Các phương pháp phân tích trong công nghệ sinh học: sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích hàm lượng cafein trong mẫu trà và cà phê PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Ở TRÀ VÀ CÀ PHÊ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Ở TRÀ VÀ CÀ PHÊ Lê Thị Thùy Du.
PHÂN PHÂNTÍCH TÍCHHÀM HÀMLLƯỢ ƯỢNG NGCAFEIN CAFEIN BBẰẰNG NGPH PHƯƠ ƯƠNG NGPHÁP PHÁPSSẮẮCCKÝ KÝ LLỎ ỎNG NGHI HIỆỆUUNĂNG NĂNGCAO CAO(HPLC) (HPLC)Ở ỞTRÀ TRÀVÀ VÀCÀ CÀPHÊ PHÊ Lê Thị Thùy Dung – 20211161M NỘI DUNG GIỚI THIỆU Caffein Tính chất caffein PHƯƠNG PHÁP Sử dụng HPLC-UV phân tích hàm lượng caffein mẫu trà cà phê KẾT QUẢ Đánh giá kết thu PHẦN GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ CAFFEIN GIỚI THIỆU VỀ CAFEIN Công thức phân tử C8H10N4O2 Khối lượng mol 194,19 g/mol Tên gọi khác • • • • • Trimethylxantine Độ tan Coffein Theine Methyltheobromine Tan nhiều nước chloroform, phần rượu GIỚI THIỆU VỀ CAFEIN Hệ TK Trung ương Kích thích vỏ não -> giảm mệt mỏi, tăng hưng phấn LỢI ÍCH H ệ tu ầnnhanh, hồn mạnh, Tim đập tăng lưu lượng tim, mạch vàng Hệ hô hấp Giãn phế quản giãn mạch phổi Liều lượng cao Gây ngủ, bồn chồn, co giật Phản ứng phụ Có thể gây táo bón, loét dày, tá tràng LD50 ~ 10g Có thể gây chết người TÁC HẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CAFEIN 2000 2016 xác định cafein huyết người thức uống coca phương pháp điện di mao quản (CE) xác định cafein thực phẩm phương pháp trắc quan kết hợp thuật toán Kalman 2010 Định lượng caffein phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG RP-HPLC/UV ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFFEIN TRONG TRÀ VÀ CÀ PHÊ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ Thiết bị Màng lọc 0.45 micrômet Dụng cụ Cân phân tích Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC-Shimadzu-model-JAPAN Dụng cụ đồng mẫu Bể ổn nhiệt Pipet, micropipet, bình nón, bình định mức Hố chất ● ● ● ● ● Mẫu trà cà phê Nước cất Metanol MgO Cafein chuẩn dạng tinh khiết (99%) About theẬcoffee THU TH P MẪU mẫu hạt cà phê rang 12 mẫu trà CTC chín vừa Kathmandu &Kaski Nepal mẫu trà xanh mẫu bột cà phê rang CHUẨN BỊ MẪU Nghiền bột mẫu trà cà phê nghiền thành bột kích thước 300 ± 50 μm Cân 0,3 g mẫu bột cà phê (trà) cân vào bình nón 250 ml, bổ sung 2g MgO Chiết xuất 200 ml nước cất thêm vào đặt bể ổn nhiệt (100 C) 30 phút Hoàn thiện Làm lạnh, lọc qua giấy lọc lấy ml dịch lọc đem pha loãng 10 lần PHA DUNG DỊCH MẪU CHUẨN pha loãng nối tiếp dung dịch gốc với Cân 10g cafein nguyên Định mức lên 100ml thu dung chất dịch gốc 100 ppm nước HPLC để thu mẫu 2,4,6,8,10 ppm ĐIỀU KIỆN HPLC • HPLC model 1514 (Simadzu Corporation) • Cột Zorbax Eclipse Plus 18 C, 5μm, 4,6mm x 150 mm • Pha đảo: ODS • Tốc độ dịng: 1ml/phút (khơng đổi) • Nhiệt độ cột: 40 C • Detectơ UV bước sóng 275nm • Pha động: Nước : Methanol (60:40) • Thể tích tiêm mẫu: 10μl Máy sắc ký lỏng HPLC, Shimadzu Corporation Kết XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN hàm lượng caffein tìm thấy tuyến tính khoảng nồng độ từ -10 ug/ml Giá trị R 0,9928 Đường cong hiệu chuẩn Đường chuẩn xây dựng từ dung dịch caffein chuẩn nồng độ 2,4,6,8,10 ppm NHẬN DIỆN CAFEIN Sắc ký đồ cafein mẫu chuẩn ppm, Detector 275nm) Sắc ký đồ cafein mẫu trà, Detector 275nm) XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY Giới hạn phát (LOD) Giới hạn định lượng (LOQ) LOD LOQ xác định cách đo tỷ lệ tín hiệu nhiễu S/N từ mẫu chuẩn nồng độ thấp chất phân tích so với pic mẫu trắng LOD LOQ 0,2 0,7 ppm ppm Phần mềm công cụ (Shimadzu Lab Solutions Version 5.60SP2) THÍ NGHIỆM VỀ ĐỘ LẶP LẠI Nồng độ chuẩn STT lặp lại Mẫu (ppm) Thời gian lưu (phút) Nồng độ chuẩn Diện tích STT lặp lại Thời gian lưu (phút) Diện tích Mẫu (ppm) 10 2,662 235470 10 2,662 234470 10 2,651 233380 10 2,66 233410 10 2,671 245310 10 2,71 242101 10 2,681 238350 10 2,659 240190 10 2,607 240120 10 2,635 247110 10 2,664 234150 Trung bình 2,648 235040 Độ lệch chuẩn 0,023 2686,217 % RSD 0,903 1,1428 Độ lặp lại ngày 10 ppm 10 2,771 235130 Trung bình 2,690 237275,2 Độ lệch chuẩn 0,044 3474,202 % RSD 1,635 1,464208 Độ lặp lại khác ngày 10 ppm % RSD (hệ số biến thiên) cho thời gian lưu diện tích đạt yêu cầu để phân tích TỈ LỆ THU HỒI Thêm mẫu trắng (trà khử cafein) vào mẫu chuẩn (1, 10 ppm) phân tích khả thu hồi sử dụng HPLC Mẫu trắng Nồng độ cafein Nồng độ cafein Nồng độ cafein thu hồi STT mẫu mẫu (mg) mẫu pha (mg) (mg) 1,27 1,24 97,6 2,52 2,49 98,8 3,81 3,75 98,4 Tỉ lệ thu hồi (%) TÍNH HÀM LƯỢNG CAFEIN Pc : Nồng độ khối lượng dd chuẩn (g/l) V: Thể tích dung dịch Ax : Diện tích pic dung mẫu dịch mẫu (đvdt) Wd: Hàm lượng chất khô mẫu Ac : Diện tích pic dung dịch chuẩn (đvdt) ms : Khối lượng phần mẫu thử (g) TÍNH HÀM LƯỢNG CAFEIN Hàm lượng cafein mẫu trà cà phê KẾT LUẬN ● Mẫu cà phê trà mà ta phân tích chứa lượng cafein không nhỏ 1% khối lượng chất khô, đạt TCVN 5251-2007 ● Thời gian lưu cafein 2,6 phút Các dung dịch chuẩn pha để xác định độ tuyến tính với hệ số tương quan (R ) 0,9928 RSD cho độ lặp lại đạt yêu cầu LOD LOQ 0,2 0,7 ppm ● Khả thu hồi cao (>97%) tìm thấy thêm mẫu chuẩn cafein vào mẫu trắng TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Pokhrel, P., Shrestha, S., Rijal, S K., & Rai, K P (2016) A simple HPLC Method for the Determination of Caffeine Content in Tea and Coffee Journal of Food Science and Technology Nepal, 9, 74-78 [2] TCVN 9723:2013 Cà phê sản phẩm cà phê - Xác định hàm lượng cafein sắc ký lỏng hiệu cao (HPCL) - Phương pháp chuẩn