Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm

- 01 chủng nấm C neoformanschuẩn ATCC (American Type Culture

Collection - Hệ thống Chủng chuẩn của Mỹ) mã số ATCC® 90113

Hình 2.1 Chủng chuẩn nấm C neoformans ATCC @ 90113

(Chủng chuẩn phục vụ cho nghiên cứu này)

- 07 chủng C neoformans nuôi cấy từ dịch não tủy bệnh nhân người Việt Nam có ký hiệu là Vn_N17, Vn_N41, Vn_N57, VN_N58, Vn_N61, Vn_N117,

- Các chủng vi nấm thuộc giống Candida gây bệnh thường gặp như: C albicans, C tropicalis, C krusei, C parapsilosis, C glabrata

- Các chủng vi khuẩn gây bệnh ở người: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Streptococcus suis,

Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa

2.1.1.2 Đối tượng nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm

Bộ sinh phẩm nested PCR #A011- 02 sản phẩm của mục tiêu 1;

- 01 chủng nấm C neoformanschuẩn mã số ATCC @ 90113;

Luận văn thạc sĩ Y học

Tại Bệnh viện Quân y 103, 30 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não đã được thu thập và kiểm tra Tất cả các mẫu này đều không nhiễm nấm C neoformans, được xác nhận thông qua phương pháp nuôi cấy và bộ sinh phẩm PCR C neoformans.

EP-42720 của hãng Norgen Trong đó:

+ 20 mẫu dịch não tủy được gây nhiễm nấm C neoformans giả định

(mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm được thêm tế bào nấm C neoformans vào) – được sử dụng như mẫu dương

+10 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm – sử dụng như chứng âm

- 51 chủng nấm C neoformans được phân lập từ dịch não tủy của bệnh nhân ở

Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch đã được xác nhận thông qua phương pháp nuôi cấy, soi xác định hình thái bằng nhuộm mực tàu, và định loài bằng sinh học phân tử.

- 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng viêm màng não thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch

- Địa điểm thu thập mẫu bệnh phẩm dịch não tủy, nuôi cấy phân lập nấm

+ Khoa Vi sinh - Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch;

+ Khoa Vi sinh - Bệnh viện Chợ Rẫy;

+Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

- Địa điểm xây dựng quy trình, chế tạo bộ sinh phẩm

+ Labo Trung tâm nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y;

+ Labo nấm Bộ môn Ký sinh trùng côn trùng – Học viện Quân y

- Địa điểm đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm

+ Khoa Vi sinh - Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch;

+ Viện kiểm định Quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế

2.1.3 Thời gian nghiên cứu: từ 3/2014 – 10/2017

Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Nguyên vật liệu và trang thiết bị bao gồm các thiết bị khoa học, sinh phẩm, hóa chất, vật liệu tiêu hao và môi trường cơ bản, tất cả đều cần thiết cho công việc nuôi cấy tế bào, phân lập nấm và thực hiện các thử nghiệm sinh học phân tử.

2.2.1 Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc

Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2 được trang bị đầy đủ các khu vực cho việc nuôi cấy tế bào, xử lý bệnh phẩm, cũng như các quy trình trước, trong và sau PCR, bao gồm cả máy ly tâm lạnh.

Mikro 22R (Hettech, Đức); Tủ an toàn sinh học (Nuaire, Hàn Quốc); Tủ lạnh âm sâu (Esco, Singgapore; Sanyo, Nhật); Máy PCR (Eppendorf, Đức; ABI

9700, Mỹ); Máy soi và chụp gel (Biorad, Mỹ); Bộ diện di (Applo CLP 300,

Mỹ); Micropipette (Eppendorf, Đức); Máy vortex (Gyromax 737R, Mỹ); Máy ủ nhiệt có lắc (Eppendorf); lò vi sóng (Sharp, Trung Quốc)…

+ Các hóa chất cơ bản: Cồn Ethanol 70 0 , ETDA, đường Glucose, dung dịch

NaCl 0,9%, dung dịch mực tàu;

+ Môi trường tăng sinh nấm: Sabouraud + Chloramphenicol;

+ Enzyme phá màng lyticase (Sigma);

+ Bộ kít tách chiết ADN QiAamp® DNA mini kit của hãng Qiagen (Code

+ Bộ kít tách chiết ADN của nấm/nấm men Fungi/Yeast Genomic DNA

Isolation Kit (Cat # 27300, Norgen Biotek Corp)

+ Hóa chất điện di: gel agarose (Serva, Đức), dung dịch TBE 10X (Corning,

Mỹ), thang DNA chuẩn 100bp hoặc 50bp (Invitrogen), Loading dye

+ Các cặp mồi cho các phản ứng PCR do công ty Integrated DNA

Technologies (IDT) - Mỹ cung cấp theo yêu cầu của luận án cụ thể như sau:

Bảng 2.1 Các mồi chung khuếch đại gen đích vi nấm

Tên mồi Trình tự (5’-3’) Kich thước sản phẩm khuếch đại

ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 555bp ở

Mirhendi SH và CS (2001) ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

CN4 ATC ACC TTC CCA CTA ACA CATT 135bp của C neoformans

Guizhen L và CS (2002) CN5 GAAGGGCATGCCTGTTTGAGAG

2.2.3 Các hóa chất, sinh phẩm khác

+ Master mix cho realtime PCR (Thermofisher, #K0351);

+ Dung dịch Mg 2+ nồng độ 25mM (Lot: 00097122);

+ Nước khử ion dùng cho sinh học phân tử (Corning, Mỹ);

+ Môi trường Sabouraud agar (Code: VM241138, Merk, Đức);

+ Dung dịch Redsafe (Intron, Hàn Quốc)

2.2.4 Dụng cụ, phụ tùng, vật tư tiêu hao

+ Ống falcon 15 (Corning, Mỹ); Đầu côn có filter 10 QSP (TF140-20-

Q, Mỹ); Đầu côn có filter 200 QSP (TF140-200-Q, Mỹ); Đầu côn có filter

1000 QSP (TF140-1000-Q, Mỹ); Ống tube chạy PCR, ống tube realtime PCR

(QSP, Mỹ); Eppendorf 1.5ml (QSP, Mỹ); Khay giữ lạnh bằng nhựa; Đĩa petri nhựa; Khẩu trang Y tế (Việt Nam); Găng tay y tế không bột HD-MED

(Malaysia); Giấy, bút, sổ ghi chép…

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm

Chủngchuẩn và các chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam

Xác định các điều kiện cho PCR1 Đánh giá độ tương đồng với nuôi cấy, soi tươi và bộ sinh phẩm của Norgen

Thiết lập quy trình kỹ thuật nested –PCR chẩn đoán C neoformans

Xác định ngưỡng phát hiện trên panel chuẩn dương

Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested - PCR

Chế tạo bộ sinh phẩm nested – PCR chẩn đoán C neoformans ở quy mô phòng thí nghiệm

Xác định các điều kiện kỹ thuật nested -

Xác định các điều kiện cho PCR2

Xác định tính đặc hiệu trên các mẫu chuẩn âm Đánh độ ổn định trên mẫu C neoformans chuẩn ACTT

90113 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn và mẫu nhiễm C neoformans giả định

Kiểm định bộ sinh phẩm tại viẹn kiểm đinh QG về vắc xin và sinh phẩm y tế

- Mẫu xây dựng quy trình kỹ thuật nested – PCR chẩn đoán nhiễm nấm

+ Chủng chuẩn C neoformans mã số ATCC ® 90113: 01 chủng

+ C neoformans được phân lập từ dịch não tủy ở Bệnh viện Quân y 103 và bệnh viện Phạm Ngọc Thạch: 07 chủng

+ C albicans: 02 chủng - 01 chuẩn ATCC ® 90028 và 01chủng Việt Nam;

+ Chủng C tropicalis: 01 chủng Việt Nam;

+ Chủng C krusei: 01 chủng Việt Nam;

+ Chủng C parapsilosis: 01 chủng Việt Nam;

+ Chủng C glabrata: 01 chủng Việt Nam;

Các chủng trên đã được giải trình tự và đăng ký trên genbank năm 2017

+ Các chủng vi khuẩn gây bệnh ở người có nguồn gốc ở Việt Nam: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,

Escherichia coli, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa: Mỗi loài 01 chủng

- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

+ 20 bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 do Học viện Quân Y sản xuất;

+ 20 mẫu dịch não tủy gây nhiễm giả định;

+ 10 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm;

+ 51 chủng nấm C neoformans được phân lập từ dịch não tủy người Việt Nam ở Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ rẫy và

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương;

+ 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch

- Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm

06 bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 do Học viện Quân Y sản xuất

+ Chủng mẫu chuẩn mua từ ATCC (American Type Culture Collection - Hệ thống Chủng chuẩn của Mỹ) ký hiệu là: ATCC® 90113 (C neoformans) và

+ Phân lập mẫu C neoformans: Tại 04 bệnh viện là Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới

Trung ương, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện

Quân y 103 sẽ thu thập dịch não tủy từ tất cả bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 12 năm 2013 Các mẫu dịch não tủy này sẽ được kiểm tra ngay lập tức và nuôi cấy để xác định sự hiện diện của C neoformans Sau đó, các chủng C neoformans sẽ được xác định loài thông qua phương pháp sinh học phân tử trước khi được sử dụng để phát triển quy trình kỹ thuật nested – PCR Một số chủng vi nấm đã được giải trình tự và đăng ký vào ngân hàng gen trong các năm 2017 và 2018.

Mẫu làm chứng âm được phân lập từ các bệnh nhân tại Việt Nam, bao gồm các chủng vi khuẩn và vi nấm Việc định loại các chủng này dựa vào các dấu hiệu hình thái điển hình và được xác thực qua các nghiên cứu sinh học phân tử đã được công bố trên các tạp chí quốc tế.

Mẫu phục vụ cho thử nghiệm giả định bao gồm dịch não tủy không nhiễm nấm, thu từ bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não hoặc nghi ngờ viêm màng não không do nấm C neoformans Mẫu này đã được xác nhận bằng phương pháp soi tươi, nuôi cấy và chạy PCR sử dụng bộ sinh phẩm của Norgen tại Bệnh viện.

+ Chọn mẫu để thử nghiệm bộ sinh phẩm ở thực địa: Dịch não tủy các bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não đến khám tại bệnh viện Phạm Ngọc

Thạch, Bệnh viện Quân y 103 trong giai đoạn 10/2015 đến 10/2017

2.3.3.1 Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C neoformans

Trong nghiên cứu, chúng tôi đã thu thập 270 mẫu dịch não tủy từ bệnh nhân viêm màng não tại 04 bệnh viện ở Việt Nam Qua quá trình nuôi cấy, chúng tôi đã phân lập thành công 51 chủng nấm Cryptococcus neoformans và lựa chọn 07 chủng tiêu biểu để xây dựng quy trình nghiên cứu.

+ Tăng sinh tạo nguồn chủng từ chủng nấm C neoformans chuẩn ATCC

+ Tạo panel dịch treo nấm của chủng chuẩn và chủng phân lập ở Việt Nam;

+ Tách chiết ADN của chủng nấm C neoformans chuẩn và của các chủng phân lập ở Việt Nam;

+ Tách chiết ADN của vi khuẩn, các nấm men khác Cryptococcus neoformans, HBV, ADN người để làm ADN chuẩn âm;

+ Giám định phân tử các chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam;

+ Giám định phân tử các vi khuẩn làm chuẩn âm;

+ Tạo panel ADN của chủng chuẩn và chủng phân lập ở Việt Nam

- Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR xác định nấm C neoformans

Lựa chọn cặp mồi phù hợp, tối ưu hóa thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của kỹ thuật nested-PCR Các nội dung chủ yếu bao gồm:

+ Lựa chọn cặp mồi phù hợp cho phản ứng PCR1 và PCR2

+ Chuẩn hóa thành phần của phản ứng PCR1 và PCR2 (như mục

+ Chuẩn hóa chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 và PCR2

+ Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR

- Xây dựng bộ sinh phẩm nested-PCR xác định C neoformans

Tạo chuẩn dương và chuẩn âm

+ Chuẩn dương của C.neoformans được tạo từ chủng nấm chuẩn ATTC

Để tạo ngân hàng nồng độ thích hợp cho mẫu nấm, cần lấy 5 mẫu nấm chuẩn đã được cấy chuyển và tách chiết ADN, thu được ít nhất 1ml ADN với nồng độ trung bình khoảng 11 ng/µl Từ nồng độ ADN nấm chuẩn ban đầu, tiến hành pha loãng với nước khử ion theo các bậc thang khác nhau: bậc thang 2 (5 lần), bậc thang 5 (3 lần) và bậc thang 10 (4 lần) nhằm tạo ra dãy chuẩn dương với nồng độ khác nhau Dãy chuẩn dương này sẽ được sử dụng trong phản ứng PCR để xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng, với chuẩn dương được chọn cao hơn ngưỡng phát hiện 1 lần; ví dụ, nếu ngưỡng phát hiện là 10^-2 ng/µl.

(10pg/ àl) thỡ chứng chuẩn dương nờn sử dụng ở mức 100 pg/ àl

Chứng chuẩn âm là ADN tách chiết từ dịch não tủy của người không nhiễm nấm C.neoformans, mặc dù có thể nhiễm các ký sinh trùng khác Các mẫu này đã được xác định không nhiễm nấm thông qua nuôi cấy và kỹ thuật PCR Đồng thời, nồng độ của các mẫu chuẩn âm tương tự với nồng độ của chứng chuẩn dương nếu có sự hiện diện của các ký sinh trùng khác.

Chuẩn bị hỗn hợp PCR cho bộ kít

Dự kiến xây dựng bộ sinh phẩm cho việc thực hiện 100 phản ứng PCR với hai hình thức đóng gói

Dạng 1: Gồm 02 loại hỗn hợp phản ứng (master mix) với đầy đủ các thành phần của phản ứng PCR lần 1 và phản ứng PCR lần 2; chỉ cần thêm ADN khuôn vào là thực hiện phản ứng PCR

Dạng 2: Gồm nhiều loại hỗn hợp phản ứng được chia ra một cách hợp lý các thành phần trong các tube, khi thực hiện sẽ hướng dẫn trộn các hỗn hợp phản ứng với nhau theo các tỷ lệ nhất định và thêm ADN khuôn để thực hiện phản

Luận văn thạc sĩ Y học ứng PCR

Hỗn hợp phản ứng được bảo quản trong các ống nhựa sạch không chứa

DNAase và RNAase thể tích 2,0 ml nắp xoắn

Số phản ứng là 100 nhưng thực tế chuẩn bị khoảng 120 phản ứng nhằm đảm bảo cho kiểm tra bộ kít và hao hụt trong quá trình thao tác

Lựa chọn dạng đóng gói của bộ sinh phẩm

Để đánh giá tính ổn định của mỗi dạng kit, cần lấy 01 bộ kít ngay sau khi sản xuất và thực hiện kiểm tra sau 1 tuần và 1 tháng Việc này sẽ được thực hiện với 20 mẫu dương tính và 10 mẫu âm tính đã được xác định từ dịch não tủy.

Lựa chọn cách đóng gói có tính ổn định cao hơn

Xây dựng hướng dẫn sử dụng bộ sinh phẩm

Hướng dẫn sử dụng cho bộ sinh phẩm cần bao gồm các thông tin quan trọng như cấu thành sản phẩm với các thành phần cụ thể, hướng dẫn xử lý mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm, quy trình xét nghiệm chi tiết, và cách diễn giải kết quả một cách chính xác.

Kiểm tra chất lượng bộ sinh phẩm và hoàn thiện sản phẩm

Với mỗi lô sản xuất lấy một lượng từ 5-10 hỗn hợp phản ứng PCR; các loại chứng để kiểm tra đánh giá chất lượng

Sau khi kiểm tra chất lượng đạt tiêu chuẩn, các thành phẩn của bộ kit sẽ được đóng gói cho 100 phản ứng, dán nhãn và bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 20 o C

2.3.3.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm

- Chuẩn bị mẫu để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu

Lấy 03 mẫu đã cấy chuyển từ mẫu nấm chuẩn C neoformans ATCC®

90113 và 51 chủng nấm C neoformansphân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam

Sau khi nuôi cấy xong, lấy 2-3 khuẩn lạc cho vào dung dịch nước muối sinh lý và trộn đều để tạo thành dịch treo Đo độ đục của dịch treo nhằm xác định mật độ nấm trong 1 ml Tiếp theo, thêm dung dịch NaCl 0,9% để điều chỉnh độ đục về 0,5 McFarland, tương đương với 1-5 x 10^6 CFU/ml.

Chuẩn bị mẫu chuẩn dương

Chọn 02 mẫu nấm chuẩn C neoformans ATCC® 90113 và 13 chủng nấm C neoformans phân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam đã được hiệu chuẩn về nồng độ 1-5 x 10 6 CFU/ml

Tiếp tục pha loãng các dịch treo trên bằng dung dịch NaCl 0,9% theo cấp số nhân để tạo các dung dịch có nồng độ từ 10 6 CFU/ml xuống

10 2 CFU/ml (ngưỡng phát hiện đã được xác định ở phần trước)

Sử dụng 02 nồng độ: Nồng độ cao 10 5 CFU/ml và nồng độ thấp

10 2 CFU/ml sử dụng bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm

Tổng cộng có 30 mẫu chuẩn dương (15 mẫu x 2 nồng độ) được sử dụng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu

Chuẩn bị mẫu dịch não tủy giả định

+ Chọn mẫu nấm chuẩn C neoformans ATCC® 90113 đã được hiệu chuẩn về nồng độ 1-5 x 10 6 CFU/ml và 20 mẫu DNT không nhiễm nấm

+ Pha loãng mẫu nấm chuẩn vào 20 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm C neoformans

Tiếp tục pha loãng các dịch treo bằng dịch não tủy không nhiễm nấm để tạo ra các mẫu dịch não tủy giả định với nồng độ nấm C neoformans giảm dần theo cấp số nhân: 10^5 CFU/ml, 10^4 CFU/ml, 10^3 CFU/ml.

Sử dụng 02 nồng độ: Nồng độ cao 10 5 CFU/ml và nồng độ thấp

10 2 CFU/ml thư nghiệm với bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm Mỗi nồng độ thử nghiệm 2 lần

Như vậy với 20 mẫu dịch não tủy gây nhiễm giả định, thử nghiệm 2 nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần, tổng có 80 mẫu

Chuẩn bị mẫu chứng âm

Chọn 20 mẫu chuẩn âm để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật trong đó có 10 mẫu chuẩn âm là nước muối sinh lý (dung dịch để pha loãng mẫu chuẩn) và 10 mẫu là dịch não tủy đã được kiểm tra lại bằng bộ sinh phẩm

Norgen khẳng định không có nấm C neoformans (nền mẫu để chẩn đoán trên các mẫu lâm sàng)

Chuẩn bị mẫu lâm sàng

120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch

- Thực hiện kỹ thuật nested – PCR để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ tương đồng với các kỹ thuật xét nghiệm khác

Thực hiện kỹ thuật PCR bằng bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 theo hướng dẫn để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu Nghiên cứu sử dụng bốn nền mẫu khác nhau: mẫu chuẩn, mẫu DNT nhiễm giả định, mẫu dương tính từ nuôi cấy lâm sàng và mẫu lâm sàng trực tiếp Trong quá trình thực hiện phản ứng nested PCR, ghi lại số lượng mẫu âm tính và dương tính Cuối cùng, tính toán độ nhạy, độ đặc hiệu và tính ổn định của bộ sinh phẩm theo hướng dẫn tại mục 2.5.

+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn

Kỹ thuật nested-PCR đã được thực hiện trên 100 mẫu, bao gồm 15 mẫu chuẩn dương với hai nồng độ: 10^5 CFU/ml và 10^2 CFU/ml, cùng với 20 mẫu chuẩn âm, mỗi mẫu được lặp lại hai lần.

+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu DNT nhiễm giả định

Tiến hành kỹ thuật nested-PCR đối với 40 mẫu dịch não tủy (20 mẫu x

2 nồng độ) và 20 mẫu chuẩn âm – mỗi mẫu lặp lại 2 lần Tổng có 80 mẫu giả định và 40 mẫu chuẩn âm

+ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu C neoformans phân lập từ DNT tại Việt Nam

Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu

Xây dựng và tuân thủ các SOP hướng dẫn cụ thể là rất quan trọng Hồ sơ biểu mẫu cần được ghi chép đầy đủ và số liệu phải được nhập hai lần bởi hai người độc lập để đảm bảo tính chính xác và minh bạch.

Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Phân tích số liệu dựa trên các phần mềm chuyên biệt cho sinh học phân tử như Blast và ClustalX để xác định tính đặc hiệu của bộ mồi

- Kỹ thuật phân tích các trình tự ADN các công cụ tin sinh học như

- Kỹ thuật so sánh trình tự gen thu được với trình tự trên ngân hàng gen sử dụng công cụ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi;

Các số liệu định tính được thu thập qua hình ảnh nuôi cấy, hình ảnh

PCR là phương pháp được sử dụng để xác định nồng độ của các chất tham gia phản ứng như Mg2+, mồi và ADN khuôn Tính tỷ lệ dương tính trong PCR giúp đánh giá ngưỡng phát hiện của phản ứng Ngoài ra, chu trình nhiệt của phản ứng, bao gồm nhiệt độ bám mồi và số chu kỳ nhiệt, cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.

- Các số liệu được ghi chép, mã hóa và xử lý bằng phần mềm y xã hội học

Dữ liệu được phân tích dựa trên các chỉ số quan trọng như độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm và chỉ số Kappa, nhằm đánh giá hiệu quả và độ chính xác của các phương pháp chẩn đoán.

- Cách tính độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các nền mẫu khác nhau như sau [78, 89, 90]:

Độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng của phương pháp xét nghiệm chẩn đoán được xác định dựa trên các mẫu chuẩn dương và âm, theo các định nghĩa đã nêu trong mục 2.6.2.

Độ nhạy của một xét nghiệm chẩn đoán là tỷ lệ giữa số kết quả dương tính thật và tổng số trường hợp dương tính, được tính toán theo công thức cụ thể.

Trong đó: Pse là độ nhạy; TP: số lượng mẫu dương tính thật (true positive);

FN: số lượng mẫu âm tính giả (false negative)

Độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán là tỷ lệ âm tính thật, tức là tỷ lệ các kết quả xét nghiệm âm tính chính xác Độ đặc hiệu được tính theo công thức xác định rõ ràng, giúp đánh giá hiệu quả của xét nghiệm trong việc phát hiện các trường hợp không mắc bệnh.

Trong đó: P là đặc hiệu; TN: số lượng mẫu âm tính thật (true negative); FP: số lượng mẫu dương tính giả (false poisitive)

Giá trị tiên đoán dương là tỷ lệ phần trăm của các kết quả xét nghiệm dương tính thực sự, được tính toán bằng công thức nhất định.

Trong đó: PPV: giá trị tiên đoán dương; TP: số lượng dương tính thật (true

Luận văn thạc sĩ Y học positive); FP: số lượng dương tính giả (false positive)

Giá trị tiên đoán âm (negative predictive value - NPV) là tỷ lệ cho thấy khả năng một kết quả xét nghiệm âm tính thực sự phản ánh tình trạng không có bệnh NPV được tính toán dựa trên công thức cụ thể, giúp đánh giá độ chính xác của xét nghiệm trong việc phát hiện các trường hợp không mắc bệnh.

- Cách tính chỉ số phù hợp chẩn đoán giữa 2 phương pháp:

Nested-PCR Phương pháp xét nghiệm khác Tổng

(+) a (dương tính thật) c (dương tính giả) a+c

(-) b (âm tính giả) d (âm tính thật) b+d

Chỉ số Kappa (K): K= Po−Pe

K : là chỉ số tương đồng Kappa giữa 2 phương pháp xét nghiệm

Po: là tỉ lệ 2 phương pháp xét nghiệm cho kết quả giống nhau (cùng âm hoặc cùng dương)

Pe: là tỉ lệ phù hợp mong muốn

N: là tổng số mẫu nghiên cứu Độ mạnh của K:

0 – 0,4: yếu ; 0,41 – 0,6: trung bình; 0,61 – 0,8: tốt ; 0,81 – 1: rất tốt (hoàn toàn thống nhất)

Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu này tuân thủ các quy định về đạo đức trong y học, và đề cương nghiên cứu đã được hội đồng y đức của Học viện Quân Y phê duyệt.

Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương.

Nhiễm sai số và cách hạn chế

Nấm C neoformans là một loại nấm có khả năng sống sót trong nhiều môi trường khác nhau, bao gồm cả không khí và bụi, điều này khiến cho việc tạp nhiễm trở nên dễ dàng và có thể gây ra sai số trong quá trình nghiên cứu Do đó, các nghiên cứu chẩn đoán về nấm này thường được thực hiện tại phòng xét nghiệm vi ký sinh của các Học viện quân Y, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương và Bệnh viện Phạm.

Ngọc Thạch và Bệnh viện Chợ Rẫy sở hữu các phòng xét nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp II, được thiết kế theo nguyên lý một chiều nhằm phân biệt khu vực sạch và khu vực bẩn, giảm thiểu tối đa sự tạp nhiễm Nghiên cứu thu thập mẫu và xét nghiệm đánh giá được thực hiện tại nhiều địa điểm với sự tham gia của đông đảo cán bộ, nhằm đảm bảo chất lượng và hạn chế sai số Trước khi tiến hành, đề tài đã xây dựng một đề cương nghiên cứu chi tiết, kèm theo quy trình thu thập mẫu và xét nghiệm rõ ràng Các cán bộ tham gia nghiên cứu được tập huấn theo quy trình chuẩn để đảm bảo sự đồng nhất trong mọi hoạt động nghiên cứu, tối đa hóa tính chính xác và giảm thiểu sai sót do sử dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau.

Theo tổng kết của các nhà nhiên cứu về quản lý chất lượng xét nghiệm

80% sai sót liên quan đến quá trình nhập và xử lý số liệu trước và sau xét nghiệm Để giảm thiểu sai số này, dữ liệu nghiên cứu được hai người nhập độc lập trên cùng một biểu mẫu thống nhất.

Luận văn thạc sĩ Y học nhất, sau đó có sự so sánh làm sạch để thống nhất số lượng trong quá trình phân tích, xử lý số liệu

Mặc dù không thể loại bỏ hoàn toàn các sai số, nghiên cứu đã áp dụng những biện pháp cơ bản nhằm giảm thiểu sai số đến mức tối đa, từ đó đảm bảo tính chính xác cao cho kết quả nghiên cứu.

Hạn chế của đề tài

Số lượng bệnh nhân mắc viêm màng não do nấm C neoformans rất hạn chế, điều này ảnh hưởng đến việc đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm được phát triển.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans

PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans

3.1.1 Kết quả giám định loài vi nấm Cryptococcus neoformans để sử dụng cho nghiên cứu

Thu thập 270 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng viêm màng não tại 04 bệnh viện: Bệnh viện (BV) Quân y 103, Bệnh viện

Từ năm 2013 đến 2015, Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương và Bệnh viện Chợ Rẫy đã tiến hành nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR Trong quá trình nghiên cứu, 270 mẫu đã được nuôi cấy để phân lập nấm.

C.neoformans trên môi trường Sabouraud

Kết quả cho thấy, có 51 mẫu nuôi cấy dương tính với nấm men và có hình thái phù hợp với C neoformans (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Kết quả thu thập và phân lập nấm C neoformans

TT Địa điểm thu thập mẫu

Mẫu lựa chọn để xây dựng quy trình nested - PCR

3 BV Bệnh Nhiệt đới Trung ương

Trong tổng số 270 mẫu dịch não tủy từ bệnh nhân viêm màng não, có 51 trường hợp mắc viêm màng não do nấm C neoformans, chiếm tỷ lệ 18,89%.

Hình 3.1 Mẫu nấm C neoformans thu thập tại thực địa Việt Nam

Toàn bộ 51 mẫu nấm dương tính tiếp tục được định danh bằng kỹ thuật

Phương pháp PCR-RFLP được mô tả bởi Mirhendi và cộng sự (2006) đã được áp dụng trong nghiên cứu này Kết quả cho thấy tất cả 51 mẫu đều có kích thước sản phẩm PCR và các đoạn cắt giới hạn phù hợp với C neoformans, như được trình bày trong Hình 3.2 và Hình 3.3.

Hình 3.2 Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 của một số mẫu nấm

Trong hình, giếng số 1 là chứng âm, giếng số 5 là thang ADN chuẩn

100bp, còn lại từ giếng số 1 đến giếng số 11 lần lượt là sản phẩm PCR của các mẫu nấm có ký hiệu N57, N61, N420, N426, N427, N432, N453, N458, N471

Hình 3.3 Kích thước các mảnh cắt giới hạn sản phẩm PCR bằng enzyme

MspI của một số mẫu nấm C neoformans

Giếng số 1 trong hình là đối chứng dương với nấm C tropicalis, trong khi giếng số 8 chứa thang ADN chuẩn kích thước 100 bp Các giếng từ số 2 đến 7 và giếng số 9 đến 11 lần lượt đại diện cho sản phẩm cắt giới hạn của các mẫu nấm được ký hiệu.

Kết quả giải trình tự và so sánh trình tự ngẫu nhiên cho thấy một số mẫu đều là C neoformans Trình tự của 06 mẫu đại diện đã được đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với các mã số được liệt kê trong bảng 3.2 dưới đây.

Bảng 3.2 Tỷ lệ tương đồng nucleotide của 06 mẫu trong nghiên cứu với các trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen

Tên mẫu Mã số trên genbank

Trình tự tham chiếu Loài nấm Tỷ lệ tương đồng

Bảng 3.2 cho thấy, các chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam được đăng ký trên ngân hàng gen có tỷ lệ tương đồng cao với nucleotide trình tự tham chiếu (> 99%)

Dựa trên kết quả định loại, 07 mẫu được lựa chọn để xác định các điều kiện của kỹ thuật nested-PCR phát hiện C neoformans

3.1.2 Kết quả thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans

3.1.2.1 Kết quả lựa chọn trình tự cặp mồi cho phản ứng nested PCR

Chúng tôi thống kê các bài báo trong và ngoài nước áp dụng kỹ thuật

PCR để nghiên cứu định loại nấm C neoformans từ năm 1990 đến 2014, là thời điểm bắt đầu tiến hành nghiên cứu

Bảng 3.3 Các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để định loại nấm C neoformans 1990 - 2014

STT Tác giả Gen đích Năm Phương pháp

1 Mitchell và cs ITS rRNA 1994 PCR

2 Rappelli và cs ITS rRNA 1998 Nested - PCR

3 Mirhend ITS + 5,6S RNA 2001 PCR-RFLP

4 Bialek và cs 18S rDNA 2002 Nested PCR + qPCR

5 Guizenluo và cs LAC1, CAP64 2002 Multiplex PCR

7 Meyer và cs URA5 2003 PCR-RFLP

8 Takahashi và cs ITS rRNA 2003 Nested PCR

9 Paschoal và cs ITS + 5,6S RNA 2004 PCR

10 Hafner và cs Microsatellitle 2005 PCR finger printing

11 Shahindokht ITS rRNA 2006 Semi nested PCR

12 Enache-A và cs CAP59 2007 AFLP

13 Levy và cs 18S/28S rRNA 2008 real-time PCR

14 Leal và cs JEC21 2008 Multiplex PCR

15 Capoor và cs Microsatellitle 2008 RADP PCR

16 Vincent Veron ITS rRNA 2009 Real-time PCR

17 Saha và cs 18S rRNA 2009 PCR

18 Martins JEC21 2010 Real-time PCR

19 Qishui và cs VAD1 2012 Real-time PCR

20 Reinwald và cs 18S rRNA 2013 Nested PCR

Sau khi đánh giá và so sánh các cặp mồi được nghiên cứu, chúng tôi đã quyết định chọn 02 cặp mồi cho phản ứng nested – PCR.

Cặp mồi cho phản ứng PCR1 theo Mitchell TG và CS, 1994; SH

- ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’

- ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’

Khuếch đại đoạn gen có kích thước 555-556 bp đặc trưng cho nấmC neoformans

Cặp mồi cho phản ứng PCR 2 theo Guizhen Luo và CS, 2002:

- CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T-5’

- CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’

Khuếch đại đoạn ADN có kích thước 135-136 bp nằm trong đoạn giao gen ITS1-ITS2

Hình 3.4 Minh họa đoạn gen khuếch đại với 02 cặp mồi được lựa chọn

Lựa chọn được cặp mồi ITS1 và ITS4 cho phản ứng PCR1, cặp mồi CN4,

CN5 nằm trong đoạn ITS cho phản ứng PCR2

Kết quả đánh giá chất lượng của cặp mồi so với tiêu chuẩn:

Bảng 3.4 Đánh giá chất lượng của mồi so với tiêu chuẩn

Các chỉ tiêu chất lượng

Cặp mồi không chênh nhau > 5 0 C

Kết quả bảng 3.4 cho thấy các chỉ tiêu kỹ thuật của mồi ITS1, ITS4 cho

PCR1; CN4, CN5 cho PCR2 đạt tiêu chuẩn chất lượng theo yêu cầu lựa chọn cặp mồi cho phản ứng PCR lồng

3.1.2.2 Kết quả đánh giá tính đặc hiệu của mồi

- Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của mồi bằng lý thuyết

Hình 3.5 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1-ITS4 bằng phần mềm Primer Blast

So sánh trình tự mồi của từng cặp mồi với trình tự gen của nấm

C.neoformans bằng phần mềm Primer-Blast Kết quả ở hình 3.5 chỉ ra cặp mồi ITS1, ITS4 của phản ứng PCR1 hoản toàn tương thích với trình tự gen của loài nấm C neoformans với kích thước sản phẩm PCR ước tính là 555 bp

Hình 3.6 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4-CN5 bằng phần mềm Primer Blast

Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4 và CN5 bằng phần mềm Primer Blast cho thấy tính tương thích đạt 100%, với độ dài sản phẩm PCR dự kiến là 135 bp.

- Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi bằng thực nghiệm

+ Kết quả thực nghiệm giải trình tự

Tiến hành phản ứng PCR bằng cặp mồi đã lựa chọn với ADN của mẫu chủng chuẩn C neoformans ATCC® 90113 Sau đó giải trình tự sản phẩm

Sử dụng phương pháp PCR, kết quả giải trình tự được so sánh với các trình tự chuẩn trên GeneBank thông qua phần mềm ClustalX Đồng thời, chương trình Blast trên NCBI được áp dụng để tìm kiếm các trình tự tương đồng với đoạn trình tự đã giải Kết quả cho thấy đoạn ADN được khuếch đại bằng cặp mồi lựa chọn có độ tương đồng cao.

Luận văn thạc sĩ Y học đồng 99% đến 100% so với các trình tự của C neoformans được lưu giữ trên ngân hàng gen (Hình 3.7)

Hình 3.7 So sánh trình tự ADN nấm chuẩn được khuếch đại bởi cặp mồi

ITS1, ITS4 và các trình tự C neoformans trên ngân hàng gen

+ Kết quả thực nghiệm trên các nền mẫu khác nhau

Bảng 3.5 Đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi trên các nền mẫu khác nhau

TT ADN thử nghiệm Băng có kích thước

Qua bảng 3.5 nhận thấy cặp mồi được lựa chọn có tính đặc hiệu cao với

C neoformans; Không bắt chéo với các loài vi nấm, vi khuẩn khác

Như vậy khi khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1, ITS4; cặp mồi

CN4 và CN5 đã chứng minh, cả về lý thuyết lẫn thực nghiệm, rằng hai cặp mồi được chọn có độ đặc hiệu cao, chỉ khuếch đại ADN của nấm C neoformans mà không ảnh hưởng đến ADN của các vi nấm, vi khuẩn hay sinh vật khác.

3.1.3 Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans

Trước khi chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng PCR trên các mẫu chuẩn cần tạo các dãy (panel) chứng chuẩn dương và chứng chuẩn âm

Dịch treo nấm có nồng độ 0,5 Marfaland được tách chiết ADN và đo nồng độ

Bảng 3.6 Nồng độ AND thu được từ chủng chuẩn C neoformans

Mẫu nấm Nồng độ ADN (ng/àl) OD (260/280)

Qua bảng 3.6 cho thấy nồng độ trung bình ADN của mẫu chuẩn là

11,12 ng/àl, độ tinh sạch là 1,97 Như vậy quỏ trỡnh tỏch chiết ADN đạt độ tinh khiết cần thiết

3.1.3.1 Kết quả tạo panel chuẩn dương

Từ nồng ADN nấm chuẩn ban đầu, lấy 1 thể tích nhất định pha loãng với nước khử ion theo bậc thang 2 (5 lần), bậc thang 5 (3 lần) và bậc thang 10

(4 lần) để thu được các dung dịch chuẩn dương như bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả tạo panel chuẩn dương nấm C neoformans

TT Cdd đầu (ng/àl) Vdd (àl) VH20 (àl) Cdd sau (ng/àl) MS panel

Hình 3.8 Kết quả PCR theo panel nồng độ Giếng 1: Chứng âm; Giếng 2: chứng dương

Giếng 3 - giếng 7: Nồng độ ADN từ 11,12 đến 0,01112ng

Giếng 9- giếng 13: Nồng độ ADN từ 0,001112đến 0,0001112 ng

3.1.3.2 Kết quả tạo dãy chứng chuẩn âm

Chứng chuẩn âm là dung dịch chứa ADN của người, vi khuẩn, virus và các vi nấm khác không phải C.neoformans Nồng độ ADN trong các dung dịch này dao động từ 50 pg/µl đến 20 µg/µl.

Bảng 3.8 Danh mục chứng chuẩn âm

TT AND vi khuẩn, vi nấm, người

Ký hiệu Số tube Thể tích mỗi tube (àl)

Kết quả bảng 3.8 cho thấy đã tạo ra 13 mẫu chứng chuẩn âm với tổng số 130 tube, mỗi tube chứa 30 àl ADN

3.1.3.3 Kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR1

Kết quả tối ưu các điều kiện của phản ứng PCR1 phát hiện nấm

C.neoformans với mẫu thực nghiệm là chủng C neoformans chuẩn

Thực nghiệm phản ứng PCR nhân gen của nấm C neoformans được thực hiện theo quy trình của SH Mirhendi và cộng sự (2001), với tổng thể tích 50 µl và số chu kỳ là 30 chu kỳ Nghiên cứu của các tác giả SH Mirhendi và cộng sự đã cung cấp những thông tin quan trọng về phương pháp này.

Sản phẩm của phản ứng PCR1 vào năm 2001 sau khi được khuếch đại sẽ trải qua quá trình cắt bằng enzym giới hạn, do đó cần đảm bảo số lượng sản phẩm của phản ứng đủ để thực hiện.

PCR cần được thực hiện với quy mô lớn Trong nghiên cứu của chúng tôi, sau khi hoàn thành phản ứng PCR lần đầu, sẽ tiến hành khuếch đại bằng phản ứng PCR lần hai, nhằm tăng cường lượng sản phẩm ADN thu được.

1 không cần quá nhiều, chúng tôi thực nghiệm giảm tổng thể tích phản ứng xuống 25àl và số chu kỳ xuống 20 và 25 chu kỳ để so sỏnh

Kết quả so sánh sự thay đổi này được thể hiện ở bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả so sánh phản ứng PCR1 với các điều kiện khác nhau

TT Thể tích và chu kỳ phản ứng Số mẫu thực nghiệm

1 Tổng thể tớch 50 àl; 30 chu kỳ 30 30

Qua kết quả ở bảng 3.9 chúng tôi lựa chọn quy trình kỹ thuật cho phản ứng PCR1 với tổng thể tớch phản ứng là 25 àl và 25 chu kỳ nhiệt

Bảng 3.10 Kết quả chuẩn hóa từng thành phần phản ứng cho PCR1

TT Thành phần Nồng độ, hàm lượng cuối cùng

Thể tích sử dụng cho 1 phản ứng (àl)

1 Nước khử ion Vừa đủ tới 25 àl 8,5

5 ADN khuụn 100pg – 100ng/25àl 2

Bảng 3.11 Kết quả chu trình nhiệt của phản ứng PCR1

Bước phản ứng Nhiệt độ 0 C Thời gian Số chu kỳ

Tách sợi ban đầu 94 5 phút 01

Kéo dài mồi 72 40 giây ổn định mồi 72 7 phút 01

Kết quả của phản ứng PCR1, theo điều kiện tại bảng 3.10 và 3.11 được thể hiện ở hình 3.9 Luận văn thạc sĩ Y học

Hình 3.9 Kết quả phản ứng PCR1 tiến hành theo quy trình tự xây dựng

Giếng 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10: Mẫu nhiễm nấm C neoformans

Giếng 7: Chứng dương – chủng chuẩn ATCC®90113 C neoformans

3.1.3.4 Kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR2

Khi thực nghiệm phản ứng PCR lần 2 theo quy trình chuẩn của phản ứng PCR để sản phẩm băng ADN có kích thước từ 100 đến 600 bp với lượng

Trong thí nghiệm PCR ban đầu, việc sử dụng 1 ng ADN khuôn cho mỗi phản ứng dẫn đến sản phẩm PCR có băng dày và đậm, cho thấy lượng ADN khuôn có thể quá lớn Để khắc phục điều này, chúng tôi đã tiến hành pha loãng sản phẩm PCR1 theo tỷ lệ 1:10, giảm từ 1 ng (1000 pg) xuống còn 100 pg, 10 pg và 1 pg, trong khi giữ nguyên các thành phần phản ứng khác.

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.12

Bảng 3.12 Kết quả lựa chọn nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR2

STT Nồng độ mẫu thử nghiệm

Sản phẩm PCR – 135 bp Chất lượng băng

Có băng ADN đúng kích thước

Không có băng ADN đúng kích thước

Qua bảng 3.12 nhận thấy có thể lựa chọn ADN khuôn cho phản ứng khoảng nồng độ 100 pg (0,1ng) là kết quả phù hợp

- Kết quả chuẩn hóa nồng độ Mg 2+

Thực nghiệm phản ứng PCR2 với 08 mẫu (01 mẫu chuẩn mã ATCC

90113 và 07 chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam) ở 6 nồng độ Mg 2+ khác nhau, kết quả được thể hiện ở bảng 3.13

Bảng 3.13 Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg 2+ trong phản ứng PCR2

Số lượng mẫu lên băng 135bp với nồng độ Mg 2+ khác nhau (mM)

Kết quả bảng 3.13 cho thấy ở Mg 2+ nồng độ 2,0 mM và nồng độ ADN

≥ 10 pg thì tất cả mẫu xét nghiệm đều có sản phẩm PCR

Hình 3.10 Sản phẩm PCR theo nồng độ Mg 2+

Giếng 1: Mg 2+ : 3,5 mM; Giếng 2: Mg 2+ : 3,0 mM

Giếng 3: Mg 2+ : 2,5 mM Giếng 4: Mg 2+ : 2,0 mM

Giếng 5: Mg 2+ : 1,5 mM Giếng 2: Mg 2+ : 1,0 mM

Giếng 7: Chứng âm Giếng 8: Thang chuẩn 100 bp

Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans trong dịch não tủy

chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans trong dịch não tủy

3.2.1 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm

3.2.1.1 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trên các ADN mẫu chuẩn

- Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm Luận văn thạc sĩ Y học

Bảng 3.26 Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên mẫu

Stt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR

Dương tính ((+)/tổng số) Âm tính ((-)/tổng số)

1 Chuẩn dương nuôi cấy nồng độ 10 5 CFU/ ml 30/30 0/30

2 Chuẩn dương nuôi cấy nồng độ 10 2 CFU/ ml 30/30 0/30

4 Mẫu DNT không nhiễm C neoformans 0/20 20/20

Qua kết quả ở bảng 3.26 nhận thấy với việc đánh giá 30 mẫu chuẩn dương, ở hai nồng độ khác nhau là nồng độ thấp 10 2 CFU/ml và nồng độ cao

10 5 CFU/ml; 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm không có ADN là NaCl 0,9% và

Trong nghiên cứu, 10 mẫu chuẩn âm có ADN từ dịch não tủy không chứa C neoformans đã được phân tích Mỗi mẫu được kiểm tra lặp lại hai lần, cho thấy rằng 100% các mẫu chuẩn dương cho kết quả PCR với sản phẩm có kích thước 135 bp, đặc hiệu cho C neoformans Ngược lại, 100% mẫu chuẩn âm không cho thấy sản phẩm PCR nào.

Bảng 3.27 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu chuẩn

Kết quả kit nested – PCR

Mẫu chuẩn (kiểm tra bằng nuôi cấy và bộ sinh phẩm Norgen)

Có C neoformans Không có C neoformans

Tổng số 60 40 100 Độ nhạy Se = 100%, Độ đặc hiệu Sp = 100%

Kết quả từ bảng 3.27 chỉ ra rằng bộ sinh phẩm nested PCR có khả năng chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy với độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% khi thử nghiệm với các mẫu nấm C neoformans của chủng chuẩn cũng như mẫu chuẩn âm.

- Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm

Bảng 3.28 Kết quả đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm

Loại mẫu thử Thời gian sau sản xuất

Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm nested-PCR

1 Mẫu dương tính Ngay sau khi SX

2 Mẫu dương tính 3 Tháng sau

5 Mẫu dương tính 12 Tháng sau SX

Qua bảng 3.28 thấy rằng ở cả ba điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm nested-PCR phát hiện nấm C neoformans trong dịch não tủy ở nhiệt độ -

20 0 C, -35 0 C và -80 0 C vẫn đảm bảo tính ổn định sau 12 tháng sản xuất

3.2.2.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu DNT nhiễm C neoformans giả định

Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR trên các mẫu dịch não tủy giả định được thể hiện ở bảng 3.29

Bảng 3.29 Kết quả phản ứng nested PCR với các mẫu DNT giả định tt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR

1 DNT giả định nồng độ 10 5 CFU/ ml 40/40 0/40

2 DNT giả định nồng độ 10 2 CFU/ ml 34/40 6/40

Kết quả từ bảng 3.29 cho thấy việc pha loãng các mẫu dịch não tủy nhiễm nấm C neoformans ở các nồng độ khác nhau đã được thực hiện, trong đó chọn 40 mẫu với nồng độ thấp 10² CFU/ml và nồng độ cao 10⁵ CFU/ml Bên cạnh đó, có 20 mẫu chuẩn âm được sử dụng, bao gồm 10 mẫu không có ADN (chuẩn trắng NaCl 0,9%) và 10 mẫu có ADN từ dịch não tủy không chứa C neoformans Thử nghiệm này đã được thực hiện với bộ sinh phẩm nested.

PCR #A011-02 kết cho thấy với mẫu nhiễm giả định nồng độ cao 10 5 CFU/ml

40 mẫu dương tính chiếm 100%; với mẫu nhiễm nấm giả định nồng độ thấp

10 2 CFU/ ml có 34/40 mẫu dương tính chiếm 85%, 6/40 mẫu âm tính chiếm

15%; 100% mẫu không nhiễm nấm có kết quả âm tính

Bảng 3.30 Kết quả đánh giá của trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ

Tổng số 40 40 80 Độ nhạy Se = 100% Độ đặc hiệu Sp = 100%

Qua bảng 3.30 nhận thấy khi gây nhiễm giả định trên dịch não tủy với nồng độ cao thì độ nhạy và độ đặc hiệu vẫn đảm bảo 100%

Bảng 3.31 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ 10 2 CFU/ ml

Bảng 3.31 là kết quả khi gây nhiễm với nồng độ thấp10 2 CFU/ ml xấp xỉ ngưỡng phát hiện thì độ nhạy giảm đi rõ chỉ là 85%

Bảng 3.32 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 10 2 CFU/ ml trở lên

Tổng số 80 40 120 Độ nhạy Se = 92,5% Độ đặc hiệu Sp = 100%

Với các mẫu nhiễm giả định từ ngưỡng phát hiện trở lên bộ sinh phẩm nested-PCR có độ nhạy 92.5%, độ đặc hiệu 100% Giá trị tiên đoán dương

100%, giá trị tiên đoán âm 87% với độ tin cậy 95%

3.2.2 Kết quả đánh giá của bộ sinh phẩm trong các mẫu dịch não tủy lâm sàng

3.2.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu C neoformans phân lập ở Việt Nam

Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR trên 51 mẫu nuôi cấy có mật độ nấm khác nhau

Bằng bộ sinh phẩm nested-PCR, chúng tôi đã tiến hành phân tích 51 mẫu ADN của 51 chủng nấm C neoformans khác nhau được phân lập tại Việt Nam, mỗi chủng được thử nghiệm với 2 mẫu Kết quả cho thấy 100% sản phẩm PCR2 sau khi điện di đều có các băng kích thước 135 bp, điều này khẳng định tính chính xác của phương pháp và sự phù hợp với đặc điểm của nấm.

Bảng 3.33 Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các chủng C.neoformans phân lập ở Việt Nam

Stt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR

Hình 3.17 trình bày kết quả khuếch đại gen đích của nấm C neoformans thông qua kỹ thuật nested-PCR Trong đó, giếng 1 là chứng âm, giếng 2 là chứng dương, các giếng 3-10 chứa các mẫu ADN thử nghiệm, và giếng 11 là thang ADN chuẩn loại 100bp.

Bảng 3.34 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam

C.neoformans phân lập ở VN Tổng số

Kết quả từ bảng trên cho thấy, qua việc đánh giá 51 mẫu nuôi cấy và 20 mẫu chuẩn âm, bộ sinh phẩm nested – PCR #011 – 02 đạt độ nhạy và độ đặc hiệu 100% Trong đó, 10 mẫu chuẩn âm không có ADN và 10 mẫu chuẩn âm có ADN từ dịch não tủy không có C neoformans.

3.2.2.2 Kết quả đánh giá độ tương đồng của bộ sinh phẩm trên mẫu DNT bệnh nhân viêm màng não

Kết quả xét nghiệm từ các phương pháp khác nhau trên mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não được trình bày trong bảng 3.35 của luận văn thạc sĩ Y học.

Bảng 3.35 Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các mẫu DNT của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng VMN

Stt Loại mẫu thực hiện Phương pháp xét nghiệm

Soi tươi nhuộm mực tàu (+/TS)

1 DNT thu thập tại BV

2 DNT thu thập tại BV

Kết quả xét nghiệm dịch não tủy từ 120 bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não cho thấy 8 mẫu (6,67%) dương tính với C neoformans qua phương pháp nuôi cấy Trong số đó, 7 mẫu cũng cho kết quả dương tính khi sử dụng phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu, bộ sinh phẩm nested –PCR #011 – 02 và bộ sinh phẩm của Norgen.

- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu với phương pháp nuôi cấy trên các mẫu lâm sàng

Bảng 3.36 Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy

Phương pháp nuôi cấy Tổng số Dương tính Âm tính

Tổng số 8 112 120 Độ nhạy Se = 87,5% Độ đặc hiệu Sp = 100%

Giá trị tiên đoán dương: 100%

Giá trị tiên đoán âm: 99,1%

So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với phương pháp nuôi cấy độ nhạy 87,5%; độ đặc hiệu 100% Giá trị tiên đoán dương là

Kết quả thử nghiệm cho thấy độ chính xác đạt 100% và giá trị tiên đoán âm là 99,1% Trong số các mẫu, có 01 mẫu dương tính với nuôi cấy nhưng âm tính với các phương pháp xét nghiệm khác, cho thấy khả năng mẫu này có thể bị ngoại nhiễm với C neoformans.

- Đánh giá độ tương đồng với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu

Bảng 3.37 Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu

Phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu

Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7%

Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 0,697

Kết quả so sánh giữa bộ sinh phẩm nested-PCR và phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho thấy tỷ lệ phù hợp quan sát Po đạt 96,7% và tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe là 89,0% Hệ số tương đồng giữa hai phương pháp xét nghiệm này được ghi nhận là 0,697 (bảng 3.37).

- Đánh giá độ tương đồng với bộ sinh phẩm của Norgen

Bảng 3.38 Độ tương đồng so với bộ sinh phẩm của Norgen

Bộ sinh phẩm Norgen Tổng số Dương tính Âm tính

Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 100%

Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 1

So sánh kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR với bộ sinh phẩm

Norgen tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 100%, tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% Hệ số tương đồng giữa 2 phương pháp xét nghiệm là 1 hoàn toàn tương đồng

3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh phẩm chế tạo ra

3.2.3.1 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

Dựa trên nghiên cứu về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của phương pháp nested-PCR, chúng tôi đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans.

Bảng 3.39 Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở

TT Chỉ tiêu đánh giá Tiêu chuẩn cơ sở

1 Nhận dạng Phản ứng PCR2 cho bang kích thước 135 bp đặc trưng cho nấm C.neoformans

4 Ngưỡng phỏt hiện ≥ 10pg/àl

5 Thời gian phát hiện Không quá 48 giờ

3.2.3.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR tại

Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế

Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế đã cấp giấy chứng nhận kết quả kiểm định số 00515/SPCD-NC cho bộ sinh phẩm chẩn đoán nested-PCR phát hiện nấm C neoformans, loạt số #A011-02 do Học viện quân y sản xuất Bộ sinh phẩm này đạt độ nhạy 98,11% và độ đặc hiệu 100%, cho thấy khả năng phát hiện chính xác cao.

0,4pg/àl khi thực hiện trờn bộ mẫu chuẩn của nhà sản xuất

BÀN LUẬN

neoformans

bao ngoài bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước nang thay đổi từ 2-40àm

Hình 1.1 Nấm C neoformans nhuộm mực tàu, quan sát dưới kính hiển vi

Giống nấm Cryptococcus tồn tại trong môi trường tự do được Kutzing đặt tên năm 1833, mẫu phân lập được từ bụi kính cửa sổ

C neoformans là sinh vật sống hoại sinh, ngoài cơ thể vật chủ, có thể sống tự do bên ngoài môi trường Nấm phân bố toàn cầu có thể tìm thấy trong chất thải của gia cầm, chim bồ câu, vẹt, yến Trong các hang động, nước trái cây lên men, sữa, đường ruột của một số động vật ăn cỏ, trên cơ thể dơi, gián, trong đất và các hốc cây khác nhau Nấm còn được tìm thấy trong thân gỗ mục của một số loài cây như: cây bạch đàn, cây cao su màu đỏ [13], [17], [18]

Nấm C neoformans có khả năng phát triển trên các môi trường như thạch Sabouraud dextrose, thạch máu cừu và thạch chocolate ở nhiệt độ từ 20-37°C Trong khoảng nhiệt độ này, nấm có thể bắt đầu mọc sau khoảng thời gian ngắn.

Trong 72 giờ, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm là 30 độ C C neoformans phát triển mạnh trong môi trường có khoảng 5% CO2, pH hơi kiềm và một lượng nhỏ chất sắt.

Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-37 0 C, nấm C neoformans mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem, đường kính có thể đến vài milimet [20]

Hình 1.2 Khuẩn lạc C neoformans trên môi trường thạch Sabouraud

Nghiên cứu năm 2014 chỉ ra rằng các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ thẩm thấu, nồng độ CO2 và độ pH có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của các bao ngoài Nhiệt độ cao từ 39-40 độ C hoặc quá thấp đều ức chế sự tăng trưởng của nấm Nồng độ CO2 ở mức sinh lý không chỉ tăng cường tổng hợp mà còn làm tăng kích thước của bao ngoài, trong khi nồng độ CO2 cao lại dẫn đến kích thước nhỏ của các nang Môi trường có độ thẩm thấu cao, như chứa 16% glucose hoặc NaCl, cũng ảnh hưởng đến sự phát triển này.

2,9%), hoặc pH acid sẽ làm giảm sản xuất các bao nang

Nấm C neoformans có khả năng gây bệnh ở động vật, năm 1895

Sanfelice là người đầu tiên phát hiện và nuôi cấy nấm C neoformans từ hệ bạch huyết của bò Vào năm 1902, Frothingham đã phân lập nấm C neoformans từ tổn thương phổi của ngựa tại Massachusetts, Anh.

Cùng với ghi nhận của Busse và Buschkle, các tác giả trên đã khẳng định nấm C neoformans có khả năng gây bệnh cả ở trên người và động vật

Những nghiên cứu hiện nay chỉ ra C neoformans có thể gă ̣p ở mèo, chó , thỏ, linh trưởng, chuô ̣t và mô ̣t số loa ̣i chim

Bệnh do C neoformans thường liên quan đến tình trạng suy giảm miễn dịch ở động vật có vú, như mèo nhiễm virus tương tự retrovirus và chuột thí nghiệm bị thiếu hụt miễn dịch Trong khi đó, chim bồ câu và các loài chim khác ít mắc bệnh do C neoformans nhờ vào nhiệt độ cơ thể cao từ 41°C đến 42°C Tuy nhiên, tế bào nấm vẫn có thể được tìm thấy trong phân của chim.

Nấm C neoformans có mặt trong không khí, đất và phân gia cầm, khiến con người dễ bị nhiễm khi hít phải Tuy nhiên, không phải ai cũng bị bệnh; bệnh thường xảy ra ở những người có hệ miễn dịch yếu, như bệnh nhân AIDS, người dùng thuốc ức chế miễn dịch, hoặc những người đã trải qua ghép tạng và ghép tủy xương Mức độ nghiêm trọng của triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào tình trạng suy giảm miễn dịch của người nhiễm.

- Bệnh gây tổn thương ở hệ thần kinh

- Viêm màng não: Đây là bệnh thường gặp nhất Bệnh thường diễn biến từ từ, các biểu hiện lâm sàng điển hình bao gồm:

+ Đau đầu, sốt, nôn, rối loạn hành vi, rối loạn cảm giác, đau và cứng gáy [23],[24],[25]

+ Rối loạn tâm thần bao gồm: mất phương hướng, lú lẫn, thay đổi nhân cách, mất trí nhớ, loạn thần, trạng thái sững sờ và hôn mê [23], [24]

Các triệu chứng ít gặp hơn của bệnh bao gồm mất điều hòa, mất phản xạ, tổn thương bó tháp, thất ngôn, loạn vận ngôn và động kinh.

Các triệu chứng về mắt thường gặp bao gồm phù gai thị, trong khi những triệu chứng không phổ biến có thể là nhìn mờ, nhìn đôi, sợ ánh sáng, đau sau nhãn cầu và thậm chí có thể dẫn đến mù lòa.

- Viêm màng não - não: Ít gặp, bệnh tiến triển nhanh, thường tiến tới hôn mê và tử vong trong thời gian ngắn, đáp ứng kém với điều trị

- U nấm trong não: Hiếm gặp, các tổn thương giả u rắn, khu trú Triệu chứng giống khối phát triển trong não

Hình 1.3.Tổn thương não do C neoformans

(Nguồ n: British Journal of Radiology, 2009) A- Tổn thương não do C neoformans trên CT sọ não

B-Tổn thương não do C neoformans trên MRI sọ não

Nấm gây tổn thương phổi thường xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp khi bệnh nhân hít phải bào tử nấm trong không khí Viêm phổi do nấm C neoformans có các triệu chứng điển hình như ho, đau ngực, khạc đờm, sút cân, sốt và ho ra máu Ngoài ra, một số triệu chứng hiếm gặp khác bao gồm khó thở, ra mồ hôi ban đêm và cản trở tĩnh mạch chủ trên.

Hình ảnh X-quang của viêm phổi do nấm C neoformans thường cho thấy một hoặc nhiều nốt không canxi hóa, thâm nhiễm ở rốn phổi hoặc trung thất Đôi khi có thể xuất hiện tràn dịch màng phổi và tạo hang Khi thăm khám, triệu chứng thường không đặc hiệu, nhưng có thể thấy thở nhanh, phổi có ran, hạch to và lách to.

Hình 1.4 Hình ảnh tổn thương phổi do C neoformans

A Tổn thương phổi do nấm C neoformans trên phim X-quang phổi

B Tổn thương phổi do nấm C neoformans trên CT phổi

- Bệnh gây tổn thương ở da

+ Tổn thương nguyên phát: Loét, viêm mô tế bào [26]

+ Tổn thương thứ phát: thường xuất hiện ở đầu, cổ dưới dạng sẩn, cục, mảng loét, áp xe, tổn thương dạng herpet, u mềm lây hoặc u Kaposi [26],

Hình 1.5 Tổn thương da do nấm C neoformans

(Nguồn: Hari Kishan Kumar Yadalla và cs, 2011) [27]

- Bệnh gây tổn thương ở các cơ quan khác:

+ Tổn thương xương: Tổn thương hủy xương, không có phản ứng màng xương, đau mơ hồ khi vận động, đôi khi có thể viêm khớp nhất là khớp gối [24]

+ Hệ tiết niệu: C neoformans thường phân lập được ở nước tiểu bệnh nhân bị bệnh lan tràn, đôi khi có dấu hiệu của viêm bể thận, viêm tiền liệt tuyến [24], [26]

+ Tổn thương cơ quan khác: ở vỏ thượng thận, viêm nội tâm mạc, viêm gan, viêm xoang, tổn thương thực quản [24], [26]

1.1.3 Tình hình viêm màng não do nấm C neoformans ở trên thế giới và

Viêm màng não do nấm C neoformans là một trong những nhiễm trùng cơ hội quan trọng nhất ở bệnh nhân AIDS Ở những nước có tỉ lệ nhiễm

HIV/AIDS cao, C neoformans là nguyên nhân phổ biến gây viêm màng não, thường xuyên hơn cả phế cầu, não mô cầu [13], [28]

Ca bệnh viêm màng não do nấm C neoformans được ghi nhận lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1905 bởi Von Hansemann, khi ông phát hiện nấm men trong các nang galentin ở não.

Khả năng xâm nhập của C neoformans vào hệ thần kinh trung ương và gây bệnh đã được ghi nhận từ đầu thế kỷ 20 Tuy nhiên, để đánh giá đúng mức độ và xu hướng của bệnh, bác sĩ cần có nhiều năm kinh nghiệm lâm sàng.

1.1.3.1 Viêm màng não do nấm C neoformans ở trên thế giới

Vào năm 1956, Littman và Zimmerman đã cho ra mắt một cuốn sách chuyên khảo về bệnh viêm màng não do nấm C neoformans, cung cấp những hiểu biết sâu sắc về đặc điểm lâm sàng và con đường truyền bệnh sau nửa thế kỷ kể từ khi bệnh được phát hiện.

Tại thời điểm đó trên toàn thế giới chỉ ghi nhận 300 trường hợp mắc bệnh

Trong những năm 1970, cùng với việc sử dụng rộng rãi các thuốc ức chế miễn

Luận văn thạc sĩ Y học dịch trong điều trị bệnh đã góp phần làm gia tăng tỷ lệ mắc bệnh này Cụ thể, trong năm 1976, Mỹ ghi nhận 338 trường hợp mắc bệnh, cho thấy sự gia tăng đáng kể sau những năm gần đây.

1980, tỷ lệ Cryptococcosis tăng mạnh cùng với việc xuất hiện của bệnh AIDS và được xem là yếu tố nguy cơ hàng đầu [13]

Từ cuối những năm 1970 đến đầu những năm 1980, người ta đã chứng kiến một sự gia tăng mạnh các trường hợp nhiễm nấm C neoformans tại

Kinshasa và ở những người Zairian nhập cư tại Châu Âu

Tiêu đề	Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật Sinh Học Phân Tử Để Chẩn Đoán Một Số Vi Nấm Gây Bệnh Nội Tạng Ở Người
Tác giả	Trần Thị Quỳnh Liên
Người hướng dẫn	PGS.TS. Cao Trường Sinh, PGS.TS. Nguyễn Thị Hương Bình
Trường học	Viện Sốt Rét – Ký Sinh Trùng – Côn Trùng Trung Ương
Chuyên ngành	Ký Sinh Trùng Y Học
Thể loại	Luận Án Tiến Sĩ Y Học
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	163
Dung lượng	2,53 MB