TIỂU LUẬN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH VIBRIO CHOLERA VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTUCUS

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI TẬP TIỂU LUẬN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH VIBRIO CHOLERA VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTUCUS GVHD SVTH: TP HỒ CHÍ MINH, Tháng 04, năm 2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI TẬP TIỂU LUẬN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH VIBRIO CHOLERA VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTUCUS GVHD: SVTH: TP HỒ CHÍ MINH, Tháng 04, năm 2022 Mục lục Tổng quan Vibrio 1.1 Đặc điểm sinh học 1.2 Tình hình gây bệnh Quy trình phát Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus .4 2.1 Phạm vi áp dụng 2.2 Nguyên tắc .4 2.3 Thiết bị dụng cụ .4 2.4 Môi trường hóa chất 2.5 Quy trình phân tich 2.6 Các bước tiến hành 2.7 Kết Kết luận: .10 An tồn phân tích 10 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH KẾT QUẢ .12 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ .16 TÀI LIỆU THAM KHẢO .19 1 Tổng quan Vibrio 1.1 Đặc điểm sinh học Vibrio chi trực khuẩn gram âm, hình dạng cong-que (dấu phẩy), di động sống kị khí tùy nghi, có khả lên men glucose không sinh hơi, không sinh H2S thường diện nước biển, vài loài gây ngộ độc thực phẩm có khả gây bệnh cho người: Vibrio cholerae (V Cholera) , Vibrio parahaemolyticus (V Parahaemolyticus), Vibrio vulnificus,… V Cholerae khuẩy khuẩn tác nhân gây bệnh dịch tả toàn giới V Cholerae thường lan truyền nhanh qua đường nước, gây nhiễm thực phẩm truyền nhiễm qua người điều kiện vệ sinh V cholerae tạo độc tố tả cholera-toxin có độc tính mạnh, cần 5µg gây nhiễm qua đường miệng có thẻ gây tiêu chảy cho người trưởng thành V Parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm tạo độc tố hemolysin bền nhiệt có phản ứng với kháng nguyên Kanagawa Triệu chứng ngộ độc đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột tiêu chảy nhẹ xuất 2-96 sau ăn phải thực phẩm bị nhiễm Loài thường diện tăng trưởng môi trường muối cao, thường phân lập từ sản phẩm thủy sản Vibrio vulnificus không gây bệnh đường ruột mà gây nhiễm trùng máu cho người Phân loại khoa học: Giới : Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio Loài : Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus Hình 01: Vi khuẩn Vibrio cholerae Hình 02: Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 1.2 Tình hình gây bệnh  Trên giới Ngộ độc thực phẩm vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ người, gây nguy hiểm, chí tử vong Triệu chứng ngộ độc thực phẩm bao gồm buồn nôn, co thắt dạ dày, tiêu chảy, nôn, sốt đau đầu Triệu chứng xảy vịng 30 phút sau ăn trong vài giờ, vài ngày sau đóvà mức độ nặng, nhẹ khác Vi khuẩn V parahaemolyticus nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước châu Á, bao gồm Trung Quốc (31,1% vụ dịch ngộ độc thực phẩm được báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20-30% trường hợp từ 1981 đến 1993) Đài Loan (69% trường hợp báo cáo năm 1981và 2003) Ngoài ra, dịch xảy nước châu Âu Tây Ban Nha (1989,1999, 2004), Pháp (1997) Châu Mỹ, điển hình Hoa Kỳ (Norinaga cộng sự, 2005)  Ở Việt Nam Mới đây, Việt Nam, người đàn ông 65 tuổi, trú TP Uông Bí (Quảng Ninh) tử vong nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus do ăn hàu sống Triệu trứng ăn phải Vibrio parahaemolyticus tiêu chảy và nơn: Có biểu kiểu tả nhẹ phân lỏng, tóe nước, phân có mùi tanh, màu xanh xanh vàng Nôn nhiều tiêu chảy phân nhiều nước dẫn đến mất nước cấp tính Gần không sốt, không gây đau bụng Dạng lỵ trực khuẩn: Phân lỏng, lờ lờ máu cá, mùi thối khẳn, kèm theo sốt đau bụng Các dấu hiệu mất nước: Người mệt lả, háo nước, tiểu ít, mắt trũng, nặng phản ứng chậm, li bì, chí mê Các dấu hiệu thường kéo dài khoảng ngày, nhẹ nặng tùy trường hợp Bệnh gây nhiễm trùng nặng người suy giảm sức đề kháng Vibrio parahaemolyticu gây viêm ruột cấp tính, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn từ vết thương Người bệnh nhiễm loại vi khuẩn biểu nhẹ khơng nguy hiểm, gây tử vong Quy trình phát Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus 2.1 Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo TCVN 7905-1:2008 (ISO 21872-1: 2007) (ISO 21872-1:2017) dùng để phát Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus thực phẩm, thức ăn chăn nuôi 2.2 Nguyên tắc Phát V Cholerae V Parahaemolyticus thực phẩm thực cách cân lượng mẫu xác định nuôi cấy môi trường chọn lọc Tư dịch khuẩn cấy sang môi trường rắn chọn lọc Những khuẩn lạc giống V Cholerae V Parahaemolyticus thử nghiệm phản ứng sinh hóa 2.3 Thiết bị dụng cụ - Tủ ấm 37.0  1.0oC - Tủ ấm 41.50 1.0oC - Kéo, kẹp - Khây inox - Máy đồng mẫu - Cân phân tích - Nồi hấp tiệt trùng - Đèn cồn - Que cấy 2.4 Mơi trường hóa chất Bảng 1: Mơi trường hóa chất Mơi trường hóa chất Mục đich APW (Alkaline phosphate water) Tăng sinh chọn lọc TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose) Phân lập TSA Phục hồi Đĩa giấy Oxidase Khẳng định sơ Dung dịch NaCl KOH 3% Thử String khẳng định sơ Arginine dehydrolase Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Lysine decarboxylase TW (Tryptone Water) ONGP Kowac’s Thuốc thử Indol HCl NaOH 10% Chỉnh pH Cách pha chế môi trường - APW (Alkaline phosphate water; nhà sản xuất: Merck) Hòa tan 20g/1L nước, hấp tiệt trùng 121 độ C 15 phút, mơi trường APW ống phân phối vào ống sau đố hấp tiệt trung Làm nguội nhiệt độ phòng, pH= 8.5  0.2 - TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose; nhà sản xuất: Merck) Hòa tan 88g/1L nước, không hấp tiệt trùng, đổ đĩa, pH: 8.6 ± 0.2 - TSA (Tryptic Soy Agar; nhà sản xuất: Merck) Hòa tan 40g/1L nước, hấp tiệt trùng 121 độ C 15 phút, đổ đĩa, môi trường TSA 1% muối bổ sung thêm 1g muối pH: 7.3 ± 0.2 - Lysine decarboxylase (TCVN 7954:2008) Thành phẩn  Yeast extract: 3.0g  Glucose : 1.0 g  L-lysine: 5.0 g  Bromocresol tía:0.015 g  NaCl: 10g  pH : 6.8 ± 0.2 25°C Hòa tan thành phần vào 1000 ml nước, phân phối vào ống hấp tiệt trùng 1210C/15’ - Arginine dehydrolase (TCVN 7954:2008)  Yeast extract: 3.0g  Glucose : 1.0 g  L-Aginin: 5.0 g  Bromocresol tía: 0.015 g  NaCl: 10g  pH : 6.8 ± 0.2 25°C Hòa tan thành phần vào 1000 ml nước, phân phối vào ống hấp tiệt trùng 1210C/15’ 2.5 Quy trình phân tích 2.6 Các bước tiến hành Đông 25g mẫu với 225ml APW Bước 1: Tăng sinh Tăng sinh lần 1: Cân 25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, thêm 225ml APW, dập mẫu 60 Tăng sinh lần 1/6-8 Phân lập lên TCBS giây, ủ 37 oC  Tăng sinh lần 2: Chuyển 1ml dịch cấy bề mặt ASPW vào ống nghiệm chứa 10ml Tăng sinh lần 2/66-24 môi trường ASPW Ủ 41,5  1oC 18  Bước 2: Phân lập Từ môi trường tăng sinh, cấy ria lên môi trường thạch TCBS, ủ 37 oC 24  o 37 0,5 C khoảng 24tròn, lớn có màu vàng, khuẩn Trên mơi trường thạch TCBS Ủkhuẩn lạc V Cholera lạc V Parahaemolyticus trịn, lớn có màu xanh dương Bước 3: Phục hồi môi trường dinh dưỡng TSA Đánh dấu khuẩn lạc điển hình nghi ngờ từ đĩa môi trường phân lập Vibrio cholera : Khuẩn lạc vàng, đường kính 2-3 mm : Khuẩn lạc xanh, đườnglạc kínhđiển 3-4 mm TCBS.Vibrio Nếuparahaemolyticus đĩa có khuẩn hình khuẩn lạc nghi ngờ, lấy tất khuẩn lạc điển hình nghi ngờ cấy ria lên mơi trường TSA có bổ sung 1% muối Ủ 37  oC 24h - Trường hợp 1: Từ đĩa thử khuẩn lạc đặc trưng, cho kết luận thử nghiệm sinh hóa phùSinh hợp thìsơkết luận phù hóa bộ, khẳng định, hợp kháng huyết - Trường họp 2: Nếu trường hợp cho kết thử nghiệm sinh hóa khơng phù hợp tiến hành thử bốn khuẩn lạc cịn lại đánh dấu, bốn khuẩn lạc cho kết phù hợp kết luận phát ngược lại kết luận không phát Kết Luận Bước 4: Khẳng định Thử nghiệm sinh hóa kháng huyết Từ khuẩn lạc chọn cấy ria lên TSA, dung que cấy cấy vào môi trường thử nghiệm sau Bước 4.1 Các phép thử nhận dạng giả định Thử nghiệm Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae Phản ứng Oxidase + + Thử nghiệm String + + Bảng 4.2 Thử nghiệm khẳng định Phản ứng tiêu biểu Phản ứng tiêu biểu V Parahaemolyticus V Cholera - - + + - + + + 0% NaCl - + 6% + - 10% - - Phép thử Arginine dihydrolase (ADH) Lysine decarboxylase (LDC) ONPG (galactosidase) Sinh Indol Thử nghiệm chịu mặn Thử nghiệm kiểu huyết thanh: Trong trường hợp có đủ chủng chuẩn/ chứng dương cho thử nghiệm gây kháng huyết Tùy theo yêu cầu phân tích, thực phân tích kiểu kháng nguyên chủng Vibrio Đối với V cholera, có yêu cầu xác định khả gây bệnh phản ứng kháng huyết tiến hành phản ứng ngưng kết kháng huyết O1 O139 Thử nghiệm V.parahaemolyticus Kanagawa: Xác định khả làm tan máu thỏ dạng  Ủ 37.0  1.0OC / 24±2 Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc V.parahaemolyticus Kanagawa dương tính bao quanh vòng sáng hẹp tượng dung huyết dạng  2.7 Kết Phát (hay không phát hiện) V Cholerae hay V Parahaemolyticus 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng Kết luận: Tùy theo nhu cầu phân tích mẫu mà xây dựng phương pháp phù hợp Phương pháp phân tích V Cholerae hay V Parahaemolyticus; theo (ISO 218721:2017) xác định thêm Vibrio vulnificus khẳng định bằng phương pháp PCR để rút ngắn thời gian phân tích Ví dụ: Chuẩn bị mẫu cho q trình phân tích Phát V Cholera V Parahaemolyticus  Chuẩn bị mẫu: Mẫu cá bạc má nguyên Hình 03: Mẫu cá bạc má Các yêu cầu lấy mẫu cho phân tích vi sinh tham chiếu TCVN 6507-3:2019 mục 9.1.2 Cá tươi nguyên (dài 15 cm) Lấy mẫu tiến hành phân tich V Cholera V Parahaemolyticus Dùng kéo kẹp vô trùng lấy phần cá phía trước cách thực hai lát cắt để tạo mặt cắt ngang, lát cắt để loại bỏ phần đuôi, viền đuôi lát thứ hai để lấy miếng thịt 25 gam để tiến hành phân tích  Quy trình phân tích: theo mục 2.6  Kết quả: Ví dụ V Cholera thử nghiệm sinh hóa với bước khẳng định V Parahaemolyticus không kết quả: STT V Cholera V Parahaemolyticus Mẫu cá bạc má Phát Khơng phát An tồn phân tích Trước vào phịng thí nghiệm phải tuân thủ nội quy sau để tránh làm 10 nhiễm bẩn mẫu thử môi trường nuôi cấy, đồng thời để tránh nguy lây nhiễm sang người: - Phải mặc áo bảo hộ (blouse), đeo trang, găng tay trăng thao tác vi sinh Không mang áo bảo hộ khỏi khu vực làm việc phòng thay đồ - Khi tiếp xúc với hóa chất, mơi trường phải dùng bao tay, trang chống an mòn, - Khi thao tác với chủng gây bệnh , cần thao tác kỹ thuật hướng dẫn để tránh lây nhiễm - Tất mơi trường , hóa chất phải dán nhãn bảo quản yêu cầu nhà sản xuất theo hướng dẫn phịng thí nghiệm - Khi bắt đầu kết thúc cơng việc phân tích phải vệ sinh tay mặt bàn bẳng cồn 700 Phân tích thao tác kiểm nghiệm phải nơi quy định, khơng tự ý đổi vị trí dụng cụ, thiết bị thí nghiệm - Tất dụng cụ có vi sinh vật ni cấy bên hay dụng cụ bẩn phải tiệt trùng 1210C/30p - Không ăn uống khu vực thử nghiệm hút thuốc phịng thí nghiệm 11 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH KẾT QUẢ Khuẩn lạc V Cholera V Parahaemolyticus môi trường TCBS agar Khuẩn lạc môi trường TSA Phản ứng indol 12 Nhân pyrrol indol chứa CH2 kết hợp với nhân benzen pDimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên dạng phức chất dạng quinone có màu đỏ Ống (-) phản ứng âm tính – không làm đổi màu thuốc thử Kovac’s Ống (+) phản ứng dương tính – đổi màu thuốc thử Kovac’s từ không màu sang màu hồng Phản ứng ONGP Thủy phân o-nitrophenyl–D–galactopyranoside (ONPG) enzyme βgalactosidase tạo thành o- nitrophenol có màu vàng Phản ứng ONPG chuyển sang màu vàng  Có sinh tổng hợp β-galactosidase 13 Phản ứng ONPG khơng đổi màu  Khơng có sinh tổng hợp β-galactosidase Oxida test Xác định diện enzyme oxidase Hoạt tính oxidase phát nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, có diện enzyme, thuốc thử bị oxy hóa → indolphenol có màu xanh dương Phản ứng Arginine dihydrolase Arginine chuyển hóa thành citruline nhờ xúc tác enzyme aginine (ADH) chuyển hóa thành CO2 putrescine Dương tính: mơi trường có màu tím Âm tính: mơi trường có màu vàng Phản ứng Lysine decarboxylase 14 Khả sử dụng lysin đánh giá qua đổi màu mơi trường ni Nếu chủng vi khuẩn có enzyme phân giải enzyme xúc tác cắt bỏ nhóm carboxyl (-COOH), phóng thích CO2, tạo sản phẩm có tính acid làm thay đổi màu mơi trường Dương tính: mơi trường đục có màu tím Âm tính: mơi trường có màu vàng String test Dương tính (có kéo sợi): gram âm Âm tính (khơng kéo sợi): gram dương 15 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Kéo lấy mẫu Kẹp lẫy mẫu Khây Inox đựng mẫu 16 Các loại pipette Tủ ấm Cân phân tích Máy đồng mẫu 17 Nồi hấp tiệt trùng 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] https://vi.wikipedia.org/wiki/Vibrio [2] TCVN 7905:2008 (ISO 21872:2007) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát Vibrio spp Có khả gây bệnh đường ruột – Phần 1: Phát Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae [3] ISO 21872-1:2017: Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp Part 1: Detection of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholera and Vibrio vulnificus [4] TCVN 6507-3:2019 (ISO 6887-3:2017) Vi sinh vật chuỗi thực phẩm – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật- Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu thủy sản sản phẩm thủy sản [5] Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm – Trần Linh Thước NXB Giáo dục 2006 [6] Phân tích vi sinh thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm HCM [7] Sổ tay Phương Pháp Kiểm nghiệm Sinh học – NAFIQAD 19 ...TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI TẬP TIỂU LUẬN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH VIBRIO CHOLERA VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTUCUS. .. người Phân loại khoa học: Giới : Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio Lồi : Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus Hình 01: Vi khuẩn... 7905:2008 (ISO 21872:2007) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát Vibrio spp Có khả gây bệnh đường ruột – Phần 1: Phát Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae [3] ISO 21872-1:2017: