PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG

I.Tổng quan về Bacillus cereus

Liều lượng gây ngộ độc 106-108 tế

II Phân Tích Bacillus cereus

Nguồn nhiễm

5

Diarrhoeal toxinEmetic

Phạm vi áp dụng

• Phương pháp được tham chiếu theo TCVN 4992:2005 ( ISO 7932:2004)

• Phương pháp này áp dụng cho các sản phẩm dùng cho người, thức ăn chăn nuôi, các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.

• Cấy một lượng mẫu qui định lên bề mặt môi trường nuôi cấy đặc đựng trong các đĩa petri

• Pha loãng theo tỉ lệ 1:9 ( 1 mẫu - 9 SPW ) • Ủ trong điều kiện hiếu khí 30oC/18-48h

• Tính số lượng B.Cereus trong 1ml hoặc 1g mẫu

Nguyên tắc

8

Môi trường và hóa chất

Môi trường và hóa chất Mục đích

SPW ( Saline Peptone Water ) Pha loãng mẫuMYP agar base ( Mannitol- Egg Yolk-

Thành PhầnHàm Lượng Vai trò

Mannitol10 g/lPhân biệt Bacillus cereus dựa trên khả năng phân giải mannitol

Peptone10 g/lCung cấp nguồn nitơ và cacbon cho vi sinh vật.

Sodium chloride5 g/lĐiều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường.

Agar15 g/lTạo thành dạng rắn cho môi trườngEgg yolk emulsion100 ml/lLà một nguồn dinh dưỡng và chất

béo cho vi sinh vật.

Polymyxin B sulphate0.3 mg/l Ức chế sự phát triển của các vi khuẩn Gram âm

Môi Trường MYP

Các bước tiến hành

Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầuBước 2 Pha loãng

Đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lòng

của phần mẫu thử đại diện, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác).

Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép + 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu.

Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong 2 – 3 phút

14

Để vi sinh vật

thương do thay đổi nhiệt , thì nhiệt độ của dịch pha loãng

trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ

Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp.

Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống.

Bước 1 Chuẩn bị mẫu và huyền phù ban đầu

15

Bước 2 Pha loãng mẫu

Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số +5% cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.

Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2(đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1) Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp.

16

• Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử cho vào giữa đĩa petri Lặp lại qui trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri

• Dùng que cấy trái trái đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa petri, sử dụng một que trãi vô trùng cho mỗi đĩa Để các đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng để chất cây bám vào thạch Lật úp đĩa và ủ 30°C/24 giờ.

Bước 3 Cấy và ủ mẫu

Bước 4 Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

• Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy Khuẩn lạc B.cereus giả

• Lấy 5 khuẩn lạc giả định, nếu trên đĩa có ít hơn 5

Bước 5 Đọc Kết Quả

Khuẩn lạc của B cereus môi trường thạch MYP

Dẹt, đường kính 2–3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục; tan máu β.

V: Thể tích dịch ược cấy trên mỗi ĩa (ml)đó:đó:

n1 : Số ĩa ở ộ pha loãng thứ nhất ược giữ lạiđó:đó:đó:

n2 : Số ĩa ở ộ pha loãng thứ hai ược giữ lạiđó:đó:đó:

21

Ví dụ giả định

Lô hàng không đạt yêu cầu

Sản phẩm Loại vi khuẩn Giới hạn Vi Sinh Vật

Sữa dạng bột B.Cereus 6,4x103 CFU/g có trong mẫu kiểm nghiệm

(*) Theo quyết định số 46/2007/QĐ-BYT

Câu hỏi: Các bước tiến hành nuôi cấy Bacillus cereus?

A Pha loãng mẫu – Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng

định – Đọc kết quả

B Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Pha loãng mẫu – Đọc kết quả – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

C Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Pha loãng mẫu – Cấy và ủ mẫu – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đọc kết quả

D Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Pha loãng mẫu – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đáp án: C

Câu hỏi: Quá trình ủ mẫu của B.cereus ở điều kiện nhiệt độ là bao nhiêu?

Câu hỏi: Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng để định lượng Bacillus cereus bằng cách nào?

A Đếm số lượng khuẩn trên một bề mặt cấy sau khi chúng đã phân tán đều.

B Sử dụng phép đo hấp thụ ánh sáng để xác định nồng độ vi khuẩn

C Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử

D Xác định sự thay đổi màu sắc khi vi khuẩn phát triển trên môi trường agar.

Đáp án: A

Câu hỏi: Bacillus cereus là một loại vi khuẩn gram

dương, có khả năng gây ra nhiều bệnh trên con người Chọn câu trả lời đúng liên quan đến tính chất của

Bacillus cereus?

A Bacillus cereus là vi khuẩn gram âm.

B Bacillus cereus có khả năng tạo nên bào tử chịu nhiệt độ cao.

C Bacillus cereus là vi khuẩn chủ yếu gây nhiễm trùng ruột D Bacillus cereus không thể tồn tại trong môi trường oxh.

Đáp án: B