Hướng dẫn ôn thi học phần phân tích vi sinh. tóm tắt các phản ứng sinh hóa dễ hiểu nhất bao gồm: lên men, citrate, Decarboxylase, urease, gelatinase,.. với nguyên tắt, cơ chế, màu phản ứng chi tiết. môi trường phân lập các phản ứng phát hiện âm tính dương tính thí nghiệm.
ÔN TẬP CHƯƠNG 3: - Thành phần môi trường: Nước Thạch Peptone Cao thịt Cao nấm men Một số tác nhân tạo môi trường kị khí Các chế phẩm từ mật bị Các chất ức chế chon lọc Các chất để thử phản ứng sinh hóa 10 Các chất thị màu - Yêu cầu bản: Có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết Có độ pH thích hợp Có độ nhớt định Không chứa yếu tố độc hại Tuyệt đối vô trùng - Các bước chuẩn bị môi trường dinh dưỡng: Pha chế Làm môi trường Điều chỉnh pH Phân phối môi trường vào dụng cụ Khử trùng môi trường Làm thạch nghiêng, thạch đứng đổ vào đĩa petri Bảo quản kiểm tra môi trường - PP khử trùng môi trường: PP Pasteur PP Tyndal PP lọc dụng cụ lọc vi khuẩn PP hấp nước bao hòa áp suất cao CHƯƠNG 4: ST T Loại PỨ Lên men Nguyên tắc Nhằm xác định khả số vi sinh vật lên men (phân giải) carbohydrate đặc hiệu có môi trường tạo acid (hoặc acid hơi) Màu phản ứng, KQ Cơ chế Môi trường: môi trường phenol red base số vsv có khả lên men loại CHO đặc hiệu tạo acid làm giảm pH dẫn đến thay đổi màu thị phenol red mơi trường acid có màu vàng - Sinh aicd (+): đỏ sang vàng (-): đỏ - Sinh (+): Khi có bọt khí ống (-): Ko có Cần phải thực lại thử nghiệm với ống nghi ngờ Đồng thời CO2 tạo thành trình lên men giữ lại tạo bọt khí làm ống Dulham(mt lỏng), vỡ thạch (mt rắn) Môi trường: môi trường Hugh-Leifson OXH – Lên men Bile Esculin Citrate Xác định khả vi sinh vật sử dụng nguồn carbonhydrate làm nguồn lượng thông qua phương thức lên men hô hấp Thử nghiệm phân biệt vi sinh vật dựa khả thủy phân liên kết glucoside esculi thành esculetin glucose có diện muối mật Nhằm xác định khả vi sinh vật sử dụng citrate nguồn carbon cho hoạt động trao đổi chất làm kiềm (+): Bị acid hóa mặt phần sâu (-): Kỵ khí: bị acid hóa khắp thạch sâu Hiếu khí: ko bị bề mặt, bị phần đáy vi sinh vật biến dưỡng carbohydrate theo phương thức oxi hóa Mơi trường: môi trường Aesculin hay Edwards (+): Môi trường chuyển thành đen hay nâu đen (-): Môi trường không đổi màu Môi trường: môi trường Simmon citrate (+): Môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương (mt kiềm) (-): xanh lục (màu ban Esculetin+muối sắt tạo thành phức hợp màu đen hay màu nâu đen Sự thay đổi pH môi trường nhận biết nhờ thị màu Bromothymol blue Vsv sử dụng citrate mt có natri nitrate àion Na+ hóa mơi trường đầu) Hoặc sd muối amonium vơ cơà NH3 Làm tăng pH từ đổi màu thị bromothymol blue Malonate Catalase Nhằm xác định khả vi sinh vật sử dụng malonate nguồn carbon cho hoạt động trao đổi chất làm kiềm hóa mơi trường Nhằm xác định có mặt enzyme catalase Mơi trường: môi trường lỏng malonate (+):Môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương (-): Xanh lục Môi trường: dd H2O2 30% (+): Sủi bọt khí xung quanh sinh khối Thủy phân đc Malonate có khả sử dụng muối amonium NH3 kiềm hóa mt tăng pH đổi màu thị bromthymol blue Catalase cắt H2O2 H2O2 + O2 (bọt khí) (-): Khơng sủi bọt Đánh giá hoạt tính enzyme vi sinh Decarboxyla vật khử nhóm se carboxyl acid amin sinh amin tạo tính kiềm Kiểm tra khả vi sinh vật làm đông huyết Coagulase tương thỏ người tác dụng enzyme coagulase Xác định khả vi sinh vật phân giải urea tạo hai phân tử ammonia Urease tác dụng enzyme urease làm kiềm hóa mơi trường Mơi trường: mơi trường decarboxylase basal chứa thị bromocresol tím (+): Đục, tím (-): Trong, vàng Vsv có khả khử carboxyl â tạo amin có tính kiềm sinh CO2 Tăng pH đổi màu thị (-): Lỏng (sau 24h) Vsv đặc biệt Staphylococcus có enzyme coagulase làm kết tụ thành phần huyết tương tạo khối đông làm đông tụ huyết tương Môi trường urea lỏng(rắn), chứa thị phenol đỏ (+): Vàng Đỏ cánh sen (-): Vàng Urea bị phân giải enzyme urease thành phân tử ammonia làm kiềm hóa mt đổi màu thị Môi trường: huyết tương thỏ hay người đông khô dạng thương phẩm (+): Huyết tương đông (sau 4h, 8h, 12h, 24h) 10 11 Gelatinase Sinh H2S Xác định khả phân giải gelatin vi sinh vật Một số vi sinh vật tổng hợp enzyme desulfohydrase xúc tác chuyển hóa điều kiện kỵ khí acid amin chứa lưu huỳnh cysteine, cystin, methione phóng thích H2S Xác định khả sinh indol từ tryptophan 12 13 Indol KIA / TSI (có chứa glu lac; thị phenol red có thành phần muối sắt) (Kiểm tra xem vsv có enzyme tryptophanase hay ko) Xác định khả sử dụng nguồn carbon khác (glucose, lactose) khả sinh H2S vi sinh vật vi sinh vật sử dụng Glucose để lên men nên khiến tồn mơi trường trở nên axit (màu vàng) khoảng 8-12 Phần gốc giữ trạng thái axit chí sau ủ khoảng 18-24 có mặt axit hữu từ việc lên men glucose Môi trường: môi trường canh NB bổ sung 10% gelatin (+): Hóa lỏng (-): Đơng đặc Mơi trường: loại mơi trường sử dụng cho thử nghiệm sinh H2S KIA, TSI, BSA (+): Đen (-): Không chuyển màu Môi trường thuốc thử: môi trường Trypton water, thuốc thử Kowac’s (thuốc thử chứa pDimethylaminobenzaldeh yde (p-DMABA)) (+):Bề mặt môi trường xuất vòng đỏ cánh sen (-): Màu vàng chanh Môi trường: môi trường KIA TSI Đáy ống nghiệm Glucose (+): Màu vàng (lên men glucose) Glucose (-): Màu đỏ/không đổi màu (không lên men glucose) màu ban đầu thị - Màu đen: sinh H S - Vỡ thạch: sinh từ glucose Mặt nghiêng: Lactose và/hoặc Sucrose (+): Màu vàng (lactose Thủy phân Gelatin enzyme gelatinase polypeptid +aa Mất tính đơng Hóa lỏng Vsv có enzyme desulfohydrase điều kiện kị khí chuyển protein thành aa chứa lưu huỳnh phóng thích H2S H2S tạo tủa màu đen vs thị sulfide Tryptophan bị oxh tryptiphanase thành sp chứa indol Phyrol indol chứa nhóm CH2 +nhân benzen p_DMABA phức chất dạng quinone có màu đỏ Lên men glucose tạo acid giảm pH thị phenol red màu vàng H2S sinh tạo tủa màu đen vs thị sulfide Sinh tạo CO2 Nếu sinh vật lên men glucose lại không lên men lactose và/hoặc sucrose, sau mặt nghiêng trở thành màu đỏ phần gốc màu vàng (K/A) khoảng 18 đến 24 điều kiện kỵ khí phần đáy ống Mặt nghiêng môi trường trở trạng thái kiềm, thị màu đỏ sản phẩm lên men bị oxy hóa thành CO2 H2O peptone điều kiện hiếu khí, phần mặt nghiêng trải qua oxy hóa giải phóng amine kiềm 14 Nitratase Xác định khả sử dụng nitrat (khử NO3-) vi sinh vật và/hoặc sucrose sử dụng) Lactose Sucrose (-): Màu đỏ/không đổi màu (lactose sucrose không sử dụng) Môi trường thuốc thử: môi trường nitrat thuốc thử Gress A (acid sulfanilic) Gress B (αnaphthylamin) (+): có màu hồng đỏ Nếu ko có màu: tt thêm bột Zn (+): Ko chuyển màu (-): Màu hồng đỏ Nếu bên cạnh việc lên men glucose sinh vật lên men lactose và/ sucrose, sản phẩm lên men hình thành mặt nghiêng trung hòa amine kiềm chuyển mặt nghiêng thành axit (màu vàng) (A/A), tượng xuất sau khoảng 18 tới 24 Nếu sinh vật dạng lên men, thay sử dụng đường, sử dụng pepton nguồn lượng thay điều kiện hiếu khí mặt nghiêng, việc khiến trở nên kiềm thị mà đỏ khơng có thay đổi màu sắc gốc Lần 1: định tính nitrite Có enzyme nitratreductase khử NO3- thành NO2phản ứng vs loại thuốc thử tạo hc màu đỏ Lần 2: định tính nitrate (bổ sung Zn) Nếu khống màu k có kn khử NO3hoặ xảy NO2- bị khử thành N2 Nếu đỏ có nghĩa cịn NO3- tác dụng vs Zn tạo NO2- sau pứ vs nitrate tạo màu đỏà khơng có khử NO3Khơng đổi màu nghĩa hết NO3trong mtà có khử NO3- 15 Oxidase Xác định diện hệ enzyme oxidase (A) vi sinh vật Thuốc thử: Giấy tẩm Ndimethyl-para phenylenediamine dung dịch 1% tetramethyl- A + B indolphenol p-phenylenediamine (màu (màu xanh dương) hồng)(B) (+): Xanh dương đậm (-): Hồng 16 17 18 ONPG MR (Methyl Red) VP (Voges Proskauer) Xác định diện enzyme βgalactosidase (A) vi sinh vật Môi trường: môi trường lỏng ONPG (B) Kiểm tra khả vi sinh vật lên men glucose tạo sản phẩm cuối mang tính acid Mơi trường thuốc thử: môi trường lỏng MR-VP, thuốc thử methyl red Xác định khả số vi sinh vật tạo sản phẩm cuối mang tính trung tính acetoin (acetylmethylcarbin ol-AMC) lên men glucose (+): Vàng (-): ko đổi (+): Đỏ (-): Đỏ Vàng A+ B o-nitrophenyl (có màu vàng) Có khả lên men lactose Lên men glu thành acid pyruvic sau chuyển hóa thành ethanol, acid acetic, acid lactic,… giảm pH (4~4,5) nên MR có màu đỏ pH cao (mt kiềm) có màu vàng Vsv chuyển hóa glu thành acid pyruvic Môi trường thuốc thử: acetoin (AMC) MR (chỉ thị) - VP mt kiềm diacetyl (+): Đỏ cam pH acid???? kết hợp vs -naphtol (-): Vàng or Nâu đất tạo hợp chất màu đỏ cam 19 CAMP - Nhằm xác định khả vi sinh vật tạo nhân tố CAMP có khả phối hợp với βhemolysin (yếu tố tan huyết) Staphylococcus tác động lên hồng cầu bò cừu sinh tượng tan huyết vùng tiếp giáp hai vi sinh vật - Nhằm xác định tượng tan huyết phối hợp nhân tố CAMP αhemolysin Clostridium perfringens 20 Tính di động Xác định khả di động vi sinh vật Môi trường: môi trường thạch máu Cơ chất β-lysine: Dùng S aureus chủng tạo nhiều β-lysine Vi sinh vật chứng: Streptococcus spp định danh (+): Có vùng tan huyết hình mũi tên (-): ko có Đối với nhóm đối chứng + Streptococcus agalactiae - Streptococcus faecalis Mơi trường: môi trường bán lỏng NA, để đứng (+): Lan khỏi đường cấy (-): Chỉ mọc theo đường cấy So sánh phương pháp Elisa Tiêu chí Khái niệm Các bước thực Trực tiếp Xét nghiệm ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể để phát kháng nguyên ELISA gián tiếp sử dụng kháng thể phụ Gián tiếp ELISA thực hai loại kháng thể là; kháng thể sơ cấp kháng thể thứ cấp Công cụ ELISA gián tiếp sử dụng hai loại kháng thể để khuếch đại tín hiệu để phát tốt kháng nguyên Các đĩa giếng (Antigen- Ag) được ủ với kháng hấp phụ lên nguyên, rửa khóa Mức độ lan xa hay gần tùy theo lồi Có tiêm mao Độ nhạy Thời gian Sử dụng kháng thể Liên kết với enzyme Phản ứng chéo nhựa, sau lượng lớn loại protein (thường albumin huyết bò- BSA) thêm vào để khóa tất vị trí liên kết khác Trong lúc đó, loại enzyme liên kết với kháng thể phản ứng riêng biệt, phức hợp enzyme- kháng thể sử dụng để hấp phụ kháng nguyên Sau phức enzymekháng thể dư thừa bị loại bỏ hết, phức hợp enzyme- kháng thể gắn với kháng nguyên lại giếng Bằng cách thêm vào chất enzyme, tín hiệu phát đại diện cho lượng kháng nguyên mẫu Xét nghiệm ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể để phát kháng nguyên ELISA gián tiếp sử dụng kháng thể phụ Nhanh chóng Chỉ loại kháng thể (Kháng thể chính) sử dụng ELISA trực tiếp Các kháng thể sơ cấp liên kết với enzym loại bỏ phản ứng BSA Thêm mẫu kháng thể vào rửa Enzyme gắn với kháng thể thứ cấp thêm vào rửa Thêm chất, enzyme kháng thể tạo tín hiệu màu huỳnh quang Nhạy trực tiếp Tốn nhiều thời gian Các kháng thể sơ cấp thứ cấp sử dụng cho ELISA gián tiếp Các kháng thể thứ cấp liên kết với enzym bị ảnh hưởng với kháng thể thứ hai chéo kháng thể thứ hai Tín hiệu Yếu gián tiếp phản ứng chéo kháng thể thứ hai khuếch đại nên dễ phát Nguyên lý kỹ thuật Elisa Kỹ thuật Elisa phương pháp sinh hoá sử dụng chủ yếu miễn dịch học để phát diện kháng thể kháng nguyên mẫu; Elisa cơng cụ chẩn đốn y học, bệnh lý học thực vật, kiểm soát chất lượng ngành cơng nghiệp khác Ngun lý ELISA dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể gồm bước sau: Kháng nguyên – antigen (KN) chưa biết gắn bề mặt Kháng thể – antibody (KT) biết trước “rửa” qua bề mặt Kháng thể gắn kết với ezyme Thêm vào chất (substance), enzyme biến đổi chất tạo tín hiệu xác định Các phương pháp ELISA Có ba phương pháp: Phương pháp ELISA trực tiếp: Sử dụng kháng thể có gắn chất enzyme liên kết trực tiếp với kháng nguyên bề mặt đĩa phản ứng Ưu điểm Nhanh, sử dụng kháng thể có gắn chất hạn chế tối đa thao tác thực phản ứng Loại bỏ phản ứng chéo kháng thể thứ cấp Nhược điểm Hoạt động miễn dịch kháng thể sơ cấp bị ảnh hưởng xấu enzyme chất gắn, Khó khăn tốn việc lựa chọn kháng thể cho phản ứng Không linh hoạt việc lựa chọn chất gắn Tín hiệu khuếch đại thu thấp 2 Phương pháp ELISA gián tiếp Trong phương pháp này, kháng thể thứ cấp bổ sung bắt cặp đặc hiệu với kháng thể sơ cấp bắt cặp với kháng nguyên Kháng thể thứ cấp có gắn chất phát tín hiệu khuếch đại xảy phản ứng bắt cặp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu Ưu điểm Linh hoạt việc sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn chất Linh hoạt dễ dàng việc lựa chọn kháng thể sơ cấp cho phản ứng Hoạt động miễn dịch kháng thể sơ cấp phát huy tối đa khơng bị ảnh hưởng chất đánh dấu Độ nhạy cao Linh hoạt việc sử dụng chất Nhược điểm Có thể xảy phản ứng chéo với kháng thể thứ cấp độ đặc hiệu phản ứng bị ảnh hưởng Thời gian thực phản ứng lâu Phương pháp ELISA “Sandwwich” Một kháng thể gắn sử dụng để gắn với kháng thể sơ cấp, kháng thể thứ cấp có gắn chất enzyme bổ sung để bắt cặp với kháng thể thứ cấp phản ứng Tín hiệu khuếch đại thu có bắt cặp kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu Ưu điểm Mẫu không cần Độ Thích hợp Linh hoạt độ nhạy cao tinh đặc cho trước hiệu mẫu phân phức tích cao tạp Ứng dụng Hiện nay, ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra chất lượng sản phẩm sinh học Trong thực phẩm Kỹ thuật ELISA phát định lượng vi sinh thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh Phát độc tố tảo Phát vi khuẩn E.coli, Salmonell, Staphylococcus aureus, sán gan, thực phẩm Phát chất chloramphenicol tôm, cá cá sản phẩm thuỷ sản Kiểm tra dư lượng kháng sinh thực phẩm, tàn dư thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu,… Trong y học Là kĩ thuật xét nghiệm HIV nhằm phát kháng nguyên p24 Chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan siêu vi B C, bệnh ung thư Ứng dụng để phát bệnh A.cantonensis (bệnh viêm màng não) Xác định tỷ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét miền Trung – Tây Nguyên Trong nơng nghiệp Chẩn đốn bệnh Tristeza (tác nhân gây bệnh héo rũ) cam quýt Giám định diện BBTV gây bệnh chùn đọt chuối Phát kháng thể chống Mycoplasma hyopnewmonia (ML) heo Giám định bệnh lùn xoắn lúa phương pháp DAS ELISA cải tiến Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có nhiều dạng mà đặc điểm chung dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, kháng thể gắn với enzyme Khi cho thêm chất thích hợp (thường nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên thông qua cường độ màu mà biết nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát Phương pháp thiết kế cho việc phát định lượng vật chất peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi cịn gọi tên gọi khác EIA (Enzyme ImmunoAssay) Kĩ thuật nhạy đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) kĩ thuật rẻ tiền an tồn mà đảm bảo độ xác ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể chất tạo màu; thực qua hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: Là kết hợp kháng nguyên kháng thể - Phản ứng hóa học: Thơng qua hoạt tính xúc tác enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa chất thị màu, làm thay đổi màu hỗn hợp dung dịch thí nghiệm (Trích từ Chemicon International) Phân loại ELISA 2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) Direct ELISA: Đây dạng đơn giản phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể phát kháng thể (kháng thể gắn enzyme) Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực phản ứng ELISA trực tiếp - Ưu điểm: Đơn Nhược giản điểm: + Độ đặc hiệu bị giới hạn thường kháng ngun có epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp sử dụng kháng thể gắn vào epitope + Phải đánh dấu cho kháng thể chuyên biệt với đối tượng 2.2 ELISA gián tiếp Indirect ELISA: Phương pháp khác Direct ELISA chỗ kháng thể bắt kháng ngun khơng gắn enzyme mà mục tiêu gắn đặc hiệu kháng thể khác (kháng thể kháng thể gắn với enzyme) Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực phản ứng ELISA gián tiếp - Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa - Nhược điểm: Độ đặc hiệu kháng huyết khác Điều dẫn đến kết khác thí nghiệm cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết khác để kết tin tưởng 2.3 Sandwich ELISA Đây dạng ELISA sử dụng phổ biến thực tiễn cho phản ứng mạnh nhạy Được gọi “sandwich” kết thí nghiệm đánh giá thông qua kết hợp hai loại kháng thể kháng thể bắt (capture antibodies) kháng thể phát (detection antibodies) Kỹ thuật phân làm hai dạng Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich) DAS ELISA gồm dính thụ động kháng thể vào pha rắn (đáy giếng) Những kháng thể sau kết hợp với kháng nguyên thêm vào Những kháng nguyên pha loãng blocking buffer nhằm ngăn dính khơng chun biệt chúng vào pha rắn Ở đây, phần blocking buffer không nên chứa kháng nguyên mà kết hợp với kháng thể bắt Sau ủ rửa, phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn Kháng thể bắt sau thêm vào Do vậy, kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích kháng thể bắt Kháng thể thứ hai giống kháng thể khác nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể Sau ủ, rửa, thêm chất vào đọc máy đo quang phổ Vì sử dụng kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn tính chuyên biệt thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt Điều giới hạn linh hoạt phương pháp, ví dụ kháng thể sử dụng phải đánh dấu riêng (cho kháng nguyên khác nhau) Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn chuẩn bị kháng thể Hệ thống bị giới hạn chỗ kháng ngun phải có hai epitope hai kháng thể bắt phát kết hợp trực tiếp với kháng nguyên Kháng thể bắt pha rắn kháng thể phát chống lại epitope khác phức hợp kháng nguyên Do đó, thuận lợi khảo sát khác biệt nhỏ kháng nguyên sử dụng kháng thể phát kháng thể bắt khác Việc sử dụng kháng thể bắt phát dẫn đến vấn đề có giới hạn vị trí gắn kết sẵn có cho phát Kích thước mối quan hệ khơng gian epitope kháng nguyên đích quan trọng ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm Sandwich ELISA chia làm hai hệ thống: 2.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực ELISA Sandwich trực tiếp - Ưu điểm: Có thể phát khác biệt nhỏ kháng nguyên sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát khác - Vì phương pháp có ưu điểm hẳn phương pháp khác mà chọn phương pháp để chẩn đoán bệnh virus nghiên cứu Chú ý: sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát giống dẫn đến vấn đề có giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát Mối quan hệ kích thước vị trí khơng gian epitope có ảnh hưởng đến thử nghiệm 2.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp Chuyên biệt Direct sanwich ELISA antispecies kháng thể gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên 2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai chất tham gia phản ứng lực bắt cặp với chất thứ ba Phản ứng cạnh tranh đắn hai chất cạnh tranh phải đưa vào đồng thời Sự khác biệt ức chế cạnh tranh Cả hai phản ứng có tham gia hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên Nếu kháng thể ủ trước phản ứng gọi ức chế (blocking/ inhibition assays) Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai kháng thể thêm vàođồng thời với (hình 1) Hình : khác biệt ức chế cạnh tranh 2.4.1 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên mô tả sơ đồ 2.5 Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên bề mặt đĩa lượng kháng thể gắn enzyme chuẩn độ để tối ưu Kháng nguyên kháng thể gắn enzyme thêm vào đĩa lúc để tạo ưu cạnh tranh Nếu kháng nguyên tương tự kháng nguyên gắn đĩa kháng thể gắn enzyme gắn lên kháng nguyên Khi nồng độ kháng nguyên cạnh tranh cao ngăn cản kết hợp kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên bề mặt đĩa (cạnh tranh 100%) Nếu nồng độ kháng nguyên cạnh tranh giảm (ví dụ : pha lỗng) cạnh tranh giảm Như nồng độ kháng nguyên cạnh tranh cao độ hấp thu màu giảm Kháng nguyên cạnh tranh thêm trực tiếp vào đĩa pha lỗng blocking buffer trước thêm kháng thể gắn enzyme Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan nồng độ phân tử cần kiểm tra kháng nguyên bề mặt đĩa (và mức độ tương đồng kháng nguyên) Sau ủ rửa, lượng kháng thể đánh dấu định lượng sau thêm chất khơng có kháng ngun mẫu kiểm tra hay khơng có tương đồng kháng ngun khơng có gắn kết với kháng nguyên đánh dấu khơng có cạnh tranh với kháng ngun Kết mẫu có chứa kháng ngun cạnh tranh làm giảm cường độ màu đối chứng âm khơng Sơ đồ 2.5 Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên 2.4.2 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể mô tả chi tiết sơ đồ 2.6 Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể tương tự với Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể Sự cạnh tranh kháng thể mẫu kháng thể đánh với vị trí kháng nguyên đĩa Mẫu kháng thể đánh dấu trộn với trước thêm vào đĩa Sơ đồ 2.6 Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy phản ứng ELISA Số lượng kháng thể thứ gắn vào đáy Ái lực kháng thể thứ kháng - Ái lực kháng thể thứ hai kháng nguyên giếng nguyên Các yếu tố ảnh hưởng đến kết ELISA Nếu đối chứng âm cho kết dương tính nhiễm từ chất tạo màu từ kháng thể đánh dấu đối chứng bị nhiễm Nếu màu không xuất đối chứng dương mẫu phải kiểm tra lại tất hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản Nếu màu xuất thấp đối chứng dương mẫu kiểm tra phải kiểm tra lại kháng thể gắn enzyme nồng độ chất tạo màu Nếu có tạo màu mẫu khơng tạo màu với đối chứng dương kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng điều kiện bảo quản Khi chạy lại thử nghiệm điều kiện gặp cố nên thay đổi yếu tố thí nghiệm Thành phần môi trường Môi trường SPW BPW LBS BGBL EC Mt canh Trypton TSA VRBG MSB BPA BHI Bile Esculin Azide glucose TCBS SDB PDA MEA DG 18 XLD KIA TSI MYP HE MKTTn RVS Thành phần NaCl, peptone, nước cất NaCl, peptone, nước cất Trypton, lactose, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, Sodium lauryl sulfate, nước cất pH cuối 6,8±0,2 Peptone, lactose, mật bò, brilliant green, nước cất pH 7,2±0,2 Trypton, muối mật, lactose, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, nước cất, pH 6,9±0,2 Trypton, nước cất, pH 6,9±0,2 Tryptocase pepton, phytone pepton, naCl, agar, nước cất pH 7,3±0,2 Cao nấm men, pepton, NaCl, muối mật, lactose, neutral red, crystal violet, agar, nước cất, pH 7,4±0,2 Cao thịt, polypeptone, NaCl, mannitol, phenol red, nước cất, pH 7,4±0,2 Trypton, cao thịt, cao nấm men, sodium pyruvate, glycine, lithium chloride, agar Dịch não dê, dịch tim bò, polypepton, NaCl, Na2HPO4, dextrose, nước cất Cao thịt, pepton, esculine, oxgall, Re citrate, agar, nước cất, pH 6,6±0,2 Trypton, dextrose, K2HPO4,KH2PO4, NaCl, sodium azide, bromocresol purple, nước cất, pH 6,9±0,2 Cao nấm men, sucrose, sodium thiosulfate, sodium citrate, oxgall, NaCl, Fe citrate, bromothymol blue, thymol blue, agar, nước cất Polypepton, dextrose, nước cất Khoai tây, dextrose, agar, nước cất Cao malt, agar, nước cất Glucose, pepton, KH2PO4, MgSO4, dichloran (0,2% etanol), glycerol, agar, choramphenicol, nước cất Natri desoxycholate, xylose, lactose, sucrose, sắt ammonium citrate, cao nấm men, L-lysine, sodium thiosulfate, phenol red Cao thịt, cao nấm men, pepton, protease peptone, NaCl, lactose, glucose, sắt sulfate, natri thiosulfate, phenol red, agar, nước cất Lactose, glucose, phenol red D-mannitol, cao thịt bò, NaCl, pepton từ casein, agar, nước, phenol đỏ, polymyxin B sunfat, lòng đỏ trứng gà Cao nấm men, lactose, saccharose, pectic digest of meat, muối mật, NaCl, natri thiosulfate, Fe ammoinium citrate, bromthymol red, acid fuchsin, agar Thạch máu TBX LDC TSC Thioglycolat lỏng LS Môi trường nitrate thử di động Lactoza-gelatin TCBS Thạch glucoza Pepton proteoza, sp thủy phân gan, cao nấm men, NaCl, agar, nước Sp thủy phân casein enzyme, muối mật, BCIG, dimethyl sulfoxit, agar, nước pectic digest of animal tissue, cáo nấm men, dextrose, l-lysin hydrochlorine, bromecresol purple, pH 6,8 ±0,2 Tryptose, peptone đậu nành, cao nấm men, sodium metabisulphite, sắt ammonium citrate, agar, pH 7,6±0,2 Pepton từ casein, L-xystin, D-glucoza, cao nấm men, NaCl, natri thiogly colat, agar, resazurin, nước Pepton từ casein, cao nấm men, NaCl, lactoza, l-xystin hydro clorua, nước Pepton từ casein, cao thịt, galactoza, glycerol, KNO3, Na2HPO4, agar, nước Pepton từ casein, cao nấm men, lactoza, gelatin, phenol đỏ, nước Polypepton, cao nấm men, sac, bacteriological ox bile, sodium cholate, sodium citrate, sodium thiosulfate, NaCl, Fe ammonium citrate, bromthymol blue, thymol blue, bacteriological agar pH 8,6±0,2 Dịch thủy phân casein enzyme, NaCl Agar, nước, cao nấm men, glucoza, bromcresol purple