ml nước đựng trong bình định mức 1 lít, chỉnh pH đến 7,2 bằng khoảng 175 ml dung dịch natri hydroxit 1

M và thêm nước đến vạch Pha loãng 1,25 ml dung dịch này đến 1 lít bằng nước đã đun sôi và để nguội, rồi hấp áp lực 15 phút ở 121°C

Nước dùng để pha loãng không được chứa xitrat, bisulfit hoặc thiosulfat vì có thể gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật

Bảng 1: Môi trương và hóa chất

Photphat đệm KH2PO4 Dung dịch đệm

NaOH 1 M Chỉnh pH2,3,5 - triphenyltetrazolium clorua Chất chỉ thị

5 - brom - 4 - clo – 3 – indolyl - ß

Peptone và chiết xuất nấm men đóng vai trò là nguồn cung cấp carbon, nitơ, vitamin và các chất dinh dưỡng tăng trưởng thiết yếu khác Lactose là carbohydrate cóthể lên men, việc sử dụng chúng dẫn đến sản xuất axit Chất chỉ thị màu đỏ trung tính phát hiện độ axit được tạo thành Tinh thể tím và hỗn hợp muối mật giúp ức chế hệ vi khuẩn gram dương và không liên quan đi kèm Natri clorua duy trì trạng thái cân bằngthẩm thấu Violet Red Bile Agar không hoàn toàn đặc hiệu cho ruột; các vi khuẩn khác đi kèm có thể cho phản ứng tương tự Các xét nghiệm sinh hóa khác là cần thiết

để xác định dương tính

Bảng 2: Chất dinh dưỡng VRBGA

Hỗn hợp muối mật Kích thích phát triển VSV, ức chế vi

khuẩn gram (+)

Crystal Violet Chất chỉ thị màu, ức chế vi khuẩn gram

(+)

6 Thiết bị và dụng cụ

- Đĩa đếm E coli/coliform PetrifilmTM

Đĩa chứa các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím, chất tạo đông tan được trong nước lạnh, chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua và chất chỉ thị hoạt độ

glucuronidase là 5-brom-4-clo-3-indolyl-ß-D-glucuronid, có thể đếm coliform và E coli trên cùng một đĩa Vùng sinh trưởng được khoanh tròn trên mỗi đĩa chứa khoảng

hai mươi ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm2 trên màng nền

Pipet phải phân phối được chính xác các thể tích yêu cầu Không sử dụng pipet

để phân phối thể tích nhỏ hơn 10 % dung tích của pipet

Ví dụ: Không dùng pipet có dung tích lớn hơn 10 ml để phân phối 1 ml.

- Thiết bị đếm khuẩn lạc

Lựa chọn loại chuẩn hoặc loại có độ khuếch đại hoặc độ nhìn thấy tương đương

có thể dễ dàng đếm chính xác khuẩn lạc trên đĩa

Hình 5: Thiết bị đếm khuẩn lạc

- Cân

Sử dụng cân chính xác đến 0,1g

- Thiết bị phối trộn cao:

Phải có bình chứa vô trùng

- Tủ ấm

Duy trì được nhiệt độ ở 35°C ± 1°C

- Nồi hấp áp lực

Có thể duy trì nhiệt độ ở 121°C

Hình 6: Nồi hấp áp lực

7 Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị tất cả các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo từ 90 ml nước dùng để pha loãng và 10 ml dung dịch mẫu thử pha loãng trước đó, trừ khi có quy định khác Lắc các dung dịch pha loãng 25 lần với biên độ dao động 30 cm

Thực phẩm nói chung

- Cân vô trùng 50 g mẫu thử, chính xác đến 0.1 g, cho vào bình trộn vô trùng của thiết bị trộn tốc độ cao Đối với mẫu đông lạnh, cân mẫu chưa rã đông Ổn định mẫu thử đông lạnh ở 2°C đến 5°C trong thời gian không quá 18 h để lấy 50 g phần mẫu thử, nếu cần Thêm 450 ml nước dùng để pha loãng và trộn trong 2 phút Thời gian trộn mẫu thử đến khi cấy mẫu lên đĩa môi trường không được quá 15 phút

- Nếu tổng khối lượng mẫu không đủ 50 g thì lấy khoảng một nửa rồi thêm thể tích nước dùng để pha loãng cần thiết để có dung dịch pha loãng 10-1 Tổng thể tích trong bình trộn phải phủ hoàn toàn dao trộn

Bột từ các loại hạt

- Cân vô trùng 10 g mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn vô trùng của thiết bị trộn.Thêm 90 ml nước dùng để pha loãng và lắc mạnh (lắc 50 lần với biên

độ dao động 30 cm) để thu được dung dịch pha loãng 10-1 Để yên trong 3 phút đến 5 phút và lắc ngay trước khi chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo và trước khi cấy mẫu

8 Cách tiến hành

Cấy

Đặt đĩa đếm E coli PetrifilmTM lên bề mặt phẳng Nhấc tấm màng mỏng phía

trên ra và nhỏ 1 ml huyền phù mẫu thử vào chính giữa màng nền Đậy cẩn thận tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy, cuộn tấm film trên xuống tránh tạo bọt khí

Dàn đều huyền phù trên diện tích 20 cm2 bằng cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (mặt láng của dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới) Lấy dụng cụ dàn mẫu ra

và để yên đĩa trong 1 phút cho gel đông đặc lại

Ủ

Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang với nắp hướng lên trên, không

chồng cao quá 20 đĩa Đĩa E coli 3M Petrifilm được ủ ở 35℃ trong 24 ± 1 h (AOAC 998.08, mẫu thịt, gia cầm và hải sản) hoặc 48 ± 4 h (AOAC 991.14, tất cả các mẫu thực phẩm khác)

Đếm khuẩn lạc

3M Petrifilm (môi trường mật đỏ đã biến tính) chứa 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua và chỉ thị glucuronidase tạo thành kết tủa xanh lam xung quanh bất kỳ khuẩn

lạc E coli nào có thể có mặt Khoảng 95% E coli tạo ra khí, như được chỉ ra bởi các

khuẩn lạc kết hợp với khí bị cuốn vào (trong khoảng một đường kính khuẩn lạc) Tất

cả các khuẩn lạc màu xanh lam kết hợp với bọt khí được tính là E coli