Định lượng coliform bằng mpn

Từ xa xưa chúng được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị, việc phát hiện Coliform sinhvật chỉ thị cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh tiềm tàng không chỉ trongnước mà còn trong thực

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TIỂU LUẬN

ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP MPN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TIỂU LUẬN

Định Lượng Coliform Bằng Phương Pháp MPN

TP HỒ CHÍ MINH, 2022

BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ iii

• 2.2.3 Môi trường khẳng định Brilliant Green Lactose Bile Salt

• DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮiT

TP.HCM: Thành phố Hồ Chí MinhMPN: Most Probable Number

MỞ ĐẦU

Trong thời đại đất nước phát triển và hội nhập ngày nay, đời sống của con người ngàymột nâng cao thì nhu cầu ăn uống cũng phải được nâng cao Tuy nhiên, cuộc sốngngày càng bận rộn, quỹ thời gian dành cho bữa tối gia đình tự nấu ngày càng hạn hẹpnên thức ăn nhanh, ăn hàng quán, thực phẩm chế biến sẵn luôn nhan nhản khắp nơi vàbiến hóa là giải pháp được nhiều người lựa chọn

Từ đó, đồ ăn sẵn đóng vai trò quan trọng trong xã hội, vừa đáp ứng nhu cầu nhanhchóng, vừa tiết kiệm thời gian Tuy nhiên, về vấn đề vệ sinh thì không có gì đảm bảo

Do người dân không kiểm soát được quá trình chế biến nên nếu sản phẩm chế biến cóvấn đề thì cũng không có cách nào biết được

Điều này có thể dẫn đến nhiều vấn đề về sức khỏe, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trìnhlàm việc, thậm chí có thể gây tử vong do ngộ độc thực phẩm Vấn đề kiểm soát mức

độ vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng được chú trọng Đánh giá mức độ vệ sinh antoàn thực phẩm không phải là một việc dễ dàng và đòi hỏi phải có đủ lý thuyết và kinhnghiệm thực tế

Đề tài "Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN" của nhóm chúng em với mongmuốn cho mọi người hiểu rõ hơn về sự nguy hiểm của trực khuẩn Coliform đối với sức

khoẻ của con người và cách phát hiện ra nó

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Coliforms là các trực khuẩn Gram âm, có hình que, sống kị khí và không sinh bào tử.

Có khả năng lên men mạnh mẽ lactose thành axit và sinh khí ở nhiệt độ 35 ± 2°C trongvòng 24 hoặc 48 giờ

Từ xa xưa chúng được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị, việc phát hiện Coliform (sinh

vật chỉ thị) cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh tiềm tàng không chỉ trongnước mà còn trong thực phẩm và đồ uống nhất định như sữa,

Không dừng lại ở đó trong những thập kỷ gần đây, quốc tế đã sự nỗ lực bền vữngnhằm phát triển các công nghệ có thể cho phép phân tích tại chỗ và thường xuyên sựhiện diện của chúng trong các mẫu có mật độ thấp

Nhóm này phần lớn bao gồm các vi khuẩn vô hại, có quan hệ gần gũi với nhau Ngoài

chất thải của con người và động vật, tổng số vi khuẩn coliform có thể được tìm thấy

trong các môi trường như nước, thảm thực vật và đất nơi chúng sống tự do

Coliform chịu nhiệt là những ví dụ điển hình về tổng số vi khuẩn coliform Đây là những coliform có khả năng lên men đường lactose ở 45 độ.

Vi khuẩn Coliform trong phân:

Vi khuẩn coliform trong phân là một phân nhóm của tổng số vi khuẩn coliform có thể

tìm thấy trong ruột và phân của động vật máu nóng (người, lợn, bò, chó, lợn, v.v.)

E coli là một ví dụ điển hình cư trú trong đường ruột của động vật máu nóng và do đó

dẫn đến có mặt trong phân của động vật

Khi ở bên ngoài cơ thể vật chủ, các sinh vật này không thể sống lâu vì sự sống còn củachúng phụ thuộc chủ yếu vào vật chủ

E.Coli (Coliform):

E coli là một nhóm phụ của vi khuẩn coliform trong phân và phần lớn bao gồm E coli (Escherichia coli) So với các loại khác, E coli hầu như chỉ được tìm thấy trong ruột

của động vật máu nóng, nơi chúng có thể sống và sinh sản

Việc phát hiện những sinh vật này trong nước là dấu hiệu của sự nhiễm bẩn phân cũngnhư sự hiện diện có thể có của các sinh vật gây bệnh khác có thể bao gồm vi-rút

Ngoài ra một số lượng lớn vi khuẩn khác thuộc nhóm Coliforms, bao gồm: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter và Proteus thuộc về nhóm Coliform

Coliform là tác nhân chính gây ra các triệu chứng tiêu chảy, mất nước, suy thận, rối loạn máu, thậm chí là tử vong nếu hàm lượng vi khuẩn Coliform không đạt chuẩn của

Bộ Y Tế

Nếu uống nước hoặc ăn phải thực phẩm có chứa vi khuẩn Coliform Cơ thể sẽ không

biểu hiện ngay lập tức Phải mất 3 – 4 ngày bệnh mới bắt đầu Sẽ có một loạt các triệuchứng như tiêu chảy, sốt nhẹ hoặc tiêu chảy từng đợt mà không sốt Đối với em béhoặc người già, sức đề kháng kém rất có thể sẽ mắc phải nhiều căn bệnh nghiêm trọng.Trong một số trường hợp nguy hiểm, một số mầm bệnh có thể lây nhiễm sang phổi,

da, mắt, hệ thần kinh, thận hoặc gân Các tác động cũng có thể nghiêm trọng hơn, mãntính hoặc thậm chí gây tử vong

E.coli là chất gây ô nhiễm phân phổ biến có trong nước và nó có thể gây bệnh nghiêm

trọng nếu xâm nhập vào cơ thể Vì vậy, trong hầu hết các phương pháp xác

suất, E.coli được sử dụng làm “Chỉ thị ô nhiễm” để phân tích chất lượng nước.

Một số có thể xảy ra nhất là một phương pháp thống kê , trong đó các kết quả được sosánh với các bảng thống kê tiêu chuẩn Nó liên quan đến ba bộ pha loãng có chứa nướcdùng lên men và mẫu nước Sự hình thành axit và khí cho thấy kết quả dương

tính Phân tích định lượng coliform được xác định bằng cách đếm số lượng ống cho

kết quả dương tính và so sánh mẫu kết quả dương tính với dữ liệu thống kê

Thử nghiệm MPN liên quan đến một loạt ống nghiệm chứa nước dùng lên men, trong

đó các mẫu nước được thêm vào theo tỷ lệ xác định Chúng ta có thể phát hiện

coliform trong mẫu nước bằng cách quan sát ống lên men để tạo ra axit và khí gas Sự

thay đổi màu sắc trong dịch lên men (từ đỏ sang vàng) cho thấy việc sản xuất axit Baogồm ba quá trình như thử nghiệm giả định, xác nhận và hoàn thành

Mất nhiều thời gian để có kết quả vì để xác nhận được sự hiện diện của coliforms, phải

thực hiện ba quá trình xét nghiệm và cần ít nhất 5 ngày

MPN là một phương pháp rất nhạy cảm, đôi khi có thể cho kết quả sai

Yêu cầu nhiều ống nghiệm và nhiều dụng cụ thủy tinh để chuẩn bị môi trường

• ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

Thực hiện định lượng Coliform bằng phương pháp MPN sử dụng 3 môi trường và 2

Bile Salt (BGBL) Khẳng định Để đảm bảo chắc chắn VSV có trong mẫuHCL 10%

NaCl 1g Để duy trì sự cân bằng thẩm thấu của môi trường

Peptone 8,5 g Cung cấp Nitơ và các dưỡng chất cần thiết

cho quá trình sinh trưởng của sinh vật

Nước cất 1 lít Giúp cho quá trình trao đổi chất, các phản ứng

diễn ra thuận lợi

▪ Môi trường tăng sinh chọn lọc: Lauryl Sulface Trytone Broth ( LSB)

40 g 20 g Cung cấp nito, năng lượng và các khoáng

chất cần thiết cho sự phát triển của VSV

Lactoza

(C12H22O11.H2O)

10 g 5 g Đường lên men và là nguồn cung cấp

năng lượng và để tăng tỷ lệ sinh trưởngcủa VSV

Làm hệ đệm ổn định pH cho môi trường,

là thành phần đệm để kiểm soát độ pHtrong quá trình lên men Lactose, nguồncung cấp quan trọng thạch bổ sung kimloại

Natri clorua 10 g 5 g Cung cấp khoáng chất cần thiết cho MT

nuôi cấy VSV và đóng vai trò làm hệ đệmduy trì 1 pH ổn định cho MT

Natri lauryl sulfat 0,2 g 0,1 g

năng lượng và để tăng tỷ lệ sinh trưởng.Mật bò khô 20 g Kích thích sự phát triển của hệ VSV có

trong môi trường

Lục sáng 0,0133 g Ức chế sự xuất hiện các VSV không

mong muốn

Nước 1 000 g Giúp cho quá trình trao đổi chất, các

phản ứng diễn ra thuận lợi

▪

◦ Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN

Tham khảo theo TCVN 4882:2007 ISO 4831:2006 về VI SINH VẬT TRONG THỰC

PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNHLƯỢNG COLIFORM - KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT nhómthực hiện quy trình định lượng gồm 4 bước:

- Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng

- Cấy và ủ

- Phép thử khẳng định

- Tính toán và biểu thị kết quả

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng

Giai đoạn chuẩn bị mẫu thử:

+ Tiến hành cân mẫu rắn hoặc đong mẫu lỏng của phần mẫu đại diện

+ Sau đó cho mẫu vào bao PE vô trùng hoặc bình tam giác cùng với dung dịch phaloãng SPW 90ml hoặc 225ml

+ Cuối cùng đồng nhất bằng máy dập mẫu trong một phút đối với mẫu huyền phù hoặclắc đều bình tam giác từ 2-3 phút đối với mẫu lỏng

Giai đoạn pha loãng mẫu: Chuẩn bị một số độ pha loãng đủ để đảm bảo rằng các ốngtương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính

Vai trò của môi trường Saline Peptone Water (SPW) ở bước pha loãng mẫu:

- Là môi trường tiền tăng sinh được sử dụng vào giai đoạn trước tăng sinh chọn lọc đểphân lập Coliforms từ mẫu thí nghiệm

- Có thành phần Peptone là chất dinh dưỡng tốt để vi khuẩn, khuẩn lạc phát triểnmạnh

Bước 2: Cấy và ủ mẫu

Tùy thuộc vào giới hạn phát hiện yêu cầu, mà ta lấy x ml mẫu thử dạng lỏng hoặchuyền phù ban đầu chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng

độ kép khi 1ml <x<10ml hoặc vào ống nghiêm chứa 10ml môi trường tăng sinh chọnlọc nồng độ đơn khi x<1ml

Thông thường lấy một tổ hợp ba ống đối với mỗi độ pha loãng Tuy nhiên, đối với một

số sản phẩm và/hoặc kết quả yêu cầu độ chính xác hơn, mà có thể cần thiết phải cấymột loạt nhiều hơn ba ống (ví dụ: năm ống) Ở bài này, chúng ta sử dụng một tổ hợp

ba ống đối với mỗi độ pha loãng cho các bước tiến hành dưới đây

Vì có 2 trường hợp lấy mẫu, nên ta chia cách tiến hành cấy và ủ thành hai trường hợpnhư sau:

- Lấy mẫu trong khoảng từ trên 1 ml đến 10 ml

+ Lấy 3 ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép Dùng pipet vô trùng chuyển10ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 10ml huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ởdạng khác vào từng ống trên

+ Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo, tiếp tục như bước trên Sử dụng mỗi pipet vôtrùng cho mỗi độ pha loãng Trộn kỹ dịch cấy với môi trường

+ Để trong tủ ấm ở 30 C hoặc 37 C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h ⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h

- Lấy mẫu bé hơn hoặc bằng 1ml

+ Lấy 3 ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn Dùng pipet vô trùng chuyển1ml mẫu thử nếu là chất lỏng hoặc 1ml huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạngkhác vào từng ống trên

+ Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo, tiếp tục như bước trên Sử dụng mỗi pipet vôtrùng cho mỗi độ pha loãng Trộn kỹ dịch cấy với môi trường

+ Để trong tủ ấm ở 30 C hoặc 37 C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h, hoặc nếu ở giai⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h ⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.đoạn này mà không thấy sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở việc phát hiện sinh khí thì ủtiếp 24h ± 2h

Màu của khuẩn lạc trên môi trường LSB:

Coliforms tạo ra các khuẩn lạc có ánh kim loại màu xanh lục Được hình thành dựatrên việc dịch cấy được cấy trên môi trường khẳng định LSB - Canh thang mật lactozalục sáng

Vai trò của môi trường Lauryl Sulface Trytone Broth (LSB) kép & đơn ở bước cấy:

Là môi trường có nồng độ muối cao đồng thời với sự kết hợp của vancomycin và natrilauryl sulphat làm cho môi trường có tính chọn lọc giúp ức chế sự phát triển của các vi

sinh vật khác và nhân lên sự phát triển của Coliform

Vai trò của môi trường (LSB) kép & đơn ở bước ủ mẫu: Với đệm phosphate có sẵn

trong thành phần đảm bảo sự tăng sinh nhanh chóng và tăng cường việc tạo khí của vi

khuẩn Coliform qua phản ứng “lên men chậm đường lactose”.

Bước 3: Phép thử khẳng định

Chuẩn bị môi trường BGBL:

Hòa tan các thành phần trong nước cất, đun nóng nếu cần Phân phối 10 ml môi trườngvào từng ống nghiệm có chứa ống Durham úp ngược Hấp khử trùng, ống Durhamkhông chứa bọt khí sau khi hấp

Cấy và ủ mẫu:

- Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy thu được từ ống môi trường nồng độ đơn đã đuợc ủ

ấm và có biểu hiện sinh khí hoặc mờ đục làm cản trở phát hiện sinh khí, khi quan sátlần thứ nhất (tức là sau 24h ± 2h hoặc 48h ± 2h) vào ống môi trường thử khẳng định.Đặt vào tủ ấm ở 30 C hoặc 37 C trong 24h ± 2h, nếu không sinh khí ở giai đoạn này⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h ⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.thì ủ tiếp 24h ± 2h

- Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy thu được từ ống môi trường nồng độ kép sau ủ vàoống môi trường thử khẳng định Đặt vào tủ ấm ở 30 C hoặc 37 C trong 24h ± 2h, nếu⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h ⁰C hoặc 37⁰C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h.không sinh khí ở giai đoạn này thì ủ tiếp 24h ± 2h

Dấu hiệu nhận biết:

Cấy riêng khuẩn lạc vào môi trường canh BGBL có ống durham, ủ ở 37oC trong 24h.Phản ứng là dương tính khi xuất hiện sự tạo khí (Thể tích bọt khí =1/10 thể tích ống)

Hình 1.2 Ống nghiệm đục do xuất hiện khí

Sau khi cấy và để yên khoảng 24h, khuẩn lạc màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính lớnhơn 0,5mm, có vòng tủa muối mật

Hình 1.3 Khuẩn lạc sau khi cấy khẳng định Giải thích dấu hiệu:

Khuẩn Coliform sử dụng đường trong môi trường BGBL để lên men tạo acid và khí

Sự hiện diện của acid chứng minh qua phản ứng đổi màu, làm đục môi trường và sựtạo bọt khí

Thành phần môi trường có muối mật ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram (+) vàBrillant Green ức chế sự phát triển của loài vi sinh vật không mong muốn khác

Vai trò của môi trường khẳng định Brilliant Green Lactose Bile Salt (BGBL) ở bước thử nghiệm khẳng định: Góp phần vào việc nhận biết, xác định đặc trưng sinh

khí của Coliforms sau khi tăng sinh tại môi trường tăng sinh chọn lọc LBS Đồng thời

là môi trường để phản ứng sinh khí tiếp tục diễn ra

Bước 4: Diễn giải kết quả

Đối với mỗi độ pha loãng, đếm tổng số các ống quan sát thấy có sinh khí trong các ốngdương tính sau 24h ± 2h hoặc 48h ± 2h sau đó đem tra tại bảng MPN để xác định sự

có mặt hay không của Coliform và mật độ của chúng.

Xác định chỉ số MPN

Các Bảng tra MPN cung cấp các giá trị MPN và các giới hạn tin cậy 95 % cho phầnmẫu thử có 10, 15, 20 và 25 ống song song (giả sử mỗi ống được cấy cùng một thể tíchcủa một dung dịch pha loãng

Để thể hiện kết quả trên lượng mẫu đối chứng (hoặc trên thể tích mẫu dạng lỏng), thìnhân MPN và các giá trị giới hạn 95 % theo tỷ lệ khối lượng tham chiếu với khốilượng phần mẫu thử Không nhân độ không đảm bảo tiêu chuẩn logarit Khối lượngđối chứng trong phân tích vi sinh thực phẩm thường là 1 g Khối lượng phần mẫu thửtương ứng với lượng mẫu (tính bằng gam) có trong thể tích được dùng để cấy các ống,

ví dụ: 0,1 g nếu sử dụng 1 ml của huyền phù mẫu 10-1

Ví dụ minh họa

Thực hiện phương pháp định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN dùng loạt 3ống nghiệm ở 3 độ pha loãng liên tiếp trên mẫu sữa chua uống lên men Qua các quátrình xử lý, nuôi cấy và ghi nhận phản ứng tại phép thử khẳng định ghi nhận được kếtquả như sau

Tại 3 ống nghiệm mẫu nguyên chất ghi nhận thấy có 3 ống dương tính; tại 3 ốngnghiệm mẫu có độ pha loãng 100 ghi nhận có 1 ống nghiệm dương tính và ở độ phaloãng 10-1 là 3 ống nghiệm dương tính

Mang kết quả ghi nhận trên tra tại “Bảng MPN dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 độ phaloãng liên tiếp” được số lượng Coliforms / 1ml mẫu sữa là 10,5

Mang kết quả này đem tra tại Quyết Định Số: 46/2007/QĐ-BYT – Quy Định Giới HạnTối Đa Ô Nhiễm Sinh Học Và Hóa Học Trong Thực Phẩm tại phần quy định giới hạnVSV cho sản phẩm sữa lên men nhận thấy quy định chỉ tiêu Coliforms là 10/ 1ml sảnphẩm

Từ đó kết luận được mẫu sữa chua uống lên men dùng làm thí nghiệm ko đạt yêu cầu

về chỉ tiêu Coliforms.

• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bộ môn Khoa học thực phẩm (2019), Bài giảng Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường

Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

TCVN 4882:2007 ISO 4831:2006 về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng coliform - Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất.

TCVN 110393:2015 về Phụ gia thực phẩm Phương pháp phân tích vi sinh vật Phần 3: Phát hiện và định lượng coliform và E.coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (Phương pháp chuẩn).

-Williams, M G., & Busta, F F (1999) TOTAL VIABLE COUNTS | Most Probable

doi:10.1006/rwfm.1999.4000

Rowe R, Todd R, Waide J Microtechnique for most-probable-number analysis Appl Environ Microbiol 1977 Mar;33(3):675-80 doi: 10.1128/aem.33.3.675-680.1977.

PMID: 16345226; PMCID: PMC170744

Edward (2010), Determination of Coliform bacteria by MPN method.

Professor Nagendra Shah (2004), School of Molecular Sciences Victoria University,

Food Microbiology Laboratory Manual.

Cara Gleeson and Nick Gray (1996) The Coliform Index and Waterborne Disease:Problems of microbial drinking water assessment

Microscope Master, Coliform Bacteria? Examples, Characteristics, Fecal/Total Count Tests, https://www.microscopemaster.com/coliform.html, Truy cập ngày 20/09/2022