Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, màng petrifilm

Trang 7 Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định trong dưới dạng tổngnấm men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải hộp và đếm khuẩn lạc trên môitrường Dichloran 18% Grycerol

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

MỤC LỤC

Chương 1 Tổng quan về nấm men, nấm mốc 5

Chương 2 Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, màng Petrifilm 7

2.1 Định lượng nấm men bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 7

2.1.1 Môi trường và hóa chất 7

2.1.2 Quy trình định lượng 9

2.2 Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp màng petrifilm 14

2.2.1 Giới thiệu về petrifilm 14

2.2.2 Ưu điểm và nhược điểm màng petrifilm 14

2.2.3 Quy trình định lượng 15

Chương 3 Kết quả 17

3.1 Tính toán kết quả 17

3.2 Ví dụ 17

Kết luận 19

Tài liệu tham khảo 20

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

Nhóm đánh giá

1 Cao Thị Mỹ Hạnh

2005208561

11DHTP15

PowerPoint,

Hoànthành tốt,đúng thờihạn

2 Nguyễn Thị Vân Anh

2005208545

11DHTP15

Tính toán kếtquả và ví dụ 100%

Hoànthành tốt,đúng thờihạn

3 Lê Ngọc Quỳnh Hoa

2005208549

11DHTP15

Định lượng menmốc bằngphương phápđếm khuẩn lạc

100%

Hoànthành tốt,đúng thờihạn

4 Lê Thị Ngân Em

2005208451

11DHTP15

Tổng quan vềnấm men, nấmmốc

100%

Hoànthành tốt,đúng thờihạn

5 Nguyễn Lê Sơn

2005208397

11DHTP15

Định lượng menmốc bằngphương phápmàng petrifilm

100%

Hoànthành tốt,đúng thờihạn

5

Chương 1 Tổng quan về nấm men, nấm mốc

Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn400,000 loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật,

có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác Tất cả các loài nấm men

và nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cungcấp năng lượng từ môi trường bên ngoài, vì thế vi sinh vật này thường xuyên đượcphân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác Ta có thể phân biệt nấmmen và nấm mốc theo các khái niệm cơ bản như sau:

● Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ chằng chịtphát triển rất nhanh gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm

● Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, pháttriển thành các khuẩn lạc tròn, lồi viền đều, bóng hoặc mờ trên bề mặtmôi trường thạch nấm Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc vànấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môitrường Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn

ty Trong thực phẩm nếu có thể sinh trưởng và phát triển của nấm men,nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ,làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực phẩm, một số tạo độc tố gâyngộ độc thực phẩm

Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố

từ môi trường Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt

độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 280oC, một số ít trongnhóm này ưa lạnh hay ưa nóng Nước hoạt tính cũng là một nhân tố ảnh hưởng rấtquan trọng đến tăng trưởng Hầu hết các loài nấm men nấm mốc và nấm men pháttriển tốt trong cơ chất hoạt nước có khoảng 85% hay lớn hơn, một số ít loài có thể pháttriển trong cơ chất có nước hoạt tính thấp hơn khoảng 60-70% Nấm mốc và nấm men

có thể tăng trưởng trong vùng pH từ 2-9, trong đó ph thích hợp nhất nằm trong khoảng4-6,5 Hầu hết nấm men và mốc đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể pháttriển trong điều kiện vi hiếu khí Một số loài có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chấtcủa chúng, nhưng dù ở dạng nào oxy vẫn là nguyên tố cần thiết cho quá trình pháttriển của nấm men và nấm mốc

Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định trong dưới dạng tổngnấm men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải hộp và đếm khuẩn lạc trên môitrường Dichloran 18% Grycerol Agar (DG 18) hay Dichloran Rose BengalChloramphecinol Agar (DBRC) Môi trường DBRC được sử dụng cho các loại mẫuthực phẩm và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước hơn 0.95 như thịt, trứng, các sảnphẩm từ sữa (trừ sữa bột) rau quả, các loại pate tươi Môi trường DG18 được sửdụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặcbằng 0.95 như quả khô, bánh ngọt, mứt, thịt khô, cá đuối các sản phẩm đậu đỗ, bột mì,quả hạch, gia vị

Trong thực phẩm, khi có sự hiện diện của mốc và men, chúng phát triển làmthay đổi màu của sản phẩm phát sinh mùi vị, lạ làm hư hỏng thay đổi cấu trúc của thựcphẩm một số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm

7

Chương 2 Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, màng Petrifilm

2.1 Định lượng nấm men bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

2.1.1 Môi trường và hóa chất

❖ Môi trường PCA

Plate count agar (PCA) là hoá chất được sử dụng cho xác định tổng số lượng vikhuẩn hiếu khí sống trong mẫu Đây không phải là dạng môi trường chọn lọc Sốlượng vi khuẩn được biểu hiện như các đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gram (CFU/g)trong mẫu dung dịch Các mẫu được pha loãng ở mức độ thích hợp sẽ được bổ sungvào các đĩa petri Thạch dạng lỏng vô trùng được bổ sung vào những đĩa này và đĩađược xoay nhẹ nhàng để đảm bảo trộn đều mẫu với thạch Đĩa được ủ ở 20 hoặc 30°Ctrong ba ngày Sau khi ủ, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa, con số nàynên nằm trong khoảng 25 - 250 là thích hợp nhất để đưa ra kết quả chính xác Khi tínhtoán con số vi khuẩn thực tế, việc pha loãng nên được xem xét cẩn thận

Các sản phẩm từ sữa, nước, nước thải, Đây là môi trường tương đương vớimôi trười kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm do APHA, AOAC, PHLS và ISO khuyêndùng

Môi trường PCA hiện có dạng gói cân sẵn (pre-weigh) vừa đủ pha 1 lít (hoặc 8lít) môi trường giúp tiết kiệm thời gian cân đong hóa chất

Nó được sử dụng để định lượng psychrotrophic

Bảng thành phần của môi trường PCA

❖ Ứng dụng của môi trường PCA:

Chất ức chế các cặn & ăn mòn và chất phân tán cho hàm lượng phosphote siêuthấp

Xử lý nước lò hơi: Xử lý bùn cặn canxi cacbonat, canxi photphat, silicat.

Được sử dụng rộng rãi trong các hệ thống nước của nhà máy lọc dầu, nhà máyhóa chất, khoan dầu và nhà máy thép,…

Xử lý nước mỏ khoan dầu để kiểm soát quy mô

Kiểm soát quy mô trong thẩm thấu ngược

Ức chế sự kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh,

vì thế cho phép phát hiện những nấm mốc mọc chậm

Nước cất hoặc nước

Dichloran

(2,6-dicloro-4-nitroanilin)

0.002g/l Tác nhân kháng nấm, làm giảm đường kính của

khuẩn lạc nấm khi phát triển rộng ra

Dextrose 10.0 g/l Nguồn cung cấp carbohydrate

❖ Môi trường DG18 (dichloran-glycerol)

9

Thành phần g/l Vai trò

Ức chế sự kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh, vì thế cho phép phát hiện những nấm mốc mọc chậm

Là kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn, nhưng

có thể diệt khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao

2.1.2 Quy trình định lượng

❖ Yêu cầu chung

Nấm men và nấm mốc thường được định lượng bằng một kỹ thuật đổ đĩa để dễdàng định lượng hơn hoặc bằng kỹ thuật cấy ria bề mặt để các tế bào có thể tiếp xúctối đa với oxy trong không khí và tránh bị quá nhiệt từ môi trường thạch nóng chảy.Các đĩa thạch đã rót sẵn cần được làm khô trước khi nuôi cấy [TCVN 8128 (ISO11133)]

Một số loại nấm men và nấm mốc có thể bị lây nhiễm hoặc có thể gây dị ứng,ngay cả với người khỏe mạnh Do đó, cần thận trọng khi xử lý chúng Tốt nhất, đĩađược giữ trong tủ ấm, không để trong phòng mở Chỉ mở nắp đĩa khi cần, ví dụ: đểchuẩn bị phiến kính để kiểm tra dưới kính hiển vi; Kim cấy phải để nguội trước khithực hiện việc cấy truyền, để tránh phát tán các bào tử và các tế bào khác Bàn làmviệc và tủ ấm phải được khử trùng thường xuyên.

Các đĩa Petri cần được để trong ủ ấm theo hướng thẳng đứng và không bị xáotrộn cho đến khi đếm, vì nếu di chuyển làm giải phóng các bào tử nấm mốc hoặc bào

tử và dẫn đến phát triển tiếp các khuẩn lạc vệ tinh làm cho số đếm bị tăng cao

Sơ đồ quy trình định lượng nấm men, nấm mốc

bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

❖ Cách tiến hành

Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích10mL/25mL đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%,cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác) Cho dung dịch pha loãng SPW90mL/225mL (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu

Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặclắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2÷3 phút Để vi sinh vật không

bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốtquá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng Do các bào tử lắng xuốngnhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầyvới một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp

Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránhcác phần tử có vi sinh vật lắng xuống

Bước 2 Pha loãng mẫu

Dùng pipet vô trùng lấy 1 mL huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào mộtống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp Trộn kỹbằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2 (đối với cácloại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1) Nếu cần, lặp lại

11

thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, cho đến khi thu đượclượng vi khuẩn thích hợp.

Bước 3 Cấy và ủ mẫu

Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1mL mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1mL huyền phùban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18

Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0,1 mL dung dịch pha loãng thập phân thứnhất (10-1) (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0,1 mL dung dịch pha loãng thập phân 10-2

(sản phẩm ở dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18 thứ hai Để thuận tiệncho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượng đến 0,3mLdung dịch pha loãng 10-1 của mẫu hoặc của mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên ba đĩa

Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vôtrùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạchbằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi dịch lỏng hấp thu hết vào môi trường

Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa nhưng trong trường hợpnày sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quảđược cấy trên bề mặt đĩa Phương pháp cấy bề mặt có thể cho kết quả định lượng caohơn Kỹ thuật dàn đĩa tạo điều kiện cho các tế bào tiếp xúc tối đa với oxi của khôngkhí và tránh mọi nguy cơ bị bất hoạt do nhiệt của chồi nấm Các kết quả có thể phụthuộc vào từng loại nấm

Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thếthẳng đứng trong tủ ấm ở 25 ± 1oC trong 3÷5 ngày Khuyến cáo ủ các đĩa trong túichất dẻo để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trong trường hợp nấm mốc lan ra ngoài đĩa

Bước 4 Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Đếm các đĩa trong khoảng thời gian ủ từ 3÷5 ngày Chọn các đĩa chứa ít hơn

150 khuẩn lạc và đếm chúng Nếu trên các đĩa có nấm mốc mọc quá nhanh thì có thểđếm các khuẩn lạc sau khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày

Tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt giữa các tế bào nấm menhoặc nấm mốc và vi khuẩn từ các khuẩn lạc, nếu cần

Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra đểkiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thíchhợp.

Đếm các đĩa chứa từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc Nếu hệ nấm gồm chủ yếu

là các nấm mốc, thì chọn các đĩa có vùng phát triển thấp hơn; nếu hệ nấm gồm chủ yếu

là các nấm men, thì chọn các đĩa có số đếm lên đến giới hạn trên để đếm

Nếu việc nhận biết các khuẩn lạc còn có sự nghi ngờ, thì kiểm tra bằng cách soitươi hoặc nhuộm màu tế bào từ ít nhất năm khuẩn lạc trên mỗi mẫu để khẳng định sựkhông có mặt của vi khuẩn

13

2.2 Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp màng petrifilm

2.2.1 Giới thiệu về petrifilm

Đĩa petrifilm là đĩa chứa môi trường làm sẵn thay thế cho môi trường agartruyền thống Mỗi đĩa gồm chất gel hòa tan trong nước, dinh dưỡng và chất chỉ thịđược làm khô và cố định trên lớp film mỏng

Khi tiến hành thí nghiệm, 1ml mẫu được cấy vào petrifilm và ủ Chất màu đặcbiệt trên đĩa khiến các khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt bằng mắt thường

Và các đường kẻ ô vuông sẽ giúp cho việc đếm số lượng khuẩn lạc dễ dàng hơn

Trong kỹ thuật này, môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định trênmột giá thể mỏng và được phủ bằng một màng bảo vệ

Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ được tách một phần để có thể bổ sung 1ml dịchmẫu lên bề mặt môi trường, sau đó phủ lại bằng màng bảo vệ

Đĩa petrifilm có thể kiểm tra hầu hết các loại vi sinh vật phổ biến và không cầnqua các bước khẳng định sinh hóa như phương pháp truyền thống

2.2.2 Ưu điểm và nhược điểm màng petrifilm

❖ Ưu điểm

Dễ thao tác

Kết quả nhất quán

Thời gian sử dụng lâu

Không cần hấp khử trùng môi trường

Nhanh, loại bỏ các bước chuẩn bị môi trường

Thiết kế nhỏ gọn, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản

❖ Nhược điểm

Giá thành cao

Miếng petrifilm có khả năng làm nhòe khuẩn lạc khi mọc to

Phải lưu trữ lạnh.

Phải sử dụng hết 1 gói trong khoảng thời gian nhất định khi đem ra khỏi tủ lạnh

và không được để lại tủ lạnh

Có khả năng lây nhiễm khéo giữa các đĩa petrifilm với nhau trong quá trìnhnuôi cấy

2.2.3 Quy trình định lượng

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10mL đối vớimẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện, với sai số cho phép ±5% cho vào bao PE vôtrùng (hoặc bình tam giác)

Cho dung dịch pha loãng SPW 90mL (sai số cho phép ±5%) vô trùng vào bao

PE (hoặc bình tam giác) chứa mẫu

Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác cómẫu và dịch pha loãng SPW trong 2-3 phút

Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độcủa dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độphòng

Mục đích: Đồng nhất mẫu

Bước 2: Pha loãng mẫu

Dùng pipet vô trùng lấy 1mL huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào mộtống nghiệm chứa 9mL dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp

Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn1cm Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng

Trộn đều bằng máy vortex trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2

(đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1).Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5,… cho đếnkhi đạt được nồng độ pha loãng thích hợp

15

Mục đích: pha loãng mẫu.

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

Đặt đĩa đếm nấm men và nấm mốc lên bề mặt mặt phẳng Nhất tấm màng mỏngphía trên ra, giữ pipet vuông góc với đĩa và cấy cẩn thận 1 mL huyến phù thử nghiệmvào chính giữa mảng mỏng Đậy tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy

Dùng tay nhấc que dàn mẫu bằng chất dẻo Dóng thẳng tâm que dán mẫu vớitâm dĩa Dàn đều huyền phù bằng cách ấn nhẹ que dàn mẫu xuống tâm đĩa Không gạtque dàn mẫu từ bên này sang bên kia màng mỏng Lấy que dàn mẫu ra và để yên đĩatrong 1giây cho đông đặc lại

Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang, hướng lên trên, không chồngcao quá 20 đĩa Ủ các đĩa này năm ngày ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C

Mục đích: Giúp dịch lỏng hấp thu được vào bề mặt môi trường

Tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt giữa các tế bào nấm menhoặc nấm mốc từ các khuẩn lạc nếu cần

Mục đích: nhận biết nấm men, nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra

để kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thíchhợp