ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong định lượng vi sinh vật

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

TRONG ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬTGVHD: TS Nguyễn Tuấn Anh

PGS.TS Nguyễn Thị Nga

Học viên: Hồ Cao Quốc Thịnh – 2326080032

Nguyễn Đoàn Tường Uyên – 2326080046

Học phần: Thực hành Y sinh học di truyền

VIÊM GAN SIÊU VI B VIÊM GAN SIÊU VI C

TỔNG QUAN

ĐỊNH NGHĨA VI SINH VẬT

Vi sinh vật là những vi sinh vật nhỏ bé chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi - đó là những sinh vật đơn bào (protist), bao gồm: vi khuẩn, động vật nguyên sinh và vi nấm (bacteria, protozoa, fungi)

• Vi khuẩn: những đơn bào không có màng nhân • Virus: không có cấu trúc tế bào (dưới tế bào)

• Prion: một loại mầm bệnh mới đơn giản hơn virus

• Rickettsia, Chlamydia và Mycoplasma: những vi

khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc

VI KHUẨN

• Vi khuẩn là những sinh vật nhân sơ đơn bào có kích thước cực kỳ nhỏ Là nhóm hiện diện đông đảo nhất trong sinh giới

• Vi khuẩn là những vi sinh vật có chuỗi ADN xoắn kép (ngoại trừ

Mycoplasma) và vách tế bào Hầu

hết vi khuẩn sống ngoại bào,

nhưng một số lại ưu tiên cư trú và nhân lên trong nội bào Nhiều vi khuẩn hiện diện ở người dưới dạng hệ vi sinh vật bình thường, thường có số lượng lớn và ở nhiều khu vực (ví dụ, trong đường tiêu hóa và da)

CẤU TẠO

• Đặc điểm cơ bản nhất để phân biệt virus với vi khuẩn là virus chỉ chứa một trong hai loại acid nucleic (ADN hoặc ARN), virus sinh sản tăng lên theo cấp số nhân, còn vi khuẩn sinh sản theo kiểu phân đôi.

• Virus có cấu trúc rất đơn giản, không có enzym hô hấp và enzym chuyển hóa, vì vậy virus bắt buộc phải ký sinh trong tế bào cảm thụ.

• Virus có nhiều hình thể khác nhau Hình thể mỗi loại rất khác nhau nhưng luôn ổn định đối với từng loại Tùy theo cách sắp xếp của acid nucleic và capsid chia làm hai loại đối xứng:

• Đối xứng hình xoắn ốc: acid nucleic và các capsomer được sắp xếp dọc theo hình lò xo đều hay không đều.

• Đối xứng hình khối: khi các capsomer được sắp xếp thành các hình khối cầu đa diện.

Cấu trúc cơ bản của virus bao gồm hai thành phần chính mà mỗi virus đều phải có:

• Acid nucleic (AN):

Mỗi loại virus đều phải có một trong hai acid nucleic: ARN (acid ribonucleic) hoặc ADN (acid deoxyribonucleic) Những loại có cấu trúc ADN phần lớn đều mang ADN sợi kép Ngược lại, loại mang ARN thì chủ yếu ở dạng sợi đơn.

• Thành phần capsid:

Capsid là cấu trúc bao quanh acid nucleic Bản chất hóa học của capsid là protein Capsid được tạo bởi nhiều đơn vị capsid bao gồm các phân tử protein có sắp xếp đặc trưng cho từng loài Các đơn vị capsid đó được gọi là các capsomer.

KỸ THUẬT PCR

• PCR được viết tắt từ Polymerase Chain Reaction nghĩa là chuỗi phản ứng polymerase hay phản ứng khuếch đại gene

• Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, không cần sự hiện diện của tế bào.• Phản ứng PCR cho phép khuyếch đại

một đoạn DNA nằm giữa 2 mồi chuyên biệt, nhờ DNA polymerase

• Giai đoạn bắt cặp (hoặc giai đoạn

gắn mồi): Nhiệt độ được hạ xuống

• Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase)

enzyme này có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 72°C.

• 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/

dGTP/dCTP là nguyên liệu để tổng hợp ra các bản sao DNA.

• DNA chứa trình tự mục tiêu (Template):

Thông thường trong xét nghiệm thì đây là DNA thu nhận từ mẫu cần xét nghiệm.

• Cặp mồi đặc hiệu (Primer): Đây là các

đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20

nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản.

• Cation Mg(2+) đây là co-factor quan trọng

để Taq polymerase hoạt động hiệu quả.

• Dung dịch đệm Tris-KCI (PCR Buffer):

Cung cấp môi trường thuận lợi cho phản ứng nhân bản diễn ra.

Ứng dụng

• Phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C,

Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1 ), các vi khuẩn (Chlamydia,

Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum ).

• Phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường tình dục

• Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước

• Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như Staphylococcus aureus – MRSA, các vi khuẩn

sinh ESBL hoặc betalactamase, carbapenemase ).

• Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN

• Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư

• Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)

REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

• Kỹ thuật sinh học phân tử giúp định lượng DNA và RNA• Theo dõi sự tiến triển của phản ứng PCR theo từng chu kỳ• Nguyên tắc so sánh từng chu kỳ với điểm đầu tiên lượng sản

phẩm PCR được nhận ra nhờ tín hiệu phát huỳnh quang• Số lượng bản copy càng tăng dẫn đến sự gia tăng tín hiệu• huỳnh quang

• Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan cũng chỉ có 2 giai đoạn:1 Biến tính ở 94 – 95*C trong 15 – 30 giây.

2 Bắt cặp và kéo dài ở 60*C trong 30 – 60 giây.

- Real-time PCR thường được sử dụng để định lượng mức độ gen cụ thể

- Nó cũng được sử dụng trong việc phát hiện, định lượng vi khuẩn, virus, và giảm sự thất bại của quy trình so với PCR truyền thống.

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SHPT ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

• Định lượng vi khuẩn: Đánh giá tình trạng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp PCR và qPCR Điều này giúp theo dõi sự thay đổi trong số lượng vi khuẩn và theo dõi, tiên lượng bệnh.

• Đánh giá nhiễm trùng: Kiểm tra nhiễm trùng virus trong mẫu sinh phẩm để xác định sự hiện diện và định lượng virus trong các loại mẫu như máu, dịch tiết, hoặc mẫu dịch nhầy.

• Đánh giá sự khử khuẩn: Kiểm tra hiệu quả khử khuẩn, khi áp dụng các biện pháp tiệt trùng, khử khuẩn như sử dụng chất khử trùng.

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SHPT ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

• Đánh giá microbiota ruột: Xác định thành phần vi sinh vật trong hệ thống ruột, PCR và qPCR được sử dụng để đánh giá thành phần của microbiota ruột, giúp hiểu rõ hơn về vai trò của các vi khuẩn trong sức khỏe và bệnh tật.

• Định lượng MicroRNA (miRNA): Kiểm tra biểu hiện gen và điều chỉnh gen, PCR có thể được sử dụng để định lượng microRNA, loại RNA nhỏ thường liên quan đến sự điều chỉnh gen Điều này có ứng dụng trong nghiên cứu về bệnh lý và phát triển.

VIRUS SARS-COV-2

Các bước thực hiện kỹ thuật

Định nghĩa và nguyên lý:

• Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt với tín hiệu khuếch đại được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt, nhờ đó người thực hiện có thể theo dõi được kết quả PCR

• One-step RT-PCR là phản ứng kết hợp phiên mã ngược và PCR trong cùng một tube xét nghiệm

• Giá trị chu kỳ ngưỡng Ct (Threshold cycle value): số chu kỳ nơi đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt quá tín hiệu nền (baseline).

Các bước thực hiện kỹ thuật

Định nghĩa và nguyên lý:

• SARS-CoV-2 là vi rút RNA, sợi đơn,

dương, có vỏ Bộ gen của SARS-CoV-2 có độ dài khoảng 25-32 kilobase gồm các vùng: vùng 5’UTR, khung đọc mở, vùng 3’UTR và cuối cùng là đuôi-poly (A).

• Hai phần ba đầu tiên của bộ

gen mã hóa cho các protein phi cấu trúc từ 2 khung mở đọc

ORF1a và ORF1b Một phần ba cuối của bộ gen mã hóa cho các protein cấu trúc là protein (S), protein màng (M), protein vỏ (E) và nucleocapsid (N) protein.

Mẫu bệnh phẩm:

• Bệnh phẩm đường hô hấp trên:Dịch tỵ hầu và dịch ngoáy họng.Dịch súc họng.

• Bệnh phẩm đường hô hấp dưới:Đờm

Dịch phế nang, dịch nội khí quản, dịch màng phổi

Tổ chức phổi, phế quản, phế nang (khi có chỉ định).

• Mẫu máu: 3-5 ml máu tĩnh mạch

Các bước xử lý mẫu:Thực hiện phản ứng Real time – PCR:

Master mix 15Mẫu acid

nucleic/ Chứng dương

5Tổng thể tích

Thành phần

Master mix 15Mẫu acid

nucleic/ Chứng dương

5Tổng thể tích

Vị trí thành phần PCR

Đúng Không đúng

Chạy mẫu trên máy Realtime PCR AbCyclerQ:

• Đặt các tube PCR đã chuẩn bị mẫu vào vị trí trên block nhiệt của buồng phản ứng PCR Cài đặt vị trí mẫu và chứng đúng với vị trí đã đặt trên máy Realtime PCR

• Cài đặt chế độ gia nhiệt (Temperature setting)

• Cài đặt thông số huỳnh quang (Flourescence setting)• Bắt đầu chạy.

Kênh màu huỳnh quang

 Kết quả kiểm tra chất lượng được đánh giá “không đạt” khi:

Chứng âm có đường biểu diễn dương tính: nhiễm chéo khi thực hiện xét

nghiệm, môi trường khu vực xét nghiệm bị nhiễm virus / amplicons…

Chứng âm và chứng nội đều có đường biểu diễn âm tính: không thu được RNA do kỹ thuật tách chiết, hóa chất/ sinh phẩm không đạt, phản ứng PCR bị ức chế…

Kết quả xét nghiệm

Kết quả

Giải thích tự động

Âm tính

Dương tính Covid CT 19

BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B

• Viêm gan B là loại bệnh lý về gan thường gặp nhất trên thế giới

• Bệnh này là do virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV) tấn công và làm tổn thương

• Virus này lây truyền qua máu, quan hệ tình dục không an toàn, dùng chung hoặc dùng lại kim tiêm, và từ người mẹ bị nhiễm bệnh sang bé mới sinh trong thai kỳ hoặc trong khi sinh • Hầu hết người lớn bị nhiễm bệnh đều có thể

loại trừ siêu vi khuẩn viêm gan B dễ dàng Tuy nhiên, một số người lớn và hầu hết trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bị nhiễm bệnh không thể loại trừ siêu vi khuẩn này và sẽ bị nhiễm bệnh mạn tính.

• HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có cấu trúc DNA

• Ở giai đoạn nhân đôi, HBV tồn tại trong huyết thanh dưới 3 dạng cấu trúc là hạt tử siêu vi hay virion hoàn chỉnh, cấu trúc hình cầu và cấu trúc hình ống Cấu trúc hình cầu và hình ống là phần kháng

nguyên bề mặt của HBV được tạo ra dư thừa trong bào tương của tế bào gan.• Hạt tử virus hay virion bao gồm lớp vỏ

bọc bên ngoài lipoprotein chứa 3 dạng kháng nguyên bề mặt ( HBsAg) là pre-S1, Pre-S2, S và phần lõi bên trong là casid bao gồm protein lõi (core protein) bao bọc DNA và DNA polymerase.

CẤU TRÚC HBV

CƠ CHẾ GÂY BỆNH

(1) Phần vỏ của HBV bám vào màng tế bào gan nhờ sự nhận biết của thụ thể trên màng tế bào gan, sau đó siêu vi hòa nhập với protein màng của tế bào gan và xâm nhập vào tế bào gan.

(2) Sau khi vào tế bào chất, chỉ có phần lõi chứa DNA và men DNA

polymerase đi vào nhân tế bào gan.(3) Tại nhân tế bào gan, DNA được sửa chữa để tạo thành DNA vòng khép kín (covalently-close circular DNA = cccDNA).

(4) cccDNA được xem là khuôn để sao chép RNA của siêu vi.

(5) mRNA được giải mã tạo thành các protein của siêu vi (protein lõi, polymerase, protein X, protein bề mặt siêu vi) trong tế bào chất.

(6) Protein lõi (core protein) bao bọc RNA tiền genome ( RNA pregenome ) và men polymerase tạo thành capsid (7).

(8,9) RNA tiền genome sẽ sao chép ngược thành DNA.

(10) Capsid chứa DNA mới được tổng hợp này có thể phóng thích DNA vào nhân tế bào gan để tạo thành cccDNA hay (11) sẽ được ghép thêm phần vỏ bọc trong mạng lưới nội bào

(endoplasmic reticulum = ER) và thể Golgi sau đó phóng thích ra khỏi tế bào gan dưới dạng virion hoàn chỉnh.

MỘT SỐ CHỈ SỐ QUAN TRỌNG TRONG VIÊM GAN SIÊU VI B

• DNA: Là phần virus hoàn chỉnh (gồm nhân và vỏ) của virus viêm gan B Xét nghiệm

HBV-DNA cho biết số lượng virus viêm gan B tồn tại trong máu HBV-HBV-DNA phản ánh sự sao chép và nhân lên của virus trong cơ thể người bệnh.

• HBsAg: Là kháng nguyên bề mặt virus HBV Để kết luận có bị nhiễm virus viêm gan B hay không

phụ thuộc vào xét nghiệm HBsAg Nếu HBsAg (+) nghĩa là đã nhiễm virus viêm gan B, nếu HBsAg (-) là không bị nhiễm virus viêm gan B.

• HBeAg: là kháng nguyên nội sinh của virus

viêm gan B Sự có mặt của HBeAg (+) chứng tỏ là bạn đang có nồng độ virus trong máu cao và rất dễ lây truyền cho người khác Nếu HBeAg âm tính (HBeAg (-)) thì nồng độ virus trong máu thấp hoặc virus đang trong giai đoạn nằm yên, không nhân bản sao chép và nguy cơ lây nhiễm cho người khác thấp

• Các chỉ số men gan ALT, AST: cho biết mức

độ tổn thương gan do virus gây ra.

KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

Nguyên lý hoạt động:

Dựa trên hai bước chính:

• Xử lý mẫu huyết thanh để thu được DNA của HBV

• Nhân bản DNA HBV bằng cặp mồi đặc hiệu và định lượng sản phẩm nhân bản dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu được

Mẫu bệnh phẩm thu thập:

• Mẫu máu toàn phần được ly tâm phân đoạn để thu lấy huyết thanh

• DNA bộ gene của các phần tử virus HBV có trong huyết thanh được thu nhận bằng phương pháp phenol-chloroform

Bảo quản mẫu:

• Nếu chưa tách huyết thanh, máu toàn phần phải được lưu ở 2 – 25*C không quá 1 ngày Chuyển toàn bộ phần huyết thanh thu được sang eppendorf 1,5 ml sạch.

• Huyết thanh được vận chuyển trong điều kiện 2 – 8*C hoặc đông lạnh ở -20*C hoặc lạnh sâu hơn.• Huyết thanh có thể được giữ ở 2-8oC trong 3 ngày hay đông lạnh ở -20*C hoặc lạnh sâu hơn trong 6

tuần Lượng huyết thanh lưu trữ nên khoảng 800 – 900µl.

• Tách chiết DNA

Bước 1 Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu và thêm 1 eppendorf cho Chứng âm tách chiết

Bật bồn ủ nhiệt khô ở 600C Bước 2 Vortex kỹ ống DNA IC

Cho vào mỗi eppendorf chính xác 10µl dung dịch DNA-IC Bước 3 Cho tiếp vào mỗi eppendorf 900µl KTS1

Lưu ý: cần trộn đều dung dịch trước khi sử dụng

Bước 4 Cho 100µl huyết thanh vào mỗi ống, hoặc 100µl nước cất 2 lần hoặc dung dịch KTS5 đối với Chứng âm tách chiết

Vortex mạnh eppendorf trong ít nhất 5 giây cho tan hoàn toàn protein biến tính

Để yên 10 phút

Bước 5 Cho 200µl KTS2 Lắc trộn thật kỹ

Bước 6 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 6 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Bước 7 Chuyển 600µl dịch nổi sang các eppendorf 1,5 ml mới

Lưu ý: chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch hơi đục (protein biến tính) ở giữa hai pha nước (trên) và chloroform (dưới)

Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh

Bước 15 Làm khô cặn trong 10 phút ở 60oC trong bồn ủ nhiệt khô Bước 16 Hòa cặn trong 50µl KTS5

Nếu không tiến hành phản ứng PCR ngay trong ngày, bảo quản DNA tách chiết ở 2-8oC trong vòng 2-3 ngày, hoặc ở -20oC trong vòng 6 tháng

Thực hiện phản ứng PCR

1 Rã đông các ống MasterMix, PrimobeMix và 3 ống Chứng dương hoàn toàn bằng cách đặt ở nhiệt độ phòng trong tối đa 30 phút Sau đó ly tâm nhẹ (3.000 – 4.000 rpm) và đặt vào rack lạnh.

2 Vortex mạnh ống PrimobeMix và hút ra 200µl chuyển vào ống MasterMix.

3 Trộn đều hỗn hợp có trong ống MasterMix bằng micropipette Hút ra lần lượt 40µl hỗn hợp cho vào từng eppendorf 0,2 ml đã được ghi sẵn tên mẫu.

4 Vortex nhẹ từng dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết, 3 dung dịch Chứng dương.

5 Cho 10µl dung dịch DNA xét nghiệm, Chứng âm tách chiết, 3 dung dịch Chứng dương hoặc nước cất 2 lần lần lượt vào các ống eppendorf 0,2 ml riêng lẻ đã chuẩn bị ở Bước 3.

6 Đậy nắp các eppendorf 0,2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ (3.000 - 4.000 rpm) và đặt vào máy Real-time PCR.7 Cài đặt chương trình định dạng vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy (Plate set up), chọn màu huỳnh quang FAM (đặc trưng cho DNA của HBV) và HEX (đặc trưng cho DNA chứng nội ngoại sinh) Khai báo dạng mẫu cho các giếng chứng dương là Standard, khai báo nồng độ DNA Chứng dương trên máy khi sử dụng các mẫu chứng dương E3, E5 và E7 lần lượt là 104, 106 và 8 copies.

Lưu ý: Không cần cài đặt màu HEX cho các giếng Standard.1 chu kì 95oC – 15 phút40 chu kì 95oC – 20 giây

60oC – 1 phút (Đọc tín hiệu)

Cài đặt chương trình

ĐỌC KẾT QUẢ

Kiểm tra đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang và Ct của các mẫu theo trình tự sau:• Tín hiệu huỳnh quang của các mẫu Chứng dương: màu FAM

Chứng dương E3: Ct = 27.33 ± 1.65*Chứng dương E5: Ct = 20.67 ± 1.65*Chứng dương E7: Ct = 14.00 ± 1.65*

• Tín hiệu huỳnh quang Chứng âm PCR: không thu được tín hiệu FAM và HEX.

• Tín hiệu huỳnh quang Chứng âm tách chiết: màu FAM không xác định (N/A) và màu HEX có Ct = 27±1.65*

• Tín hiệu huỳnh quang chứng nội (màu HEX) đối tất cả các mẫu xét nghiệm: Ct = 27±1.65*

• Mẫu xét nghiệm có giá trị Ct (màu FAM) xác định được gọi là “Dương tính với DNA HBV”.

• Mẫu xét nghiệm có giá trị Ct (màu FAM) không xác định (N/A) được gọi là “Dưới ngưỡng phát hiện của quy trình (102 copies/ml)”.