Các phương pháp phân tích trong công nghệ sinh học: sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích hàm lượng cafein trong mẫu trà và cà phê

Tiểu luận Các phương pháp phân tích trong công nghệ sinh học: sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích hàm lượng cafein trong mẫu trà và cà phê Các phương pháp phân tích trong cnsh I GIỚI THIỆU Cafein (1,3,7 trimethylxanthine) một alkaloid họ xanthine, là thành phần kích thích chính trong 60 loài thực vật bao gồm trà, cà phê, ca cao.

Học viên: Lê Thị Thùy Dung - 20211161M TIỂU LUẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG CNSH Sử dụng phương pháp HPLC-UV xác định hàm lượng caffein mẫu trà cà phê thương hiệu địa phương khác có sẵn thị trường Kathmandu Kaski, Nepal SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐƠN GIẢN ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFFEIN TRONG TRÀ VÀ CÀ PHÊ I GIỚI THIỆU Cafein (1,3,7-trimethylxanthine) - alkaloid họ xanthine, thành phần kích thích 60 lồi thực vật bao gồm trà, cà phê, ca cao, v.v (Francis, 1999) Bên cạnh trà cà phê, cafein tiêu thụ rộng rãi thông qua nhiều loại sản phẩm dành cho người ăn kiêng, đồ uống ca cao, nước tăng lực, nước ngọt, v.v (Da Silva, 2011) Cafein loại bột màu trắng, khơng mùi, có vị đắng Là dẫn xuất nhân xanthine, cafein có đặc tính dược lý (Francis, 1999) Nó chất kích thích trao đổi chất hệ thống thần kinh trung ương, sử dụng mặt giải trí y tế để giảm mệt mỏi thể chất phục hồi tỉnh táo buồn ngủ xảy Sử dụng cafein giúp tỉnh táo hơn, dòng suy nghĩ nhanh rõ ràng hơn, tăng cường tập trung khả phối hợp thể nói chung tốt (Sethuraman cộng sự, 2013) Cơng thức hóa học Cafein Cafein chứng nhận an toàn mức 200 ppm (Da Silva, 2011) Cafein khơng tích lũy thể theo thời gian thường tiết vòng vài sau tiêu thụ (Barone Roberts, 1996) Tỷ lệ tiêu thụ trà trung bình tồn quốc dự đốn 3,5 g/người/ngày Nepal (Rijal, 2014) Sự thay đổi hàm lượng cafein loài thực vật khác kết đa dạng chủng loại, thay đổi khí hậu khu vực trồng trọt kỹ thuật làm vườn Trong chè, non có hàm lượng cao Điều kiện chế biến ảnh hưởng đến hàm lượng cafein Nhiệt độ rang cà phê cao làm lượng cafein nhỏ q trình thăng hoa Trong trà có hàm lượng cafein cao hạt cà phê, 200 tách trà pha pound trà, khoảng 40-60 tách cà phê thường pha chế cho pound hạt cà phê Hàm lượng cafein cà phê arabica, cà phê robusta cà phê hòa tan nằm khoảng (0,58-1,7), (1,2-3,3) (2,2-5,0), trà đen, trà xanh trà hòa tan, mức độ dao động từ (1,2-4.6), (1.0-2.4), (4.0-5.0) tương ứng (Francis, 1999) Hàm lượng cafein trà cà phê Nepal không nhỏ (1% chất khô) theo tiêu chuẩn bắt buộc Luật Thực phẩm ban hành năm 1967 (DFTQC, 2012) đặt Nghiên cứu thực với mục tiêu phát triển phương pháp xác thực để phân tích thường xuyên hàm lượng cafein sản phẩm trà cà phê có sẵn Nepal  Tính chất vật lý hóa học cafein: Cơng thức hóa học C8H10N4O2 Khối lượng phân tử 194,19 g/mol Mật độ 1,2 g/cm³ Độ hòa tan nước Dung mơi hịa tan Ít tan Tan nhiều dung dịch ethyl axetat, chloroform, pyrimidine, pyrrole, tetrahydrofuran; tan vừa phải rượu, axeton; tan ether dầu hỏa, ether, benzen Độ nóng chảy 237°C Điểm sơi 178°C Độ axit (pKa) 10,4 (40°C) II PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thu thập mẫu Tổng cộng có 12 mẫu trà CTC, mẫu trà xanh, mẫu hạt cà phê rang chín vừa mẫu bột cà phê rang thu thập từ Kathmandu huyện Kaski, Nepal (Trà CTC: trà đen viên, chế biến theo phương pháp tự động máy CTC, bao gồm công đoạn : làm héo trà xuống 70% độ ẩm, đưa trà vào xử lý CTC để cắt nhỏ vo viên, lên men- oxi hóa, giai đoạn sấy trà khơ xuống cịn 3% độ ẩm) Các mẫu cà phê trà giữ nhiệt độ phịng suốt q trình phân tích Tất dụng cụ thủy tinh làm cách, sau tráng nước HPLC trước sử dụng Các hóa chất thuốc thử sử dụng nghiên cứu cấp độ phân tích, mẫu chuẩn cafein (Sigma-Aldrich) sử dụng nghiên cứu Viện Khoa học Công nghệ Quốc gia Hoa Kỳ truy xuất nguồn gốc 2.2 Xác định độ ẩm Độ ẩm mẫu trà cà phê xác định theo AOAC, 2005 2.3 Chuẩn bị mẫu • Đầu tiên, mẫu trà cà phê nghiền thành bột kích thước 300 ± 50 μm khoảng 0,3 g mẫu bột cà phê chè cân bình nón 250 ml • Sau 200 ml nước cất thêm vào đặt bể ổn nhiệt (100 C) Quá trình chiết xuất thực nửa • Sau đó, dung dịch làm lạnh, trì thể tích đến 250 ml lọc qua giấy lọc Whatmann số • Dùng pipet lấy ml dịch lọc vào bình định mức 10 ml thêm nước HPLC đến vạch 2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Dung dịch gốc cafein 100 ppm chuẩn bị cách cân xác 10 mg cafein nguyên chất (Sigma-Aldrich) chuyển định lượng vào bình định mức 100 ml Các mẫu chuẩn 2, 4, 6, 10 ppm chuẩn bị cách pha loãng nối tiếp dung dịch gốc với nước HPLC Vẽ đồ thị đường chuẩn ngoại diện tích pic so với nồng độ chất chuẩn Hàm lượng cafein (ppm) mẫu khác tính tốn phép nội suy phương trình hồi quy đường phù hợp Sau đó, kết trình bày theo tỷ lệ phần trăm chất khơ 2.5 Thiết bị đo đạc  Điều kiện HPLC: • HPLC model 1514 (Simadzu Corporation) • Cột Zorbax Eclipse Plus 18 C, kích thước lỗ 5μm, đường kính 4,6mm dài 150 • • • • • • mm Pha đảo: ODS Tốc độ dịng 1ml/phút (khơng đổi) Nhiệt độ cột trì 40 C UV detectơ đặt bước sóng 275nm Pha động: Nước : Methanol (60:40) Thể tích tiêm mẫu: 10μl 2.6 Phân tích thống kê Các kết biểu thị dạng Mean ± SD phân tích thống kê cách sử dụng MS Excel 2007 Đối với tính tốn có liên quan phần mềm Labsolutions 2.7 Phương pháp kiểm chứng Theo khuyến nghị ICH, (2005), đặc điểm kiểm chứng xem xét nghiên cứu độ tuyến tính, phạm vi, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại độ thu hồi Năm dung dịch cafein tiêu chuẩn khác từ 2-10 ppm thực để đánh giá biểu đồ tín hiệu hàm nồng độ chất phân tích Để có độ xác, lặp lại ngày liên ngày thực dung dịch chuẩn 10 ppm cho lần xác định LOQ LOD xác định cách ghi lại so sánh tín hiệu đo từ mẫu có nồng độ biết Tỷ lệ tín hiệu cực đại nhiễu (Signal to Noise ratio - S/N) nằm 3: 10: xem xét cho LOD LOQ Khả thu hồi kiểm tra cách thêm mẫu trắng (trà khử cafein) vào mẫu chuẩn cafein nồng độ khác phân tích hàm lượng chúng III Kết thảo luận Trước thông số xác thực tiến hành, kiểm tra nhận dạng tiến hành để phân biệt cafein hợp chất có cấu trúc tương tự có mặt Quy trình phân biệt thực cách thu kết dương từ sản phẩm trà, cà phê, mẫu trắng mẫu chuẩn Khơng có nhiễu đáng kể đỉnh bị nhiễu trùng với đỉnh cafein 3.1 Độ tuyến tính phạm vi Năm nồng độ khác dung dịch cafein tiêu chuẩn khoảng từ đến 10 ppm phân tích, tương đối đại diện cho sản phẩm trà cà phê có sẵn Đồ thị hiệu chuẩn tạo cách sử dụng vòng tiêm 10μl đường cong thiết lập theo diện tích pic nồng độ cafein dung dịch tiêu chuẩn Kết thu cho thấy mối quan hệ tuyến tính Mỗi giá trị tín hiệu đo từ mẫu nồng độ chuẩn giá trị trung bình ba lần xác định Đồ thị hiệu chỉnh (Hình 1) cho thấy mối tương quan thuận chặt chẽ tín hiệu thiết bị nồng độ mẫu cafein chuẩn Thí nghiệm độ tuyến tính cho thấy hàm lượng cafein tìm thấy tuyến tính khoảng nồng độ từ đến 10 µg/ml Giá trị R 0,9928 Hình Đường cong hiệu chuẩn Hình Sắc ký đồ cafein (2 ppm, Detector 275nm) Hình Sắc ký đồ cafein mẫu trà 3.2 Độ lặp lại Độ lặp lại phương pháp khảo sát cách thực lần phân tích lặp lại dung dịch chuẩn (10 ppm) ngày (đối với độ lặp lại ngày) ngày khác để có độ xác ngày Kết cho thấy % RSD (hệ số biến thiên) cho thời gian lưu diện tích đạt yêu cầu để phân tích Kết độ lặp lại thể Bảng Bảng Độ lặp lại ngày 10 ppm STT lặp lại Nồng độ chuẩn Mẫu (ppm) 10 10 10 10 10 10 Trung bình Độ lệch chuẩn % RSD Thời gian lưu (phút) Diện tích 2,662 2,651 2,671 2,607 2,635 2,664 2,648 0,023 0,903 235470 233380 245310 240120 247110 234150 235040 2686,217 1,1428 Thời gian lưu (phút) Diện tích 2,662 2,66 2,71 2,681 2,659 2,771 2,690 0,044 1,635 234470 233410 242101 238350 240190 235130 237275,2 3474,202 1,464208 Bảng Độ lặp lại khác ngày 10 ppm STT lặp lại Nồng độ chuẩn Mẫu (ppm) 10 10 10 10 10 10 Trung bình Độ lệch chuẩn % RSD 3.3 Độ nhạy Độ nhạy phương pháp đo Giới hạn phát (LOD) Giới hạn định lượng (LOQ) LOD LOQ xác định cách đo tỷ lệ tín hiệu nhiễu S/N từ mẫu chuẩn nồng độ thấp chất phân tích so với pic mẫu trắng Phần mềm công cụ (Shimadzu Lab Solutions Version 5.60SP2) phát tỷ lệ tín hiệu nhiễu 3:1 nồng độ cafein 0,2 ppm, giá trị nằm giới hạn phát phương pháp Tương tự, LOQ tìm thấy 0,7 ppm phần mềm cơng cụ đánh giá tỷ lệ tín hiệu nhiễu 10:1 3.4 Khả thu hồi Độ xác phương pháp xác định cách thêm mẫu trắng (trà khử cafein) vào mẫu chuẩn (1, 10 ppm) phân tích khả thu hồi chúng Bảng 3: Thu hồi cafein Mẫu trắng STT mẫu Nồng độ cafein mẫu (mg) 0 Nồng độ cafein mẫu pha (mg) 1,27 2,52 3,81 Nồng độ cafein thu hồi (mg) 1,24 2,49 3,75 Tỉ lệ thu hồi (%) 97,6 98,8 98,4 3.5 Kết hàm lượng cafein mẫu trà cà phê khác Hàm lượng cafein biểu thị theo phần trăm khối lượng, tương đương với gam 100g chất khô cà phê/trà theo cơng thức: Ac diện tích pic cafein dung dịch chuẩn cafein xác định HPLC, tính đơn vị diện tích Ax diện tích pic cafein dung dịch mẫu xác định HPLC, tính đơn vị diện tích; ms khối lượng phần mẫu thử, tính gam (g); V thể tích dung dịch mẫu chiết được, xác định Pc nồng độ khối lượng dung dịch chuẩn cafein, tính gam lít (g/l) Wd hàm lượng chất khơ mẫu Bảng 5: Hàm lượng cafein trà cà phê Lưu ý: Hàm lượng cafein mẫu trà cà phê phân tích chuyển đổi thành % chất khô Giá trị thu giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn IV KẾT LUẬN  Cafein phân tích chất chiết xuất từ nước mẫu trà cà phê Thời gian lưu cafein 2,6 phút Các dung dịch chuẩn pha để xác định độ tuyến tính với giá trị hệ số tương quan (R 2) 0,9928 RSD cho độ lặp lại đạt yêu cầu LOD LOQ 0,7 0,2 ppm  Khả thu hồi cao (>97%) tìm thấy thêm mẫu chuẩn cafein vào mẫu trắng Không quan sát thấy hiệu ứng ma trận đáng kể q trình xác nhận Do đó, phương pháp xác nhận sử dụng để định lượng cafein mẫu sản phẩm trà cà phê thu thập từ nơi khác  Sắc ký lỏng cho phép nhanh chóng tách cafein khỏi chất khác axit tannic, axit caffeic đường Phương pháp khuyến nghị cho Phịng thí nghiệm Thực phẩm Trung ương để phân tích cafein thường quy trà cà phê TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Pokhrel, P., Shrestha, S., Rijal, S K., & Rai, K P (2016) A simple HPLC Method for the Determination of Caffeine Content in Tea and Coffee Journal of Food Science and Technology Nepal, 9, 74-78 [2] TCVN 9723:2013 Cà phê sản phẩm cà phê - Xác định hàm lượng cafein sắc ký lỏng hiệu cao (HPCL) - Phương pháp chuẩn