(TIỂU LUẬN) môn CÔNG NGHỆ VI SINH THỰC PHẨM đề tài PHÂN lập TUYỂN CHỌN nấm MEN TRÊN NHO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN NẤM MEN TRÊN NHO GIÁO VIÊN HD: ThS NGUYỄN MINH HIỀN NHÓM II: TỔ 1/ NGUYỄN NGÔ ĐỨC KHANG 16125242 2/ PHẠM THỊ MỸ LY 16125304 3/ HỒ THỊ MỸ TRINH 16125532 4/ LÊ THỊ HẠNH 16125182 5/ NGUYỄN THỊ TRANG 17125318 6/ TRẦN THỊ BÍCH SƯƠNG 16125428 TP.Hồ Chí Minh, ngày 6, tháng 1, năm 2019 Tieu luan Mục lục DANH MỤC BẢNG: DANH MỤC HÌNH: .2 CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ .3 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sơ Lược Về Nấm Men .3 1.1 Hình Dạng Và Kích Thước Tế Bào 1.2 Cấu Tạo Tế Bào Nấm Men 1.3 Sự Sinh Sản Của Nấm Men 1.4 Phân Loại Nấm Men 1.5 Các Quá Trình Sinh Lý Của Nấm Men ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN .5 KỶ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGUYÊN VẬT LIỆU .8 MÔI TRƯỜNG .8 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ MỤC ĐÍCH, HĨA CHẤT 3.1 DỤNG CỤ 3.2 THIẾT BỊ .9 3.3 HÓA CHẤT PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆ 11 4.1 Phân Lập Nấm Men 12 4.2 Tuyển Chọn Nấm Men .13 4.3 Xác Định Số Lượng Tế Bào Nấm Men Và Xây Dựng Đường Cong Sinh Trưởng 14 4.4 Cố Định Tế Bào Nấm Men 15 4.5 Kiểm tra chất lượng nấm men cố định .15 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM .17 KẾT QUẢ PHÂN LẬP NẤM MEN 17 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN NẤM MEN .18 2.1 Khả Năng Sử Dụng Đường 18 2.2 Khả Năng Sinh CO2 19 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG 22 Kết luận 23 KẾT QUẢ CỐ ĐỊNH NÁM MEN 24 4.1 Kết Quả So Sánh Hoạt Lực Giữa Nấm Men Tự Do Và Nấm Men Cố Định 25 Tieu luan 4.2 Kết Quả Đánh Giá Cảm Quan Về Nước Trái Cây Lên Men: .26 4.3 Kết Quả Khả Năng Tái Sử Dụng Của Nấm Men Cố Định 26 CHƯƠNG V PHỤ LỤC 27 PHỤ LỤC 1: THỐNG KÊ TUYỂN CHỌN GIỐNG NẤM MEN 27 PHỤ LỤC 2: THỐNG KÊ SO SÁNH HOẠT LỰC CỦA NẤM MEN Y4 28 Tieu luan DANH MỤC BẢNG: Bảng 1.1: phân lập nấm men 16 Bảng 2.1: Kết Quả Thay Đổi Độ Brix Đã Được Thống Kê 16 Bảng 2.2: Kết khả sinh CO2 sau 24h nấm men 18 Bảng 2.3: Kết khả sinh CO2 sau 48h nấm men 19 Bảng 2.4:Kết khẩ sinh CO2 sau 48h nấm men .20 Bảng 2.5: bảng đánh giá khả sử dụng đường sinh CO2 mã hóa quan sát 21 Bảng 3.1: Thống kê số lượng tế bào nấm men Y4 sau 48h 21 Bảng 4.1: so sánh khả sinh khí CO2 hai kiểu nấm men 24 Bảng 4.2: so sánh độ brix sau 30h 25 Bảng 4.3:Đặc điểm viên ứng với lần sử dụng 25 Bảng 4.4:Độ brix sau lần sử dụng củ men cố định .25 Bảng 1.1: BẢNG PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI PỬ ĐỘ TIN CẬY 95% 26 Bảng 1.2: BẢNG TRẮC NGHIỆM LSD Ở ĐỘ TIN CẬY 95%,CHO YẾU TỐ NẤM MEN 26 Bảng 1.3: BẢNG TRẮC NGHIỆM LSD Ở ĐỘ TIN CẬY 95% CHO YẾU TỐ THỜI GIAN 27 Bảng 2.1: BẢNG PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI CỦA ĐỘ BRIX GIẢM THEO YÊU TỐ LÊN MEN .27 Bảng 2.2: BẢNG TRẮC NGHIỆM LSD ĐỘ TIN CẬY 95% .27 DANH MỤC HÌNH: HÌNH 1.1-1: Khuẩn lạc nấm men thuộc giống saccharomyces .3 HÌNH 1.1-2: tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae .4 HÌNH 1.5-1: mơ hình đường cơng sinh trưởng chung vi sinh vật HÌNH 3.3-1: Quy Trình Thí Nghiệm Chung 10 HÌNH 4.1-1: mơ hình cấy ria đĩa petri 11 HÌNH 2.2-1: đường cong sinh trưởng nấm men Y4 22 HÌNH 2.2-1: nấm men cố định (a) 23 HÌNH 2.2-2: nấm men cố định (b) 23 Tieu luan CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ Mục đích:  phân lập nấm men nhằm chọn giống nấm men chủng mẫu nho (chọn nho có đề tài phân lập giống nấm men nhao0  tuyển chọn giống nấm men có hoạt lực mạnh, đưa vào sản xuất (lên men)  xây dựng đường cong sinh trưởng nhầm, đề biện pháp bảo quản sản xuất với nấm men giống  cố định tế bào nấm men, thực lên men nước thơm+chanh dây CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sơ Lược Về Nấm Men Nấm men (yeast, levure) tên chung để nhóm vi nấm thường có cấu tạo đơn bào thường sinh sơi nảy nở phương pháp nẩy chồi (budding) Nấm men không thuộc đơn vị phân loại định, chúng thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) ngành Nấm đảm (Basidiomycota) Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi Đặc biệt chúng có mặt nhiều đất trồng nho nơi trồng hoa Ngoài thấy chúng có mặt trái chín, nhụy hoa, khơng khí nơi sản xuất rượu vang 1.1 Hình Dạng Và Kích Thước Tế Bào  Hình dạng khuẩn lạc nấm men: Khuẩn lạc nấm men có hình trịn, bóng, khơng nhấy nhớt, kích thước lơn so với khuẩn lạc vi khuẩn, khn có hệ sợi khuẩn ty khuẩn lạc nấm mốc HÌNH 1.1- 1: Khuẩn lạc nấm men thuộc giống saccharomyces  Hình dạng tế bào nấm men: Nấm men thường có hình dạng tế bào khác nhau, thường có hình cầu, hình elip, hình trứng, hình bầu dục hình dài Một số lồi nấm men có tế bào hình dài nối với thành dạng sợi gọi khuẩn ty (Mycelium) hay khuẩn ty giả (Pseudo mycelium) Tuy nhiên hình dạng chúng không ổn định, phụ thuộc vào tuổi nấm men điều kiện nuôi cấy Tieu luan HÌNH 1.1- 2: tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae  Kích thước tế bào nấm men: Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp từ – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước thay đổi, khơng đồng lồi khác nhau, lứa tuổi khác điều kiện nuôi cấy khác 1.2 Cấu Tạo Tế Bào Nấm Men Tế bào nấm men nhiều loại tế bào khác cấu tạo chủ yếu từ phần sau:  Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác Trong chủ yếu là: glucan, manan, protein, lipid số thành phần nhỏ khác kitin, volutin ,…  Màng nguyên sinh chất: gồm hợp chất phức tạp protein, phospholipit enzyme permeaza…  Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu nước, protit, gluxit, lipit muối khoáng, enzyme có quan  Nhân tế bào  Những thành phần quan khác: không bào, ty lạp thể, riboxom , … 1.3 Sự Sinh Sản Của Nấm Men Nấm men có số hình thức sinh sản sau:  Sinh sản cách nảy chồi  Sinh sản cách phân đôi  Sinh sản bào tử hình thành bào tử 1.4 Phân Loại Nấm Men Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) Lớp nấm men thật (lớp Ascomyces – lớp nấm túi):  Phần lớn nấm men dùng công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces  Giống Endomyces:  Giống Schizosaccharomyces Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti – nấm men bất toàn) Tieu luan      Crytococus (toscula, tornlopsis) Mycoderma Eandida Geotrichum (đã xếp vào lớp nấm mốc) Rhodotorula 1.5 Các Quá Trình Sinh Lý Của Nấm Men Sinh dưỡng nấm men  Cacbon Nguồn Cacbon cung cấp loại đường khác nhau: saccarose, maltose, lactose, glucose…  Hơ hấp: o Hơ hấp hiếu khí: C6H12O6 + 6O2 →6CO2 + 6H2O + 674 cal o Hô hấp kị khí: C6H12O6 →2CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal  Dinh dưỡng oxy, hydro: cung cấp cho tế bào từ nước môi trường nuôi cấy hay dịch  Dinh dưỡng Nitơ: Nấm men khơng có men ngoại bào để phân giải protid, nên phân cắt albumin mơi trường mà phải cung cấp nitơ dạng hịa tan, đạm hữu vơ Dạng hữu thường dùng acid amin, pepton, amid, urê Đạm vô muối amon khử nitrat, sulfat… - Các vitamin chất khống: Chất khống có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống nấm men  Phospho: có thành phần nucleoprotein, polyphosphat nhiều enzyme sản phẩm trung gian trình lên men rượu, chúng tạo liên kết có lượng lớn  Ngồi nấm men cịn cần số chất vi lượng khát để sinh trưỡng phát triển  Môi trương nuôi cấy nấm men thường PDA (Potato Dextrose Agar), Sabouraud, Hasen,  Nuôi cấy điều kiện hơ hấp hiếu hay kị khí tùy nghi Nguồn tài liệu phần 1: tiểu luận môn công nghệ sinh học thực phẩm –trường đại học công nghiệp TP.HCM-đề tài: “ công nghệ sinh học sản xuất nấm men sử dụng sản xuất rượu vang”-gvhd:Ths.ĐÀO SAO MAI ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN Quá trình sinh trưởng phát tiển nấm men môi trường nuối cấy không liên tục tương tự vi sinh vật khác: Nấm men sử dụng chất dinh dưỡng (cơ chất) có mơi trường nuôi cấy để sinh trưỡng phát triển, trình sinh trưỡng nâm men trải qua giai đoạn :  Giai đoạn Tiềm phát Khi cấy vi sinh vật vào môi trường số lượng thường khơng tăng lên ngay, giai đoạn Tiềm phát hay pha Lag Trong giai đoạn tế bào chưa phân cắt thể tích khối lượng tăng lên rõ rệt có tăng thành phần tế bào Nguyên nhân tế bào trạng thái già, thiếu hụt ATP, cofactor cần thiết ribosome Thành phần môi trường không giống môi trường cũ tế bào cần thời gian Tieu luan định để tổng hợp enzyme nhằm sử dụng chất dinh dưỡng Các tế bào bị thương tổn cần thời gian để hồi phục  Giai đoạn pha logarit (lũy thừa) Trong giai đoạn vi sinh vật sinh trưởng phân cắt với nhịp độ tối đa so với tính di truyền chúng gặp mơi trường điều kiện ni cấy thích hợp Nhịp độ sinh trưởng chúng không thay đổi suốt giai đoạn này, tế bào phân đôi cách đặn Do tế bào sinh khác đường cong sinh trưởng đường trơn nhẵn không gấp khúc  Pha cân Trong pha tốc độ sinh trưởng trao đổi chất vi sinh vật giảm Số lượng tế bào chết cân với số tế bào sinh Một số nguyên nhân khiến vi sinh vật chuyển sang pha cân chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm( vi sinh vật hiếu khí), chất độc (chất thải) tích lũy, nồng độ cồn tăng (đối với nấm men), pH thay đổi…  Pha suy vong Việc tiêu hao chất dinh dưỡng việc tích lũy chất thải độc hại làm tổn thất đến môi trường sống vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống Đó đặc điểm giai đoạn tử vong Giống giai đoạn logarit, tử vong quần thể vi sinh vật có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết không đổi) Bốn pha thể qua đường cong sinh trưởng sau: HÌNH 1.5- 3: mơ hình đường cơng sinh trưởng chung vi sinh vật Nguồn tài liệu phần 2: Trích dẫn từ “ ảnh hưỡng yếu tố bên đến hoạt động vi sinh vật”-phần trình sinh trưỡng phát triễn-đăng trang “ thư viện học liệu mỡ việt nam”-voer.edu.vn Link: http://voer.edu.vn/m/anh-huong-cua-yeu-to-ben-ngoai-den-hoat-dong-cua-vi-sinhvat/d497319d KỶ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN  Khái niệm cố định tế bào vi sinh vật: giử chúng vị trí định cách bao bọc, gắn chất mang hay biện pháp khác, ta cần lưu ý trình cố định khơng làm suy giảm hoạt tính chúng Tieu luan  Có bốn phương pháp cố định vi sinh vật chủ yếu: o Hấp thụ bề mặt: vi sinh vật hấp thụ bề mặt giá thể loại lực liên kết giữ chúng bề mặt o Giử lưới: vi sinh vật giữ mạng lưới cấu trúc gel Mạng lưới gel hình thành cấu trúc cao phân tử chuỗi cao phân tử kết lưới với nhờ loại lực liên kết ion hay cộng hóa trị o Bộc vỏ: phương pháp vi sinh vật bọc vỏ xốp có ống mao dẫn nhỏ đển dẫn chất, dưỡng chất sản phẩm Vi sinh vật di chuyển vỏ o Kết tụ: tạo nhờ lực liên kết giữ vi sinh vật  Chọn cách cố định giữ lưới: alginate có khả tạo gel với ion Ca 2+ điều kiện pH acid Nấm men giử nguyên khả lên men dạng tự Nguồn phần 3:Trích dẫn từ tài liệu “q trình thiết bị lên men lên men công nghiệp”-chương 6: lên men với vi sinh vật cố định lên men môi trường rắn-đã đăng trang hoctp.com Tieu luan CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGUYÊN VẬT LIỆU Phân lập: Nho Cố định nấm men lên men Nước thơm + chanh dây MƠI TRƯỜNG Mơi trường ni cấy nấm men Mơi trường PDA: Dùng để giữ giống nấm men phân lập Thành phần:  Khoai tây:  Dextrose:  Agar: Môi trường tuyển chọn nấm men 200g 20g 15g Môi trường Sabouraud Thành phần:     Pepton: Glucose: Agar: Nước: 20g 40g 20g lít Cách tiến hành: Cân xác thành phần mơi trường cho vào nồi vào có chứa 1000ml nước Sau Đun, khuấy cho thành phần môi trường tan hoàn toàn Đổ vào đĩa peptri , ống nghiệm Hấp tiệt trùng 121 ℃ 15’ Môi trường thiết lập đường cong sinh trưởng Môi trường Hansen - Môi trường tuyển chọn thiết lập đường sinh trưởng cho Nấm men Thành phần:  Glucose Maltose: 50g  Pepton: 10g  KH2PO4: 3g  MgSO4 2-5g  Nước: lít Cách tiến hành: Cân xác thành phần môi trường cho vào nồi vào có chứa 1000ml nước Sau khuấy cho thành phần mơi trường tan hồn tồn Đổ vào ống nghiệm Hấp tiệt trùng 121 ℃ 15’ Tieu luan Tiến hành quan sát đĩa mẫu, nhận diện khuẩn lạc nấm men chưa ta chọn khuẩn lạc cho nấm men cấy qua môi trường thạch đĩa (SAB) tiếp tục quan sát đến khuẩn lạc mang đặc điểm nấm men: Cách phân lập tới thuần:     Tiến hành phân lập vi sinh vật Không lấy từ mẫu mà lấy từ khuẩn lạc nghi ngờ phân lập Các khuẩn lạc giống cấy khuẩn lạc vào đĩa petri Sau thời gian ủ thu khuẩn lạc mọc đĩa petri Sau tiến hành quan sát khuẩn lạc hình dạng, màu sắc, đặc điểm Sau tiến hành quan sát kính hiển vi để quan sát rõ Bước 5: Quan sát vi thể: bước làm tiêu 1: Trải trùng (Nhỏ giọt nước lên lam kính dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ngờ mơi trường hòa vào giọt nước.) Lưu ý: Que cấy vịng phải hơ nóng đỏ lửa đèn cồn 2: Cố định mẫu (Hơ nhẹ lam kính lửa đèn cồn đến khô.) 3: Nhuộm màu crystal violet phút Rửa nước hơ khô 4: Quan sát Khi quan sát nhỏ thêm giọt dầu Bước 6: Cấy giữ giống qua ống thạch nghiên Mục đích: Bảo tồn nấm men ni tinh khiết Phương pháp: môi trường tổi thiểu, môi trường giàu dinh dưỡng, nấm men phát triển nhanh thối hóa nhanh Cách tiến hành: Dùng que cấy vòng khử trùng qua lữa đèn cồn lấy khuẩn lạc cấy ria lên mặt thạch nghiên  Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, tốn kém, thích hợp qui mơ phịng thí nghiệm  Nhược điểm: thời gian bảo quản ngắn, vơ tình huấn luyện nấm men sống điều kiện lạnh, làm biến đổi đặc điểm nấm men ban đầu 4.2 Tuyển Chọn Nấm Men Mục đích: Sau phân lập có nhiều men khác để chọn men thích hợp theo dõi tiêu chí để đánh giá Phương pháp: so sánh khả sử dụng đường khả sinh khí CO nấm men TN1: Khả sử dụng đường: Mục đích: khảo sát khả sử dụng đường loại nấm men phân lập Chọn nấm men sử dụng đường tốt để thiết lập đường cong sinh trưởng Cách thực hiện: 14 Tieu luan Chuẩn bị môi trường SAB lỏng có độ brix 19 cho loại nấm men phân lập tới vào ống nghiệm (mỗi loại bố trí vào ống nghiệm để tiến hành đo ngày ống) Các điều kiện giữ loại tiến hành đo độ brix vòng ngày, loại có độ brix giảm nhiều chứng tỏ giống nấm men có khả sử dụng đường tốt Ưu điểm: đơn giản, dễ thực Nhược điểm: Không tránh khỏi sai số lượng men đưa vào ban đầu chưa TN2: Khả sinh CO2 Mục đích: khảo sát khả sinh CO2 loại nấm men phân lập Chọn nấm men sinh CO2 tốt để thiết lập đường cong sinh trưởng Cách thực hiện: Chuẩn bị ống nghiệm có chứa durham, sử dụng mơi trường Sabouraud lỏng, cấy men phân lập vào ống nghiệm, để nhiệt độ thường, quan sát vịng 72h, độ đục mơi trường chiều cao cột khí ống durham 4.3 Xác Định Số Lượng Tế Bào Nấm Men Và Xây Dựng Đường Cong Sinh Trưởng Mục đích: kiểm tra lại đánh giá khả sinh trưởng nấm men sau tuyển chọn Phương pháp: đếm số lượng tế bào buồng đếm hồng cầu Cách tiến hành: Sau tuyển chọn men phù hợp ta tiến hành nuôi men môi trường Hansen lỏng để đếm tế bào nấm men vẽ đường cong sinh trưởng  Cho 5ml nước muối sinh lí vơ trùng vào ống nghiệm ni cấy giống chọn Sau lắc lên dùng pitte hút 1ml mẫu vừa lắc cho vào 9ml môi trường Hansen, đem ủ  Đếm số lượng tế bào nấm men thời điểm ban đầu (0h) Sau đó, tiếng đếm lần (Chú ý: thực thao tác bên cạnh lửa đèn cồn)  Pha loãng mẫu  Lắc ống nghiệm pha loãng mẫu  Đậy buồng đếm lame  Nhẹ nhàng dùng đậu pipet (chứa giọt huyền phù có chứa nấm men) đặt cạnh vào buồng đếm (nơi có tiếp giáp với lame) Dịch huyền phù vào buồng đếm nhờ lực mao dẫn  Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm đẻ dịch uyền phù tràn đầy khoang  Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi, điều chỉnh vật kính 40 dùng ốc vi cấp để điều chỉnh đến nhìn rõ, sau tiến hành đếm số lượng tế bào ô lớn chéo (chọn ô góc giữa) 15 Tieu luan  Nếu buồng đếm hồng cầu bị bẩn dùng giấy lau nhẹ, dùng giấy thấm cồn lau vật kính, đèn Cách đếm tế bào men buồng đếm hồng cầu: đếm ô lớn chéo Trong ô lớn đếm từ ô nhỏ thứ đến ô nhỏ thứ 16 Chỉ đếm tế bào ô tế bào nằm cạnh liên tiếp chiều 4.4 Cố Định Tế Bào Nấm Men Mục đích: cố định nhằm bảo quản nấm men để sử dụng trình sản xuất Phương pháp: cố định nấm men cách tạo hạt gel alginate với nấm men (alginate có khả tạo gel với ion Ca2+ điều kiện pH acid) Cách tiến hành: Bước 1: Pha loãng ống giống nước muối sinh lí vơ trùng để đạt dịch nấm men Bước 2: chia đôi dịch nấm men, cho vào bình nước thơm + chanh dây để thực lên men tự do, đem cố định Bước 3: Cố định dịch nấm men lại Natri alginate (2%) (cho lượng vừa phải natri alginate vào bao PE vô trùng, cho dịch nấm men lại vào, lắc đều) Bước 4: Tạo hạt gel từ dung dịch cách nhỏ giọt vào CaCl 2(trong q trình nhỏ, khơng nhỏ từ vị trí cao hay thấp cách dung dịch CaCl để tránh hạt gel khơng trịn, bị biến dạng Khi lắc bình dịch CaCl2 nên nhẹ nhàng tránh hạt gel tiếp xúc với gây cấu trúc) Sau tạo hạt gel để thời gian để hạt gel ổn định, 4.5 Kiểm tra chất lượng nấm men cố định 4.5.1 So sánh hoạt lực nấm men Mục đích: kiểm tra xem nấm men sau cố định có cịn khả lên men chưa cố định không Phương pháp: so sánh khả lên men men cố đinh men tự lên men nước thơm+ chanh dây Cách tiến hành: Bước 1: Cho nấm men cố định vào bình khát chứa nước trái thơm+ chanh dây giống bình chứa men tự (giống độ pH, hàm lượng đường, thể tích, …) Bước 2: Đậy hai bình hai bong bóng để quan sát khả sinh CO2 Bước 3: Sau khoảng thời gian (khoảng 30h), bóng bóng hai bình căng khí, tháo đo độ brix cịn lại hai bình đánh giá cảm quan 4.5.2 Khả tái sử dụng nấm men cố định Mục đích: kiểm tra khả tái sử dụng lại nẫm men cố định Cách thực hiện: Sử dụng lại các hạt gel có men cố định cho vào bình chứa dịch đường (có độ brix độ brix nước trái thơm ban đầu) để tiếp tục lên men, sau 24h đo lại độ brix lại thay dịch đường (có độ brix độ brix nước trái thơm ban đầu) để sau 24h lại tiếp tục đo độ brix Đo đến có thay đổi lơn so với kết hàm lượng đường sử dụng lần dừng lại 16 Tieu luan CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM KẾT QUẢ PHÂN LẬP NẤM MEN Nấm men Khuẩn lạc Tế bào Hình 3.1.1 kl trịn, đục, vun, d= 0.75mm Hình 3.1.2 tb hình cầu Y1 Hình 3.1.3 kl trịn, đục nhiều, vun, Hình 3.1.4 tb hình oval bóng, d=2mm Y2 Hình 3.1.5 kl trịn, đục, khơng vun, Hình 3.1.6 tb hình elip đầu nhọn d=1.5mm Y3 Hình 3.1.7 kl trịn, đục, vun giữa, d=2mm Hình 3.1.8 tb hình elip Y4 17 Tieu luan Bảng 1.1: phân lập nấm men KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN NẤM MEN 2.1 Khả Năng Sử Dụng Đường (PHỤ LỤC 1) Tiêu chí khả sử dụng đường nấm men đo độ brix (độ giảm độ brix lớn ) Bảng kết độ brix đo sau ngày: Nấm thứ Y1 Y2 Y3 Y4 Độ brix ban đầu 19aEF 19aED 19aF 19aD 18bEF 17.5bEF 17.5cEF 17cEF 17.5bED 17.5bED 17cED 16.5cED 18bF 18bF 17.5cF 17.5cF 17bD 17.2bD 16.5cD 16cD Ngày Bảng 2.2: Kết Quả Thay Đổi Độ Brix Đã Được Thống Kê Chú Thích:  Nhóm ký tự: a, b, c thuộc nhóm đồng yếu tố thời gian  Nhóm ký tự: E, D, F thuộc nhóm đồng yếu tố nấm men Dựa vào bảng ta xử lý số liệu thống kê phân mềm STATGRAPHICS phiên 15.1.02, kiểu phân tích phương sai yếu tố khối ta được:  Nấm men Y4 nấm men sử dụng lượng đường nhiều sau bốn ngày khả sử dụng không thay đổi ,ổn đinh 18 Tieu luan 2.2 Khả Năng Sinh CO2 Tiêu chí khả sử dụng đường môi trường nấm men quan sát qua làm đục mơi trường sinh khí CO2 Bảng kết sau ngày quan sát: Nấm men sau cấy hình ảnh quan sát 24h Kết quan sát tương ứng Y1 Môi trường trong, khí chiếm 7/10 ống Durham Y2 Mơi trường trong, khí chiếm 3/10 ống Durham Y3 Mơi trường suốt, bọt khí ít, chiếm gần 1/10 ống Durham Y4 Mơi trường đục,bọt khí chiếm 7/10 ống Durham Bảng 2.3: Kết khả sinh CO2 sau 24h nấm men Nấm men sau cấy Hình ảnh nấm men quan sát 48h Kết quan sát 19 Tieu luan Y1 Mơi trường đục vừa, bọt khí chiếm 8/10 ống Durham Y2 Mơi trường đục, có lắng cặn đáy ống nghiệm Bọt khí chiếm 6/10 ống Durham Y3 Mơi trường đục nhiều, bọt khí chiếm 1/10 ống Durham Y4 Mơi trường đục nhiều nhất, có lắng cặn đáy ống nghiệm Bọt khí chiếm 9/10 ống nghiệm Bảng 2.4: Kết khả sinh CO2 sau 48h nấm men Nấm men sau cấy Hình ảnh nấm men quan sát 72h 20 Tieu luan Kết quan sát Y1 Môi trường suốt, nhạt màu, có cặn, khí đầy ống Durham Y2 Mơi trường suốt, nhạt màu, có nhiều cặn đáy ống, khí 9/10 ống Durham Y3 Mơi trường đục, ngả xanh, bọt khí 1/10 ống Durham Y4 Mơi trường đục,có cặn, nửa đục nhiều màu đậm, nửa đục nhạt hơn, khí đầy ống Durham Bảng 2.5:Kết khẩ sinh CO2 sau 48h nấm men Nấm men Y1 Dấu hiệu Độ đục môi - - + trường SAB lỏng Y2 Y3 Y4 + +++ +++ 21 Tieu luan Khí CO2 sinh + + + ống Durham +++ - +++ Bảng 2.6: bảng đánh giá khả sử dụng đường sinh CO2 mã hóa quan sát Trong đó:  Dấu “-” thể mơi trường khơng đục/ không sinh CO2  Dấu “+” thể môi trường đục/ sinh CO2  Tương ứng cho dấu -/+ liên tiếp cho ngày liên tiếp  Kết luận: nấm men Y4 sau quan sát cho thấy khả sinh làm đục môi trường tốt nhất, chọn nấm men Y4 để đưa vào xây dựng đường sinh trưởng KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG bảng thông kê số lượng tế bào nấm men sau 48h Thời gian Số lượng ( *10^4) tb/ml 0h 4h 8h 14h 16h 20h 24h 28h 32h 38h 40h 44h 48h 1845 2010 5850 11550 13250 14450 14000 13200 13050 8005 6020 5050 3550 Bảng 3.7: Thống kê số lượng tế bào nấm men Y4 sau 48h  Từ bảng ta có Đường cong sinh trưởng nấm men Y4 xây dựng sau: 22 Tieu luan Số Lượng ( *10^4) Tb/ml 16000 14000 Số lượng tế bào 12000 10000 8000 Số lượng ( *10^4) tb/ml 6000 4000 2000 0h 4h 8h 14h 16h 20h 24h 28h 32h 38h 40h 44h 48h HÌNH 2.2-6: đường cong sinh trưởng nấm men Y4 NHẬN XÉT: đường cong sinh trưởng đường cong thể pha sinh trưởng nấm men cách rõ ràng.Trong đó:  Pha lag khoảng từ 0-4h: Khi cấy nấm men vào môi trường số lượng thường không tăng lên Số lượng Nấm men thấp Độ dốc đường cong sinh trưởng khoảng 4h bị lệch lên nhẹ chút  Pha log khoảng 4h-12h: Nấm men phân cắt sinh trưởng tối đa Đường cong sinh trưởng thời gian có độ dốc gần thẳng đứng  Pha ổn định khoảng 12h-32h: tốc độ sinh trưởng trao đổi chất nấm men giảm Số lượng tế bào chết cân với số tế bào sinh Số lượng nấm men pha lúc đầu có phần tăng nhẹ, sau giảm cân lại  Và bắt đầu suy vong sau 32h: Lượng nấm men giảm mạnh nhanh chóng Độ dốc so với pha log Độ dốc cong tương đối đẹp, giống với đường cong sinh trưởng chuẩn vi sinh vật dễ dàng kiểm sốt q trình lên men Khoảng thời gian pha log nhanh,pha ổn định kéo dài, điều có nghĩa lượng sinh khối thu nhiều khoảng thời gian để thu sinh khối ngăn, mang lại giá trị kinh tế cao Kết luận: Sau đánh giá tiêu chí ta thấy Nấm men Y4 nấm men có khả sử dụng tốt chất mơi trường ni cấy để thực q trình lên men cách ổn định,ước tínhcó suất lên men cao đưa vào sản xuất 23 Tieu luan KẾT QUẢ CỐ ĐỊNH NÁM MEN HÌNH 2.2-7: nấm men cố định (a) HÌNH 2.2-8: nấm men cố định (b) 1.1 Kết Quả So Sánh Hoạt Lực Giữa Nấm Men Tự Do Và Nấm Men Cố Định Thời gian quan sát sinh hình ảnh lên men với nấm Hình ảnh lên men với nấm khí CO2 men tự men cố định 24 Tieu luan Lên men sau 5h Lên men sau 10h Lên men sau 30h Bảng 4.8: so sánh khả sinh khí CO2 hai kiểu nấm men Thống kê phụ lục 2: Men Thời gian 30h Nấm men tự Nấm men cố định 15.2 16 25 Tieu luan Bảng 4.9: so sánh độ brix sau 30h 4.1 Kết Quả Đánh Giá Cảm Quan Về Nước Trái Cây Lên Men: Sản phẩm nước lên men từ nấm men tự do:     Màu vàng cam Mùi rượu ethanol nhiều Cảm nhận vị đắng uống vào Thơm chanh dây Sản phẩm nước lên men từ nấm men cố định:  Màu vàng cam nhạt  Mùi rượu ethanol vừa  Cảm nhận vị đắng sau uống 15s  Thơm chanh dây  Sau sử dụng phần mềm thống kê so sánh số liệu thống kê độ brix hai kiểu lên men ta thấy khơng có ý nghĩa thơng kê thống kê Vậy khả sử dụng đường nấm men cố định nấm men tự Về cảm quan sau so sánh nên chọn nấm men cố định để lên men sản phẩm nước trái 4.2 Kết Quả Khả Năng Tái Sử Dụng Của Nấm Men Cố Định lần sử dụng viên men Độ bền viên men Viên men nguyên vẹn Thể tích viên men tăng so với ban đầu Nhiều viên men nứt Bảng 4.10:Đặc điểm viên ứng với lần sử dụng Lần sử dụng viên men Độ Brix 16 16,5 17,5 Bảng 4.11:Độ brix sau lần sử dụng củ men cố định 26 Tieu luan CHƯƠNG V PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: THỐNG KÊ TUYỂN CHỌN GIỐNG NẤM MEN Biến phụ thuộc: BRIX GIẢM Các yếu tố:  Nấm (chính )  Thời gian (khối) Số Đơn Vị Thí Nghiệm: 16 NGUỒN BIẾN THIÊN TỔNG ĐỘ BẬC PHƯƠNG SAI TỶ LỆ P LỆCH BÌNH TỰ DO PHƯƠNG PHƯƠNG SAI CHÍNH A:NAM 1.7535 0.5845 7.47 0.0044 B:THOIGIAN DƯ 11.753 2.93825 37.55 0.0000 0.939 12 0.07825 TỔNG 14.4455 19 Bảng 1.12: BẢNG PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI PỬ ĐỘ TIN CẬY 95%  P thời gian < 0.05 thống kê có ý nghĩa  P Nấm < 0.05 thống kê có ý nghĩa NAMMEN Count LS Mean LS Sigma Y4 17.14 0.1251 Homogeneous Groups X Y2 17.5 0.1251 XX Y1 17.8 0.1251 XX Y3 17.9 0.1251 X Bảng 1.13: BẢNG TRẮC NGHIỆM LSD Ở ĐỘ TIN CẬY 95%,CHO YẾU TỐ NẤM MEN  Dựa vào bảng cột nhóm đồng ta thấy khơng có chênh lệch có ý nghĩa thống kê nhóm cạnh bảng lại có khát biệt có ý nghĩa thống kê nhóm cách dịng Kết hợp với cột giá trị trung bình ta thấy nấm men Y4 Y2 cho độ brix trung thấp chúng sai lệch khơng có ý nghĩa Vậy nên ta chọn hai nấm Y4 Y2 để tiếp tục thí nghiệm  Nhưng chọn nấm đưa vào khỏa sát nên chọn Y4 sử dụng lượng đường nhiều 27 Tieu luan THOIGIAN BANDAU Count 4 4 LS Mean 16.75 17.125 17.55 17.625 19.0 LS Sigma 0.132994 0.132994 0.132994 0.132994 0.132994 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 1.14: BẢNG TRẮC NGHIỆM LSD Ở ĐỘ TIN CẬY 95% CHO YẾU TỐ THỜI GIAN Kết Luận: dựa vào thống kê ta thấy Y4 nấm phát triển vượt bật sử dụng lượng đường nhiều chọn Y4 để tiếp tục thí nghiệm PHỤ LỤC 2: THỐNG KÊ SO SÁNH HOẠT LỰC CỦA NẤM MEN Y4 Sử dụng phẩn mềm STATGRAPHICS (Độ Tinh Cậy 95%) Source BÌNH PHƯƠNG PHƯƠNG SAI GIỮA CÁC 0.16 NHÓM TRONG 11.72 CÁC NHÓM TỔNG 11.88 BẬT TRUNG F-Ratio TỰ BÌNH BÌNH DO PHƯƠNG P-Value 0.16 0.8839 5.86 0.03 Bảng 2.15: BẢNG PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI CỦA ĐỘ BRIX GIẢM THEO YÊU TỐ LÊN MEN  P-Value >0.05, thống kê khơng có ý nghĩa LENMEN TUDO CODINH Count 2 Mean 17.1 17.5 Homogeneous Groups X X Bảng 2.16: BẢNG TRẮC NGHIỆM LSD ĐỘ TIN CẬY 95% So sánh hai trung bình độ brix hai mẫu khơng có ý nghĩa thống kê Kết luận: hai phương pháp lên men cho suất lên men 28 Tieu luan ... giống nấm men chủng mẫu nho (chọn nho có đề tài phân lập giống nấm men nhao0  tuyển chọn giống nấm men có hoạt lực mạnh, đưa vào sản xuất (lên men)  xây dựng đường cong sinh trưởng nhầm, đề biện... hiếu hay kị khí tùy nghi Nguồn tài liệu phần 1: tiểu luận môn công nghệ sinh học thực phẩm –trường đại học công nghiệp TP.HCM -đề tài: “ công nghệ sinh học sản xuất nấm men sử dụng sản xuất rượu vang”-gvhd:Ths.ĐÀO... Sự Sinh Sản Của Nấm Men Nấm men có số hình thức sinh sản sau:  Sinh sản cách nảy chồi  Sinh sản cách phân đôi  Sinh sản bào tử hình thành bào tử 1.4 Phân Loại Nấm Men Chủ yếu có hai lớp: nấm