Định lượng vi khuẩn escherichia coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

TỔNG QUAN VỀ THÍ NGHIỆM1 Trang 5 CHƯƠNG 4.DANH MỤC BẢNG BIỂUBảng 1:Môi trường và hoá chất 1 Trang 6 CHƯƠNG 5.CHƯƠNG 6.TỔNG QUAN VỀ THÍ NGHIỆM6.1.Khái niệm về E.coli6.2.Escherichia coli

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC TP HỒ CHÍ MINH, 2022 TP HỒ CHÍ MINH, 2022 MỤC LỤC CHƯƠNG MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH ẢNH ii DANH MỤC BẢNG BIỂU iii CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ THÍ NGHIỆM 1.1 Khái niệm E.coli 1.2 Phạm vi áp dụng .1 1.3 Nguyên tắc 1.4 Mơi trường hố chất .2 1.4.1 Môi trường SPW 1.4.2 Môi trường TBX CHƯƠNG QUY TRÌNH TIẾN HÀNH 2.1 Thiết bị dụng cụ 2.2 Quy trình phân tích 2.3 Các bước tiến hành 2.4 Màu khuẩn lạc môi trường TBX .7 CHƯƠNG KẾT QUẢ 3.1 Kết .9 3.2 Biểu thị kết CHƯƠNG CHƯƠNG DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1:Vi khuẩn E.coli Hình 2:Đĩa petri Hình 3:Bộ đếm khuẩn lạc Hình 4:Máy votrex Hình 5:Nồi hấp tiệt trùng Hình 6:Máy dập mẫu Hình 7: Màu khuẩn lạc E.coli CHƯƠNG DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1:Môi trường hoá chất Bảng 2:Bảng số khuẩn lạc độ pha loãng CHƯƠNG CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ THÍ NGHIỆM 6.1 Khái niệm E.coli 6.2.Escherichia coli vi sinh vật thường gặp môi trường E.coli dạng trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, khơng sinh bào tử, phổ biến tự nhiên đặc biệt đường tiêu hóa người động vật Chúng thuộc loại glucose lactose dương tính, indol methyl red dương tính song có phản ứng VP citrate âm tính 6.3.Nhiều người không E.coli vi sinh vật gây bệnh thực phẩm song nghiên cứu cho thấy số chủng chúng thực có khả gây bệnh lây lan qua thực phẩm nghiêm trọng Chúng có loại thực phẩm cá hồi, – mai, thịt sữa,… Ngồi ra, E.coli có mặt môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu 6.4.Độc tố chúng nhạy với nhiệt, có khả tạo loại độc bền nhiệt E.coli có nguy lớn trẻ em, đặc biệt bệnh liên quan đến hội chứng dung huyết phân có máu Hình 1:Vi khuẩn E.coli 6.5 Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo ISO 16649-2:2001 6.6 Nguyên tắc Cấy lượng mẫu xác định mơi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch TBX) có chứa lactose chất thị pH Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau ủ môi trường 440C 24 Đếm khuẩn lạc E.coli điển hình mơi trường TBX Kết biểu thị số E.coli 1g mẫu pha lỗng 6.7 Mơi trường hố chất Mơi trường- Hố chất Saline Pepton Water (SPW) TBX HCl 10% NaOH 10% Mục đích Pha lỗng mẫu Ni cấy E.coli Chỉnh pH Bảng 1:Mơi trường hố chất 6.7.1 Mơi trường SPW Dung dịch pha lỗng tham chiếu theo TCVN 6507-1:2005 (ISO 68871:2003) Thành phần: ● NaCl: 8,5g ● Pepton: 1g ● Nước cất: lít Chuẩn bị: Hịa tan thành phần nước, đun nóng cần Phân phối 90ml dịch pha loãng vào bình (hoặc lọ có nắp vặn) 9ml vào ống nghiệm Đậy nắp bình ống nghiệm, hấp khử trùng Mục đích: Dùng để pha lỗng mẫu 6.7.2 Mơi trường TBX Tham chiếu theo TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649:2001) Thành phần: ● Sản phẩm thủy phân casein enzyme 20,0g ● Muối mật 1,5g ● Acid 5-bromo-4-clo-3-indolyl-Dglucuronid (BCIG) ● Thạch: 9g đến 18g ● Nước: 1000ml Chuẩn bị: Hòa tan BCIG dimety sulfoxit dung dịch loãng theo khuyến cáo nhà sản xuất Hòa tan tất thành phần nước đun đến sôi Chỉnh pH để sau khử trùng pH phải 7,2 ± 0,2 25°C, cần Khử trùng môi trường 15 phút nhiệt độ 121°C nồi hấp áp lực Làm nguội môi trường nồi cách thủy đến khoảng từ 44°C đến 47°C Mục đích:Dùng làm môi trường nuôi cấy E.coli CHƯƠNG QUY TRÌNH TIẾN HÀNH 7.1 Thiết bị dụng cụ Hình 2: Đĩa petri \ Hình 3: Bộ đếm khuẩn lạc Hình 4: Máy votrex Hình 5: Nồi hấp tiệt trùng Hình 6: Máy dập mẫu 7.2 Quy trình phân tích 10g/25g mẫu rắn 10ml/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water Đồng mẫu Stomacher 60 giây Pha loãng Dịch mẫu 10-1 15 ml 02 dĩa Dịch mẫu 10-2 15 ml TBX 02 dĩa (TBX đun chảy làm nguội đến 47°C) Xoay nhẹ trộn mẫu, nhiệt độ phịng, chờ hỗn hợp đơng đặc, lật ngược đĩa ủ tủ ấm 44°C 24 Đọc kết Chọn đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc độ pha lỗng liên tiếp Tính biểu thị kết 7.3 Các bước tiến hành Bước Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Cân xác 10g/25g mẫu rắn đong mẫu với thể tích 10ml/25ml mẫu lỏng phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vơ trùng (bình tam giác) Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml ( sai số cho phép ± 5%) vơ trùng vào túi nhựa (bình tam giác chứa mẫu) Đồng mẫu dịch pha loãng SPW máy dập mẫu phút lắc bình tam giác có mẫu dịch pha lỗng 2÷3 phút Do bào tử lắng xuống nhanh pipet, nên để pipet tư nằm ngang (không để đứng) làm đầy với thể tích huyền phù dung dịch pha lỗng thích hợp Bước Pha lỗng mẫu Dùng pipet vơ trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào ống nghiệm có chứa ml dịch pha lỗng SPW vơ trùng nhiệt đọ thích hợp Trộn kĩ máy vortex - 10 giây để thu dịch pha loãng 10 -2 (đối với loại mẫu làm từ nguyên chất thu dung dịch pha loãng 10 -1) Nếu cần, lặp lại thao tác để có dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,… thu lượng vi khuẩn định Bước Cấy ủ mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển ml mẫu thử dạng lỏng ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác cho vào hai đĩa petri Sử dụng nồng độ pha loãng liên tiếp, nồng độ đĩa petri Rót vào đĩa khoảng 15 ml môi trường TBX Lật úp đĩa ủ 44°C 24 Bước Đếm chọn khuẩn lạc để khẳng định Đếm đĩa có số khuần lạc 150 sau 24 nuôi cấy Khuẩn lạc E.coli đặc trưng môi trường TBX có màu xanh Đếm khuẩn lạc E.coli đặc trưng đĩa có số đếm phù hợp Tính giá trị trung bình từ độ pha lỗng để qui số E.coli 1g mẫu 7.4 Màu khuẩn lạc môi trường TBX Đối với môi trường TBX (Tryptone Bile X-glucuronide) thành phần mơi trường có Acid 5-bromo-4chloro-3-indolyl-D-beta- glucuronide, thành phần quan trọng để định màu khuẩn lạc E.Coli qua trình sinh trưởng đếm Giải thích cho màu khuẩn lạc E.coli hiểu đơn giản sau: Sự có mặt enzyme β-D-glucuronidase giúp phân biệt hầu hết E.coli với vi khuẩn Coliform khác E.coli hấp thụ chất sinh màu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- βD-glucuronide (X- β-D-glucuronide) Enzym β-glucuronidase chia đôi liên kết chất sinh màu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide Các khuẩn lạc E.coli sau có màu từ màu xanh lam đến màu xanh lam Nhưng màu thể rõ màu xanh lam Bên cạnh số chủng E.coli có màu số chủng âm tính với enzyme Beta-D biểu khuẩn lạc khơng màu 7.5 Hình 7: Màu khuẩn lạc E.coli CHƯƠNG KẾT QUẢ 8.1 Kết Tổng số E.coli 1g mẫu (X) tính theo cơng thức: (CFU/g hay CFU/ml) C: Tổng số khuẩn lạc E.coli đếm đĩa hai độ pha loãng liên tiếp V: Thể tích dịch cấy cấy đĩa, tính mililit n1: Số đĩa độ pha loãng thứ giữ lại n2: Số đĩa độ pha loãng thứ hai giữ lại d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ giữ lại 8.2 Biểu thị kết Làm tròn kết thu đến hai chữ số có nghĩa Sau tính kết quả, chữ số thứ nhỏ khơng thay đổi chữ số đứng trước nó, chữ số thứ lớn tăng chữ số đứng trước lên đơn vị tương ứng 10, làm tròn số với chữ số có nghĩa Lấy kết số thích hợp 1,0 9,9 nhân với 10x, x lũy thừa tương ứng 10, làm trịn số với chữ số có nghĩa Ví dụ: Tính kết vi vật E.coli sản phẩm thịt đơng lạnh tiệt trùng Độ pha lỗng 10-3 10-4 Số khuẩn lạc 113 27 127 11 Bảng 2:Bảng số khuẩn lạc độ pha loãng 113+ 27+127+11 N= 1× [ 2+ ( 0,1× ) ] × 10−3 = 126363 Làm tròn kết 1,3×105CFU/g (hoặc CFU/ml) Kết 1,3×105 CFU/g (hoặc CFU/ml) cho biết Tổng số E.coli 1g mẫu thịt đông lạnh 1,3×105CFU/g Giới hạn cho phép: 102 (theo định 46/2007 Bộ Y tế) X = 1,3×105> 102 Kết luận: Mẫu thực phẩm không đạt yêu cầu 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ môn khoa học thực phẩm, Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP HCM, 2016 [2] TCVN 7924-2:2008, Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng E.coli, phần 2: kĩ thuật đếm khuẩn lạc 44oC sử dụng 5-bromo-4-chloro-3indolyl β-D-glucuronide 11 CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM Vi khuẩn E.Coli vi khuẩn? Gram dươnng Gram âm Hiếu khí Tất đáp án Đáp án: A Vi khuẩn E.coli có kích thước? 2-3 μmm 2-3 nm 5-8 μmm 5-8 mm Đáp án: A Môi trường sử dụng cho việc định lượng khuẩn lạc E.coli? TBX SPW A B A B sai Đáp án: C Hóa chất dùng ni cấy khuẩn lạc E.coli? H 2SO4 10%, NaOH 10% HCl 10%, NaOH 10% KOH 10%, HCl 10% HNO 10%, NaOH 10% Đáp án: B Vai trị mơi trường SPW cho việc sử dụng định lượng E.Coli? Phát triển sinh trưởng E.coli Pha lỗng mẫu Ni cấy E.coli Tất đáp án Đáp án: B Vai trị mơi trường TBX cho việc sử dụng định lượng E.Coli? Phát triển sinh trưởng E.coli Pha lỗng mẫu Ni cấy E.coli Tất đáp án 12 Đáp án: C Vai trò hóa chất NaOH 10%, HCl 10% việc định lượng khuẩn lạc E.coli? Dùng để xác định khuẩn lạc E.Coli Dùng làm chất hấp thu Chỉnh pH Dùng để phát triển khuẩn lạc E.coli Đáp án: C Thành phần môi trường SPW? Nước cất NaCl Pepton Tất đáp án Đáp án: D Thành phần môi trường TBX? Pepton, muối mật Muối mật, BCIG, pepton Nước, Thạch, BCIG Pepton, Muối mật, BCIG, Nước, Thạch Đáp án: Câu D Môi trường SPW, TBX ủ độ? 44 0C 48 0C 550 C 600 C Đáp án: A Môi trường SPW,TBX ủ thời gian bao lâu? ngày ngày Đáp án: A Sau khử trùng môi trường TBX cần chỉnh pH đạt bao nhiêu? 7,2 ± 0,2 20oC 7,2 ± 0,2 25oC 8,2 ± 0,2 25oC 8,2 ± 0,2 20oC Đáp án: B Vi khuẩn E Coli tồn đâu? Trong tự nhiên Con người động vật Trong thực phẩm cá hồi, phô mai, thịt sữa, 13 Tất đáp án Đáp án: D Tại dịch pha lỗng q trình thao tác phải giữ xấp xỉ nhiệt độ phòng? Để vi sinh vật thuận lợi phát triển Để vi sinh vật không bị tổn thương Để ức chế vi sinh vật Để tiêu diệt vi sinh vật Đáp án: B Phạm vi áp dụng? Theo ISO 9001:2015 Theo ISO 9001:2008 Theo ISO 16649-2-2001 Theo ISO 16645-2-2001 Đáp án: C Trong trình chuẩn bị mẫu thử bào tử môi trường lắng nhanh pipet thể nên để pipet tư thế? Thẳng đứng Nằm ngang Nghiêng 45 độ Nghiêng 60 độ Đáp án: B Quy trình tiến hành định lượng E.Coli phương pháp đếm khuẩn lạc? Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu →Pha loãng mẫu→Cấy ủ mẫu→ Đếm chọn khuẩn lạc để khẳng định Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu →Cấy mẫu→Pha loãng mẫu→Đếm chọn khuẩn lạc để khẳng định Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu → Đếm chọn khuẩn lạc để khẳng định→ Pha loãng mẫu→Cấy ủ mẫu Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu → Đếm chọn khuẩn lạc để khẳng định→ Cấy ủ mẫu→Pha loãng mẫu Đáp án: A Mục đích việc chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu? Hịa tan mơi trường Đo mơi trường Hịa tan mơi trường đo mơi trường 10-1 Hịa tan mơi trường đo mơi trường 10-2 Đáp án: C Mục đích bước pha lỗng mẫu? Tạo mơi trường cho vsv phát triển mặt đĩa Hịa tan mơi trường Làm giảm mật độ VSV (để đếm VSV xác hơn) 14 Để dễ dàng tính số khuẩn lạc Đáp án: C Mục đích việc cấy ủ mẫu? Tạo mơi trường cho vsv phát triển mặt đĩa Hịa tan môi trường Làm giảm mật độ VSV (để đếm VSV xác hơn) Để dễ dàng tính số khuẩn lạc Đáp án: A Mỗi đĩa petri rót mơi trường TBX? 10ml 15ml 20ml 25ml Đáp án: B Màu khuẩn lạc môi trường TBX có màu? Màu xanh Màu vàng Màu nâu Màu trắng Đáp án: A BCIG có mơi trường TBX dùng để? Xác định tính di động ni dưỡng vi sinh vật Kích thích phát triển vi sinh vật Dùng để pha chế môi trường Dùng để phát E.Coli ( đổi màu xanh ) Đáp án: D Thành phần quan trọng định đến màu khuẩn lạc E.Coli? Muối mật BCIG Enzyme β-D-glucuronidase Pepton Đáp án: B Cách chọn khuẩn lạc để đếm? Đếm đĩa có số khuẩn lạc 150 sau 24 ni cấy Đếm đĩa có số khuẩn lạc 120 sau 24 ni cấy Đếm đĩa có số khuẩn lạc 150 sau 48 nuôi cấy Đếm đĩa có số khuẩn lạc 120 sau 48 nuôi cấy Đáp án: A Các khuẩn lạc E.Coli âm tính với enzyme β-D-glucuronidase biểu màu gì? Màu xanh Màu vàng Màu trắng 15