Định lượng tpc bằng phương pháp Đếm khuẩn lạc, màng petrifilm

+ Môi trường agar không chọn lọc được đun chảy và làm nguội đến 45±1°C được đổ vào trong đĩa, lắc đều+ Ủ đĩa trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 30°C trong 72 ± 6 giờ + Tính số lượng vi

CHỦ ĐỀ :Định Lượng TPC Bằng Phương Pháp Đếm Khuẩn Lạc, Màng Petrifilm

Nhóm 1

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HỌC PHẦN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Phạm Vũ Kim Ngân 2022222956 Đặng Thị Thu Ngân 2022222955 Nguyễn Hoàng Thảo Nguyên 2022223171 Đào Minh Bảo Ngọc 2022223101

Nội dung

Môi trường & hóa chất

1.2.Quy trình tiến hành

Kết quả

3.

1

1 Môi trường Và

Hóa Chất

2

Tổng quát

Tổng số vi sinh vật hiếu khí(Total Plate Count_TPC) là vi sinh vật phát

triển và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử.

Tổng số vi sinh vật hiếu khí còn có thể chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực phẩm.

Một khuẩn lạc là một sinh khối phát triển từ một tế bào hoặc một bào tử hiện diện trong mẫu.

3

4

+ Môi trường agar không chọn lọc được đun chảy và làm nguội đến 45±1°C được đổ vào trong đĩa, lắc đều

+ Ủ đĩa trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 30°C trong 72 ± 6 giờ

+ Tính số lượng vi sinh trên mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu được trên đĩa đã chọn

5

Môi trường – Hóa

Chất

Môi trường – Hóa chất Mục đích

Saline Pepton Water (SPW)Pha loãng mẫu Giảm mật độ vi sinh

vật

Plate count agar (PCA)Nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí

Đ Đếm tổng lượng vi khuẩn có trên một ml mẫu (CFU).

HCl 10%

Chỉnh pH Đảm bảo nồng độ ion H+ phù hợp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật

NaOH 10%

6

Môi trường PCA

 Casein peptone: cung cấp amino acids, nitrogen,

carbon, vitamins, và minerals giúp vi sinh vật phát triển

 Yeast extract (cao nấm men): chủ yếu cung cấp

B-complex vitamins tạo điều kiện phát triển tốt cho nhiều loại vi sinh vật  

 Glucose: là nguồn carbohydrate cho quá trình

lên men và cung cấp năng lượng cho vi sinh vật  Agar: là nhân tố là đông đặc môi trường.

 Nước: Tạo môi trường lỏng và hòa tan các thành

phần khác

7

2 Quy trình tiến

hành

8

Phạm Vi Áp Dụng

Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4884 : 2005 (ISO 4833 : 2003) được áp dụng để đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí ở 30°C trong 72 giờ cho tất cả các loại thực phẩm

9

1 Chuẩn bị mẫu

• Cân 10,0g hay hút 10,0 ml mẫu vào bình tam giác đã có

90,0 ml SPW• Nếu là mẫu rắn thì đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu

(stomacher) hay xay mẫu trong cối vô trùng tối đa 2,5 phút

• Lắc đều mẫu trong bình tam giác ít nhất 2 phút ta được

mẫu có độ pha loãng

MỤC ĐÍCH: Đồng nhất mẫu

11

2 Pha loãng mẫu

• Dùng micropipet với đầu tip vô trùng (hay pipette 1

ml vô trùng) hút 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm để được các độ pha loãng tiếp theo

• Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng máy

vortex mixer hay lắc mạnh bằng tay ta được các độ pha loãng

MỤC ĐÍCH: Giảm mật độ VSV

12

3 Cấy và ủ mẫu

• Hút 0,1 ml dung dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri• Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch• Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều trên các đĩa thứ 2, thứ 3• Đặt các đĩa petri 1,2,3 trên vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp sau một thời gian

thích hợp • MỤC ĐÍCH: Giúp dịch lỏng hấp thu vào bề mặt môi trường

13

4 Đếm và chọn các KL

• Lấy kết quả từ các đĩa petri đã cấy bằng kỹ thuật hộp trải

và hộp đổ, chọn đĩa petri có số lượng 25-250 khuẩn lạc• Dùng bút lông phân mặt đáy thành 4 phần bằng nhau hay

dùng máy đếm khuẩn lạc nếu có• Mỗi một khuẩn lạc đếm được đánh dấu 1 chấm mực bằng

bút đếm khuẩn lạcMỤC ĐÍCH: Nhận biết nấm men, nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp

14

Màu khuẩn lạc

Khuẩn lạc có màu trắng, trơn, bóng, nhẵn, mọc riêng lẻ trên bề mặt đĩa.

15

Petrifilm là gì?

• Đĩa petrifilm là đĩa chứa môi trường làm sẵn

thay thế cho môi trường agar truyền thống Mỗi đĩa gồm chất gel hoà tan trong nước, dinh dưỡng và chất chỉ thị được làm khô và cố định trên lớp film mỏng

16

Ưu & nhược điểm màng

petrifilm

• Dễ thao tác• Kết quả nhất quán• Thời gian sử dụng lâu• Không cần hấp khử trùng

môi trường• Nhanh, loại bỏ các bước

khử trùng MT• Thết kế nhỏ gọn, tiết kiệm

không gian ủ và bảo quản

• Độ chính xác không cao• Miếng petrifilm có khả năng

làm nhòe khuẩn lạc khi mọc to• Phải lưu trữ lạnh

• Có khả năng lây nhiễm chéo

giữa các đĩa petrifilm trong quá trình nuôi cấy

Nhược

17

1 Chuẩn bị mẫu

• Cân chính xác 10,0g đối với mẫu rắn hoặc 10,0 ml đối với mẫu

lỏng cho vào bình tam giác• Cho dung dịch pha loãng SPW 90 ml vô trùng vào bình tam

giác chứa mẫu• Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều

bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng SPW trong 2-3 phútMỤC ĐÍCH: Đồng nhất mẫu

19

2 Pha loãng mẫu

• Dùng pipetman (micropipet) với đầu tip vô trùng

(hay pipette 1 ml vô trùng) hút 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm để được các độ pha loãng tiếp theo

• Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng máy

vortex mixer hay lắc mạnh bằng tay ta được các độ pha loãng

MỤC ĐÍCH: Giảm mật độ VSV

20

3 Cấy và ủ mẫu

• Hút 0,1 ml dung dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri• Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch• Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều cho các đĩa thứ 2, thứ 3• Đặt các đĩa petri 1,2,3 trên vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp sau một thời gian

thích hợp • MỤC ĐÍCH: Giúp dịch lỏng hấp thu vào bề mặt môi trường

21

4 Đếm khuẩn lạc

Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của độ pha loãng kế tiếp, thì tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm của nấm men, nấm mốc

Tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt giữa các tế bào nấm men hoặc nấm mốc từ các khuẩn lạc

MỤC ĐÍCH: Nhận biết nấm men, nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp

22

Màu của phản ứng trên môi trường PCA

-Màu của các phản ứng trên môi trường PCA thường là màu trắng hoặc màu vàng, phụ thuộc vào loại vi khuẩn phát triển trên môi trường Vi khuẩn thường tạo ra cách đếm khuẩn lạc có màu khác

nhau khi phát triển trên môi trường PCA, giúp người thực hiện dễ dàng đếm và định lượng TPC trong mẫu

-Màu của các phản ứng trên môi trường PCA không chỉ giúp xác định số lượng vi khuẩn mà còn giúp

phân biệt loại vi khuẩn phát triển trong mẫu

23

3 Kết quả

24

Kết quả

Tính số lượng khuẩn lạc vi sinh vật có mặt trong mẫu thử theo trung bình từ hai độ pha loãng liên tiếp:

Trong đó:N: số khuẩn lạc trên 1ml( 1g) mẫuΣC: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2 độ pha loãng liên tiếp và trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 khuẩn lạc

V: thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa(ml)n1: số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lạin2 : số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lạid: độ pha loãng đầu tiên được giữ lại

25

Trường hợp có hai đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc

Trong đó:N: số khuẩn lạc trên 1 ml(1g) mẫuΣC: tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa V: thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa(ml)n: số đĩa được giữ lại ( trong trường hợp này n=2)d: độ pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc của độ pha loãng thứ nhất đã được cấy hoặc được giữ lại( d=1 khi sản phẩm ở dạng lỏng)

26

V x [n1+(0,1x n2)]x d 1x [2+(0,1 x 2)]x 10 = -3 =170454

Làm tròn kết quả 1,7 x CFU/g ( hoặc CFU/ml)

27

You