VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU
Cố định nấm men lên men trên Nước thơm + chanh dây
MÔI TRƯỜNG
Môi trường PDA: Dùng để giữ giống nấm men và phân lập.
Môi trường tuyển chọn nấm men Môi trường Sabouraud.
Để tiến hành, trước tiên, hãy cân chính xác các thành phần môi trường và cho vào nồi chứa 1000ml nước Tiếp theo, đun sôi và khuấy đều cho đến khi các thành phần tan hoàn toàn Sau đó, đổ hỗn hợp vào các đĩa petri và ống nghiệm, và cuối cùng, hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121℃ trong 15 phút.
Môi trường thiết lập đường cong sinh trưởng
Môi trường Hansen - Môi trường tuyển chọn và thiết lập đường con sinh trưởng cho Nấm men
Cách tiến hành: Cân chính xác các thành phần của môi trường cho vào nồi vào có chứa
1000ml nước Sau đó khuấy đều cho các thành phần của môi trường tan hoàn toàn Đổ vào các ống nghiệm Hấp tiệt trùng ở 121 ℃C trong 15’
DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ MỤC ĐÍCH, HÓA CHẤT
Micropipette là dụng cụ chuyên dụng để hút mẫu với dung tích nhỏ từ 0.1ml đến 1ml, giúp thực hiện các thí nghiệm chính xác Khúc xạ kế được sử dụng để đo độ ngọt trong mẫu thí nghiệm một cách chính xác Buồng đếm hồng cầu giúp xác định nồng độ tế bào trong mẫu thí nghiệm Các dụng cụ như lam, lammen được sử dụng để làm tiêu bản quan sát tế bào vi sinh vật dưới kính hiển vi Ngoài ra, đèn cồn, ống nghiệm, ống đong và bình tam giác là những thiết bị cần thiết trong quá trình tiến hành thí nghiệm.
Nồi hấP tiệt trùng ALP:
Nồi hấp tiệt trùng (autoclave sterilizer) đóng vai trò quan trọng trong việc tiệt trùng và khử trùng dụng cụ thí nghiệm y tế Thiết bị này được sử dụng rộng rãi tại bệnh viện, các phòng nghiên cứu vi sinh, dược phẩm và các phòng thí nghiệm chuyên dụng, đảm bảo an toàn và hiệu quả trong công tác vệ sinh hàng ngày.
Hấp tiệt trùng môi trường, hấp bỏ mẫu trong thực hành
Cân kỹ thuật là dòng cân điện tử chính xác từ 0,1g đến 0,01g (hay còn gọi là chính xác từ 1 đến 2 số lẻ).
Cân phân tích là thiết bị quan trọng thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm, bệnh viện, viện nghiên cứu, và nhà máy Chúng chuyên dụng cho việc đo lường các mẫu phẩm có kích thước siêu nhỏ, đòi hỏi độ chính xác cao.
Kính hiển vi quang học: Với 3 vật kính ×10, ×40, ×100, giúp cho việc quan sát vi thể các tế bào nấm men, mốc cũng như vi khuẩn
Tạo nhiệt độ môi trường nuôi cấy vi sinh
Tạo nhiệt độ môi trường ủ ấm vi sinh vật
Sấy dụng cụ thí nghiệm sau khi hấp tiệt trùng, giấy báo
Ngoài công dụng sấy các sản phẩm bột bào tử ta còn có thể dùng để ủ vi sinh vật
Máy lắc ống nghiệm Vortex ZX3 giúp đồng nhất hiệu quả các môi trường trong ống nghiệm, trong khi máy lắc ngang phù hợp để lắc mẫu chứa trong nhiều loại dụng cụ thí nghiệm khác nhau.
Thuốc nhuộm: crystal violet để quan sát tế bào Nấm men trên kính hiển vi.
Natri alginate: cố đinh nấm men
Canxi clorua: cố định nấm men (tạo hạt gel cho hổn hợp nấm men và natri alginate)
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆ
4.1 Phân Lập Nấm Men Mục đích: Phân lập tới thuần giống nấm men và giữ giống để thực hiện quả trình nghiên cứu về sau
Phương pháp: nuối cấy nấm men trên môi trường thạch SAB bằng phương pháp cấy ria
Phân lập Quan sát đại thể Phân lập tới thuần Quan sát vi thể
Giữ giống Nhân giống Đếm số lượng tế bào Cô định nấm men
Lên men nước thơm + chanh dây Dịch lên men nho
HÌNH 3.3-4: Quy Trình Thí Nghiệm Chung
Vẽ đường cong sinh trưởng
Bước 1: Xử lí mẫu (Tăng sinh nấm men)
Để chuẩn bị mẫu, trước tiên, bạn cần sử dụng một hủ nhựa sạch đã được chần qua nước sôi nhằm hạn chế tạp nhiễm vi sinh vật Sau đó, cho 200g quả nho đã rửa sạch và cắt đôi vào cùng với 100g đường sucrose, và ủ lên men trong khoảng hai ngày.
Bước 2: Phân lập chọn lọc nấm men
Sử dụng que cấy đã được khử trùng trên ngọn lửa của đèn cồn để lấy mẫu nho đã ủ Tiếp theo, cấy mẫu vào môi trường Sabouraud Agar (SAB) và ủ đĩa môi trường đã cấy ở nhiệt độ thích hợp.
37 o C Cách thực hiện phân lập:
Chia đáy đĩa petri làm 4 phần: 1, 2, 3, 4
Khử trùng que cấy vòng bằng cách đốt nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn.
Đợi cho vòng cấy nguội, sau đó lấy dịch chứa vi sinh vật bằng cách nhúng vòng que cấy vào mẫu nho và di chuyển trên mặt thạch theo đường AB Cuối cùng, tiến hành khử trùng que cấy.
Cấy theo kiểu cấy ria 4 góc (như hình) từ phần 1 sang phần 2, khử trùng que cấy.
Xoay đĩa 90 o , cấy ria từ phần thứ 2 sang phần thứ 3, khử trùng que cấy.
Xoay đĩa 90 o , cấy ria từ phần thứ 3 sang phần thứ 4, khử trùng que cấy.
Khi cấy xong ủ ở 37 o C trong 24h, đặt ngược đĩa petri cho đáy lên trên, nắp ở dưới
Bước 3: Quan sát đại thể (nhận diện khuẩn lạc điển hình)
Chọn ra các khuẩn lạc nghi ngờ là nấm men để phân lập tới thuần: khuẩn lạc có màu trắng, đục , bóng tròn, lồi để phân lập tới thuần
Bước 4: Phân lập tới thuần
HÌNH 4.1-5: mô hình cấy ria trên đĩa petri
Quan sát đĩa mẫu để nhận diện khuẩn lạc nấm men Nếu chưa thuần, chọn khuẩn lạc nghi ngờ là nấm men và cấy vào môi trường thạch đĩa (SAB) Tiếp tục quan sát cho đến khi chỉ còn lại những khuẩn lạc có đặc điểm của nấm men.
Cách phân lập tới thuần:
Tiến hành như phân lập vi sinh vật
Không lấy từ trong mẫu mà lấy từ khuẩn lạc nghi ngờ đã phân lập
Các khuẩn lạc giống nhau thì chỉ cấy một khuẩn lạc vào một đĩa petri.
Sau thời gian ủ thu được các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri Sau đó tiến hành quan sát các khuẩn lạc về hình dạng, màu sắc, đặc điểm
Sau đó tiến hành quan sát trên kính hiển vi để quan sát rõ hơn.
Bước 5: Quan sát vi thể: các bước làm tiêu bản
1: Trải trùng (Nhỏ 1 giọt nước lên lam kính rồi dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường hòa đều vào giọt nước.) Lưu ý: Que cấy vòng phải được hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn.
2: Cố định mẫu (Hơ nhẹ lam kính dưới ngọn lửa đèn cồn đến khi khô.) 3: Nhuộm màu bằng crystal violet trong một phút Rửa nước và hơ khô.
4: Quan sát Khi quan sát nhỏ thêm giọt dầu Bước 6: Cấy giữ giống qua ống thạch nghiên Mục đích: Bảo tồn nấm men nuôi tinh khiết.
Phương pháp: môi trường tổi thiểu, nếu môi trường giàu dinh dưỡng, nấm men phát triển nhanh sẽ thoái hóa nhanh.
Cách tiến hành: Dùng que cấy vòng đã khử trùng qua ngọn lữa đèn cồn lấy khuẩn lạc cấy ria lên mặt thạch nghiên
Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém, thích hợp qui mô phòng thí nghiệm.
Nhược điểm: thời gian bảo quản ngắn, vô tình đã huấn luyện nấm men sống ở điều kiện lạnh, làm biến đổi các đặc điểm nấm men ban đầu.
4.2 Tuyển Chọn Nấm Men Mục đích: Sau khi phân lập sẽ có rất nhiều men khác nhau để chọn ra con men thích hợp thì chúng ta sẽ theo dõi các tiêu chí để đánh giá.
Phương pháp: so sánh khả năng sử dụng đường và khả năng sinh khí CO2 của các con nấm men
TN1: Khả năng sử dụng đường:
Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát khả năng sử dụng đường của các loại nấm men đã được phân lập Qua đó, nghiên cứu sẽ chọn ra loại nấm men có khả năng sử dụng đường tốt nhất nhằm thiết lập đường cong sinh trưởng.
1 Chuẩn bị môi trường SAB lỏng có độ brix là 19
2 cho 4 loại nấm men đã được phân lập tới thuần vào các ống nghiệm (mỗi loại bố trí vào ít nhất 5 ống nghiệm để tiến hành đo mỗi ngày một ống) Các điều kiện giữ như nhau ở mỗi loại.
3 tiến hành đo độ brix trong vòng 5 ngày, loại nào có độ brix giảm nhiều hơn chứng tỏ giống nấm men đó có khả năng sử dụng đường tốt hơn. Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện.
Nhược điểm: Không tránh khỏi sai số do lượng men đưa vào ban đầu chưa hẳn là như nhau.
TN2: Khả năng sinh CO 2
Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát khả năng sinh CO2 của các loại nấm men đã được phân lập Qua đó, chúng tôi sẽ chọn ra loại nấm men có khả năng sinh CO2 tốt nhất để thiết lập đường cong sinh trưởng.
Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa môi trường Sabouraud lỏng và thêm vào mỗi ống nghiệm 4 con men đã được phân lập Để ống nghiệm ở nhiệt độ thường và quan sát trong vòng 72 giờ Đánh giá độ đục của môi trường và chiều cao cột khí trong ống Durham để xác định sự phát triển của vi sinh vật.
4.3 Xác Định Số Lượng Tế Bào Nấm Men Và Xây Dựng Đường Cong Sinh Trưởng Mục đích: kiểm tra lại và đánh giá khả năng sinh trưởng của con nấm men sau tuyển chọn
Phương pháp: đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.
Sau khi lựa chọn được chủng men phù hợp, chúng ta tiến hành nuôi cấy trong môi trường Hansen lỏng nhằm mục đích đếm số lượng tế bào nấm men và vẽ đường cong sinh trưởng.
Cho 5ml nước muối sinh lý vô trùng vào ống nghiệm chứa mẫu giống đã chọn Lắc đều hỗn hợp và dùng pipet hút 1ml mẫu đã lắc cho vào 9ml môi trường Hansen, sau đó tiến hành ủ.
Đếm số lượng tế bào nấm men ngay tại thời điểm ban đầu (0h) và tiếp tục thực hiện việc đếm sau mỗi 4 tiếng Lưu ý rằng thao tác này cần được thực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn để đảm bảo an toàn.
Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu.
Đậy buồng đếm bằng lame
KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
KẾT QUẢ PHÂN LẬP NẤM MEN
Nấm men Khuẩn lạc Tế bào
Hình 3.1.1 kl tròn, đục, vun, d= 0.75mm Hình 3.1.2 tb hình cầu
Hình 3.1.3 kl tròn, đục nhiều, vun, hơi bóng, d=2mm Hình 3.1.4 tb hình oval
Hình 3.1.5 kl tròn, đục, không vun, d=1.5mm
Hình 3.1.6 tb hình elip đầu nhọn
Hình 3.1.7 kl tròn, đục, vun chính giữa, d=2mm Hình 3.1.8 tb hình elip
Bảng 1.1: phân lập nấm men
KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN NẤM MEN
2.1 Khả Năng Sử Dụng Đường (PHỤ LỤC 1)
Tiêu chí khả năng sử dụng đường của nấm men được đo bằng độ brix (độ giảm độ brix lớn nhất )
Bảng kết quả độ brix đo được sau 4 ngày:
Ngày Y1 Y2 Y3 Y4 Độ brix ban đầu 19 aEF 19 aED 19 aF 19 aD
Bảng 2.2: Kết Quả Thay Đổi Độ Brix Đã Được Thống Kê
Nhóm ký tự: a, b, c thuộc nhóm đồng nhất của yếu tố thời gian
Nhóm ký tự: E, D, F thuộc nhóm đồng nhất của yếu tố nấm men
Dựa vào bảng ta xử lý số liệu thống kê trên phân mềm STATGRAPHICS phiên bản 15.1.02, kiểu phân tích phương sai một yếu tố khối ta được:
Nấm men Y4 là nấm men sử dụng lượng đường nhiều nhất và sau bốn ngày khả năng sử dụng nó hầu như không thay đổi ,ổn đinh nhất
Khả năng sử dụng đường trong môi trường của nấm men được đánh giá thông qua sự làm đục môi trường và sự sinh khí CO2 Kết quả quan sát sau 3 ngày cho thấy sự phát triển rõ rệt của nấm men trong việc chuyển hóa đường.
Nấm men sau khi cấy 24h hình ảnh quan sát được Kết quả quan sát được tương ứng
Y1 Môi trường trong, khí chiếm 7/10 ống Durham.
Y2 Môi trường trong, khí chiếm 3/10 ống Durham.
Y3 Môi trường trong suốt, bọt khí ít, chiếm gần 1/10 ống Durham.
Y4 Môi trường hơi đục,bọt khí chiếm
Bảng 2.3: Kết quả khả năng sinh CO 2 sau 24h của nấm men
Nấm men sau khi cấy 48h
Hình ảnh nấm men quan sát Kết quả quan sát được
Y1 Môi trường đục vừa, bọt khí chiếm
Môi trường hơi đục, có lắng cặn ở đáy ống nghiệm.
Bọt khí chiếm 6/10 ống Durham.
Y3 Môi trường đục nhiều, bọt khí chiếm 1/10 ống Durham.
Môi trường đục nhiều nhất, có lắng cặn ở đáy ống nghiệm.
Bọt khí chiếm 9/10 ống nghiệm.
Bảng 2.4: Kết quả khả năng sinh CO 2 sau 48h của nấm men
Nấm men sau khi cấy 72h
Hình ảnh nấm men quan sát được Kết quả quan sát được
Y1 Môi trường trong suốt, nhạt màu, có ít cặn, khí đầy ống Durham.
Y2 Môi trường trong suốt, nhạt màu, có nhiều cặn ở đáy ống, khí 9/10 ống Durham.
Y3 Môi trường đục, hơi ngả xanh, bọt khí 1/10 ống Durham.
Môi trường đục,có cặn, nửa trên đục nhiều màu đậm, nửa dưới đục nhưng nhạt hơn, khí đầy ống Durham.
Bảng 2.5:Kết quả khẩ năng sinh CO 2 sau 48h của nấm men
Y1 Y2 Y3 Y4 Độ đục của môi trường SAB lỏng
Khí CO2 sinh ra trong ống Durham
Bảng 2.6: bảng đánh giá khả năng sử dụng đường và sinh CO 2 đã được mã hóa khi quan sát
Dấu “-” thể hiện môi trường không đục/ không sinh CO2
Dấu “+” thể hiện môi trường đục/ sinh CO2
Tương ứng cho 3 dấu -/+ liên tiếp cho 3 ngày liên tiếp
Kết luận, nấm men Y4 thể hiện khả năng sinh hơi và làm đục môi trường tốt nhất trong quá trình quan sát, do đó, nấm men Y4 được lựa chọn để xây dựng đường con sinh trưởng hiệu quả.
KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG
bảng thông kê số lượng tế bào nấm men sau 48h
Thời gian Số lượng ( *10^4) tb/ml
Bảng 3.7: Thống kê số lượng tế bào nấm men Y4 sau 48h
Từ bảng ta có Đường cong sinh trưởng của nấm men Y4 được xây dựng như sau: