(TIỂU LUẬN) TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM đề tài PHÁT HIỆN và ĐỊNH DANH SALMONELLA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LÊ THỊ HỒNG ÁNH BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Đề tài: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH SALMONELLA Nhóm: 05 GVHD: Hồng Xuân Thế Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Mỹ Huyền 2005180173 Nguyễn Thị Trúc Linh 2005180312 Trịnh Ngọc Như Huỳnh 2005181102 Hồ Trúc Linh 2005181128 Nguyễn Võ Nhật Khanh 2005181107 TP HỜ CHÍ MINH, NĂM 2020 Tieu luan STT Họ tên Phân công nhiệm vụ Nguyễn Thị Trúc Linh Cơ sở khoa học, tình hình gây bệnh ngộ độc vi khuẩn Salmonella, nguyên tắc phân tích Salmonella Quy trình phân tích, giải thích quy trình Hồ Trúc Linh Trịnh Ngọc Như Huỳnh Phạm Thị Mỹ Huyền Nguyễn Võ Nhật Khanh Quy trình phâ tích giải thích quy trình, ví dụ minh họa Mơi trường, dụng cụ, hóa chất thiết bị So sánh TCVN ISO, thuật ngữ đề xuất, kết luận Bảng phân cơng nhiệm vụ Tieu luan Mức độ hồn thành 100% 100% 100% 100% 100% MỤC LỤC Cơ sở sinh học Tình hình ngộ độc, gây bệnh Salmonela Nguyên tắc phân tích Quy trình phân tích Các bước tiến hành Mơi trường hóa chất 15 Dụng cụ thiết bị 16 So sánh TCVN 10780-1: 2017 ISO 6579-1:2017 19 10 Thuật ngữ đề xuất 20 11 Kết luận 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 Tieu luan DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 7.1 Tủ sấy .16 Hình 7.2 Tủ ấm 16 Hình 7.3 Tủ lạnh 17 Hình 7.4 Nồi cách hâp thủy 17 Hình 7.5 Que cấy vô trùng 17 Hình 7.6 Dụng cụ đo pH 18 Hình 7.7 ĐĨa petri vơ trùng 18 Hình 7.8 Ống nghiệm, bình tam giác vơ trùng 18 Tieu luan DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BPW: dung dịch Buffered Peptone Water CDC: Trung tâm Kiểm sốt Phịng ngừa dịch bệnh Mỹ HE: Hektoen Entric Agar LD: lysine decarboxylase MKTTn: Mueller Kauffman Tetrathionate Novobiocin Broth RVS: Canh Rappaport - Vassiliadis Soya Pepton TSA: Tryptone Soy Agar TSI: Kilgler Iron Agar VP: Voges-Proskauer XLD: Xylose Lysine Desoxycholate Tieu luan Cơ sở sinh học Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, khơng sinh bào tử, hiếu khí kỵ khí tùy nghi, có khả di động (trừ Salmonella gallinarum Salmonella pullorum), sinh acid từ glucose mannitol không lên men saccharose lactose, không sinh indol không phân giải ure Hầu hết chủng sinh H 2S (trừ Salmonella typhi) Chúng có mặt khắp nơi đất, nước, nước đá, sữa, sản phẩm bơ sữa, gia cầm, sản phẩm gia cầm, trứng, sản phẩm trứng, thịt, phân động vật, thú ni… sinh sống đường ruột, có đường kính khoảng 0,7µm đến 1,5µm, dài từ 2µm đến 5µm có vành lơng rung hình roi Salmonella có 2000 kiểu huyết kiểu có khả gây bệnh chúng phát triển tốt ở nhiê ̣t đô ̣ 6℃ – 42℃ , thích hợp nhất ở 35℃ – 37℃ , pH từ – và thích hợp nhất ở pH = 7,2 Ở nhiê ̣t đô ̣ từ 18℃ – 40℃ vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày Tại Bắc Mỹ, Salmonella typhimurium Salmonella enteridis hai chủng thường gặp Tại Việt Nam, bệnh thương hàn Salmonella typhi Salmonella paratyphi A, B, C gây Bệnh Salmonella gây vấn đề quan trọng liên quan đến sức khỏe cộng đồng, gây nguy hiểm tử vong đến người động vật giới Liều gây bệnh khoảng 10 5-6 tế bào, số chủng độc, việc ăn lượng nhỏ tế bào gây bệnh Salmonella tác nhân gây bệnh chủ yếu thực phẩm Có ba dạng bệnh Samonela gây Sốt thương hàn S typhy, nhiễm trùng máu S cholera-sius, rối loạn tiêu hóa S.typhymurium S.enterithdis Hầu hết tiêu chuẩn vi sinh an toàn thực phẩm khơng cho phép có diện Salmonella 25g/25ml mẫu Theo phương pháp truyền thống việc phát Salmonella bao gồm bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập, phuc hồi khẳng định Vi khuẩn Salmonella chịu nhiệt, dễ bị tiêu diệt thức ăn đun nấu phù hợp Việc làm lạnh, cấp đông, đảm bảo vệ sinh có tác dụng quan trọng làm giảm thiểu nguy nhiễm bệnh Salmonella có ba loại kháng nguyên, chất xuất thể tạo kích thích đáp ứng miễn dịch kết hợp đặc hiệu với sản phẩm kích thích đó, gồm: kháng ngun thân O, kháng ngun lơng H kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) yếu Tieu luan tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên tế bào bạch cầu Vi khuẩn Salmonella tiết loại độc tố: Ngoại độc tố nội độc tố + Nội độc tố Salmonella mạnh gồm loại: Gây xung huyết mụn loét, độc tố ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật + Ngoại độc tố phát lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau ngày lấy ra, lại cấy truyền từ đến 10 lần, sau đem lọc, nước lọc có khả gây bệnh cho động vật thí nghiệm Ngoại độc tố hình thành điều kiện invivo ni cấy kỵ khí Ngoại độc tố tác động vào thần kinh ruột Tình hình ngộ độc, gây bệnh Salmonela Trong nước: Tại Việt Nam, năm nước ta xảy khoảng 168 ca ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, nguyên nhân phần lớn Salmonella Tại TP Hồ Chí Minh, đợt giám sát thí điểm năm 2013, sau lấy 1.618 mẫu chợ đầu mối Bình Điên, Hóc Môn, Thủ Đức phát Salmonella 30% mẫu thịt heo 45% mẫu thịt gà Ngày 10/7/2013, Công ty TNHH Foremart Việt Nam (thị trấn Ân Thi, huyện Ân Thi, tỉnh Hưng Yên) làm 232 công nhân bị ngộ độc thực phẩm ăn bữa trưa bếp ăn đặt Công Ty với giị, ngao nấu mùng tơi, giá xào mướp, đậu sốt cà chua Đồn cơng tác đại diện quan y tế địa phương thống đánh giá nguyên nhân vụ ngộ độc vi khuẩn Salmonella độc tố chúng gây Ngày 3/10/2013, sau bữa ăn ca trưa Bếp ăn tập thể Công ty TNHH MTV WONDO VINA ấp Tân Bình, xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang, hàng loạt cơng nhân có biểu nơi mửa, ngồi phải nhập viện Tính đến ngày 08/10/2013, tổng số bệnh nhân ghi nhận 779 người phải nhập viện điều trị Rất may mắn, bệnh nhân có tiến triển tốt, khơng có diễn biến bất thường Thức ăn nghi ngờ chứa tác nhân là món thịt bọc trứng chim cút kho; nguyên nhân ngộ độc nghi vi sinh vâ ̣t và đô ̣c tố vi khuẩn nhóm Gram âm đến nay, mẫu kiểm nghiệm xác định hàng loạt công nhân bị ngộ độc thức ăn nhiễm khuẩn Salmonella Tieu luan Tại Thành phố Đồng Hới với gần 250 người phải nhập viện từ ngày 14 tháng 10 năm 2015 bánh mì thịt, bánh mì trứng nhiễm khuẩn Những ngày đầu tháng năm 2018, Nà Mện, xã Nậm Ty, huyện Sông Mã, tỉnh Sơn La, sau ăn cỗ cưới, có tới 300 người bị ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Salmonella (vi khuẩn thương hàn) gây Ngày 14/11/2018, vi khuẩn Salmonella nguyên nhân khiến 200 trẻ mầm non Đông Anh (Hà Nội) bị ngộ độc thực phẩm sau tổ chức liên hoan Kết kiểm tra cho thấy mẫu bánh dương tính với vi khuẩn Salmonella Mẫu bánh cung cấp Công ty Cổ phần sản xuất thương mại Nguyên Cát có địa phường Hạp Lĩnh, tỉnh Bắc Ninh Ngày 28/11/2018, 200 người nhập viện sau ăn bánh mì vỉa hè TP Bn Ma Thuột Ngày 5/12, bà Lê Thị Châu - Chi cục trưởng Chi cục Vệ sinh An toàn thực phẩm thuộc Sở Y tể Đắk Lắk xác nhận liên quan đến vụ 215 người bị ngộ độc thực phẩm sau ăn tiệm bánh mì ngã tư đường Hồng Diệu - Phan Chu Trinh (TP Buôn Ma Thuột), đơn vị xác định nguyên nhân ngộ độc hàng loạt nhiễm vi khuẩn Salmonella Sau lấy mẫu thực phẩm gồm thịt heo, giò chả, nước sốt, hành phi, bơ kiểm trathì phát tất mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella Ngày 25/3/2019, hàng chục người bị ngộ độc ăn giỗ xã Hòa Hải, huyện Hương Khê, tỉnh Hã Tĩnh thức ăn đám giỗ bị nhiễm Salmonella Nguyên nhân gây nhiễm Salmonella khơng đảm bảo an tồn thực phẩm khâu chế biến, mặt nước bị ô nhiễm nước tù đọng… Các triệu chứng ngộ độc thực phẩm Salmonella thường xuất nhanh chóng, vịng – 72 sau ăn thức ăn uống nước nhiễm Salmonella Các triệu chứng điển đau bụng co thắt, ớn lạnh, tiêu chảy, sốt, đau cơ, buồn nôn, nước tiểu có màu sẫm, khơ miệng, phân tồn nước đơi có máu… Ngồi nước: Theo dự đốn của WHO, tồn giới có 16 triệu ca bệnh thương hàn hàng năm, nửa triệu số tử vong Salmonella có khả sống sót hàng tuần bên thể người động vật Ánh sáng mặt trời (tia UV) làm tăng tốc độ chết tác nhân gây bệnh Trong phân khô, chúng cịn sống 2,5 năm Vi khuẩn khơng bị giết cách đông lạnh Trong môi trường axit, vi khuẩn Salmonella chết nhanh chóng chất diệt khuẩn phổ biến giết chết chúng vòng vài phút Ở nhiệt độ 6 °C, mức tăng trưởng Tieu luan chúng chậm nhiều Để ngăn ngừa nhiễm khuẩn Salmonella, thực phẩm khuyến cáo chế biến nên giữ nhiệt độ 75°C mười phút (nhiệt độ lõi), trứng tươi cần bảo quản tủ lạnh Năm 1885 Slamon Smith (Mỹ) tìm Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả gọi tên Bacilus cholerasuis, gọi Salmonella Tại Hoa Kỳ, Salmonella thủ phạm 15% trường hợp ngộ độc thực phẩm Ngày 15/12/2011, trường học đảo Hokkaido phía Bắc Nhật Bản có 953 học sinh 48 giáo viên nhân viên nhà trường có triệu chứng ngộ độc thực phẩm sau ăn trưa gồm súp miso, salad củ cải với thịt băm Nhật Bản Các mẫu thức ăn thử nghiệm xác định nguyên nhân phát sinh vụ ngộ độc thức ăn nhiễm Salmonella Ngày 3/7/2019, đu đủ tươi nhập từ Mexico khiến 62 người bị ngộ độc nhiễm khuẩn Samonella Ngày 26/9/2020, 41 người dân Mỹ nhiễm khuẩn Salmonella sau ăn mộc nhĩ chế biến kèm với mỳ ramen Trung tâm Kiểm sốt Phòng ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC) cho ca nhiễm sử dụng mộc nhĩ khơ cơng ty nhập đồ Châu Á có trụ sở Sante Fe Springs, California phân phối Chính quyền tỉnh Saitama ngày 2/7/2020 xác nhận 3.453 người trường tiểu học trung học Yashio - thành phố phía Bắc thủ Tokyo, bị đau bụng, sau ăn bữa trưa với suất ăn công ty TQC cung cấp vào ngày 26/6 Suất ăn bao gồm gà rán, khoai tây sốt cá ngừ, salad rong biển cơm súp đậu hũ.  Salmonella ghi nhận nguyên nhân phổ biến vụ ngộ độc thực phẩm EU Năm 2018, quốc gia thành viên EU báo cáo 5.146 vụ ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng đến 48.365 người, theo báo cáo quan an toàn thực phẩm Châu Âu (EFSA) Trung tâm phòng chống dịch bệnh Châu Âu (ECDC), có 1.581 vụ số vụ ngộ độc Salmonella, 67% có nguồn gốc từ Tây Ban Nha Ba Lan chủ yếu liên quan đến trứng Tieu luan Nguyên tắc phân tích Phương pháp tham chiếu theo TCVN 10780-1:2017 dùng để phát Salmonella tất loại thực phẩm Phương pháp dùng để định tính kết luận phát hay khơng phát Salmonella lượng mẫu lấy Quy trình phát Salmonella bắt buộc phải qua năm giai đoạn phải sử dụng chủng đối chứng toàn q trình phân tích + Tiền tăng sinh: mẫu tiền tăng sinh môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ 37℃ khoảng 18h + Tăng sinh chọn lọc: Sau giai đoạn tiền tăng sinh, dịch mẫu chuyển qua môi trường tăng sinh chọn lọc RVS ủ 41,5 ℃ MKTTn ủ 37℃ khoảng 24h + Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai môi trường rắn chọn lọc ( XLD HE), ủ 37℃ khoảng 24h + Phục hồi: Cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ Salmonela môi trường phân lập sang môi trường dinh dưỡng + Khẳng định: Cấy chuyển sinh khối môi trường dinh dưỡng sang mơi trường thử nghiệm sinh hóa thử nghiệm kháng huyết lọc Tieu luan Các bước tiến hành Cân lượng 25g mẫu rắn đong thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số cho phép ± 5% phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vơ trùng (hoặc bình tam giác), bố sung 225ml môi trường BPW đồng mẫu máy dập mẫu (stomacher) 60 giây + Bước 1: Tiền tăng sinh (Tăng sinh sơ bộ) Mẫu tiền tăng sinh môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ 37±1oC 18±2h + Bước 2: Tăng sinh chọn lọc - Chuyển 0,1 ml dịch cấy tăng sinh thu vào ống chứa 10 ml môi trường RSV - Chuyển ml dịch cấy thu vào ống có chứa 10 ml mơi trường MKTTn  Ủ mơi trường RVS cấy 41,5 °C trong 24 h ± h  Ủ môi trường MKTTn cấy 37°C trong 24 h ± h + Bước 3: Phân lập - Từ dịch cấy thu canh thang RVS, cấy phân lập lên bề mặt đĩa thạch XLD HE cho thu khuẩn lạc riêng rẽ - Từ dịch cấy thu canh thang MKTTn, cấy phân lập lên bề mặt đĩa thạch XLD HE cho thu khuẩn lạc riêng rẽ - Lật úp đĩa XLD HE ủ 37°C trong 24±3h - Sau ủ 24±3h, kiểm tra đĩa có mặt khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình mà nghi ngờ Salmonella F Các khuẩn lạc Salmonella điển hình phát triển thạch XLD có màu hồng suốt, có khơng có tâm màu đen F Các khuẩn lạc Salmonella điển hình phát triển thạch HE có màu xanh lam, có khơng có tâm màu đen + Bước 4: Phục hồi môi trường dinh dưỡng NA/TSA Tieu luan - Đánh dấu khuẩn lạc điển hình nghi ngờ từ đĩa môi trường phân lập XLD HE Nếu đĩa có năm khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc nghi ngờ, lấy tất cá khuẩn điển hình nghi ngờ cấy ria lên NA/TSA Ủ 37±1oC 24±3h + Trường hợp 1: từ đĩa thử khuẩn lạc đặc trưng, cho kết thử nghiệm sinh hóa phù hợp kết luận phát Salmonella mẫu + Trường hợp 2: khuẩn lạc cho kết thử nghiệm sinh hóa khơng phù hợp tiến hành thử bốn khuẩn lạc lại đánh dấu, bốn khuẩn lạc cho kết thử nghiệm sinh hóa phù hợp kết luận phát Salmonella mẫu ngược lại kết luận khơng phát Salmonella mẫu F Chọn khuẩn lạc để khẳng định Đánh dấu khuẩn lạc nghi ngờ đĩa Chọn khuẩn lạc điển hình nghi ngờ để cấy truyền khẳng định Nếu khuẩn lạc âm tính chọn nhiều bốn khuẩn lạc nghi ngờ để chắn khuẩn lạc cấy truyền hỗn hợp môi trường phân lập/môi trường tăng sinh chọn lọc khác cho thấy khuẩn lạc nghi ngờ phát triển Cấy ria khuẩn lạc chọn bề mặt môi trường thạch không chọn lọc làm khô trước, cho khuẩn lạc phát triển riêng rẽ Ủ đĩa cấy nhiệt độ từ 34°C đến 38°C trong 24± h Cách khác, có khuẩn lạc riêng rẽ (ni cấy thuần) mơi trường đĩa thạch chọn lọc thực khẳng định sinh hóa trực tiếp với khuẩn lạc riêng rẽ nghi ngờ từ môi trường đĩa thạch chọn lọc Sau thực bước nuôi cấy môi trường thạch không chọn lọc song song với phép thử sinh hóa để kiểm tra độ khuẩn lạc từ môi trường thạch chọn lọc Sử dụng chủng cấy để khẳng định phép thử sinh hóa huyết Tieu luan + Bước 5: Khẳng định sinh hóa kháng huyết - Từ khuẩn lạc chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào môi trường sau:  Thạch TSI  - Nguyên tắc: xác định khả sử dụng nguồn carbohydrate cụ thể kết hợp với mơi trường tăng trưởng bản, có khơng có sinh hydrogen sulfide (H2S) - Cách cấy mẫu: Cấy ria bề mặt nghiêng thạch cấy đâm sâu xuống đáy Ủ 37±1°C trong 24±3h Diễn giải thay đổi môi trường sau:  Cấy đâm sâu Màu vàng Glucose dương tính (sử dụng glucose) Màu đỏ hoặc khơng đổi màu Glucose âm tính (khơng sử dụng glucose) Màu đen Sinh hydro sunfua Bọt khí nứt thạch Sinh khí từ glucose  Bề mặt nghiêng thạch màu vàng lactose và/hoặc sucrose dương tính (sử dụng lactose và/hoặc sucrose) màu đỏ lactose sucrose âm tính (khơng sử dụng lactose không không sử dụng sucrose) đổi màu Phần lớn chủng cấy Salmonella điển hình thể tính kiềm (màu đỏ) bề mặt nghiêng thạch tính axit (màu vàng) có sinh khí (bọt khí), (với khoảng 90% trường hợp) sinh hydro sunfua (thạch bị đen) cấy đâm sâu Tieu luan Khi Salmonella phân lập dương tính lactose, bề mặt nghiêng thạch TSI có màu vàng Do vậy, việc khẳng định sơ chủng Salmonella không dựa kết phép thử thạch TSI  Lysine decarboxylase Nguyên tắc: sử dụng để phát vi khuẩn sinh enzyme decarboxylase, enzyme tương tác với amino acid có gốc carboxyl (-COOH) cuối, tạo thành amine hay diamine carbon dioxide (CO2) Cách lấy mẫu: cấy phía bề mặt mơi trường lỏng, phủ lớp paraffin hay dầu khoáng lên bề mặt môi trường Ủ 37± 1°C 24 h ± h Salmonella có phản ứng lysine decarboxylase dương tính nên sau nuôi cấy, môi trường giữ nguyên màu tím Phản ứng âm tính mơi trường có màu vàng Phần lớn chủng cấy Salmonella điển hình có phản ứng LDC dương tính  Thạch urê  Nguyên tắc: sử dụng để phát khả phân cắt ure thành amoniac hoạt tính enzyme urease từ VSV kết mơi trường bị kiềm hóa NH tạo Cách cấy mẫu: Cấy ria bề mặt nghiêng thạch Ủ 37± 1°C 24 h ± h Nếu phản ứng dương tính urê phân giải thành amoniac, làm phenol đỏ chuyển thành màu hồng sau chuyển thành màu đỏ hồng Ngược lại, phản ứng âm tính mơi trường khơng đổi màu (vàng cam)  Mơi trường thử phản ứng indol Nguyên tắc: phát khả oxi hóa tryptophan thành dạng indol: Indol, Skatol (methyl indol) indol-acetate Cách cấy mẫu: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa ml môi trường trypton water Ủ 37 ±1°C trong 24 h ± h Sau ủ, thêm ml thuốc thử Kovacs, xuất vòng màu đỏ (lớp bề mặt) chứng tỏ phản ứng dương tính, xuất màu khác phản ứng âm tính 10 Tieu luan Phép thử indol sử dụng cần phân biệt Salmonella (thường phản ứng âm tính indol với Escherichia coli và Citrobacter (cả hai phản ứng dương tính indol) vi sinh vật cho phản ứng điển hình mơi trường phân lập Salmonella  Phát β-galactosidase Nguyên tắc: xác định khả lên men lactose vi sinh vật Cách cấy mẫu: cho vòng đầy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống vơ trùng có chứa 0,25ml dung dịch muối sinh lý Thêm giọt toluen lắc ống Đặt ống vào nồi cách thủy 37°C và để vài phút (khoảng phút) Thêm 0,25ml thuốc thử để phát β-galactosidase lắc Đặt lại ống vào nồi cách thủy để 37°C trong 24h ± 3h, kiểm tra ống thường xuyên Màu vàng cho thấy phản ứng dương tính Phản ứng thường xuất sau 20 phút Nếu sử dụng đĩa giấy bán sẵn, theo dẫn nhà sản xuất  Voges – Proskauer Nguyên tắc: xác định khả sinh acetymethylcarbinol (acetoin) trình lêm men glucose só vi sinh vật Cách cấy mẫu: cho vịng đầy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống vô trùng có chứa 3ml mơi trường VP Ủ 37±1°C trong 24h ± 3h Sau ủ, thêm giọt dung dịch creatine, giọt dung dịch α-naphthol sau thêm giọt dung dịch kali hydroxyde (KOH), lắc dều sau lần thêm loại thuốc thử Khi xuất màu hồng đến màu đỏ sáng 15 phút chứng tỏ phản ứng dương tính, cịn phản ứng âm tính dịch vi khuẩn khơng đổi màu  Phép thử huyết  Yêu cầu chung Các khuẩn lạc cho thấy phản ứng sinh hóa điển hình đối với Salmonella được thử nghiệm tiếp để phát có mặt kháng nguyên Salmonella O H (và với kháng nguyên Vi, nơi dự kiến có mặt Salmonella Typhi nguồn cung cấp thực phẩm) cách ngưng kết với kháng nguyên đa giá lam kính Các khuẩn lạc nuôi cấy 11 Tieu luan môi trường thạch không chọn lọc kiểm tra khả tự ngưng kết Loại bỏ chủng tự ngưng kết mà không thử nghiệm tiếp để phát có mặt kháng nguyên Salmonella. Sử dụng kháng nguyên theo hướng dẫn nhà sản xuất khác với phương pháp mô tả để phát có mặt kháng nguyên Salmonella O H  Loại bỏ chủng tự ngưng kết Cho giọt dung dịch nước muối lên lam kính thủy tinh Dùng que cấy vòng trộn dung dịch nước muối với khuẩn lạc cần thử nghiệm, để thu huyền phù đục đồng Lắc nhẹ lam kính từ 30s đến 60s (tùy theo hướng dẫn nhà sản xuất) Quan sát huyền phù tối, tốt dùng kính lúp Nếu có vón cục, khơng rời (ít nhiều) vi khuẩn, chủng xem tự ngưng kết, khơng cần thử phản ứng huyết Nếu vốn cục vi khuẩn rời nhau, chủng xem không tự ngưng kết, cần phảo tiếp tục thử phản ứng huyết + Kiểm tra O, H, Nhỏ giọt anti-O H lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường Nutrient Agar để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ 30-60s, quan sát đen Phản ứng dương tính có tượng ngưng kết xảy Đôi cần quan sát tượng ngưng kết kính lúp hay kính hiển vi với độ phóng đại thấp Ngược lại, vi khuẩn phân bố huyết thanh, làm cho giọt dung dịch đục xem kết âm tính Mẫu kết luận dương tính với salmonella có khuẩn lạc đặc trưng môi trường phân lập cho kết sinh hóa sau: TSI/KIA: đỏ/vàng, có/khơng có H2S sinh hơi; Ure (-); Indol (-); VP (-); ONPG (-); LDC (+) + Kiểm tra kháng nguyên O Kiểm tra có mặt kháng nguyên O với khuẩn lạc xác định khả tự ngưng kết, sử dụng giọt huyết kháng nguyên K đa giá thay cho dung dịch nước muối 12 Tieu luan Nếu xuất ngưng kết phản ứng coi dương tính + Kiểm tra kháng nguyên Vi (tùy chọn) Kiểm tra có mặt kháng nguyên Vi với khuẩn lạc xác định khơng có khả tự ngưng kết, tiến hành theo, sử dụng giọt huyết kháng nguyên Vi thay cho dung dịch nước muối Nếu xuất ngưng kết phản ứng coi dương tính + Kiểm tra kháng nguyên H Kiểm tra có mặt kháng nguyên H với khuẩn lạc xác định khơng có khả tự ngưng kết, tiến hành theo, sử dụng giọt huyết kháng nguyên H đa giá thay cho dung dịch nước muối Nếu xuất ngưng kết phản ứng coi dương tính  13 Tieu luan  Diễn giải phản ứng sinh hóa huyết Bảng diễn giải kết phép thử khẳng định với khuẩn lạc thử nghiệm Phản ứng sinh hóa Tự ngưng kết Phản ứng huyết Diễn giải Điển hình Khơng Kháng ngun O H dương tính (và Vi dương tính thử nghiệm) Các chủng coi Salmonella Điển hình Khơng Kháng ngun O và/hoặc H âm tính Có thể Salmonella Điển hình Có Khơng thử nghiệm tự ngưng kết Phản ứng khơng điển hình Khơng coi Salmonella 14 Tieu luan Mơi trường hóa chất Mơi trường hóa chất Mục đích Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW) Tăng sinh sơ Canh Rappaport - Vassiliadis Soya Peptone (RVS) Selenit xystin / Tetrathionat (TT) Xylose Lysine Desoxycholate (SLD) Tăng sinh chọn lọc Phân lập Hektoen Entric Agar (HE) Tryptone Soy Agar (TSA) Phục hồi Lysine Decacboxylase broth (LDC) Voges-Proskauer (VP) Ure Broth Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Salmonella Tryptone Water Kligler Iron Agar (KIA)/TSI Đĩa giấy ONPG Dung dịch creatine Kháng huyết Thuốc thử phản ứng sinh hóa Dung dịch α-naphtol KOH 40% Thuốc thử Kovac's HCl NaOH 10% Chỉnh pH 15 Tieu luan Dụng cụ thiết bị Sử dụng thiết bị dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thơng thường như: Hình 7.1 Tủ sấy Hình 7.2 Tủ ấm 16 Tieu luan Hình 7.3 Tủ lạnh Hình 7.4 Nồi cách hâp thủy Hình 7.5 Que cấy vơ trùng 17 Tieu luan Hình 7.6 Dụng cụ đo pH Hình 7.7 ĐĨa petri vơ trùng Hình 7.8 Ống nghiệm, bình tam giác vơ trùng Ví dụ minh họa Thực thí nghiệm để phát (hay khơng phát hiện) Salmonella có mẫu ruột cá qua mơi trường: - Thạch TSI: thạch có màu đỏ, vàng, thạch bị đen, có sinh 18 Tieu luan - Mơi trường LDC: mơi trường giữ ngun màu tím => Phản ứng dương tính (+) - Thử nghiệm Urê: Mơi trường chuyển sang màu đỏ hồng => Phản ứng âm tính (-) - Mơi trường phản ứng Indol: Trên bề mặt mơi trường xuất vịng màu vàng nhạt => Phản ứng âm tính (-) - - galactosidase: Khuẩn lạc nghi ngờ đưa vào que thử Oxidase, tượng khơng màu => Phản ứng âm tính (-) - Thử nghiệm phản ứng VP (Voges-Proskauer): Môi trường không đổi màu =>Phản ứng âm tính (-)  TSI: đỏ/ vàng, có sinh H 2S, có sinh hơi; Urease (+); Indol (-); ONPG (-); LDC (+)  Kết luận: Không phát Salmonella mẫu ruột cá dựa vào TCVN 8-32012/BYT So sánh TCVN 10780-1: 2017 ISO 6579-1:2017  Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 10780 -1 :2017 vi sinh vật chuỗi thực phẩm - phương pháp phát hiện, định lượng xác định typ huyết samonella, phần phương pháp phát Samonella spp  ISO 6579-1: 2017 Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp TCVN 10780-1: 2017 ISO 6579-1:2017 Giống phạm vi ứng dụng tiêu chuẩn phương pháp xác định Samonella, nguyên tắc chung, Giống quy trình phát Samonella mẫu thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, khu vực chế biến thực phẩm,… 19 Tieu luan TCVN 10780-1:2017 có đề cập đến mục 9.5.3.6 môi trường ISO 6579-1:2017 không Khác thử phản ứng Indol để phân biệt đề cập tới môi trường thử Samonella  với  Escherichia phản ứng Indol coli và Citrobacter  10.Thuật ngữ đề xuất 10 thuật ngữ Anh - Việt sử dụng nhiều phương pháp phát định danh Samonella Selective enrichment – Tăng sinh chọn lọc Colony – Khuẩn lạc Sampling – Lấy mẫu Cultivation – Nuôi cấy Presumptive Samonella – Samonella giả định Biochemical testing – Phép thử hóa sinh Gas formation – Sinh bọt khí Isolation medium – Môi trường phân lập Serological testing – Phép thử huyết 10.Antisera – Kháng huyết 11.Kết luận Có nhiều vụ ngộ độc gây vi sinh vật có thực phẩm Trong QCVN 8-3:2012/BYT có quy định khơng phép có mặt vi khuẩn Samonella thực phẩm, việc phát định danh danh Salmonella thực phẩm việc thật cần thiết với phương pháp hầu hết xác đinh vi khuẩn Salmonella, dễ thực thực hiện, nhiên phương pháp cần phải chọn lọc kĩ khuẩn lạc nghi ngờ, cần thời gian để khuẩn lạc phát triển Vì vi khuẩn nguy hiểm cao nên người thực cần phải đảm bảo u cầu an tồn phịng thí nghiệm, thận trọng xử lí nguyên vật liệu sau ủ, phải tự thiêt lập thao tác an tồn thích hợp đảm bảo tn thủ quy định quy định hành 20 Tieu luan TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bài giảng Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TPHCM [2] TCVN 10780-1:2017 Vi sinh vật chuỗi thực phẩm - Phương pháp phát hiện, định lượng xác định typ huyết salmonella - Phần 1: Phương pháp phát Salmonella spp [3] QCVN 8-3 :2012/BYT quy chuẩn kỹ thuật quốc gia ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm [4] ISO 6579-1: 2017 Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp 21 Tieu luan ... nhiều vụ ngộ độc gây vi sinh vật có thực phẩm Trong QCVN 8-3:2012/BYT có quy định khơng phép có mặt vi khuẩn Samonella thực phẩm, vi? ??c phát định danh danh Salmonella thực phẩm vi? ??c thật cần thiết... quy định quy định hành 20 Tieu luan TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bài giảng Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TPHCM [2] TCVN 10780-1:2017 Vi sinh vật chuỗi thực phẩm. .. tiêu chuẩn vi sinh an tồn thực phẩm khơng cho phép có diện Salmonella 25g/25ml mẫu Theo phương pháp truyền thống vi? ??c phát Salmonella bao gồm bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập,