Công nghệ chế tạo sinh phẩm khuếch đại nucleic acid

CƠNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM chẩn đốn Cơng nghệ chế tạo Sinh phẩm khuếch đại Axit nucleic NỘI DUNG I II TỔNG QUAN VỀ AXIT NUCLEIC VÀ KHUẾCH ĐẠI AXITNUCLEIC CÁC CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM KHUẾCH ĐẠI AXITLUCLEIC 2.1 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR 2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM RT – PCR 2.3 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM MULTIPLEX – PCR 2.4 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM LAMP III SINH PHẨM Real time-PCR VÀ KIT XÉT NGHIỆM TaqPath™ COVID-19 RNase P Combo Kit 2.0 I tổng quan Axit nucleic đại phân tử lưu trữ thông tin di truyền sinh vật sống Các phân tử cấu tạo chuỗi nucleotide dài liên kết với liên kết cộng hóa trị Nucleotide bao gồm bazơ nitơ, đường năm cacbon nhóm phốt phát Hai ví dụ axit nucleic bao gồm axit deoxyribonucleic (hay gọi DNA ) axit ribonucleic (hay gọi RNA ) tổ chức với liên kết cộng hóa trị Axit nucleic tìm thấy nhân tế bào chất tế bào Khuếch đại axit nucleic Các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic lấy lượng DNA RNA nhỏ, nhân chúng lên nhiều lần, phát dấu vết vi sinh vật mẫu, tránh cần thiết phải ni cấy Những kỹ thuật đặc biệt hữu ích cho sinh vật khó ni cấy khó xác định phương pháp khác (ví dụ virus, vi khuẩn nội bào, nấm, mycobacteria, số vi khuẩn khác) vi sinh vật có số lượng Phương pháp khuếch đại Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation II CÁC CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM KHUẾCH ĐẠI AXIT NUCLEIC 2.1 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR  Khái niệm: PCR trình tổng hợp sợi DNA dựa DNA khuôn nhờ hoạt động xúc tác enzyme DNA polymerase Đến mức số lượng mục tiêu dễ phát định lượng 2.1 CƠNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR Mạch khn DNA Ion Mg ++ o 72 C DNA polymerase loại nucleotide 5p 30s 30s 5p đoạn mồi dd đệm nước 2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR Mạch khuôn DNA Ion Mg ++ Chứa vùng cần nhân bản, loại DNA, không cần tinh sạch, không chưa chất ức chế DNA polmerase Cofactor quan trọng DNA polymerase, ổn định cấu trúc xoắn kép DNA Q ezyme hoạt động yếu khơng hoạt động, nhiều phản ứng không đặc hiệu : từ 0.5 to 3.5 mM DNA polymerase Kéo dài mạch DNA, thường taq enzyme tương tự, chịu nhiệt, nồng độ Unit/phản ứng lại nucleotide Thành phần cấu trúc lên mạch DNA A, T, G, C đoạn mồi Đặc hiệu cho đầu đoạn gen (mồi ngược mồi xi) Cần biết nhiệt độ nóng chảy ( phụ thuộc chiều dài, thành phần GC… Chiều dài 15-30 nucleotide, nồng độ 0.1 – uM Dd đệm nước Mơi trường hoạt động cho thành phần cịn lại, ổn định thành phần 500 mM KCl, 100 mL Tris-HCL, pH 8,3 Triton -x100 / Tween 2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR Taq DNA polymersae     Thu nhận từ thermus aquaticus Chịu nhiệt Nhiệt độ tối ưu 72 độ Chiều tổng hợp: 5’ to 3’ Thành phần • TaqPath™ COVID-19 RNase P Kit 2.0—Multiplexed assays that contain primer/probe sets specific to different SARS-CoV-2 genomic regions and primers/probes for human RNase P • TaqPath™ COVID-19 Plus Control—In vitro transcribed RNA control that contains templates specific to the SARS-CoV-2 and RNase P regions targeted by the assays • TaqPath™ COVID-19 Control Dilution Buffer—Dilution buffer for the control Các bước sử dụng • Tách chiết RNA MagMAX™ Viral/Pathogen II Nucleic Acid Isolation Kit Thực phản ứng RT-PCR Perform RT-PCR using the QuantStudio™ Real‑Time PCR Instrument (96‑well, 0.2‑mL block) Phân tích kết • • • • Dye calibration Transfer the template Set up and run Applied Biosystems™ Pathogen Interpretive Software v1.1.0 • When scaling, group all elements to be scaled Scale as needed Use the “Increase Font Size,” “Decrease Font Size” buttons or manually change the font size for the editable text Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation C19-RNaseP-EUA_QS5-9602_1.0.0 Tan đơng hố chất đá Chuẩn bị phản ứng RT-PCR Vortex, spin down nhẹ ống Component Volume per RNA Volume for n RNA Samples Volume for 94 RNA Samples Sample/ Control plus Controls plus Controls 6.25 µL 6.875 x (n + 2) µL 660.0 µL 1.25 µL 1.375 x (n + 2) µL 132.0 µL 7.5 µL — 792.0 µL Pha lỗng TaqPath COVID-19 Plus Control (1 ì 10^4 copies/àL) theo dóy TaqPath™ 1‑Step Multiplex Master Mix (4X) Chuẩn bị Mix cho phản ứng Với lượt chạy, bổ sung thành phần theo số mẫu TaqPath™ COVID-19 chạy (bảng 1) RNaseP Kit 2.0 Total Reaction Mix volume Chuẩn bị giếng phản ứng • • • • • • • Pipet 7.5 µL Mix (B3) vào giếng MicroAmp™ Optical 96 ‑Well Reaction Plate Component Volume per reaction Vortex, spin down ống chứa mẫu RNA tinh (mẫu chạy /chứng) Mở nắp, thêm RNA tinh sạch, mẫu KC âm, dương vào giếng tương ứng (bảng 2) RNA Sample reaction Positive Control reaction Negative Control reaction Đậy mẫu MicroAmp™ Optical Adhesive Film Vortes plate tốc độ set cao nhất, 10-30s Di chuyển plate, đảm bảo đảo trộn đồng Ly tâm plate 1-2p ≥650 × g (≥650 RCF) > loại bỏ bọt khí thu mẫu đáy ống Reaction Mix (from step 3) 7.5 µL 7.5 µL 7.5 µL Purified sampleRNA 17.5 µL — — — 17.5 µL — — — 17.5 µL 25.0 µL 25.0 µL 25.0 µL Đặt mẫu chạy vào đá để sử dụng Positive Control (diluted TaqPath™ COVID-19 Plus Control - step 2) Negative Control Total volume Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation Phân tích kết Phân tích kết Kết âm tính giả: Cách lấy mẫu không phù hợp RNA virus phân huỷ trình vận chuyển/bảo quản Mẫu lấy khơng cịn tải lượng virus Phương pháp tách chiết hố chất khơng phù Kết dương tính giả: Kết khơng rõ ràng (Inconclusive): Nhiễm chéo thao tác chuẩn bị mẫu Nồng độ mẫu gần LoD Nhiễm chéo mẫu lấy ban đầu Phản ứng chéo với SARS-CoV-1 Mẫu gộp Các yếu tố khác Nhiễm RNA trình thao tác hợp Có chất ức chế phản ứng RT-PCR Có đột biến virus Không tuân theo hướng dẫn sử dụng kit Không cho mẫu vào phản ứng Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation Đánh giá số đặc tính kit (Performance characteristics) Reactivity Limit of detection Interfering substances (Inclusivity) Cross-reactivity Clinical evaluation Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation Limit of detection (LoD) • • Thực phản ứng với 17.5 µL RNA tinh để xác định LoD 95 Kiểm tra kit với mẫu dịch mũi họng (nasopharyngeal swab) (NP) mẫu dịch mũi trước (anterior nasal swab) (NS) • Kiểm tra 20 mẫu loại dịch, lặp lần) Specimen Type Limit of Detection (GCE/ml of sample) Nasopharyngeal swab 75 GCE/ml of sample Anterior nasal swab 75 GCE/ml of sample (GCE: Genomic Copy Equivalents ) Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation Reactivity (Inclusivity) Phân tích In silico sử dụng 1,808,689 trình tự gen hoàn chỉnh SARS-CoV-2 sở liệu GISAID kể từ 9/6/2021 với biển thể quan tâm: • 819,801 genomes biến thể Alpha • 20,057 genomes biến thể Beta • 25,068 genomes biến thể Gamma • 29,149 genomes biến thể Delta 100% trình tự SARS-CoV-2 lẫy mẫu từ người thể độ tương đồng 100% với nhiều primer/probe sử dụng >> kit có khả phát Interfering substances Kiểm tra lặp lần với mẫu: • Mẫu gộp dịch mũi họng (nasopharyngeal swab) âm tính trộn virus bất hoạt nồng độ 3LoD (225 GCE/ml), bổ sung chất tương tác nồng độ khác • Mẫu âm tính gộp khơng trộn virus bất hoạt, bổ sung chất tương tác nồng độ tương ứng >> Không có kết âm tính giả dương tính giả với chất tương tác nồng độ khảo sát Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation Cross-reactivity • Kiểm tra In vitro với 31 lồi >>Khơng xuất kết “Presence” với loài test (SARS coronavirus cho kết “Inconclusive” ( khuếch đại N Gene) • Kiểm tra In silico phân tích Blast với 59 lồi >> Khơng có trình tự vi khuẩn, virus, nấm,… tương đồng >80% identity với primer/probe kit (trừ SARS coronavirus có trình tự tương đồng >80% identity với N/ORF1b gene) Clinical evaluation Kiểm tra mẫu Kit phương pháp đánh giá so sánh FDA EUA • 60 mẫu dương tính SARS-CoV-2 (54 nasopharyngeal swabs anterior nasal swabs) • 60 mẫu âm tính SARS-CoV-2 (45 nasopharyngeal swabs 15 anterior nasal swabs) >> Tính tốn Positive Percent Agreement (PPA), Negative Percent Agreement (NPA) PPA: tỷ lệ kết dương tính phương pháp so sánh / đối chiếu kết phương pháp thử nghiệm dương tính NPA: tỷ lệ kết âm tính phương pháp so sánh / đối chiếu kết phương pháp thử nghiệm âm tính Một số yếu tố ảnh hưởng độ xác SPCĐ Dịch phế quản phế nang Tải lượng virus (93%) mẫu Thời gian lấy mẫu Mẫu đờm (69%) Dịch đường mũi (62%) Dịch hầu họng (32%) Wang et al (1070 mẫu) (205 bệnh nhân) • • Tải lượng virus khác tuỳ cá thể giai đoạn nhiễm, phụ thuộc tiền sử bệnh, khả đáp ứng miễn dịch biện pháp y tế can thiệp, Sethuraman et al: mẫu nasopharyngeal swabs sử dụng chẩn đốn sớm (ít khơng triệu chứng), mẫu sputum để khẳng định, tránh âm tính giả Độ đặc hiệu mồi/probe Đột biến • Osório Correia-Neves : ~79% trình tự bám mồi gen kit Wuhan-Hu-1 đột biến >> ~14% biến thể khơng phát với loại mồi thương mại hố • Các trình tự SARS-CoV-2 thường xuyên cập nhập GISAID Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation Kết luận chung Công nghệ chế tạo sinh phẩm khuếch đại nucleic acid phụ thuộc: Lựa chọn, tối ưu thành phần phản ứng (Mix) Thiết kế Primer/Probe (tuỳ kỹ thuật PCR sử dụng) Bổ sung chất làm tăng hiệu phản ứng Để đưa ứng dụng >> cần đánh giá hiệu đặc tính sản phẩm • • • Click icon to add picture Questions? Use or disclosure of data contained on this sheet is subject to the restriction on the title page of this proposal or quotation ... AXIT NUCLEIC VÀ KHUẾCH ĐẠI AXITNUCLEIC CÁC CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM KHUẾCH ĐẠI AXITLUCLEIC 2.1 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR 2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM RT – PCR 2.3 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH. .. title page of this proposal or quotation II CÁC CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM KHUẾCH ĐẠI AXIT NUCLEIC 2.1 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR  Khái niệm: PCR trình tổng hợp sợi DNA dựa DNA khuôn... Tween 2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR Taq DNA polymersae     Thu nhận từ thermus aquaticus Chịu nhiệt Nhiệt độ tối ưu 72 độ Chiều tổng hợp: 5’ to 3’ 2.2 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM PCR