Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người

BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG họ c TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN Y NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO sĩ BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM Lu ận vă n th ạc Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI, 2019 BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG họ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO c TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN vă n th ạc sĩ Cryptococcusneoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY Y BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM Mã số : 62 72 01 16 Lu ận Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học Hướng dẫn khoa học: PGS.TS Cao Trường Sinh PGS.TS Nguyễn Thị Hương Bình HÀ NỘI, 2019 i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Cao Trường Sinh, PGS.TS Nguyễn Thị Hương Bình, nhiệt tình dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! PGS.TS Trần Thanh Dương Viện trưởng Ban Giám đốc Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; PGS TS Cao Bá Lợi tồn cán Phịng Khoa học – Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn họ Ban chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật c trùng Trung ương; Y sinh học phân tử để chấn đoán số vi nấm gây bệnh nội tạng người” Mã sĩ số CK.10.32/11-15 ạc PGS.TS Nguyễn Khắc Lực, TS Đỗ Ngọc Ánh toàn thể cán bộ th môn Ký sinh trùng – Côn trùng Học viện Quân Y; Khoa Sinh học phân tử vă n Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học Quân Học viện Quân Y; Khoa Vi sinh Bệnh Viện Chợ Lu ận Rẫy; Khoa Vi sinh Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - Thành phố Hồ Chí Minh; Bệnh viện Quân y 103; Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ương tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập thực đề tài nghiên cứu GS.TS Lê Bách Quang, PGS.TS Nguyễn Mạnh Hùng, PGS TS Nguyễn Ngọc San,… có ý kiến đóng góp quý báu giúp tơi hồn thiện luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba, Mẹ, Chồng, Con, anh chị em gia đình bạn bè đồng nghiệp động viên khích lệ tơi vượt qua khó khăn hồn thành luận án Luận án bước đầu nghiệp khoa học Những lời cảm ơn chưa đủ kể hết tình cảm thật ii cao q, tình cảm theo suốt đời không thay đổi! Lu ận vă n th ạc sĩ Y họ c Trần Thị Quỳnh Liên iii LỜI CAM ĐOAN Đây nhánh đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chấn đoán số vi nấm gây bệnh nội tạng người” Mã số CK.10.32/11-15 mà trực tiếp tham gia Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các kết quả, số liệu thu luận án trung thực chưa công bố luận án khác Các bước tiến hành thực đề tài đề cương nghiên cứu, chấp hành đầy đủ quy định tiến hành nghiên cứu họ c Nếu có sai sót tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm th ạc Tác giả Y tháng năm 2019 sĩ Hà Nội, ngày Lu ận vă n Trần Thị Quỳnh Liên iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AIDS Acquired immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) Acid Deoxyribonucleic ARV Antiretroviral (Liệu pháp kháng retro vi rút) CFU Colony forming units (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CNS Central nervous system (Hệ Thần kinh Trung ương) CS Cộng CSF Cerebrospinal fluid (Dịch não tủy) DNT Dịch não tủy ELISA Enzyme-Linked immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch hấp phụ liên kết enzym) sĩ Y họ c ADN Enzym immunoassay (thử nghiệm miễn dịch enzym) FP False positive (Dương tính giả) FN False negative (Âm tính giả) GACA Giuzotia abyssinica creatinin agra (Thạch nuôi cấy GACA) GRHP Ground red hot pepper agar (Thạch ớt đỏ) HE Hematoxylin eosin (Nhuộm HE) HIV Human immunodeficinecy Virus (vi rút gây suy giảm miễn Lu ận vă n th ạc EIA dịch người) K Kappa (Hệ số tương đồng) LAT Latex agglutination assay test (Thử nghiệm đông kết latex) LFA Lateral flow assay (Thử nghiệm miễn dịch dòng chảy) MRI Magnetic resonance imaging (Chụp cộng hưởng từ) NPV Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm) PCR Polymerase chairn reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) PAS Periodic acid schiff (nhuộm PAS) v PPV Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương) RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình đoạn phân cắt giới hạn) Sensitivity (Độ nhạy) SOP Standard operating procedure (Quy trình thao tác chuẩn) Sp Specificity (Độ đặc hiệu) TN True negative (dương tính giả) TP True positive (dương tính thật) Lu ận vă n th ạc sĩ Y họ c Se vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học vai trò y học nấm Cryptococcus neoformans họ 1.1.2 Vai trò y học c 1.1.1 Đặc điểm sinh học nấm C neoformans Y 1.1.3 Tình hình viêm màng não nấm C neoformans giới Việt sĩ Nam ạc 1.2 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans 13 th 1.2.1 Chẩn đoán trực tiếp 14 vă n 1.2.2 Chẩn đoán miễn dịch học phát kháng nguyên 16 1.2.3 Chẩn đoán kỹ thuật sinh học phân tử 17 Lu ận 1.3 Nghiên cứu xây dựng chuẩn hóa sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh 23 1.3.1 Thiết kế chuẩn hóa nồng độ mồi cho phản ứng PCR 25 1.3.2 Chuẩn hóa điều kiện phản ứng PCR 27 1.3.3 Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương kỹ thuật 31 1.4 Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh 32 1.4.1.Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm chẩn đốn 32 1.4.2 So sánh tính tương đồng sinh phẩm 35 1.4.3 Đánh giá tính ổn định sinh phẩm 36 1.4.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở sinh phẩm 36 vii Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 37 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 38 2.1.3 Thời gian nghiên cứu: 39 2.2 Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng nghiên cứu 39 2.2.1 Cơ sở vật chất trang thiết bị, máy móc 39 2.2.2 Sinh phẩm hóa chất 39 họ 2.2.4 Dụng cụ, phụ tùng, vật tư tiêu hao 40 c 2.2.3 Các hóa chất, sinh phẩm khác 40 Y 2.3 Phương pháp nghiên cứu 40 sĩ 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phịng thí nghiệm 40 ạc 2.3.2 Mẫu nghiên cứu 42 th 2.3.3 Nội dung nghiên cứu 44 vă n 2.3.4 Các số nghiên cứu 50 2.3.5 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 51 Lu ận 2.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu sai số nghiên cứu 63 2.5 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 63 2.6 Đạo đức nghiên cứu 66 2.7 Nhiễm sai số cách hạn chế 66 2.8 Hạn chế đề tài 67 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 68 3.1 Kết xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 68 3.1.1 Kết giám định loài vi nấm C neoformans để sử dụng cho nghiên cứu 68 viii 3.1.2 Kết thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 71 3.1.3 Kết xác định điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 78 3.1.4 Kết chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 92 3.2 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não tủy 97 họ phịng thí nghiệm 97 c 3.2.1 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định sinh phẩm Y 3.2.2 Kết đánh giá sinh phẩm mẫu DNT lâm sàng 102 sĩ 3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở kiểm định chất lượng sinh phẩm chế ạc tạo 107 th Chương BÀN LUẬN 109 vă n 4.1 Về kết xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 109 Lu ận 4.1.1 Bàn luận kết giám định loài vi nấm C neoformans để sử dụng cho nghiên cứu xây dựng quy trình 109 4.1.2 Về kết thiết kế/lựa chọn mồi xác định điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 112 4.1.3 Kết chế tạo sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans 122 4.2 Bàn luận độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não tủy 124 4.2.1 Bàn luận kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định sinh phẩm phịng thí nghiệm 125