Định lượng e coli bằng phương pháp màng petrifilm

Màu khuẩn lạc và gải thích 10 Trang 4 MỤC LỤC HÌNH ẢNHHình 1: Vi khuẩn E.coli 6Hình 2: Đĩa Petrifilm 8Hình 3: Khuẩn lạc trên màng petrifilm 11Hình 4: Dụng cụ dàn mẫu 13Hình 5: Thiết bị

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN TÊN ĐỀ TÀI : ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM SVTH: Nhóm 11 GVHD: Đinh Thị Hải Thuận Trưởng nhóm: Nguyễn Như Mai Mssv: 2005200137 Nguyễn Thị Mỹ Duyên Mssv: 2005201061 Nguyễn Bùi Hạnh Nguyên Mssv: 2005200600 Trần Lữ Anh Thư Mssv: 2005201099 Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 10 năm 20 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN TÊN ĐỀ TÀI : Định Lượng E.Coli Bằng Phương Pháp Màng Petrifilm SVTH: Nhóm 11 GVHD: Đinh Thị Hải Thuận Trưởng nhóm: Nguyễn Như Mai Mssv: 2005200137 Nguyễn Thị Mỹ Duyên Mssv: 2005201061 Nguyễn Bùi Hạnh Nguyên Mssv: 2005200600 Trần Lữ Anh Thư Mssv: 2005201099 Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 10 năm 2022 MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC HÌNH ẢNH MỤC LỤC BẢNG BIỂU LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN LỜI MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN VI KHUẨN E.COLI Đặc điểm vi khuẩn E.coli Tính sinh hóa E.coli Nguồn lây nhiễm E coli II PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM III ĐỊNH LƯỢNG E COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM 10 Phạm vi áp dụng 10 Nguyên tắc 10 Mục đích bước mơi trường 10 Màu khuẩn lạc gải thích 10 Mơi trường hóa chất 11 Thiết bị dụng cụ 13 Chuẩn bị mẫu thử 15 Cách tiến hành 16 KẾT LUẬN 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 MỤC LỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Vi khuẩn E.coli Hình 2: Đĩa Petrifilm Hình 3: Khuẩn lạc màng petrifilm Hình 4: Dụng cụ dàn mẫu Hình 5: Thiết bị đếm khuẩn lạc Hình 6: Nồi hấp áp lực Hình 7: Khuẩn lạc màng Petrifilm 11 13 14 15 17 MỤC LỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Mơi trương hóa chất Bảng 2: Chất dinh dưỡng VRBGA 11 12 LỜI CAM ĐOAN Chúng em xin cam đoan đề tài: “Định lượng E.Coli phương pháp Petrifilm” chúng em thực Các nội dung trình bày tiểu luận trung thực, không chép Các tài liệu tham khảo sử dụng trích dẫn nguồn thích rõ ràng TP.HCM, ngày 20 tháng 10 năm 2022 Sinh Viên Thực Hiện Nhóm 11   LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tiểu luận này, nhóm chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện sở vật chất với hệ thống thư viện đại, đa dạng loại sách, tài liệu thuận lợi cho việc tìm kiếm, nghiên cứu thơng tin Nhóm chúng em xin cảm ơn giảng viên môn Cô Đinh Thị Hải Thuận giảng dạy tận tình, chi tiết để chúng em có đủ kiến thức vận dụng chúng vào tiểu luận Do chưa có nhiều kinh nghiệm nội dung để tài hạn chế kiến thức, tiểu luận chắn không tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận nhận xét, ý kiến đóng góp, phê bình từ phía Cơ bạn để tiểu luận nhóm chúng em hồn thiện Lời cuối, nhóm chúng em xin kính chúc Cô nhiều sức khỏe thành công đường giảng dạy Chúng em xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 10 năm 2022 Sinh Viên Thực Hiện Nhóm 11   LỜI MỞ ĐẦU Escherichia coli (viết tắt: E coli) loài vi khuẩn gram âm, phân bố rộng môi trường sống Trái Đất, hay có mặt thực phẩm, nguồn nước, thường kí sinh ruột già người hầu hết loài thú đẳng nhiệt Đa số chủng E coli vô hại kí sinh, số dịng gây ngộ độc thức ăn, gây bệnh đường ruột Trong trường hợp định, chúng giúp vật chủ nhờ sản xuất vitamin K2, chống xâm lấn vài mầm bệnh khác, tạo nên mối quan hệ cộng sinh E coli thường nhắc đến chủ yếu lồi sinh vật vơ hình quan trọng sinh học đại, đặc biệt di truyền phân tử Ngồi ra, có mặt chúng nguồn nước tiêu quan trọng để đo độ nước, E coli bị thải mơi trường qua phân, có khả tiếp tục tạo nên quần thể sống tự do, sinh trưởng mạnh phân tươi điều kiện hiếu khí vài ba ngày giảm tăng trưởng Để định lượng E coli có nhiều phương pháp như: Đếm khuẩn lạc, màng lọc, MPN, màng petrifilm Bài cáo cáo nhóm chúng em xin phép trình bày đề tài: “ĐỊNH LƯỢNG E COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM” I TỔNG QUAN VI KHUẨN E.COLI Đặc điểm vi khuẩn E.coli Escherichia coli (còn gọi E coli) vi sinh vật thường gặp môi trường Nhiều người không coi E.coli vi sinh vật gây bệnh thực phẩm song nghiên cứu gần cho thấy số chủng chúng thực có khả lây bệnh lây lan qua thực phẩm nghiêm trọng E coli dạng trực khuẩn gram âm kị khí tuỳ nghi, khơng sinh bào tử, phổ biến tự nhiên đặc biệt đường tiêu hoá người động vật Chúng thuộc loại glucose lactose dương tính, indol methyl red dương tính song có phản ứng VP citrate âm tính Tế bào Escherichia coli thường rộng 1,1–1,5 μm, dài 2–6 μm đường kính m, dài 2–6 μm, dài 2–6 μm đường kính m đường kính 0,25–1,0 μm, dài 2–6 μm đường kính m, với thể tích tế bào 0,6–0,7 μm, dài 2–6 μm đường kính m3 tồn dạng que thẳng đơn lẻ Chúng di động khơng di động, chuyển động tạo bên, khơng phải lơng roi phân cực Ngồi trùng roi, nhiều chủng tạo fimbriae pili, cấu trúc protein (hoặc phần phụ sợi) kéo dài ngồi từ bề mặt vi khuẩn đóng vai trò gắn kết tế bào với tế bào khác với mơ vật chủ Hình 1: Vi khuẩn E.coli Sáu chủng E coli khác biết nguyên nhân gây tiêu chảy Các chủng là: E coli sinh độc tố Shiga (STEC): Đây loại vi khuẩn biết đến nhiều việc ô nhiễm thực phẩm E coli Chủng gọi E coli sinh ruột (EHEC) E coli sinh verocytotoxin (VTEC) Enterotoxigenic E coli (ETEC): Chủng thường biết đến nguyên nhân gây tiêu chảy cho khách du lịch E coli tiêu hóa đường ruột (EAEC) E coli xâm nhập (EIEC) E coli sinh đường ruột (EPIC) E coli bám dính phân tán (DAEC) E coli nhóm vi khuẩn lớn đa dạng Mặc dù hầu hết chủng E coli vô hại, số khác gây bệnh cho người bệnh Một số loại E coli gây bệnh cách tạo loại độc tố gọi độc tố Shiga Vi khuẩn tạo độc tố gọi “E coli sản xuất độc tố Shiga”, viết tắt STEC, phát triển nhiệt độ từ 7°C đến 50°C, với nhiệt độ tối ưu 37 °C Một số STEC phát triển thực phẩm có tính axit, độ pH xuống tới 4,4 thực phẩm có hoạt độ nước tối thiểu (aW) 0,95 STEC tiếng Bắc Mỹ thường gọi E coli O157: H7, E coli O157 Có loại STEC khác gọi STEC không thuộc O157 Các chủng gây bệnh tương tự chủng O157 có khả dẫn đến biến chứng nghiêm trọng Tính sinh hóa E.coli E coli có khả lên men nhiều loại đường có sinh Hầu hết E coli lên men lactose sinh trừ E coli trơ (trong có EIEC) khơng lên men chậm Một số chi khác họ vi khuẩn đường ruột có khả lên men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia Citrobacter) gộp vào nhóm vi khuẩn có tên chung Coliform E coli có khả sinh indole, không sinh H2S Chúng thuộc loại glucose lactose dương tính indol đỏ methyl, VP âm tính, citrat âm tính, urease âm tính, H2S âm tính Nguồn lây nhiễm E coli Một số thực phẩm bị ô nhiễm như: Thịt: Thịt bị nhiễm vi khuẩn E coli trình giết mổ, vi khuẩn E coli ruột động vật dính vào vết cắt thịt đặc biệt thịt nhiều vật xay Thịt chưa nấu chín (E coli bị giết thịt nấu chín kỹ) bị nhiễm E coli Sữa chưa tiệt trùng (nguyên liệu): E coli bầu vú bò / thiết bị vắt sữa xâm nhập vào sữa Uống sữa tươi bị nhiễm dẫn đến nhiễm khuẩn E.coli chưa đun nóng để tiêu diệt vi khuẩn Phơ mai mềm làm từ sữa tươi Trái rau: Các loại trồng gần trang trại chăn ni bị ô nhiễm phân động vật chứa E coli kết hợp với nước mưa nước chảy tràn vào cánh đồng đất sản xuất Nước bị ô nhiễm Môi trường bị nhiễm phân hay chất thải hữu E coli phân động vật người tồn tất loại nguồn nước bao gồm ao, hồ, suối, sông, giếng, bể bơi trẻ em chí nguồn cung cấp nước thành phố địa phương chưa khử trùng II PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRIFILM Môi trường dinh dưỡng dạng đông khô cố định vào màng mỏng gọi Petrifilm Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên nâng lên nhỏ vào 1ml dịch mẫu đậy lại Một đĩa petri nhựa đặt lên màng bảo vệ để tạo khn trịn Mơi trường dinh dưỡng hỗ trợ cho phát triển vi sinh vật thời gian ủ Có thể đếm trực tiếp số khuẩn lạc Petrifilm Kỹ thuật màng pêtri (Petrifilm) phương pháp dùng để kiểm tra nhanh vi sinh vật Trong kỹ thuật môi trường dinh dưỡng dạng đông khô cố định giá thể mỏng phủ màng bảo vệ Môi trường dinh dưỡng hỗ trợ cho tăng trưởng vi sinh vật thời gian ủ số khuẩn lạc xuất đếm trực tiếp Đây phương pháp áp dụng phổ biến nước Châu Âu nhà khoa học, cơng ty nước đặc biệt quan tâm Hình 2: Đĩa Petrifilm Không phương pháp kiểm tra vi sinh khác, đĩa Petrifilm chuẩn bị sẵn giúp cho trình kiểm tra đạt suất cao Đặc điểm thiết kế chuyên biệt Tấm film phía giữ bọt khí sinh từ q trình lên men lactose E.coli Khoảng 95% E.coli có sinh bọt khí, cho khuẩn lạc có màu từ xanh đến xanh – đỏ kèm theo bọt khí đĩa Petrifilm Hình 3: Khuẩn lạc màng petrifilm Không sử dụng đĩa riêng rẽ để phát E.Coli O157 hầu hết môi trường kiểm tra E.coli khác Môi trường hóa chất Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước cất nước có chất lượng tương đương, trừ có quy định khác Nước dùng để pha lỗng (dung dịch nước đệm phosphat) Hịa tan 34 g kali dihydro phosphat (KH2PO4) vào 500 ml nước đựng bình định mức lít, chỉnh pH đến 7,2 khoảng 175 ml dung dịch natri hydroxit M thêm nước đến vạch Pha loãng 1,25 ml dung dịch đến lít nước đun sôi để nguội, hấp áp lực 15 phút 121°C Nước dùng để pha lỗng khơng chứa xitrat, bisulfit thiosulfat gây ức chế phát triển vi sinh vật Bảng 1: Môi trương hóa chất Mơi trường - Hóa chất Mục đích Photphat đệm KH PO Dung dịch đệm Nước cất Pha loãng mẫu 11 NaOH M Chỉnh pH 2,3,5 - triphenyltetrazolium clorua Chất thị - brom - - clo – – indolyl - ß Chất thị - D - glucuronid Chất dinh dưỡng mật đỏ - tím (violet red Cung cấp dinh dưỡng, bile nutrients) chọn lọc E coli Chất tạo đông Làm đông môi trường Peptone chiết xuất nấm men đóng vai trị nguồn cung cấp carbon, nitơ, vitamin chất dinh dưỡng tăng trưởng thiết yếu khác Lactose carbohydrate lên men, việc sử dụng chúng dẫn đến sản xuất axit Chất thị màu đỏ trung tính phát độ axit tạo thành Tinh thể tím hỗn hợp muối mật giúp ức chế hệ vi khuẩn gram dương không liên quan kèm Natri clorua trì trạng thái cân thẩm thấu Violet Red Bile Agar khơng hồn tồn đặc hiệu cho ruột; vi khuẩn khác kèm cho phản ứng tương tự Các xét nghiệm sinh hóa khác cần thiết để xác định dương tính Bảng 2: Chất dinh dưỡng VRBGA Thành phần Mục đích Peptone Cung cấp protein Chiết xuất men Cung cấp vitamin Natri clorua Cung cấp ion Kích thích phát triển VSV, ức chế vi Hỗn hợp muối mật khuẩn gram (+) Glucose Cung cấp chất dinh dưỡng Neutral Red Chất thị màu 12 Chất thị màu, ức chế vi khuẩn gram Crystal Violet (+) Agar Làm rắn môi trường Thiết bị dụng cụ - Đĩa đếm E coli/coliform PetrifilmTM Đĩa chứa chất dinh dưỡng mật đỏ-tím, chất tạo đơng tan nước lạnh, chất thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua chất thị hoạt độ glucuronidase 5-brom-4-clo-3-indolyl-ß-D-glucuronid, đếm coliform E coli đĩa Vùng sinh trưởng khoanh tròn đĩa chứa khoảng hai mươi ô vuông, có diện tích cm2 màng - Dụng cụ dàn mẫu chất dẻo Gồm có mặt gờ mặt láng, cung cấp đĩa đếm Dùng để dần huyền phù lên khắp vùng sinh trưởng đĩa Hình 4: Dụng cụ dàn mẫu - Pipet Sử dụng pipet hiệu chuẩn, dùng để phân tích vi sinh vật pipet dạng xyranh phân phối 1.0 ml, chia vạch đến 0.1 ml dùng pipet tự động Pipet phải phân phối xác thể tích yêu cầu Không sử dụng pipet để phân phối thể tích nhỏ 10 % dung tích pipet 13 Ví dụ: Khơng dùng pipet có dung tích lớn 10 ml để phân phối ml - Thiết bị đếm khuẩn lạc Lựa chọn loại chuẩn loại có độ khuếch đại độ nhìn thấy tương đương dễ dàng đếm xác khuẩn lạc đĩa Hình 5: Thiết bị đếm khuẩn lạc - Cân Sử dụng cân xác đến 0,1g - Thiết bị phối trộn cao: Phải có bình chứa vơ trùng - Tủ ấm Duy trì nhiệt độ 35°C ± 1°C - Nồi hấp áp lực Có thể trì nhiệt độ 121°C 14 Hình 6: Nồi hấp áp lực Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị tất dung dịch pha loãng thập phân từ 90 ml nước dùng để pha loãng 10 ml dung dịch mẫu thử pha lỗng trước đó, trừ có quy định khác Lắc dung dịch pha loãng 25 lần với biên độ dao động 30 cm Thực phẩm nói chung - Cân vơ trùng 50 g mẫu thử, xác đến 0.1 g, cho vào bình trộn vơ trùng thiết bị trộn tốc độ cao Đối với mẫu đông lạnh, cân mẫu chưa rã đông Ổn định mẫu thử đông lạnh 2°C đến 5°C thời gian không 18 h để lấy 50 g phần mẫu thử, cần Thêm 450 ml nước dùng để pha loãng trộn phút Thời gian trộn mẫu thử đến cấy mẫu lên đĩa môi trường không 15 phút - Nếu tổng khối lượng mẫu khơng đủ 50 g lấy khoảng nửa thêm thể tích nước dùng để pha lỗng cần thiết để có dung dịch pha lỗng 10-1 Tổng thể tích bình trộn phải phủ hồn tồn dao trộn Hạt vỡ - Cân vô trùng 50 g mẫu thử, xác đến 0.1 g, cho vào bình trộn vơ trùng thiết bị trộn Thêm 50 ml nước dùng để pha loãng lắc mạnh (lắc 50 lần với biên độ dao động 30 cm) để thu dung dịch pha loãng 100 Để yên đến lắc trước chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân trước cấy mẫu Bột từ loại hạt 15 - Cân vơ trùng 10 g mẫu thử, xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn vơ trùng thiết bị trộn.Thêm 90 ml nước dùng để pha loãng lắc mạnh (lắc 50 lần với biên độ dao động 30 cm) để thu dung dịch pha loãng 10-1 Để yên phút đến phút lắc trước chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân trước cấy mẫu Cách tiến hành Cấy Đặt đĩa đếm E coli PetrifilmTM lên bề mặt phẳng Nhấc màng mỏng phía nhỏ ml huyền phù mẫu thử vào màng Đậy cẩn thận màng mỏng phía xuống chất cấy, cuộn film xuống tránh tạo bọt khí Dàn huyền phù diện tích 20 cm2 cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (mặt láng dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới) Lấy dụng cụ dàn mẫu để yên đĩa phút cho gel đông đặc lại Ủ Đặt đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang với nắp hướng lên trên, không chồng cao 20 đĩa Đĩa E coli 3M Petrifilm ủ 35℃ 24 ± h (AOAC 998.08, mẫu thịt, gia cầm hải sản) 48 ± h (AOAC 991.14, tất mẫu thực phẩm khác) Đếm khuẩn lạc 3M Petrifilm (môi trường mật đỏ biến tính) chứa 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua thị glucuronidase tạo thành kết tủa xanh lam xung quanh khuẩn lạc E coli có mặt Khoảng 95% E coli tạo khí, khuẩn lạc kết hợp với khí bị vào (trong khoảng đường kính khuẩn lạc) Tất khuẩn lạc màu xanh lam kết hợp với bọt khí tính E coli 16 Hình 7: Khuẩn lạc màng Petrifilm Không đếm khuẩn lạc phát triển ngồi vịng trịn giới hạn mơi trường chọn lọc, khơng đếm bọt khí giả tạo thao tác chưa trình cấy mẫu lên đĩa Tính biểu thị kết Để tính số lượng E coli, nhân tổng số lượng khuẩn lạc đĩa (hoặc số lượng trung bình khuẩn lạc đĩa, đếm đĩa kép độ pha loãng) với số nghịch đảo độ pha loãng tương ứng Khi đếm khuẩn lạc đĩa kép độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình khuẩn lạc cho độ pha loãng trước xác định trung bình số đếm E coli Kết tính sau: N=n× d Trong đó: n: số đếm xác đĩa d: độ pha lỗng tương ứng Nếu khơng có đĩa có số đếm lớn 15 khuẩn lạc với màu đặc trưng kèm bọt khí trở lên (màu xanh khuẩn lạc E coli) ghi lại số đếm xác đĩa có độ pha lỗng thấp (tương ứng với dung dịch pha lỗng nhất) Nếu tất đĩa có số đếm lớn 150 xác định số đếm ước tính cách đếm số khuẩn lạc nhiều vng đại diện, tính số đếm trung bình 17 vng nhân số đếm với 20 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 20 cm2) Trong trường hợp này, phải báo cáo số ước tính Nếu đĩa có mật độ khuẩn lạc lớn để ước tính số đếm kết báo “quá nhiều để đếm” KẾT LUẬN Định lượng E coli phương pháp màng Petrifilm đánh giá nhanh chóng, có độ tin cậy cao đưa đến kết tương đối xác từ giúp giảm thời gian khâu chuẩn bị Đây phương pháp đại hướng đến áp dụng rộng rãi Sử dụng đĩa Petrifilm cho kết đáng tin cậy Tất đĩa Petrifilm sản xuất theo qui trình chứng nhận tiêu chuẩn ISO 9001 qui trình quản lý chất lượng khắc khe Phương pháp kiểm tra đĩa Petrifilm kiểm định công nhận Official Methods of Analysis, AOAC Bộ sản phẩm đĩa cấy Petrifilm giúp quản lý chất lượng gồm: High-sensitivity Coliform Counts, Rapid Coliform Counts, Aerobic Counts, E.coli Counts, Yeast and Mold Counts Enterobacteriaceae Counts 18