TỔNG QUAN VỀ THÍ NGHIỆM1 Trang 5 CHƯƠNG 4.DANH MỤC BẢNG BIỂUBảng 1:Môi trường và hoá chất 1 Trang 6 CHƯƠNG 5.CHƯƠNG 6.TỔNG QUAN VỀ THÍ NGHIỆM6.1.Khái niệm về E.coli6.2.Escherichia coli
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
TIỂU LUẬN
ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM
Trang 3MỤC LỤC
CHƯƠNG 1.
1.1 Khái niệm về E.coli 1
1.2 Phạm vi áp dụng 1
1.3 Nguyên tắc 1
1.4 Môi trường và hoá chất 2
1.4.1 Môi trường SPW 2 1.4.2 Môi trường TBX 2 CHƯƠNG 2 QUY TRÌNH TIẾN HÀNH 4 2.1 Thiết bị và dụng cụ 4
2.2 Quy trình phân tích 6
2.3 Các bước tiến hành 7
2.4 Màu của khuẩn lạc trong môi trường TBX 7
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 9 3.1 Kết quả 9
3.2 Biểu thị kết quả 9
CHƯƠNG 2.
Trang 5CHƯƠNG 4 DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2:Bảng số khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng 8
Trang 6CHƯƠNG 5.
6.2.Escherichia coli là một trong những vi sinh vật thường gặp trong môi trường.
E.coli là dạng trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến
trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hóa của người và động vật Chúng thuộcloại glucose và lactose dương tính, indol và methyl red dương tính song có phản ứng
VP và citrate âm tính
6.3.Nhiều người không E.coli là vi sinh vật gây bệnh do thực phẩm song những nghiên
cứu đây cho thấy một số chủng của chúng thực sự có khả năng gây bệnh lây lan quathực phẩm rất nghiêm trọng Chúng có trong các loại thực phẩm như cá hồi, pho – mai,
thịt sữa,… Ngoài ra, E.coli có mặt trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu
cơ
6.4.Độc tố của chúng rất nhạy với nhiệt, có khả năng tạo ra loại độc bền nhiệt E.coli
có nguy cơ rất lớn đối với trẻ em, đặc biệt là những bệnh liên quan đến hội chứng dunghuyết hoặc phân có máu
Hình 1:Vi khuẩn E.coli
Trang 7khi ủ môi trường ở 440C trong 24 giờ Đếm các khuẩn lạc E.coli điển hình trên môi trường TBX Kết quả được biểu thị bằng số E.coli trên 1g mẫu pha loãng.
Môi trường- Hoá chất Mục đích
Saline Pepton Water (SPW) Pha loãng mẫu
Chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần Phân phối 90ml
dịch pha loãng vào các bình (hoặc lọ có nắp vặn) và 9ml vào các ống nghiệm Đậy nắpbình và ống nghiệm, hấp khử trùng
Mục đích: Dùng để pha loãng mẫu
Trang 8Khử trùng môi trường 15 phút ở nhiệt độ 121°C trong nồi hấp áp lực Làm nguội ngaymôi trường trên nồi cách thủy đến khoảng từ 44°C đến 47°C.
Mục đích:Dùng làm môi trường nuôi cấy E.coli
Trang 9CHƯƠNG 7 QUY TRÌNH TIẾN HÀNH
Hình 2: Đĩa petri
\
Hình 3: Bộ đếm khuẩn lạc
Trang 10Hình 4: Máy votrex
Hình 5: Nồi hấp tiệt trùng
Hình 6: Máy dập mẫu
Trang 117.2 Quy trình phân tích
10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone
TBX
(TBX đã đun chảy vàlàm nguội đến 47°C)
Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đôngđặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 44°C trong 24 giờ
Đọc kết quảChọn các đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp
Tính và biểu thị kết quả
Trang 127.3 Các bước tiến hành Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml/25ml đối vớimẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vôtrùng (bình tam giác)
Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml ( sai số cho phép ± 5%) vô trùng vào túinhựa (bình tam giác chứa mẫu)
Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đềubình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2÷3 phút
Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không
để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãngthích hợp
Bước 2 Pha loãng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào một ốngnghiệm có chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt đọ thích hợp
Trộn kĩ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dịch pha loãng 10-2 (đối với cácloại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1) Nếu cần, lặp lạithao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5,… cho đến khi thu đượclượng vi khuẩn nhất định
Bước 3 Cấy và ủ mẫu
Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu đốivới sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa hai đĩa petri Sử dụng 2 nồng độ pha loãngliên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri Rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml môi trường TBX Lật
úp đĩa và ủ ở 44°C trong 24 giờ
7.4 Màu của khuẩn lạc trong môi trường TBX
Đối với môi trường TBX (Tryptone Bile X-glucuronide) thì trong thành phần của môitrường này có Acid 5-bromo-4chloro-3-indolyl-D-beta- glucuronide, đây là thành phần
Trang 13quan trọng để quyết định màu của khuẩn lạc E.Coli trong qua trình sinh trưởng và
đếm
Giải thích cho màu của khuẩn lạc E.coli được hiểu đơn giản như sau:
Sự có mặt của enzyme β-D-glucuronidase giúp phân biệt hầu hết E.coli với các vi khuẩn Coliform khác E.coli hấp thụ cơ chất sinh màu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-
D-glucuronide (X- β-D-glucuronide) Enzym β-glucuronidase chia đôi liên kết giữa cơ
chất sinh màu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl và β-D-glucuronide Các khuẩn lạc E.coli
sau đó sẽ có màu từ màu xanh lam đến màu xanh lam lá cây Nhưng màu thể hiện rõ
nhất là màu xanh lam Bên cạnh một số chủng E.coli có màu thì đối với 1 số chủng âm
tính với enzyme Beta-D sẽ biểu hiện là các khuẩn lạc không màu
7.5.
Hình 7: Màu khuẩn lạc E.coli
Trang 14CHƯƠNG 8 KẾT QUẢ
Tổng số E.coli trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức:
(CFU/g hay CFU/ml)
C: Tổng số khuẩn lạc E.coli đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa
Sau khi tính kết quả, nếu chữ số thứ 3 nhỏ hơn 5 thì không thay đổi chữ số đứng trước
nó, nếu chữ số thứ 3 lớn hơn hoặc bằng 5 thì tăng chữ số đứng trước lên 1 đơn vịtương ứng của 10, hoặc làm tròn số với 2 chữ số có nghĩa
Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa tươngứng của 10, hoặc làm tròn số với 2 chữ số có nghĩa
Ví dụ: Tính kết quả của vi vật E.coli trong sản phẩm thịt đông lạnh tiệt trùng
Trang 15Làm tròn kết quả là 1,3×105CFU/g (hoặc CFU/ml)
Kết quả 1,3×105 CFU/g (hoặc CFU/ml) cho biết
Tổng số E.coli trong 1g mẫu thịt đông lạnh là 1,3×105CFU/gGiới hạn cho phép: 102 (theo quyết định 46/2007 của Bộ Y tế)
X = 1,3×105> 102Kết luận: Mẫu thực phẩm không đạt yêu cầu
Trang 16TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Bộ môn khoa học thực phẩm, Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại
học Công nghiệp Thực phẩm TP HCM, 2016
[2] TCVN 7924-2:2008, Vi sinh vật thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp
định lượng E.coli, phần 2: kĩ thuật đếm khuẩn lạc ở 44oC sử dụng indolyl và β-D-glucuronide
Trang 175-bromo-4-chloro-3-CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM
Vi khuẩn E.Coli là vi khuẩn?
Vai trò của môi trường SPW cho việc sử dụng định lượng E.Coli?
Phát triển và sinh trưởng E.coli
Pha loãng mẫu
Nuôi cấy E.coli
Tất cả đáp án trên
Đáp án: B
Vai trò của môi trường TBX cho việc sử dụng định lượng E.Coli?
Phát triển và sinh trưởng E.coli
Pha loãng mẫu
Nuôi cấy E.coli
Trang 19Tất cả đáp án trên
Đáp án: D
Tại sao dịch pha loãng trong quá trình thao tác phải giữ xấp xỉ ở nhiệt độ phòng?
Để vi sinh vật thuận lợi phát triển
Để vi sinh vật không bị tổn thương
Trong quá trình chuẩn bị mẫu thử do các bào tử trong môi trường lắng nhanh trong
pipet vì thể nên để pipet ở tư thế?
Quy trình tiến hành định lượng E.Coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc?
Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu→Pha loãng mẫu→Cấy và ủ mẫu→
Mục đích của việc chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu?
Hòa tan môi trường
Đo môi trường
Hòa tan môi trường và đo môi trường ở 10-1
Hòa tan môi trường và đo môi trường ở 10-2
Đáp án: C
Mục đích của bước pha loãng mẫu?
Tạo môi trường cho vsv phát triển trên mặt đĩa
Hòa tan môi trường
Trang 20Để dễ dàng tính được số khuẩn lạc
Đáp án: C
Mục đích của việc cấy và ủ mẫu?
Tạo môi trường cho vsv phát triển trên mặt đĩa
Hòa tan môi trường
Làm giảm mật độ VSV (để đếm được VSV chính xác hơn)
BCIG có trong môi trường TBX dùng để?
Xác định tính di động và nuôi dưỡng vi sinh vật
Kích thích sự phát triển của vi sinh vật
Dùng để pha chế môi trường
Dùng để phát hiện E.Coli ( đổi màu xanh )
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 120 sau 24 giờ nuôi cấy
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 48 giờ nuôi cấy
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 120 sau 48 giờ nuôi cấy
Trang 21Không màu
Đáp án: D
27 Vai trò của thành phần NaCl có trong môi trường SPW?
A Cung cấp protein (nitơ)
B Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của môi trường
C Kích thích sự phát triển VSV
D Xác định tính di động & nuôi dưỡng VSV
Đáp án: B
28 Vai trò của thạch có trong môi trường TBX?
A Cung cấp protein (nitơ)
B Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của môi trường
C Kích thích sự phát triển VSV
D Xác định tính di động & nuôi dưỡng VSV
Đáp án: D
29 Vai trò của muối mật có trong môi trường TBX?
A Cung cấp protein (nitơ)
B Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của môi trường