Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, màng petrifilm

Trang 7 Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định trong dưới dạng tổngnấm men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải hộp và đếm khuẩn lạc trên môitrường Dichloran 18% Grycerol

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 🙞🙞🙞🙞🙞 BÁO CÁO TIỂU LUẬN MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG NẤM MEN, NẤM MỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC, MÀNG PETRIFILM TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 🙞🙞🙞🙞🙞 BÁO CÁO TIỂU LUẬN MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH ĐỀ TÀI: Định Lượng Nấm Men, Nấm Mốc Bằng Phương Pháp Đếm Khuẩn Lạc, Màng Petrifilm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09, năm 2022 MỤC LỤC Chương Tổng quan nấm men, nấm mốc Chương Định lượng nấm men, nấm mốc phương pháp đếm khuẩn lạc, màng Petrifilm 2.1 Định lượng nấm men phương pháp đếm khuẩn lạc 2.1.1 Môi trường hóa chất .7 2.1.2 Quy trình định lượng 2.2 Định lượng nấm men, nấm mốc phương pháp màng petrifilm 14 2.2.1 Giới thiệu petrifilm .14 2.2.2 Ưu điểm nhược điểm màng petrifilm 14 2.2.3 Quy trình định lượng 15 Chương Kết 17 3.1 Tính tốn kết .17 3.2 Ví dụ 17 Kết luận 19 Tài liệu tham khảo .20 BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC ST T Họ, tên MSSV Cao Thị Mỹ Hạnh 2005208561 Nguyễn Thị Vân Anh 2005208545 Lê Ngọc Quỳnh Hoa 2005208549 Lê Thị Ngân Em 2005208451 Nguyễn Lê Sơn 2005208397 Lớp 11DHTP1 Cơng việc giao PowerPoint, Word 11DHTP1 Tính tốn kết ví dụ 11DHTP1 Định lượng men mốc phương pháp đếm khuẩn lạc 11DHTP1 Tổng quan nấm men, nấm mốc 11DHTP1 Định lượng men mốc phương pháp màng petrifilm Cá nhân tự đánh giá (%) Nhóm đánh giá 100% Hồn thành tốt, thời hạn 100% Hoàn thành tốt, thời hạn 100% Hoàn thành tốt, thời hạn 100% Hoàn thành tốt, thời hạn 100% Hoàn thành tốt, thời hạn Chương Tổng quan nấm men, nấm mốc Nấm men nấm mốc nhóm vi sinh vật đa dạng, có 400,000 lồi nấm men nấm mốc mơ tả Đây nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào lớp vỏ chitin, có nhân bào quan khác Tất loài nấm men nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung cấp lượng từ mơi trường bên ngồi, vi sinh vật thường xuyên phân lập từ thực phẩm hay nguồn giàu dinh dưỡng khác Ta phân biệt nấm men nấm mốc theo khái niệm sau: ● Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành hệ chằng chịt phát triển nhanh gọi khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm ● Nấm men tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, phát triển thành khuẩn lạc trịn, lồi viền đều, bóng mờ bề mặt mơi trường thạch nấm Đơn vị hình thành khuẩn lạc nấm mốc nấm men mầm để tạo nên khuẩn lạc nuôi cấy mơi trường Mầm bào tử, tế bào hay đoạn khuẩn ty Trong thực phẩm sinh trưởng phát triển nấm men, nấm mốc làm thay đổi màu thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc thực phẩm, số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm Quá trình tăng trưởng nấm men nấm mốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố từ môi trường Hầu hết nấm mốc, nấm men thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho phát triển chúng khoảng 20 – 280 oC, số nhóm ưa lạnh hay ưa nóng Nước hoạt tính cũng nhân tố ảnh hưởng quan trọng đến tăng trưởng Hầu hết loài nấm men nấm mốc nấm men phát triển tốt chất hoạt nước có khoảng 85% hay lớn hơn, số lồi phát triển chất có nước hoạt tính thấp khoảng 60-70% Nấm mốc nấm men tăng trưởng vùng pH từ 2-9, ph thích hợp nằm khoảng 4-6,5 Hầu hết nấm men mốc thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, số phát triển điều kiện vi hiếu khí Một số lồi tiếp nhận oxy ngun tử từ chất chúng, dù dạng oxy nguyên tố cần thiết cho trình phát triển nấm men nấm mốc Mật độ nấm men nấm mốc mẫu xác định dạng tổng nấm men nấm mốc kỹ thuật pha loãng, trải hộp đếm khuẩn lạc môi trường Dichloran 18% Grycerol Agar (DG 18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphecinol Agar (DBRC) Môi trường DBRC sử dụng cho loại mẫu thực phẩm thức ăn chăn ni có hoạt độ nước 0.95 thịt, trứng, sản phẩm từ sữa (trừ sữa bột) rau quả, loại pate tươi Môi trường DG18 sử dụng cho loại mẫu thực phẩm thức ăn chăn ni có hoạt độ nước nhỏ 0.95 khô, bánh ngọt, mứt, thịt khơ, cá đuối sản phẩm đậu đỗ, bột mì, hạch, gia vị Trong thực phẩm, có diện mốc men, chúng phát triển làm thay đổi màu sản phẩm phát sinh mùi vị, lạ làm hư hỏng thay đổi cấu trúc thực phẩm số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm Chương Định lượng nấm men, nấm mốc phương pháp đếm khuẩn lạc, màng Petrifilm 2.1 Định lượng nấm men phương pháp đếm khuẩn lạc 2.1.1 Mơi trường hóa chất ❖ Mơi trường PCA Plate count agar (PCA) hoá chất sử dụng cho xác định tổng số lượng vi khuẩn hiếu khí sống mẫu Đây dạng môi trường chọn lọc Số lượng vi khuẩn biểu đơn vị hình thành khuẩn lạc gram (CFU/g) mẫu dung dịch Các mẫu pha loãng mức độ thích hợp bổ sung vào đĩa petri Thạch dạng lỏng vô trùng bổ sung vào đĩa đĩa xoay nhẹ nhàng để đảm bảo trộn mẫu với thạch Đĩa ủ 20 30°C ba ngày Sau ủ, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc đĩa, số nên nằm khoảng 25 - 250 thích hợp để đưa kết xác Khi tính tốn số vi khuẩn thực tế, việc pha loãng nên xem xét cẩn thận Các sản phẩm từ sữa, nước, nước thải, Đây môi trường tương đương với môi trười kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm APHA, AOAC, PHLS ISO khun dùng Mơi trường PCA có dạng gói cân sẵn (pre-weigh) vừa đủ pha lít (hoặc lít) mơi trường giúp tiết kiệm thời gian cân đong hóa chất Nó sử dụng để định lượng psychrotrophic Bảng thành phần môi trường PCA Thành phần Gms/L Casein peptone 5.0 Yeast Extract 2.5 Glucose 1.0 Agar 9-18 ❖ Ứng dụng môi trường PCA: Chất ức chế cặn & ăn mòn chất phân tán cho hàm lượng phosphote siêu thấp Xử lý nước lò hơi: Xử lý bùn cặn canxi cacbonat, canxi photphat, silicat Được sử dụng rộng rãi hệ thống nước nhà máy lọc dầu, nhà máy hóa chất, khoan dầu nhà máy thép,… Xử lý nước mỏ khoan dầu để kiểm sốt quy mơ Kiểm sốt quy mơ thẩm thấu ngược ❖ Môi trường DRBC Bảng thành phần vai trị mơi trường DRBC Thành phần g/l Vai trò Cung cấp hợp chất chứa nitơ, cacbon, Peptone 5.0g/l chuỗi amino acid dài, vitamin chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng Ức chế kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh, Thạch 12-15g/l cho phép phát nấm mốc mọc chậm Nước cất nước 1000 ml loại bỏ ion Cung cấp độ ẩm thích hợp cho vi sinh vật sinh trưởng Là kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn, có Choloramphenicol 0.1g/l thể diệt khuẩn nồng độ cao vi khuẩn nhạy cảm cao Ức chế phát triển vi khuẩn hạn chế Rose Bengal 0.025g/l kích thước khuẩn lạc nấm mốc phát triển nhanh Dichloran (2,6- 0.002g/l dicloro-4-nitroanilin) Magie sulfat (MgSO4.H2O) Kali dihydro phosphate (KH2PO4 ) Dextrose Tác nhân kháng nấm, làm giảm đường kính khuẩn lạc nấm phát triển rộng 0.5g/l 1.0 g/l 10.0 g/l Cung cấp ion dương sulfate Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường Nguồn cung cấp carbohydrate ❖ Môi trường DG18 (dichloran-glycerol) Thành phần g/l Vai trò Ức chế kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc Thạch 12-15g/l nhanh, cho phép phát nấm mốc mọc chậm Magie sulfat (MgSO4.H2O) Dichloran (2,6dicloro-4-nitroanilin) 0.5g/l 0.002g/l Kali dihydro phosphate 1.0g/l (KH2PO4) Cung cấp ion dương sulfate Tác nhân kháng nấm, làm giảm đường kính khuẩn lạc nấm phát triển rộng Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường Là chất rắn, tinh thể không màu, dễ tan nước, có vị khơng D-Glucoza 10,0g đường mía, cũng hay sử dụng môi trường nuôi cấy mô thực vật, động vật môi trường vi sinh vật Glycerol khan ( 2,6dicloro-4-nitroanilin ) Nước cất nước 0,0002g 000 m/l loại ion Có đặc tính kháng khuẩn kháng vi rút Cung cấp độ ẩm thích hợp cho vi sinh vật sinh trưởng Là kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn, Choloramphenicol 0.1g/l diệt khuẩn nồng độ cao vi khuẩn nhạy cảm cao 2.1.2 Quy trình định lượng ❖ Yêu cầu chung Nấm men nấm mốc thường định lượng kỹ thuật đổ đĩa để dễ dàng định lượng kỹ thuật cấy ria bề mặt để tế bào tiếp xúc tối đa với oxy khơng khí tránh bị q nhiệt từ mơi trường thạch nóng chảy Các đĩa thạch rót sẵn cần làm khô trước nuôi cấy [TCVN 8128 (ISO 11133)] 10 thao tác để có dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5, thu lượng vi khuẩn thích hợp Bước Cấy ủ mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1mL mẫu thử dạng lỏng 0,1mL huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác cho vào đĩa thạch DRBC DG18 Dùng pipet vô trùng để chuyển 0,1 mL dung dịch pha loãng thập phân thứ (10-1) (sản phẩm dạng lỏng) 0,1 mL dung dịch pha loãng thập phân 10 -2 (sản phẩm dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC DG18 thứ hai Để thuận tiện cho việc định lượng lượng nhỏ nấm men nấm mốc, lấy lượng đến 0,3mL dung dịch pha loãng 10-1 mẫu mẫu thử dạng lỏng, dàn ba đĩa Lặp lại thao tác với dung dịch pha lỗng tiếp theo, sử dụng pipet vơ trùng cho dung dịch pha loãng Dàn dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch que dàn mẫu vô trùng dịch lỏng hấp thu hết vào mơi trường Có thể sử dụng kỹ thuật cấy phương pháp đổ đĩa trường hợp tương đương kết phải đánh giá cách so sánh với kết cấy bề mặt đĩa Phương pháp cấy bề mặt cho kết định lượng cao Kỹ thuật dàn đĩa tạo điều kiện cho tế bào tiếp xúc tối đa với oxi khơng khí tránh nguy bị bất hoạt nhiệt chồi nấm Các kết phụ thuộc vào loại nấm Ủ đĩa chuẩn bị môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thẳng đứng tủ ấm 25 ± 1oC 3÷5 ngày Khuyến cáo ủ đĩa túi chất dẻo để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trường hợp nấm mốc lan đĩa Bước Đếm chọn khuẩn lạc để khẳng định Đếm đĩa khoảng thời gian ủ từ 3÷5 ngày Chọn đĩa chứa 150 khuẩn lạc đếm chúng Nếu đĩa có nấm mốc mọc nhanh đếm khuẩn lạc sau ủ ngày đếm lại sau ủ ngày Tiến hành kiểm tra kính hiển vi để phân biệt tế bào nấm men nấm mốc vi khuẩn từ khuẩn lạc, cần Đếm khuẩn lạc nấm men nấm mốc riêng lẽ, cần 12 Để nhận biết nấm men nấm mốc, chọn vùng phát triển nấm lấy để kiểm tra kính hiển vi cấy mơi trường phân lập nhận dạng thích hợp Đếm đĩa chứa từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc Nếu hệ nấm gồm chủ yếu nấm mốc, chọn đĩa có vùng phát triển thấp hơn; hệ nấm gồm chủ yếu nấm men, chọn đĩa có số đếm lên đến giới hạn để đếm Nếu việc nhận biết khuẩn lạc cịn có nghi ngờ, kiểm tra cách soi tươi nhuộm màu tế bào từ năm khuẩn lạc mẫu để khẳng định khơng có mặt vi khuẩn 13 2.2 Định lượng nấm men, nấm mốc phương pháp màng petrifilm 2.2.1 Giới thiệu petrifilm Đĩa petrifilm đĩa chứa môi trường làm sẵn thay cho môi trường agar truyền thống Mỗi đĩa gồm chất gel hòa tan nước, dinh dưỡng chất thị làm khô cố định lớp film mỏng Khi tiến hành thí nghiệm, 1ml mẫu cấy vào petrifilm ủ Chất màu đặc biệt đĩa khiến khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt mắt thường Và đường kẻ ô vuông giúp cho việc đếm số lượng khuẩn lạc dễ dàng Trong kỹ thuật này, môi trường dinh dưỡng dạng đông khô cố định giá thể mỏng phủ màng bảo vệ Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ tách phần để bổ sung 1ml dịch mẫu lên bề mặt môi trường, sau phủ lại màng bảo vệ Đĩa petrifilm kiểm tra hầu hết loại vi sinh vật phổ biến không cần qua bước khẳng định sinh hóa phương pháp truyền thống 2.2.2 Ưu điểm nhược điểm màng petrifilm ❖ Ưu điểm Dễ thao tác Kết quán Thời gian sử dụng lâu Không cần hấp khử trùng môi trường Nhanh, loại bỏ bước chuẩn bị môi trường Thiết kế nhỏ gọn, tiết kiệm không gian ủ bảo quản ❖ Nhược điểm Giá thành cao Miếng petrifilm có khả làm nhòe khuẩn lạc mọc to 14 Phải lưu trữ lạnh Phải sử dụng hết gói khoảng thời gian định đem khỏi tủ lạnh khơng để lại tủ lạnh Có khả lây nhiễm khéo đĩa petrifilm với q trình ni cấy 2.2.3 Quy trình định lượng Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Cân xác 10g mẫu rắn đong mẫu với thể tích 10mL mẫu lỏng phần mẫu thử đại diện, với sai số cho phép ±5% cho vào bao PE vơ trùng (hoặc bình tam giác) Cho dung dịch pha loãng SPW 90mL (sai số cho phép ±5%) vô trùng vào bao PE (hoặc bình tam giác) chứa mẫu Đồng mẫu máy dập mẫu phút lắc bình tam giác có mẫu dịch pha lỗng SPW 2-3 phút Để vi sinh vật không bị tổn thương thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ dịch pha lỗng suốt q trình thao tác ln phải giữ xấp xỉ nhiệt độ phịng Mục đích: Đồng mẫu Bước 2: Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1mL huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào ống nghiệm chứa 9mL dịch pha lỗng SPW vơ trùng nhiệt độ thích hợp Để có độ xác tối ưu, khơng nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu 1cm Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng Trộn máy vortex 5-10 giây để thu dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với loại mẫu làm từ nguyên chất thu dung dịch pha loãng 10 -1) Nếu cần, lặp lại thao tác để có dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,… đạt nồng độ pha lỗng thích hợp 15 Mục đích: pha loãng mẫu Bước 3: Cấy ủ mẫu Đặt đĩa đếm nấm men nấm mốc lên bề mặt mặt phẳng Nhất màng mỏng phía ra, giữ pipet vng góc với đĩa cấy cẩn thận mL huyến phù thử nghiệm vào mảng mỏng Đậy màng mỏng phía xuống chất cấy Dùng tay nhấc que dàn mẫu chất dẻo Dóng thẳng tâm que dán mẫu với tâm dĩa Dàn huyền phù cách ấn nhẹ que dàn mẫu xuống tâm đĩa Không gạt que dàn mẫu từ bên sang bên màng mỏng Lấy que dàn mẫu để yên đĩa 1giây cho đông đặc lại Đặt đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang, hướng lên trên, không chồng cao 20 đĩa Ủ đĩa năm ngày nhiệt độ từ 20°C đến 25°C Mục đích: Giúp dịch lỏng hấp thu vào bề mặt môi trường Bước 4: Đếm khuẩn lạc Để tính số nấm men nấm mốc, nhân số lượng tổng số nấm men nấm mốc/ đĩa (hoặc số lương tSrung bình khuẩn lạc/đĩa, đếm đĩa kép độ pha loãng) với hệ số pha loãng tương ứng Khi đếm khuẩn lạc đĩa kép độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình khuẩn lạc cho Sđộ pha lỗng trước xác định trung bình số đếm nấm men nấm mốc Tiến hành kiểm tra kính hiển vi để phân biệt tế bào nấm men nấm mốc từ khuẩn lạc cần Mục đích: nhận biết nấm men, nấm mốc, chọn vùng phát triển nấm lấy để kiểm tra kính hiển vi cấy mơi trường phân lập nhận dạng thích hợp 16 Chương Kết 3.1 Tính tốn kết Tổng số nấm men nấm mốc 1g mẫu (X) tính theo cơng thức: N= ΣCC CFU CFU hay g ml V × [ n1+ ( 0.1× n2 ) ] ×d ( ) Trong đó: N: số khuẩn lạc 1mL (1g) mẫu C: tổng số khuẩn lạc nấm men nấm mốc đếm đĩa độ pha loãng liên tiếp V: Thể tích dịch cấy cấy đĩa, tính ml n1: Số đĩa độ pha loãng thứ giữ lại n2: Số đĩa độ pha loãng thứ hai giữ lại d: Độ pha loãng giữ lại Làm tròn kết thu đến hai chữ số có nghĩa (chẳng hạn 2864 làm trịn thành 2900) Biểu thị cơng thức: a x 10n a: chữ số thập phân tương ứng có giá trị từ 1.0 đến 9.9 n: số mũ phù hợp 10 3.2 Ví dụ Tính kết tổng vi sinh vật hiếu khí Độ pha lỗng Số khuẩn lạc 10−3 10−4 168 19 173 15 Số khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí đếm hai độ pha loãng liên tiếp là: 17 Ở độ pha loãng d= 10−3 : đếm 168 khuẩn lạc 173 khuẩn lạc Ở độ pha loãng d= 10−4: đếm 19 khuẩn lạc 15 khuẩn lạc, ta có: X= 168+173+ 15+ 19 =170454 −3 ×⟦ 2+(0,1 ×2) ⟧×10 Làm trịn kết 1,7 ×10 CFU/g CFU/ml 18 Kết luận Với phương pháp định lượng nấm men mốc phương pháp đếm khuẩn lạc petrifilm giúp hiểu sâu khái niệm nấm mốc nấm men Bên cạnh giúp chọn mơi trường hóa chất thích hợp để ni cấy loài vi sinh vật phát triển Đếm khuẩn lạc giúp biết cách đếm cho màng petrifilm để điếm định lượng đếm nhanh vi sinh vật Qua ta tính tốn kết sai số việc ghi nhận kết 19 Tài liệu tham khảo [1] Giáo trình phân tích vi sinh Khoa Cơng nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM, 2002 [2] Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8275-2:2010 (ISO 21527-2:2008) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng nấm men nấm mốc – Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ 0,95, 2010 [3] Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6507 (ISO 6887) (tất phần) Vi sinh vật học Hướng dẫn chung việc chuẩn bị dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh vật [4] Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7852:2008 Thực phẩm - đếm nấm men nấm mốc phương pháp màng khơ hồn nước (phương pháp petrifilm) 20