TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG
Trang 3I.Tổng quan về Bacillus cereus
Trang 4Liều lượng gây ngộ độc 106-108 tế
Trang 5II Phân Tích Bacillus cereus
Trang 6Nguồn nhiễm
5
Trang 7Diarrhoeal toxinEmetic
Trang 8Phạm vi áp dụng
• Phương pháp được tham chiếu theo TCVN 4992:2005 ( ISO 7932:2004)
• Phương pháp này áp dụng cho các sản phẩm dùng cho người, thức ăn chăn nuôi, các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.
• Cấy một lượng mẫu qui định lên bề mặt môi trường nuôi cấy đặc đựng trong các đĩa petri
• Pha loãng theo tỉ lệ 1:9 ( 1 mẫu - 9 SPW ) • Ủ trong điều kiện hiếu khí 30oC/18-48h
• Tính số lượng B.Cereus trong 1ml hoặc 1g mẫu
Nguyên tắc
8
Trang 10Môi trường và hóa chất
Môi trường và hóa chất Mục đích
SPW ( Saline Peptone Water ) Pha loãng mẫuMYP agar base ( Mannitol- Egg Yolk-
Trang 11Thành PhầnHàm Lượng Vai trò
Mannitol10 g/lPhân biệt Bacillus cereus dựa trên khả năng phân giải mannitol
Peptone10 g/lCung cấp nguồn nitơ và cacbon cho vi sinh vật.
Sodium chloride5 g/lĐiều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường.
Agar15 g/lTạo thành dạng rắn cho môi trườngEgg yolk emulsion100 ml/lLà một nguồn dinh dưỡng và chất
béo cho vi sinh vật.
Polymyxin B sulphate0.3 mg/l Ức chế sự phát triển của các vi khuẩn Gram âm
Môi Trường MYP
Trang 13Các bước tiến hành
Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầuBước 2 Pha loãng
Trang 14Đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lòng
của phần mẫu thử đại diện, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác).
Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép + 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu.
Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong 2 – 3 phút
14
Trang 15Để vi sinh vật
thương do thay đổi nhiệt , thì nhiệt độ của dịch pha loãng
trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ
Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp.
Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống.
Bước 1 Chuẩn bị mẫu và huyền phù ban đầu
15
Trang 16Bước 2 Pha loãng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số +5% cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2(đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1) Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp.
16
Trang 17• Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử cho vào giữa đĩa petri Lặp lại qui trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo Sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri
• Dùng que cấy trái trái đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa petri, sử dụng một que trãi vô trùng cho mỗi đĩa Để các đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng để chất cây bám vào thạch Lật úp đĩa và ủ 30°C/24 giờ.
Bước 3 Cấy và ủ mẫu
Trang 18Bước 4 Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
• Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy Khuẩn lạc B.cereus giả
• Lấy 5 khuẩn lạc giả định, nếu trên đĩa có ít hơn 5
Trang 19Bước 5 Đọc Kết Quả
Khuẩn lạc của B cereus môi trường thạch MYP
Dẹt, đường kính 2–3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục; tan máu β.
Trang 21V: Thể tích dịch ược cấy trên mỗi ĩa (ml)đó:đó:
n1 : Số ĩa ở ộ pha loãng thứ nhất ược giữ lạiđó:đó:đó:
n2 : Số ĩa ở ộ pha loãng thứ hai ược giữ lạiđó:đó:đó:
21
Trang 23Ví dụ giả định
Lô hàng không đạt yêu cầu
Sản phẩm Loại vi khuẩn Giới hạn Vi Sinh Vật
Sữa dạng bột B.Cereus 6,4x103 CFU/g có trong mẫu kiểm nghiệm
(*) Theo quyết định số 46/2007/QĐ-BYT
Trang 25Câu hỏi: Các bước tiến hành nuôi cấy Bacillus cereus?
A Pha loãng mẫu – Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng
định – Đọc kết quả
B Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Pha loãng mẫu – Đọc kết quả – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
C Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Pha loãng mẫu – Cấy và ủ mẫu – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đọc kết quả
D Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Pha loãng mẫu – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đáp án: C
Trang 26Câu hỏi: Quá trình ủ mẫu của B.cereus ở điều kiện nhiệt độ là bao nhiêu?
Trang 27Câu hỏi: Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng để định lượng Bacillus cereus bằng cách nào?
A Đếm số lượng khuẩn trên một bề mặt cấy sau khi chúng đã phân tán đều.
B Sử dụng phép đo hấp thụ ánh sáng để xác định nồng độ vi khuẩn
C Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử
D Xác định sự thay đổi màu sắc khi vi khuẩn phát triển trên môi trường agar.
Đáp án: A
Trang 28Câu hỏi: Bacillus cereus là một loại vi khuẩn gram
dương, có khả năng gây ra nhiều bệnh trên con người Chọn câu trả lời đúng liên quan đến tính chất của
Bacillus cereus?
A Bacillus cereus là vi khuẩn gram âm.
B Bacillus cereus có khả năng tạo nên bào tử chịu nhiệt độ cao.
C Bacillus cereus là vi khuẩn chủ yếu gây nhiễm trùng ruột D Bacillus cereus không thể tồn tại trong môi trường oxh.
Đáp án: B