Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.

B nh Hemophilia A ệnh Hemophilia A

Lịch sử nghiên cứu bệnh Hemophilia A

Từ thời kỳ cổ đại, loài người đã biết đến bệnh máu khó đông, tuy nhiên không có tên gọi chính thức cho nó Trong các văn tự cổ của người Do Thái từ thế kỷ thứ II trước công nguyên đã miêu tả những đứa trẻ chết do chảy máu không cầm được sau khi cắt bao quy đầu (theo tục lệ của người Do Thái: trẻ em trai sinh ra được cắt bao quy đầu) Bệnh máu khó đông được nhận thấy là có tính di truyền hàng trăm năm qua các thế hệ trong một gia đình Vào những năm 1880, bệnh máu khó đông đã được phát hiện di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính, các nhà khoa học nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh cho con trai, người mẹ mang gen bệnh và truyền cho con trai mình [10].

Bệnh máu khó đông còn được biết đến như căn bệnh của hoàng gia vì nữ hoàng Anh Victoria (1838-1901) mang gen bệnh và truyền bệnh cho nhiều thế hệ hoàng gia khác [11], [12], [13] Năm 1937, Patek và Taylor phát hiện ra rằng họ có thể kiểm soát những khiếm khuyết của quá trình đông máu bằng cách thêm một chất chiết xuất từ huyết tương, chất này được gọi là globulin chống chảy máu [14] Bệnh máu khó đông được gọi là bệnh Hemophilia A,theo tên gọi của một trong các yếu tố tham gia quá trình đông máu (yếu tố chống ưa chảy máu Hemophilia A - yếu tố VIII) Năm 1944, Pavlosky nghiên cứu ở Buenos Aires cho thấy máu của một bệnh nhân Hemophilia có thể điều trị triệu chứng rối loạn đông máu của bệnh nhân Hemophilia khác và ngược lại,khi tình cờ ông gặp hai bệnh nhân bị thiếu hụt hai protein khác nhau - yếu tốVIII và yếu tố IX [15] Những phát hiện này cho phép chẩn đoán chính xác và xây dựng cơ sở khoa học cho việc điều trị bệnh rối loạn đông máu di truyền.

Cơ chế bệnh sinh, chẩn đoán, nguyên tắc điều trị bệnh Hemophilia A

Bệnh Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền do khiếm khuyết gen tổng hợp yếu tố VIII dẫn đến giảm nồng độ hoạt tính yếu tố VIII trong máu [16] Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc, do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan Các sợi fibrin sẽ trùng hợp với nhau tạo ra mạng lưới fibrin giam giữ các thành phần của máu và máu sẽ đông lại Cục máu đông hình thành sẽ có tác dụng bịt kín chỗ tổn thương [17]. Bình thường trong máu và trong mô có chất gây đông và chất chống đông, những chất gây đông ở dạng tiền chất không hoạt động nên máu không đông được Khi mạch máu bị tổn thương sẽ hoạt hóa các yếu tố đông máu làm cho máu đông lại.

Hội nghị quốc tế năm 1959 về đông máu, đã quy định tên gọi của 12 các yếu tố đông máu bằng các chữ số La Mã [18] Có 12 yếu tố đông máu là: Fibrinogen (yếu tố I); Prothrombin (yếu tố II); Prothrombin của mô hoặc các yếu tố mô (yếu tố III); Ion canxi (yếu tố IV); Proaccelerin (yếu tố V); Proconvectin (yếu tố VII); Yếu tố chống Hemophilia A (yếu tố VIII); Yếu tố chống Hemophilia B (yếu tố IX); Yếu tố Stuart (yếu tố X); Yếu tố tiền thromboplastin huyết tương - yếu tố chống Hemophilia C (yếu tố XI); Yếu tố Hageman - yếu tố chống Hemophilia D (yếu tố XII).

Gần đây, đã phát hiện hai protein của huyết tương mới được xếp vào các nhóm yếu tố đông máu huyết tương là prekallikrein và kininogen trọng lượng phân tử cao.

Quá trình đông máu của huyết tương là sự kết hợp giữa hai con đường đông máu nội sinh và đông máu ngoại sinh Các hoạt động kế tiếp nhau của các enzyme trong chuỗi các phản ứng nối tiếp dẫn tới hình thành thrombin và chuyển fibrinogen thành fibrin, trong đó yếu tố VIII tham gia như một đồng yếu tố [17], [19]

Hình 1.1 Sơ đồ đông máu theo con đường nội sinh và ngoại sinh

PL: Phospholipid (yếu tố 3 tiểu cầu); TF: Yếu tố tổ chức; HMWK: Kininogen trọng lượng phân tử cao

- Lâm sàng: người bệnh thường là nam giới; chảy máu khớp, cơ, dưới da, niêm mạc, lâu cầm, xu hướng tự nhiên, từ nhỏ; chảy máu kéo dài bất thường sau chấn thương hoặc phẫu thuật; biến dạng khớp, teo cơ do chảy máu nhiều lần ở khớp, cơ; tiền sử gia đình: có người nam giới liên quan họ mẹ bị chảy máu lâu cầm [21].

- Xét nghiệm cận lâm sàng: thời gian đông máu kéo dài có thể hơn một giờ; chất lượng cục máu đông kém; thời gian Howel kéo dài; định lượng yếu tố VIII (FVIII) giảm hoặc không có; xét nghiệm DNA phát hiện đột biến gen

F8; yếu tố Von - Willebrand bình thường; số lượng tiểu cầu bình thường; thời gian máu chảy bình thường; thời gian prothrombin bình thường; thời gian thrombin bình thường [21].

Hemophilia A được chia làm ba mức độ: nặng, trung bình và nhẹ.

Mức độ nặng: hoạt tính FVIII dưới 1%, thường bị chảy máu vài lần trong tháng

Mức độ trung bình: hoạt tính FVIII từ 1-5%, chỉ bị chảy máu sau những chấn thương nhẹ.

Mức độ nhẹ: hoạt tính FVIII từ 5-T, R1689C (Arginine1689Cysteine) ở exon 14 của gen F8 đã được báo cáo vào năm 2006 [67] Tuy nhiên, phương pháp trực tiếp giải trình tự gặp nhiều khó khăn vì phải thiết kế mồi riêng biệt đối với mỗi loại đột biến, chưa áp dụng được với trường hợp đột biến đảo đoạn, đặc biệt là đảo đoạn Intron 22 Hơn nữa, tỷ lệ ADO đối với đột biến R1698C trong nghiên cứu là 5,94% [67] Ở một hướng đi khác, trong 10 năm nghiên cứu và áp dụng PGT-M cho bệnh Hemophilia A ở bệnh viện Đại học Virgen Del Rocío - Tây Ban Nha

(2005 - 2015), Fernández R.M và cộng sự (2015) đã tổng kết có 30 cặp vợ chồng được tiến hành chẩn đoán Tuy nhiên, được chia thành 2 giai đoạn Từ năm 2005 cho tới 2009, trung tâm tiến hành PGT-M dựa trên lựa chọn các phôi nữ, bằng cách sử dụng kỹ thuật FISH hoặc PCR [68] Hạn chế của phương pháp này là đã loại bỏ các phôi nam không mang gen bệnh Số phôi được chuyển là 24/132 phôi được chẩn đoán, tỷ lệ chuyển phôi là 10,3%, tỷ lệ sinh sống trên chu kỳ chuyển là 10,3% Từ năm 2010 tới năm 2015, trung tâm trên đã tiến hành lựa chọn các marker giúp chẩn đoán gián tiếp bệnhHemophilia với kỹ thuật Multiplex PCR Bộ 6 STR nằm trên gen hoặc gần gen F8 đã được xác định để đảm bảo liên kết chặt chẽ với gen F8 gồm:DXS9901, DXS8087, DXS1073, STR13, DXS1108, STR22 Bốn marker(DXS1073, STR13, STR22, DXS1108) được sử dụng có chỉ số dị hợp tử cao(>90%) Đặc biệt, STR13 (gồm các đoạn lặp TG) ở intron 13 và STR12 (gồm các đoạn lặp GT) nằm ở intron12 DXS1073 (gồm các đoạn lặp TG), vàDXS1108 (gồm các đoạn lặp CA) là các STR ngoại gen, nằm gần và liên kết với gen F8, và được xác định ở khoảng 235kb centromere và khoảng 610kb telomere, tương ứng [68] Phương pháp gián tiếp sử dụng các STR đã cho kết quả tốt hơn so với phương pháp chỉ lựa chọn giới tính của phôi Số phôi được chuyển là 48/205 phôi được chẩn đoán, tỷ lệ chuyển phôi là 16,7%, tỷ lệ sinh sống trên chu kỳ chuyển là 16,7% [68] Phương pháp chẩn đoán gián tiếp dựa trên Multiplex PCR đã làm giảm kinh phí, thời gian, công sức chẩn đoán và có thể áp dụng cho nhiều loại đột biến gen F8 khác nhau.

Như vậy, việc lựa chọn các STR có chỉ số dị hợp tử cao, liên kết chặt chẽ với gen F8 là rất quan trọng Tuy nhiên, chỉ số dị hợp tử của các STR lại phụ thuộc vào quần thể Trong nghiên cứu của Zhao M và cộng sự (2017) đã đưa ra 13 STR có tính đa hình cao với quần thể người Trung quốc và người da trắng sinh sống tại Singapore nằm trong vòng 0,6Mb gần F8 (DXS1073, REN90682, REN90833, F8Int25.2, F8Int22, F8Int21, F8Int13.2, F8Int1, stSG604486, HEMA154130.5, TMLHEInt2, TMLHEInt1.1, HEMA154498.9 cùng với AMELX/Y) Tần số dị hợp tử lý thuyết (He) và tần số dị hợp tử quan sát (Ho) của các marker ở quần thể người da trắng (0,48-0,77 và 0,49- 0,84; tương ứng) và người gốc Trung (0,49-0,79 và 0,43-0,78; tương ứng)

[57] Bộ STR của Zhao M và cộng sự nghiên cứu chẩn đoán trên các phôi bào nhưng chưa có chu kì IVF nào được thực hiện ở thời điểm công bố Từ nghiên cứu trên có thể thấy, chỉ số Ho và He của các STR sẽ khác nhau ở các quần thể người da trắng và người Trung Quốc

Như vậy, để áp dụng phương pháp liên kết gen để chẩn đoán Hemophilia

A cho người Việt Nam, một vấn đề quan trọng được đặt ra là nghiên cứu và lựa chọn các STR có tính dị hợp tử cao đối với quần thể người Việt Nam.

Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, vào năm 2016 đã có nghiên cứu thuộc đề tài KC04-17 chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A bằng microsatellite DNA Nghiên cứu đã tiến thành kỹ thuật chẩn đoán trước làm tổ cho các gia đình mang gen bệnh Hemophilia A, kỹ thuật được thực hiện trên phôi giai đoạn phân cắt (ngày 3)

[8] Các tác giả đã sử dụng bộ 14 STR phục vụ sàng lọc người mẹ mang gen và chẩn đoán trước làm tổ trên các phôi thụ tinh trong ống nghiệm Các thành công đạt được của nghiên cứu đánh dấu mốc đầu tiên tại Việt Nam trong chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A Để đạt được các kết quả trong nghiên cứu, các tác giả đã vượt qua các khó khăn về thời gian và công sức thực hiện khi tiến hành sàng lọc bằng xác định các STR dị hợp tử sử dụng kỹ thuật Singleplex PCR để tìm các chỉ thị dị hợp tử trên mẫu DNA của mẹ và trẻ bị bệnh Trong quá trình thực hiện, cần tiến hành tối thiểu 14 phản ứng PCR mỗi mẫu nghiên cứu nhằm tìm được chỉ thị dị hợp tử trên mẫu máu mẹ (không xác định các alen của các STR trên mẫu của bố).

Tiêu chuẩn lựa chọn chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán cần có tần số dị hợp tử quan sát >50% Tần số dị hợp tử quan sát quyết định giá trị của STR đóng góp thông tin trong chẩn đoán Tần số dị hợp tử quan sát càng cao, giá trị trong chẩn đoán càng cao Tuy nhiên, khi tần số dị hợp tử quan sát thấp, việc sử dụng các STR này trong sàng lọc trên các mẫu bố mẹ sẽ gây lãng phí về kinh tế, thời gian và công lao động Vấn đề đặt ra hiện nay là cần có nghiên cứu sàng lọc tần số dị hợp tử của các STR bệnh Hemophilia A trên đối tượng người Việt Nam. Ưu điểm vượt trội của kỹ thuật STR là giúp hạn chế tỷ lệ nhân gen thất bại, tỷ lệ ADO… Tuy nhiên, những vấn đề này vẫn có thể xuất hiện khi tiến hành kỹ thuật trên những mẫu DNA kém chất lượng, hàm lượng DNA đưa vào rất thấp như trong chẩn đoán trên 1 tế bào trong chẩn đoán trước làm tổ

[69] Do vậy, khi thực hiện kỹ thuật, yêu cầu đặt ra là phải kiểm tra, đánh giá tỷ lệ ADO, tỷ lệ xác định kiểu gen thành công, thất bại trong thực hành, trước khi đưa vào chẩn đoán trước làm tổ Hiện nay, chưa có báo cáo nào đánh giá tỷ lệ ADO trên 1 tế bào đối với bệnh Hemophilia A Chính vì vậy, việc nghiên cứu đánh giá tỷ lệ ADO trên tế bào phôi cũng được đặt ra và hết sức cần thiết.

Đ i t ống nghiệm ượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu ng, đ a đi m, th i gian nghiên c u ịa điểm, thời gian nghiên cứu ểm, thời gian nghiên cứu ời gian nghiên cứu ứu

Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng đánh giá tính đa hình của bộ chỉ thị STR liên kết với gen F8 là

103 mẫu máu của những người phụ nữ mang gen bệnh Hemophilia A tình nguyện thu thập được tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương từ tháng

9 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019 Đánh giá kết quả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho một số cặp vợ chồng mang gen là 16 gia đình mang gen bệnh Hemophilia A tình nguyện tham gia điều trị tại Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội, mẫu máu của các thành viên trong gia đình (bố, mẹ, con hoặc người thân) và mẫu phôi sử dụng cho chẩn đoán được cung cấp tại đây.

Các cặp vợ chồng tham gia nghiên cứu cần thỏa mãn tiêu chuẩn sau:

+ Người vợ mang gen F8 bị đột biến.

+ Cơ quan sinh sản bình thường về giải phẫu và chức năng: người vợ có tử cung bình thường, dự trữ buồng trứng bình thường; người chồng có tinh dịch đồ bình thường.

+ Người vợ trong độ tuổi từ 18 - 40 tuổi.

+ Có ít nhất một phôi nang sinh thiết được.

+ Tình nguyện tham gia nghiên cứu.

+ Không thực hiện theo các hướng dẫn của bác sĩ và nghiên cứu viên.+ Không đủ hồ sơ nghiên cứu hỗ trợ sinh sản.

Thời gian, địa điểm nghiên cứu

+ Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương: cung cấp các mẫu máu thiết kế bộ chỉ thị STR.

+ Phòng Phân tích DNA, Học viện Quân Y: xét nghiệm di truyền.

+ Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội: thực hiện quy trình thụ tinh trong ống nghiệm và cung cấp các mẫu phôi phục vụ xét nghiệm.

Ph ương pháp nghiên cứu ng pháp nghiên c u ứu

Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu ở mục tiêu 1 là nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích.Thiết kế nghiên cứu ở mục tiêu 2 là nghiên cứu can thiệp không đối chứng.

Phương pháp chọn mẫu và cách tính cỡ mẫu

- Mẫu nghiên cứu mục tiêu 1:

Xác định cỡ mẫu nhằm xác định chỉ số dị hợp tử của các chỉ thị STR theo công thức như sau:

+ Z1-α/2 là giá trị biểu thị độ tin cậy Nếu độ tin cậy của nghiên cứu là 95%, tương ứng với α = 5% thì Z1-α/2 = 1,96.

+ p: chỉ số dị hợp tử của chỉ thị STR có chỉ số dị hợp tử thấp nhất là 0,45 (theo Chen và cộng sự, 2016) [57].

+ ∆ : mức sai lệch giữa tỷ lệ của mẫu và quần thể: 0,01.

+ Áp dụng vào công thức, cỡ mẫu tối thiểu thu được là 95 mẫu.

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 103 mẫu máu từ nguồn cung cấp đối tượng nghiên cứu nêu trên

- Mẫu nghiên cứu mục tiêu 2: lấy mẫu thuật tiện, đã lấy được 16 gia đình đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu Các gia đình tình nguyện tham gia nghiên cứu đã được xét nghiệm di truyền tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã được chẩn đoán là có người vợ mang gen F8 đột biến.

Phương tiện và vật liệu nghiên cứu

2.2.3.1 Phương tiện và vật liệu labo xét nghiệm di truyền

- Hóa chất dùng để tách chiết DNA: QIAGEN blood Minikit, cồn tuyệt đối dùng trong thí nghiệm sinh học phân tử Merk

- Hóa chất dùng để khuếch đại toàn hệ gen tế bào: REPLI-g Single Cell Kit QIAGEN

- Hóa chất để thực hiện kỹ thuật PCR: QIAGEN Multiplex PCR 2X Mastermix, QIAGEN Q-Solution, các cặp mồi (IDT).

- Hóa chất để điện di agarose sản phẩm PCR: Bột Agarose LE (Roche), TBE Buffer 10X (Serva), Agarose gel loading dye 6x (Intron), 100bp Ladder (Norgen), RedSafe Nucleic Acid staining solution (Intron).

- Hóa chất để điện di mao quản sản phẩm PCR: CE Running buffer 10X (MCLAB), Nano POP4 dùng cho máy ABI3130/3130XL (MCLAB), Size standard Genscan 500LIZ (Thermo Fisher Scientific), Hi-Di Formamide (Thermo Fisher Scientific).

- Dụng cụ và thiết bị: Ống Eppendorf 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml; ống lấy máu chống đông EDTA; găng tay vô khuẩn; khẩu trang y tế; hộp giữ mẫu; máy Proflex PCR System (Thermo Fisher Scientific); máy đo NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific); máy đo Qu-bit 2.0 Fluorometric Quantitation (Life Technologies); bộ điện di NANOPAC 300P (Cleaver); tủ lạnh sâu: -

20 o C, -80 o C (Panasonic); máy ly tâm lạnh Hitech và ly tâm để bàn Boeco;máy giải trình tự gen ABI Prism 3130XL Genetic Analyzer (Thermo Fisher

Scientific); tủ an toàn sinh học cấp II dùng trong sinh học phân tử; máy ủ nhiệt và lắc MTH - 100 (Holdwell), máy lắc MS3 basic (IKA); cân điện tử Practum (Sartorius); pipet, đầu tips các loại sử dụng cho kỹ thuật sinh học phân tử.

2.2.3.2 Thiết bị và hóa chất tại trung tâm IVF

- Thiết bị: Máy siêu âm; bộ tủ cấy; bộ sinh thiết phôi; các thiết bị đông phôi; các thiết bị rã đông phôi; tủ ấm 37 0 C, 6% CO2, 5% O2, 89%N2 (Astec, Nhật); tủ ấm khí trộn Benchtop - Origio, BT 37 (Đan Mạch); kính hiển vi soi ngược (NiKon Tiu 21, Nhật) có gắn hệ thống kính tương phản NMIC, máy ảnh kỹ thuật số và bộ vi thao tác Narishige, hệ thống laser Saturn IR của Anh; kính hiển vi soi nổi (Zeiss, Đức); hood vô trùng (Sanyo, Nhật); workstation (K System, Đan Mạch); IVF Chamber (Mỹ); micropipet, tripper; kim chọc hút noãn.

- Dụng cụ tiêu hao: hộp cấy nunc, pipette 1ml, 5ml, 10ml, đĩa petri đường kính 30mm, 100mm, pipette pasteur, kim tiêm tinh trùng vào bào tương noón, kim giữ, kim sinh thiết cú đường kớnh 25àm.

+ Thuốc nội tiết: Gonal-F (Serono, Thụy Sỹ), Pregnyl 5000 IU

+ Môi trường rửa giao tử: G-MOPS (Vitrolife, Thụy Điển).

+ Môi trường lọc rửa tinh trùng (Vitrolife, Thụy Điển)

+ Môi trường nuôi cấy phôi: G-IVF, G1 pus, G2 plus (Vitrolife, Thụy Điển). + Hyase, OVOIL (Vitrolife, Thụy Điển).

+ Kít đông và rã phôi của hãng Kitazato.

Các kỹ thuật được sử dụng

2.2.4.1 Giai đoạn đánh giá tính đa hình của bộ chỉ thị STR liên kết với gen F8 phục vụ chẩn đoán trước làm tổ trên các mẫu phôi bào ở phụ nữ mang gen bệnh Hemophilia A

- Kỹ thuật lựa chọn chỉ thị STR:

Sử dụng cơ sở dữ liệu STR và phần mềm Tandem Repeat Finder (TRF) cung cấp bởi Gary Benson và cộng sự (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html) để tiến hành lựa chọn chỉ thị xác định đột biến gen F8 theo tiêu chuẩn hướng dẫn bởi Machado F.B và cộng sự năm 2009 [3], sử dụng trình tự tham chiếu cho NST X của người trên NCBI với mã truy cập NC_000023: cài đặt thông số align bao gồm Match: 2, Mismatch: 2, Indels: 7; vị trí tìm kiếm cách 1Mb về phía trước, sau gen F8 và trong gen; tiêu chí chọn lọc: số lần lặp trình tự từ 2 đến 6 với điểm Align thấp nhất với trình tự trên NST X tương ứng là 54, 80,

66, 52 (là điểm thấp nhất của các chỉ thị nội gen F8 có số lần lặp như vậy và được đánh giá là có giá trị đa hình di truyền thông qua xác định kiểu gen trực tiếp), % Match ≥ 80.

Hình 2.1 Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để lựa chọn

* Nguồn: Ảnh tự chụp từ phần mềm Để lựa chọn hệ thống chỉ thị STR có thể sử dụng trên quần thể ngườiViệt Nam: từ những STR đã lựa chọn được từ phần mềm TRF, dựa trên dữ liệu được báo cáo từ các nghiên cứu đã tiến hành trên quần thể người Brazil,

New Zealand, Trung Quốc, tiếp tục chọn ra các chỉ thị STR có các chỉ số He, Ho lớn hơn 0,5 và có mồi khuếch đại đáp ứng yêu cầu khuyến cáo của QIAGEN bao gồm: kích thước 20 - 30 nucleotide, Tm ≥ 60 o C, có không quá 3 nucleotide G hoặc C ở đầu 3’ và 2 mồi không bắt cặp nhau ở đầu 3’[3], [4], [5], [6], [7]. Tiếp tục chọn lọc theo kích thước sản phẩm khuếch đại sao cho các sản phẩm cách nhau khoảng 10 nucleotide, từ đó xác định kích thước sản phẩm nhỏ nhất và chia làm các nhóm với khoảng cách sản phẩm khuếch đại là 10 nucleotide Cuối cùng chọn chỉ thị đại diện sao cho tổng thể có cả chỉ thị trước, trong và sau gen F8.

Sau khi lựa chọn được các STR và mồi khuếch đại đáp ứng tiêu chí sàng lọc, sử dụng công cụ In-silico PCR tại https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr với hệ gen tham chiếu là GRCh38/hg38 kết hợp phần mềm so sánh trình tự BLAST trên NCBI nhằm xác định sơ bộ các allele của loci để loại bỏ các chỉ thị có trình tự mồi bắt cặp với các đoạn lặp Alu và các trình tự không đặc hiệu trên NST khác, sau đó thiết kế gắn huỳnh quang cho 1 mồi trong mỗi cặp sao cho các sản phẩm của các mồi cùng màu huỳnh quang có thể phân biệt được với nhau.

Sử dụng QIAGEN blood Minikit:

+ Chuẩn bị hóa chất trước thí nghiệm:

Tất cả hóa chất phải đưa về 15-25 0 C trước khi sử dụng.

Lắc kỹ các lọ hóa chất trước khi tiến hành quy trình. Đặt nhiệt độ của block máy ủ nhiệt ở 70 0 C trước khi tiến hành thí nghiệm. AW1, AW2 được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất [70].

+ Thực hiện quy trình gồm các bước sau:

1 Cho 20 àl proteinase vào ống Eppendorf 1,5 ml.

2 Cho tiếp 200 àl mẫu (mỏu, dịch ối) và 200 àl AL vào ống, đúng nắp, vortex 15 giây.

4 Thờm tiếp 200 àl cồn tuyệt đối vào ống, đúng nắp, vortex 15 giõy.

5 Chuyển toàn bộ hỗn dịch ở bước 4 vào cột lọc QIAamp, không làm ướt mép ống, đóng nắp, ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút; đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa dịch lọc đi [70].

6 Mở nắp cột lọc, thờm 500 àl AW1, khụng làm ướt mộp cột, đúng nắp, ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút, đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa dịch lọc đi.

7 Mở nắp cột lọc, thờm 500 àl AW2, khụng làm ướt mộp cột, đúng nắp, ly tâm ở 18000 vòng/phút trong 2 phút, đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa dịch lọc đi.

8 Ly tâm ở 18000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ ống 2 ml.

9 Đặt cột lọc vào ống Eppendorf 1,5 ml sạch, thờm 50 àl AE buffer vào trung tâm của màng lọc, không chạm vào màng lọc; ủ ở nhiệt độ phòng trong

10 Ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA hòa tan từ màng lọc.

11 Bảo quản ở 2 - 8 o C và thực hiện phản ứng trong cùng ngày tách.

- Kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen:

Sử dụng REPLI-g Single Cell Kit QIAGEN (USA).

+ Rã đông REPLI-g sc DNA Polymerase trên đá, các hóa chất còn lại rã đông ở nhiệt độ phòng.

+ Buffer D2 pha sẵn phải được sử dụng trong vòng 3 tháng.

+ Đối chứng õm cú thể cú 40àg sản phẩm phụ ngẫu nhiờn do mồi dimers nhưng không ảnh hưởng tới chất lượng của mẫu xét nghiệm và không gây dương tính giả trong xét nghiệm.

+ Bổ sung 500àl H2O vào ống Buffer DLB trước khi sử dụng (sau khi pha loãng phải sử dụng trong vòng 6 tháng và lưu trữ ở -20 o C).

+ Nếu sử dụng máy luân nhiệt (PCR) thay cho bể ổn nhiệt, cài đặt nhiệt độ làm nóng nắp block ở 70 O C [71].

1 Cho 4 àl dung dịch PBS chứa tế bào vào ống PCR Nếu thể tớch mẫu ban đầu ớt hơn 4àl, bổ sung thờm PBS để thu được tổng dung dịch chứa tế bào là 4 àl.

2 Chuẩn bị Buffer D2 (Denaturation buffer) theo bảng 2.1 [71].

Số ống phản ứng DTT 1M (àl) Buffer DLB (àl)

3 Thờm 3 àl Buffer D2 vào mỗi ống Bỳng nhẹ để mix và spin down.

5 Thờm 3 àl Stop Solution vào mỗi ống Bỳng nhẹ để mix và spin down. Đặt trên đá lạnh/khay lạnh.

6 Rã đông REPLI-g sc DNA Polymerase trên đá và rã đông các hóa chất khác ở nhiệt độ phòng.

7 Chuẩn bị Mastermix theo bảng 2.2 (đã lấy dư).

REPLIC-g sc DNA Polymerase (àl)

8 Thờm 40àl mastermix vào mỗi ống.

9 Cài đặt chu trình nhiệt:

30 0 C trong 8 giờ, 65 0 C trong 3 phút, 4 0 C lưu trữ

Cài đặt nắp block nhiệt ở 70 0 C.

10 Lưu trữ và bảo quản mẫu ở -20 0 C.

- Kiểm tra nồng độ DNA sau WGA:

Nồng độ của sản phẩm khuếch đại hệ gen được tính bằng cách đo nồng độ của mẫu sản phẩm pha loãng, sau đó nhân hệ số để có nồng độ gốc Các sản phẩm bước WGA được pha loãng tỷ lệ 1:10 trước khi tiến hành đo Chuẩn bị dung dịch Qu-bit working solution theo tỷ lệ: 1àl reagent (dye): 100àlBuffer Bổ sung 190àl dung dịch Qu-bit working solution vào cỏc ống 0,5ml mới đó chuẩn bị trước đú Tiếp tục thờm 10àl chất chuẩn 1 và 2 vào hai ống0,5ml đó chứa 190àl dung dịch Qu-bit working solution Cỏc ống cũn lại được bổ sung thờm 10àl cỏc mẫu đó pha loóng tương ứng Trộn đều cỏc ống bằng vortex và ly tâm nhanh Chuẩn máy đo Qu-bit sử dụng 2 ống chất chuẩn vừa chuẩn bị và đo các mẫu rồi ghi lại nồng độ các mẫu.

+ Sử dụng các mồi được thiết kế như trong bảng 2.3.

Bảng 2.3 Trình tự mồi khuếch đại các chỉ thị STR.

Trình t m i (5’-3’) ự mồi (5’-3’) ồi S n ảng phẩ m (bp)

X1F (Xanh da tr i) ời gian nghiên cứu

Trình t m i (5’-3’) ự mồi (5’-3’) ồi S n ảng phẩ m (bp) stSG6044

+ Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi: sau khi sử dụng công cụ phân tích tại http://sg.idtdna.com/calc/analyzer, xác định được nhiệt độ Tm Từ đó tính toán nhiệt độ gắn mồi trung bình của tất cả các cặp mồi Tiến hành phản ứng PCR cho riêng mỗi cặp mồi theo gradient nhiệt độ gắn mồi trung bình với khoảng cách 5 0 C Dựa trên kết quả điện di trên gel agarose 2% (120V trong 30 phút) tiếp tục tối ưu bằng gradient nhiệt độ với khoảng cách 1 0 C.

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng Singleplex PCR (tổng thể tớch phản ứng 20àl)

Thành ph nần N ng đồi ộ Th tớch (àl/ ng)ể tớch (àl/ ống) ống)

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng Singleplex PCR

Nhi t đệt độ ộ Th i gianời gian S chu kỳống)

Biến tính ban đầu 95 0 C 5 phút 1

D i nhi t đ t i uả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ệnh Hemophilia A ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ống nghiệm ư hóa 30 giây

Kéo dài cuối cùng 72 0 C 5 phút 1

B o qu nả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho 11 0 C ∞ 1

Đánh giá tính đa hình c a b ch th STR liên k t v i gen F8 ph c v ủa bộ chỉ thị STR liên kết với gen F8 phục vụ ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ỉ tiêu nghiên cứu ịa điểm, thời gian nghiên cứu ế giới và Việt Nam ớc làm tổ ụ tinh trong ống nghiệm ụ tinh trong ống nghiệm

Kết quả các STR lựa chọn bằng công cụ Tin sinh học

Sau quá trình lựa chọn bằng công cụ Tin sinh học kết hợp tham khảo các công bố trên thế giới về chỉ số dị hợp tử của các STR, bộ chỉ thị STR ban đầu gồm 13 chỉ thị đã được thiết lập theo sau:

Bảng 3.1 Thông tin các STR lựa chọn được

TT Tên STR V trí trênị trí trên

Kích thướcc s n ph mảng ẩ PCR (bp)

TT Tên STR V trí trênị trí trên

Kích thướcc s n ph mảng ẩ PCR (bp)

Kho ng cách tính theo bp t đ u mút cánh ng n NST X, theo trình tả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ừ máu ần D2 ắn màu huỳnh quang ự mồi khuếch đại các chỉ thị STR.tham chi u NC_000023 human X chromosome Gen ế giới và Việt Nam F8 n m trongằng phương pháp Qu-bit kho ng 153717260-153904192 bp.ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho

Hình 3.1 Sơ đồ vị trí các STR trên NST X sử dụng trong nghiên cứu

Bộ chỉ thị gồm 13 STR có 03 chỉ thị nằm phía trước gen F8 (DXS1073,

REN90682, REN90833), 05 chỉ thị nằm trong gen F8 (F8Int25.2, F8Int22, F8Int21, F8Int13.2, F8Int1) và 05 chỉ thị nằm phía sau gen này (StSG604486, HEMA154130.5, TMLHEInt2, TMLHEInt1.1, HEMA 154498.9) Khoảng cách từ các chỉ thị đến gen F8 nằm trong khoảng 1 Mb Tần số dị hợp tử quan sát và tần số dị hợp tử lý thuyết của bộ chỉ thị này sẽ được kiểm tra trên quần thể người Việt Nam; sau đó, bộ chỉ thị sẽ được đồng khuếch đại với chỉ thị giới tính Amelogenin để phục vụ quy trình PGT-M.

Sau khi lựa chọn được các marker, chúng tôi tiến hành thiết kế mồi để khuếch đại các marker bằng phần mềm Primer 3.

3.1.2 Kết quả tối ưu hóa quy trình multiplex PCR khuếch đại các STR trên các mẫu máu

Các bước tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi khuếch đại 13 STR theo thông tin bảng 2.3 (mã hóa từ X1 đến X6 và X8 đến X14) và chỉ thị NST giới tính Amelogenin (mã hóa là X15) đều thực hiện trên bộ mồi thường với trình tự thiết kế tương tự bộ mồi gắn huỳnh quang, khuôn DNA tách từ mẫu máu đạt yêu cầu về độ tinh sạch (A260/A280 đạt từ 1,8 đến 2,0) sau khi tách chiết và được pha loóng về nồng độ 10 ng/àl để tiến hành PCR

Thông tin trình tự mồi thể hiện trong bảng 2.3

Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi:

Từ kết quả xác định Tm của 14 cặp mồi trên http://sg.idtdna.com/calc/analyzer, nhiệt độ gắn mồi trung bình trên lý thuyết của 14 cặp mồi này là 61,3 0 C Tiến hành Singleplex PCR theo dải nhiệt độ

55 0 C - 60 0 C - 65 0 C và phân tích sản phẩm trên gel agarose Sản phẩm được điện di trên bản gel agarose 1% 120V trong 30 phút Thể tích trong mỗi giếng là 10àL Nhiệt độ cho băng sản phẩm rừ nột và cường độ tớn hiệu ổn định nhất cho cả 15 cặp mồi sẽ được lựa chọn làm nhiệt độ gắn mồi tối ưu.

Sau đây là kết quả điện di agarose tối ưu hóa các mồi ở dải nhiệt độ 55, 60, 65 0 C:

Hình 3.2 Kết quả tối ưu hóa các mồi X1 đến X5 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65 0 C

Hình 3.3 Kết quả tối ưu hóa các mồi X6 đến X10 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65 0 C

Hình 3.4 Kết quả tối ưu hóa các mồi X11 đến X15 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65 0 C Kết quả cho thấy cặp mồi X11 và X14 cho sản phẩm tốt nhất ở 65 0 C (mũi tên vàng), cặp mồi X12 và X15 đều có tín hiệu sản phẩm đặc hiệu nhiều ở cả 3 dải nhiệt độ (mũi tên đỏ), cặp mồi X13 không có tín hiệu sản phẩm hoặc chỉ có tín hiệu sản phẩm không đặc hiệu ở cả 3 dải nhiệt độ.

Từ các kết quả tối ưu hóa ở 3 dải nhiệt độ trên, có thể nhận thấy 14 cặp mồi này có nhiệt độ gắn mồi tối ưu không đồng nhất nhau Việc tối ưu nhiệt độ gắn mồi không khả thi Để khắc phục tình trạng trên, chúng tôi sử dụng QIAGEN Multiplex PCR Mastermix với ưu điểm tối ưu điều kiện phản ứng đa mồi về cùng một điều kiện chu trình nhiệt chung của nhà sản xuất (với nhiệt độ gắn mồi là 60 0 C), không phụ thuộc nhiều vào thông số của từng cặp mồi trong phản ứng

Tất cả 14 cặp mồi đều được ghép vào cùng một ống phản ứng QIAGENMultiplex PCR Mastermix với cựng một nồng độ phản ứng là 0,2 àM Sản phẩm PCR sau đó tiếp tục được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR gắn huỳnh quang phục vụ cho bước điện di mao quản Việc gắn màu huỳnh quang phụ thuộc kích thước sản phẩm PCR của các mồi, đảm bảo phân biệt được sản phẩm giữa các cặp mồi có cùng màu huỳnh quang theo thông tin bảng 2.3.Kết quả điện di mao quản được phân tích bằng phần mềm Genemapper version 4.0 để từ đó điều chỉnh nồng độ mồi bằng cách tăng nồng độ các cặp hoạt động yếu, giảm nồng độ cỏc cặp hoạt động mạnh theo gradient 0,05 àM dựa trên cường độ tín hiệu sản phẩm khuếch đại

Hình 3.5 Kết quả điện di mao quản phản ứng multiplex PCR 14 cặp mồi có cựng nồng độ phản ứng là 0,2àM

Chú thích: Peak sản phẩm X1 tương ứng với DXS1073 Tương tự, các peak khác tương ứng với các STR như sau: X2 (REN90682), X3 (REN90833), X4 (F8Int25.2), X5 (F8Int22), X6 (F8Int21), X8 (F8Int13.2), X9 (F8Int1), X10 (stSG604486), X11 (HEMA154130.5), X12 (THLMEInt2), X13 (THLMEInt1.1), X14 (HEMA154498.9).

Kết quả cho thấy có sự xuất hiện sản phẩm tương ứng về kích thước và màu huỳnh quang của cả 14 cặp mồi Tuy nhiên, cường độ tín hiệu của các cặp mồi này không đồng đều nhau và có sản phẩm có cường độ tín hiệu khá thấp (thậm chí có sản phẩm cường độ tín hiệu dưới 500) Do đó dựa trên các kết quả này, nồng độ của từng mồi được hiệu chỉnh theo gradient 0,05 àM. Sau nhiều lần hiệu chỉnh, nồng độ phản ứng của từng cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR được xác định như bảng 3.2.

Bảng 3.2 Nồng độ mồi trong phản ứng multiple PCR cho DNA từ máu

Tên m iồi Màu huỳnh quang N ng đ (àM)ồi ộ

X1 Xanh da tr iời gian nghiên cứu 0,25

Chú thích: Các mồi tương ứng với các STR là: X1 (DXS1073), X2 (REN90682), X3 (REN90833), X4 (F8Int25.2), X5 (F8Int22), X6 (F8Int21), X8 (F8Int13.2), X9 (F8Int1), X10 (stSG604486), X11 (HEMA154130.5), X12 (THLMEInt2), X13 (THLMEInt1.1), X14 (HEMA154498.9).

Nồng độ mồi X15 là thấp nhất (0,15 àM) và n ng đ m i X8 là caoồ nghiờn cứu ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoỏn trước làm tổ ồ nghiờn cứu nh t (0,7 àM).ất cỏc đột biến gen F8 ở cỏc gia đỡnh

Hình 3.6 Kết quả điện di mao quản phản ứng multiplex PCR 14 cặp mồi sau khi đã hiệu chỉnh nồng độ phản ứng

Kết quả điện di cho thấy cường độ tín hiệu sản phẩm của 14 cặp mồi đã được cải thiện rõ rệt, hầu hết các chỉ thị đều có 2 tín hiệu sản phẩm có kích thước khác nhau tương ứng với 2 alen dị hợp tử với cường độ sản phẩm tương đương nhau

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR tối ưu cho DNA từ máu

Chu trình Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

Biến tính ban đầu 95 0 C 15 phút 1

Kéo dài cuối cùng 60 0 C 30 phút 1

Phản ứng Multiplex PCR tối ưu diễn ra với 30 chu kỳ, với tổng thời gian là 135 phút.

Chỉ số dị hợp tử của các STR

Sau khi tối ưu hóa được phản ứng Multiplex PCR, tiến hành các phản ứng Multiplex PCR, gắn mồi huỳnh quang và điện di mao quản với 103 mẫu tách từ máu của các tình nguyện viên để xác định chỉ số dị hợp tử Ho, He Kết quả được thống kê dưới bảng sau:

Bảng 3.4 Tần số alen của 13 STR

F8Int13.2 REN90682 F8Int25.2 F8Int22 THLMEInt2 F8Int1 stSG604486 REN90833 THLMEInt1.1

Qua quá trình khảo sát 13 STR cho thấy có tổng cộng 189 alen và mỗi STR có từ 8 - 24 alen STR có nhiều alen nhất là HEMA154498.9 (24 alen) và STR ít alen nhất là F8Int22 (8 alen).

Căn cứ vào tần số alen của 13 STR, kết quả tính toán chỉ số dị hợp tử được thể hiện trong sau:

Bảng 3.5 Kết quả tính toán chỉ số Ho, He

TT Markers D h p tị trí trên ợp tử ử T ngổn H o He

Ho: Observed Heterozygosity (tần số dị hợp tử quan sát);

He: Expected Heterozygosity (tần số số dị hợp tử lý thuyết).

Kết quả xác định chỉ số Ho và He cho thấy, tất cả các chỉ thị đều có chỉ số Ho và He trên 0,5, đảm bảo thông tin cao Giá trị Ho của các chỉ thị nằm trong khoảng từ 0,55 (F8Int13.2) và 0,85 (REN90682); giá trị He của các chỉ thị thấp nhất là 0,77 (REN90833, F8Int22 và F8Int1) và cao nh t là 0,89ất các đột biến gen F8 ở các gia đình (HEMA154130.5) D a trên các k t qu thu đự mồi khuếch đại các chỉ thị STR ế giới và Việt Nam ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ượng, địa điểm, thời gian nghiên cứuc, t t c các ch th đ uất các đột biến gen F8 ở các gia đình ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ỉ tiêu nghiên cứu ịa điểm, thời gian nghiên cứu ền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ có ch s d h p t cao trên qu n th ngỉ tiêu nghiên cứu ống nghiệm ịa điểm, thời gian nghiên cứu ợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu ử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ần D2 ểm, thời gian nghiên cứu ười gian nghiên cứui Vi t Nam.ệnh Hemophilia A

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ phần trăm mẫu máu theo số lượng chỉ thị dị hợp tử Ngoài việc xác định tần số dị hợp tử quan sát và tần số dị hợp tử lý thuyết, số lượng chỉ thị dị hợp tử của mỗi mẫu máu cũng được thống kê nhằm xác định tính thông tin của cả bộ chỉ thị khi áp dụng trên từng mẫu máu Dữ liệu thống kê cho thấy trong số 103 mẫu máu trong nghiên cứu thì phần lớn là có từ 4 - 13 chỉ thị dị hợp tử (95,15% số mẫu), có ít nhất 1 chỉ thị dị hợp tử chỉ chiếm 0,97% số mẫu.

Bi ểu đồ 3.2 Tỷ lệ phần trăm các mẫu về số lượng các marker nội gen khác nhau (n3)

Sự phân bố của các chỉ thị dị hợp tử so với gen F8 trên từng mẫu máu đã được đánh giá theo biểu đồ 3.2 Biểu đồ trên cho thấy đa số các mẫu máu

T l các m u (%) ỷ lệ ADO của các markers ệnh Hemophilia A ẫu phôi bào ở phụ nữ mang gen bệnh

S ch th d h p t n i gen ống nghiệm ỉ tiêu nghiên cứu ịa điểm, thời gian nghiên cứu ịa điểm, thời gian nghiên cứu ợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu ử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ nghiên cứu có ít nhất 1 chỉ thị dị hợp tử nội gen Số mẫu máu không có chỉ thị dị hợp tử nội gen chiếm tỷ lệ thấp (15,53%).

Tỷ lệ số mẫu nghiên cứu (%)

Số lượng marker trước gen

Số lượng marker sau gen

Biểu đồ 3.3 Tỉ lệ phần trăm mẫu dị hợp tử theo số lượng chỉ thị nằm phía trước và phía sau gen F8 (n3) Biểu đồ trên cho thấy các bong bóng có mũi tên màu xanh lá là các bong bóng đại diện cho tỷ lệ phần trăm mẫu máu không có chỉ thị dị hợp tử nằm trước gen (3,9%).

Các bong bóng có mũi tên màu cam là các bong bóng đại diện cho tỷ lệ mẫu máu không có chỉ thị dị hợp tử nằm sau gen (2,0%)

Các bong bóng nằm trong khung màu đỏ là các bong bóng đại diện cho tỷ lệ phần trăm mẫu máu có đồng thời ít nhất một chỉ thị dị hợp tử nằm trước gen và ít nhất một chỉ thị dị hợp tử nằm sau gen F8 Như vậy, có 94,1% số mẫu máu có ít nhất 2 chỉ thị dị hợp tử nằm cả 2 phía so với gen F8

Như vậy, bộ chỉ thị STR phân bố đồng đều ở cả 2 phía của gen F8.Tóm lại, qua quá trình lựa chọn các STR và tối ưu hóa quy trình multiplex PCR khuếch đại các STR cho kết quả: có ít nhất 1 STR ở trước hoặc sau gen trong khoảng 1Mb.

Chuẩn hóa quy trình PGT - M trên mẫu tế bào phôi 73 3.2 Đánh giá k t qu ch n đoán trế giới và Việt Namả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A choẩn đoán trước làm tổ ước làm tổ c làm t b nh Hemophilia A choổ ệnh Hemophilia A

Tiến hành phản ứng Multiplex PCR khuếch đại 14 chỉ thị STR liên kết gen F8 trên sản phẩm WGA của 05 mẫu tế bào sinh thiết từ phôi dư 5 ngày tuổi, được kiểm tra bằng điện di agarose và đo nồng độ sau WGA bằng máy đo Qu-bit 4.0 (Thermo) cho kết quả sau:

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm sau WGA

MI1-5: s n ph m WGA c a các t bào sinh thi t t phôi; M1kb: marker 1ản: ẩn đoán ủa các tế bào sinh thiết từ phôi; M1kb: marker 1 ến hành IVF: ến hành IVF: ừ phôi; M1kb: marker 1 kb

Qua hình trên cho thấy tất cả các mẫu sản phẩm WGA của các tế bào sinh thiết đều có thể phát hiện bằng điện di trên gel agarose Hình ảnh điện di gel agarose của sản phẩm WGA trên hình 3.7 là một vệt tập trung phần lớn trong khoảng kích thước 10 kb Vì đây không phải phương pháp khuếch đại một trình tự đặc hiệu mà khuếch đại toàn bộ hệ gen nên sản phẩm phân tích là các vệt thay vì các băng rõ ràng Các kích thước này tương ứng với kích thước khuếch đại do nhà sản xuất đưa ra.

Bảng 3.6 Kết quả định lượng sản phẩm WGA đo bằng phương pháp Qu-bit

Tờn m uẫu N ng đ DNA sau WGA (ng/àl)ồi ộ

NC (đ i ch ng âm)ống nghiệm ứu 0,20

K t qu đ nh lế giới và Việt Nam ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ịa điểm, thời gian nghiên cứu ượng, địa điểm, thời gian nghiên cứung s n ph m WGA đo b ng phả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ẩn đoán trước làm tổ ằng phương pháp Qu-bit ương pháp nghiên cứung pháp Qu-bit ở phụ nữ mang gen bệnh b ng 3.6 cho th y ph n ng WGA đã thành công, t t c các m u s nả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ất các đột biến gen F8 ở các gia đình ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ứu ất các đột biến gen F8 ở các gia đình ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ẫu phôi bào ở phụ nữ mang gen bệnh ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ph m WGA c a cỏc t bào sinh thi t cú n ng đ t 232,1 t i 456,2 ng/àl,ẩn đoỏn trước làm tổ ủa bộ chỉ thị STR liờn kết với gen F8 phục vụ ế giới và Việt Nam ế giới và Việt Nam ồ nghiờn cứu ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoỏn trước làm tổ ừ mỏu ớc làm tổ đ m b o cho th c hi n các ph n ng ti p theo ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ự mồi khuếch đại các chỉ thị STR ệnh Hemophilia A ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ứu ế giới và Việt Nam

Sau khi kiểm tra sản phẩm bằng điện di agarose và đo nồng độ sau WGA bằng máy đo Qu-bit 4.0, chúng tôi đã tiến hành chu trình nhiệt với 14 mồi ở cựng nồng độ 0,2àM D a vào k t qu đi n di cựng n ng đ ban đ u, cỏcự mồi khuếch đại cỏc chỉ thị STR ế giới và Việt Nam ả chẩn đoỏn trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ệnh Hemophilia A ồ nghiờn cứu ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoỏn trước làm tổ ần D2 c p m i có cặp vợ chồng mang gen bệnh ồ nghiên cứu ười gian nghiên cứung đ tín hi u không tột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ệnh Hemophilia A ương pháp nghiên cứung đương pháp nghiên cứung nhau, cười gian nghiên cứung đ tínột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ hi u ban đ u c a m t s m i quá th p, m t s m i quá cao ệnh Hemophilia A ần D2 ủa bộ chỉ thị STR liên kết với gen F8 phục vụ ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ống nghiệm ồ nghiên cứu ất các đột biến gen F8 ở các gia đình ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ống nghiệm ồ nghiên cứu Chính vì v y, chúng tôi t i u hóa n ng đ 14 m i b ng cách tăng n ng đ m i cóật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ống nghiệm ư ồ nghiên cứu ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ồ nghiên cứu ằng phương pháp Qu-bit ồ nghiên cứu ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ồ nghiên cứu cười gian nghiờn cứung đ th p và gi m n ng đ m i cú cột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoỏn trước làm tổ ất cỏc đột biến gen F8 ở cỏc gia đỡnh ả chẩn đoỏn trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ồ nghiờn cứu ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoỏn trước làm tổ ồ nghiờn cứu ười gian nghiờn cứung đ cao (m i l n 0,05àM).ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoỏn trước làm tổ ỗi STR dựa ần D2

Sau nhi u l n phân tích, chúng tôi thu đền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ần D2 ượng, địa điểm, thời gian nghiên cứuc k t qu đi n di mao qu n ế giới và Việt Nam ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ệnh Hemophilia A ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ở phụ nữ mang gen bệnh hình 3.8 v i n ng đ m i t i u b ng 3.7 và ớc làm tổ ồ nghiên cứu ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ồ nghiên cứu ống nghiệm ư ở phụ nữ mang gen bệnh ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho chu trình nhi t ph n ngệnh Hemophilia A ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ứuMultiplex PCR t i u nh b ng 3.8.ống nghiệm ư ư ở phụ nữ mang gen bệnh ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho

Hình 3.8 Kết quả điện di mao quản sau khi tối ưu hóa nồng độ mồi bằng phản ứng Multiplex PCR

Kết quả điện di mao quản sản phẩm phản ứng Multiplex PCR đã tối ưu được thể hiện trên hình 3.8, với các peak sản phẩm đã phân tách đúng kích thước và cường độ tín hiệu đồng đều

Bảng 3.7 Nồng độ mồi tối ưu cho DNA từ phôi

Thành ph nần N ng đồi ộ Th tớchể tớch (àl/ ống)

Chú thích: F (Forward): m i xuôi; R (Reverse): m i ng ồ nghiên cứu ồ nghiên cứu ượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu c.

N ng đ m i t i u dao đ ng t 0,15 - 0,7.ồ nghiên cứu ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ồ nghiên cứu ống nghiệm ư ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ừ máu

Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR tối ưu cho DNA từ phôi

Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ

Biến tính ban đầu 95 15 phút 1

Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR tối ưu diễn ra trong 30 chu kỳ,thời gian phản ứng là 135 phút

3.2 Đánh giá kết quả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho một số cặp vợ chồng mang gen bệnh

Một số đặc điểm của các gia đình tham gia nghiên cứu

Bảng 3.9 Một số đặc điểm của các gia đình tham gia nghiên cứu

ID Tuổi vợ Tuổi chồng Đột biến gen F8 gia đình Kỹ thuật chẩn đoán

Tình trạng đột biến gen F8

1 28 28 Đảo đoạn intron 22 Longrange PCR F8/- F8/f8 f8/-

4 32 32 c.1594T>C, Trp532Arg tại exon 11 Giải trình tự gen F8/- F8/f8 f8/-

7 39 41 c.4825dupA, p.Thr1609Anfs*4 tại exon 14 Giải trình tự gen F8/- F8/f8 f8/-

8 34 35 c.4626 tại exon 14 Giải trình tự gen F8/- F8/f8 F8/f8

10 30 32 c.4626 tại exon 14 Giải trình tự gen F8/- F8/f8 F8/f8

11 28 32 Đảo đoạn intron 22 Longrange PCR F8/- F8/f8 F8/

12 33 35 c.4379deIA, p.Asn1460Ilefs*5 tại exon 14 Giải trình tự gen F8/- F8/f8 f8/-

15 34 34 c.3637delA trên exon 14 gây dịch khung dọc từ aa IsoLeucine ở vị trí 1213

ID Tuổi vợ Tuổi chồng Đột biến gen F8 gia đình Kỹ thuật chẩn đoán

Tình trạng đột biến gen F8

* Chú thích: F8: gen bình thường; f8: gen đột biến

Tuổi trung bình của người vợ mang gen bệnh khi tham gia nghiên cứu là: 31,81 ± 4,12; tuổi cao nhất là 39, tuổi thấp nhất là 25 Tuổi trung bình của người chồng bình thường khi tham gia nghiên cứu là: 33,44 ± 4,35; tuổi cao nhất là 41, tuổi thấp nhất là 25.

Bảng 3.10 Tình trạng mang thai và sinh con của các cặp vợ chồng

Tình tr ng mang thai và sinh conạng lặp S c p v ch ngống) ặp ợp tử ồi T lỷ lệ ệt độ

S con hi n t i ống) ệt độ ạng lặp đang s ngống)

Tình tr ng ạng lặp mang thai và sinh con b ị trí trên

Không có ti n s ền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ sinh con b b nhịa điểm, thời gian nghiên cứu ệnh Hemophilia A 2 12,5 Đã sinh con b ịa điểm, thời gian nghiên cứu b nh Hemophilia ệnh Hemophilia A A

Kết quả bảng 3.10 cho thấy: Đa số các cặp vợ chồng tham gia nghiên cứu đều đã sinh con (chiếm 93,75%) Đa số các cặp vợ chồng tham gia nghiên cứu đều đã sinh con bị bệnh (87,5%), chỉ có 02 cặp vợ chồng không có tiền sử sinh con bị bệnh (12,5%).

Trong nhóm đã sinh con bị bệnh Hemophilia A, có 01 cặp vợ chồng có tiền sử phải đình chỉ thai do chọc hút dịch ối làm xét nghiệm chẩn đoán trước sinh có kết quả thai bị bệnh.

Bảng 3.11.Tần suất các đột biến gen F8 ở các gia đình

Lo i đ t bi nạng lặp ộ ến S lống) ượp tửng người gian ợp tửi v mang gen b nhệt độ

T lỷ lệ ệt độ Đ o đo n intron 22ả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho ạo đức trong nghiên cứu 10 62,50 Đ t bi n t i exon ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ế giới và Việt Nam ạo đức trong nghiên cứu

5 31,25 Đ t bi n t i exon ột số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ế giới và Việt Nam ạo đức trong nghiên cứu

T ngổn 16 100,0 Đột biến thường gặp ở các gia đình mang gen bệnh là đột biến đảo đoạn intron 22 (62,5%).

Kết quả điều trị IVF/ICSI

Bảng 3.12 Kết quả điều trị IVF/ICSI

Kết quả điều trị IVF/ICSI ´ x ± SD (Mean)

AFC (nang thứ cấp siêu âm ngày 2 chu kỳ)

Số ngày sử dụng FSH kích thích buồng trứng (ngày) 9,56 ± 0,63 (9,50) 9 -11

E2 (pg/ml) ngày cho thuốc gây trưởng thành noãn và rụng trứng

Số noãn chọc hút được (244 noãn) 15,25 ± 8,69

Noãn trưởng thành (MII) (210 noãn) 13,13 ± 7,54

Tỉ lệ noãn trưởng thành (MII) (%) 210/244 (86,07%)

Số noãn thụ tinh trung bình

(155 noãn thụ tinh bình thường)

Số phôi nang trung bình 7,31 ± 4,69 2 - 17

Kết quả điều trị IVF/ICSI ´ x ± SD (Mean)

Tỉ lệ phôi nang tạo được (%) 117/155 (75,48%)

Chỉ số AMH trung bình 3,06 ± 2,21 ng và AFC trung bình là 10,31 ± 6,99 Liều trung bình FSH kích thích buồng trứng 260,94 ± 46,51 IU/ngày với số ngày sử dụng là 9,56 ± 0,63 Nồng độ estrogen trong huyết thanh tại ngày tiêm thuốc gây trưởng thành noãn và rụng trứng là 3902,75 ± 2001,04 pg/ml Sau khi thực hiện kích trứng, tổng số noãn thu được từ các người vợ tham gia nghiên cứu là 244 noãn, trong đó có 210 noãn tới được giai đoạn trưởng thành chiếm tỉ lệ 86,07%, trung bình mỗi người vợ có số noãn trưởng thành là 13,12 ± 7,54 Trong số 210 noãn trưởng thành có 155 noãn thụ tinh, tỉ lệ thụ tinh thành công 73,8%, trung bình mỗi người vợ có noãn được thụ tinh 9,69 ± 5,78 Số phôi nang trung bình là 7,31 ± 4,69, tỉ lệ phôi nang tạo được là 75,48%.

Bảng 3.13 Phân loại chất lượng phôi nang dựa trên tiêu chuẩn đồng thuận Alpha

Ch t lất lượng phôi ượp tửng phôi nang

S lống) ượp tửng phôi T l (%)ỷ lệ ệt độ

Trong 117 phôi nang t o đạo đức trong nghiên cứu ượng, địa điểm, thời gian nghiên cứuc thì có 85 phôi lo i t t (72,65%), 30ạo đức trong nghiên cứu ống nghiệm phôi trung bình (25,64%), 2 phôi kém (1,71%)

16 cặp vợ chồng có tất cả 117 phôi nang thì có 2 phôi nang không có nụ phôi nên không đủ tiêu chuẩn sinh thiết để sàng lọc phôi, cho nên chỉ có

115 phôi thuộc loại phôi tốt và trung bình được sinh thiết để chẩn đoán đột biến gen F8.

Kết quả chẩn đoán trước làm tổ cho các gia đình

Bảng 3.14 Tỷ lệ ADO của các markers

TT Markers T l ỷ lệ ệt độADO (%)

Marker có tỉ lệ ADO cao nhất là 26,56 Marker có t l ADO th p nh tỷ lệ ADO của các markers ệnh Hemophilia A ất các đột biến gen F8 ở các gia đình ất các đột biến gen F8 ở các gia đình là 0 Tỷ lệ ADO của tất cả các marker là 11,72.

Bảng 3.15 Số lượng phôi, số phôi được chuyển, kết quả chuyển phôi của các gia đình

T ng sổn ống) phôi ch nẩ đoán

Sống) phôibị trí trên b nhệt độ

S phôiống) không manggen b nhệt độ

S phôiống) đượp tửc chuy nể tớch (àl/ ống) l n 1ần

S phôiống) đượp tửc chuy n l nể tớch (àl/ ống) ần 2

01 10 1 3 6 1 1 Chuy n phôi th t b iểm, thời gian nghiên cứu ất các đột biến gen F8 ở các gia đình ạo đức trong nghiên cứu

02 6 2 0 4 1 1 M t tr nam sinh s ngộ ẻ nam sinh sống ống)

03 5 0 1 4 1 1 M t tr n sinh s ngộ ẻ nam sinh sống ữ sinh sống ống)

04 15 4 4 7 1 M t tr nam sinh s ngộ ẻ nam sinh sống ống)

05 10 1 2 7 0 Các phôi không đượng, địa điểm, thời gian nghiên cứuc chuy n v i lý do cá nhânểm, thời gian nghiên cứu ớc làm tổ

06 4 0 1 3 1 M t tr n sinh s ngộ ẻ nam sinh sống ữ sinh sống ống)

07 1 0 0 1 1 Chuy n phôi th t b i ểm, thời gian nghiên cứu ất các đột biến gen F8 ở các gia đình ạo đức trong nghiên cứu

08 2 2 0 0 0 Không có phôi phù h p đ chuy nợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu ểm, thời gian nghiên cứu ểm, thời gian nghiên cứu

09 14 2 3 9 1 1 Mang thai thành công nh ng m t thai ư ất lượng phôi ở quý I

10 6 0 1 5 1 M t tr nam sinh s ngộ ẻ nam sinh sống ống)

11 16 3 5 8 2 C p tr sinh đôi khác gi i ặp ẻ nam sinh sống ớc

12 6 2 0 4 1 Ch a ngoài t cungử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ ử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ

13 1 0 1 0 0 Không có phôi phù h p đ chuy nợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu ểm, thời gian nghiên cứu ểm, thời gian nghiên cứu

14 3 0 0 3 1 1 M t tr n sinh s ngộ ẻ nam sinh sống ữ sinh sống ống)

15 8 1 2 5 1 1 M t tr nam sinh s ngộ ẻ nam sinh sống ống)

16 8 1 3 4 2 C p tr sinh đôi namặp ẻ nam sinh sống

Có 16 cặp vợ chồng có phôi không mang gen bệnh, 2 cặp vợ chồng không có phôi khỏe mạnh, 06 người vợ được chuyển phôi 2 lần, 7 người vợ được chuyển phôi 1 lần, 10 người vợ mang thai thành công đã sinh ra được 11 trẻ sinh sống, có 2 thai phụ sinh đôi Có 2/13 người vợ thất bại với các lần chuyển phôi Có 2 gia đình không có phôi không mang gen bệnh nên không tham gia chuyển phôi, 1 gia đình có phôi không mang gen bệnh chưa thực hiện chuyển phôi vì lý do cá nhân.

Bảng 3.16 Phân loại phôi theo đột biến di truyền

Phân loại Số lượng phôi Tỷ lệ (%)

Số phôi mang gen bệnh 26 22,61

Số phôi không mang gen bệnh 70 60,87

Trong 115 phôi được chẩn đoán, có 70 phôi không đột biến gen F8 (60,87%), 26 phôi dị hợp tử có đột biến gen F8 (22,61%) và 19 phôi bị bệnh do có đột biến gen F8 (16,52%)

Bảng 3.17 Kết quả rã đông và chuyển phôi nang trên 19 chu kỳ

Kết quả rã đông và chuyển phôi nang Tỉ lệ/ Số lượng

Tỉ lệ phôi nang sống sau rã đông 21/21 (100%)

Số chu kỳ chuyển phôi đông lạnh 19 chu kỳ

Số phôi chuyển trung bình trong một chu kỳ (17 chu kỳ chuyển 1 phôi, 2 chu kỳ chuyển 2 phôi)

Số người vợ được chuyển phôi 13 người vợ

Tỉ lệ có thai lâm sàng/ số chu kỳ chuyển phôi 10/19 (52,6%)

Tỉ lệ có thai lâm sàng/ số cặp vợ chồng điều trị 10/16 (62,5%)

Tỉ lệ phôi làm tổ 11/21 (52,4%) Đơn thai 7 ca Đa thai (2 thai) 2 ca

Có 13 người vợ đã được chuyển phôi thực hiện trong 19 chu kỳ 17 chu kỳ thực hiện chuyển 1 phôi, 2 chu kỳ chuyển 2 phôi, số phôi chuyển trung bình của một chu kỳ là 1,11 ± 0,32 phôi

Kết quả tỉ lệ có thai lâm sàng/số chu kỳ chuyển phôi là 10/19 (52,6%), tỉ lệ có thai lâm sàng/ số cặp vợ chồng điều trị là 10/16 (62,5%) Tỉ lệ phôi làm tổ là 52,4% Có 9 sản phụ đã sinh với 11 trẻ sinh sống (2 trường hợp sinh đôi), các bé đều khỏe mạnh.

- Kết quả chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán sau sinh:

Sau khi tiến hành chuyển phôi, các thai phụ được tư vấn chẩn đoán trước sinh Có 4 thai phụ tình nguyện tham gia chọc hút dịch ối và xét nghiệm đột biến đảo đoạn intron 22 bằng kỹ thuật Longrange PCR tại Viện Huyết học, Truyền máu Trung ương Các thai phụ không tham gia chẩn đoán trước sinh được theo dõi và chẩn đoán trên mẫu máu của em bé sau sinh tại Viện Huyết học, Truyền máu Trung ương bằng các kỹ thuật sinh học phân tử Kết quả chẩn đoán trước sinh và sau sinh phù hợp với kết quả chẩn đoán PGT-M Sau đây là hình ảnh minh họa kết quả chẩn đoán trước sinh:

Hình 3.9 Minh họa kết quả chẩn đoán trước sinh

* Nguồn: Ảnh chụp kết quả chẩn đoán trước sinh của sản phụ Trần Thị Q., gia đình số 06

KẾT QUẢ MỘT SỐ GIA ĐÌNH NGHIÊN CỨU

- Kiểu đột biến gen F8 của gia đình số 09 là đảo đoạn intron 22 Trong đó: người vợ mang kiểu gen đột biến dị hợp tử (F8/f8), người chồng bình thường (F8/-), người con trai bị bệnh (f8/-)

- Cặp vợ chồng trên được tiến hành IVF thu được 14 phôi đủ điều kiện sinh thiết Thông qua phương pháp phân tích di truyền liên kết gen, chúng tôi xác định được haplotype của gia đình 09 Kết quả điện di mao quản và phân tích các haplotype được thể hiện ở hình 3.9

- Trong 14 phôi được chẩn đoán có 2 phôi được xác định là bị bệnh (phôi 8 và phôi 14) do nhận NST Y từ bố và nhận NST X mang alen đột biến từ mẹ; 3 phôi mang gen bệnh (phôi 1, phôi 5, phôi 13) do nhận được 1 alen bình thường từ bố và 1 alen đột biến từ mẹ; 9 phôi không mang gen bệnh do nhận được 2 alen bình thường từ bố và mẹ (phôi 2, phôi 3, phôi 4, phôi 6, phôi 7, phôi 9, phôi 10, phôi 11, phôi 12)

- Tại gia đình này, có phát hiện phôi số 13 và phôi số 5 có hiện tượng ADO trên hầu hết các marker (trừ marker F8Int21 và F8Int13.2 đối với phôi số 13 và trừ marker DXS1073, HEMA154130.5, F8Int25.2, Amelogenin, F8Int1 đối với phôi số 5) Phôi số 4 có hiện tượng ADO trên marker DXS1073 và THLMEInt2, phôi số 1 có hiện tượng ADO trên marker HEMA154498.9 và stSG604486, REN90833

- Người vợ đã trải qua 2 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh, lần 1 chuyển 1 phôi không mang gen bệnh nhưng không có thai, lần 2 chuyển 1 phôi không mang gen bệnh vào buồng tử cung và có thai quý I.

Hình 3.10 Kết quả điện di mao quản của các marker STR trong gia đình 09

Chú thích: AF: Amplification failure (khuếch đại thất bại), ADO: Allele dropout (mất alen)

- Kiểu đột biến gen F8 của gia đình số 11 là đảo đoạn intron 22 Trong đó: người vợ mang kiểu gen đột biến dị hợp tử (F8/f8), người chồng bình thường (F8/-), người con trai bình thường (F8/-)

- Cặp vợ chồng trên được tiến hành IVF thu được 16 phôi đủ điều kiện sinh thiết Thông qua phương pháp phân tích di truyền liên kết gen, chúng tôi xác định được haplotype của gia đình 11 Kết quả điện di mao quản và phân tích các haplotype được thể hiện ở hình 3.10

- Trong 16 phôi được chẩn đoán có 3 phôi được xác định là bị bệnh (phôi 3, phôi 7, phôi 16) do nhận NST Y từ bố và nhận NST X mang alen đột biến từ mẹ; 5 phôi mang gen bệnh (phôi 2, phôi 6, phôi 9, phôi 10, phôi 13) do nhận được 1 alen bình thường từ bố và 1 alen đột biến từ mẹ; 8 phôi không mang gen bệnh do nhận được 2 alen bình thường từ bố và mẹ (phôi 1, phôi 4, phôi 5, phôi 8, phôi 11, phôi 12, phôi 14, phôi 15)

- Tại gia đình này, có phát hiện phôi số 1 có hiện tượng ADO trên các marker DXS1073, HEMA154498.9, REN90682, THLMEInt2 và F8Int1, phôi số 2 có hiện tượng ADO trên các marker HEMA154498.9, F8Int22, F8Int1, phôi số 3 có hiện tượng ADO trên marker Amelogenin, phôi số 4 có hiện tượng ADO trên các marker HEMA154498.9, F8Int13.2, REN90682, THLMEInt2, F8Int1, phôi số 8 có hiện tượng ADO trên marker Amelogenin, phôi số 9 có hiện tượng ADO trên các marker HEMA154498.9, REN90682, stSG604486, THLMEInt1.1; phôi số 10 có hiện tượng ADO trên marker REN90682, F8Int22; phôi số 11 có hiện tượng ADO trên HEMA154130.5, REN90682, THLMEInt2, F8Int1; phôi số 13 có hiện tượng ADO trên marker F8Int22, F8Int1; phôi số 14 có hiện tượng ADO trên DXS1073, F8Int1, stSG604486

- Người vợ đã trải qua chu kỳ chuyển phôi đông lạnh đầu tiên với 2 phôi không mang gen bệnh Hai trẻ khỏe mạnh sinh đôi khác giới đã được sinh ra.

Hình 3.11 Kết quả điện di mao quản của các marker STR trong gia đình 11

Chú thích: AF: Amplification failure (khuếch đại thất bại), ADO: Allele dropout (mất alen)

Đánh giá tính đa hình của bộ chỉ thị STR liên kết với gen

Lựa chọn marker bằng các công cụ tin Sinh học trên ngân hàng gen

Trong nghiên cứu này, kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ được áp dụng cho bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể X là bệnh Hemophilia A Đây là bệnh có tỉ lệ mắc cao và bệnh cảnh lâm sàng nặng nề Chẩn đoán trước làm tổ sẽ giúp lựa chọn những phôi không mang gen đột biến để cấy vào tử cung, như vậy người mẹ sẽ có khả năng sinh ra những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh mà không mắc bệnh Hemophilia A Trước đây, để hạn chế trẻ sinh ra bị bệnh, chẩn đoán trước sinh bằng cách chọc ối đã được áp dụng phổ biến, tuy nhiên trong trường hợp người mẹ mang thai bệnh lý sẽ phải bỏ thai ở những tuần thai lớn, ảnh hưởng đến tâm sinh lý và sức khỏe của người mẹ

Trong nghiên cứu, đã sử dụng các STR có tính đa hình cao và dễ dàng khuếch đại được sử dụng để xác định alen bệnh có thể di truyền cho con Mặc dù kỹ thuật sử dụng các STR có độ nhạy cao, tuy nhiên trong một số trường hợp vẫn xảy ra tình trạng khuếch đại thất bại hay ADO Nhằm làm tăng tỉ lệ chính xác của kỹ thuật, ít nhất 2 - 3 marker dị hợp tử có thông tin thường được lựa chọn, trong trường hợp thất bại một trong các marker dị hợp tử, nếu các marker dị hợp tử còn lại có kết quả tương đồng thì có thể xác định được phôi không mang gen bệnh hay bệnh lý Chính vì vậy, để tăng giá trị cho chẩn đoán, cần phải lựa chọn bộ chỉ thị STR với số lượng marker vừa đủ đảm bảo hiệu quả chẩn đoán cao, vừa đảm bảo tiết kiệm chi phí và công sức thực hiện không quá phức tạp Để đảm bảo hiệu quả chẩn đoán cao, các marker phải được lựa chọn theo các khuyến cáo Theo khuyến cáo khi sử dụng các STR phục vụ phân tích di truyền liên kết trong PGT - M, yêu cầu có ít nhất một marker chứa thông tin ở trước gen và sau gen với khoảng cách dưới 1Mb

[77] Các STR lựa chọn được trong nghiên cứu đều đảm bảo khoảng cách dưới 1Mb và phân bố đều trên cả hai phía của gen F8

Trong nghiên cứu này, ngoài việc sử dụng các marker để xác định bệnh lý, chúng tôi sử dụng cả marker giới tính để xác định giới tính của phôi vì bệnh Hemophilia A là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X Sau quá trình lựa chọn bằng công cụ Tin sinh học kết hợp tham khảo các công bố trên thế giới về chỉ số dị hợp tử của các chỉ thị STR, chúng tôi đã lựa chọn thành công bộ chỉ thị gồm 13 STR, bao gồm 03 chỉ thị nằm phía trước gen F8, 05 chỉ thị nằm trong gen F8 và 05 chỉ thị nằm phía sau gen này Ngoài ra, còn một chỉ thị NST X/Y.

Theo hình 3.1 mô tả khoảng cách tương đối giữa các STR với gen F8, tất cả các STR có khoảng cách so với gen F8 đều dưới 1Mb Khoảng cách này đảm bảo các STR liên kết chặt chẽ với gen F8, qua đó có thể đánh dấu sự di truyền của các alen qua các thế hệ trong một gia đình.

Chúng tôi đã lựa chọn được 13 STR đảm bảo theo khuyến cáo Với số lượng lớn các STR, cơ hội để một gia đình có được nhiều các STR mang thông tin càng lớn, khả năng chẩn đoán chính xác càng cao Số lượng các STR của chúng tôi cao hơn so với một số nghiên cứu trước đây như:

Laurie A.D và cộng sự (2008) đã tiến hành chẩn đoán PGT-M Hemophilia A với 2 marker nằm trong gen F8 (F8C-IVS13, F8C-IVS22) và

1 marker nằm gần F8 (DXS1073) Tuy nhiên, tại thời điểm nghiên cứu của tác giả có chỉ tiến hành trên một số loại đột biến nhất định của gen F8 (đảo đoạn intron 22, c.6901-2A>G) [5].

Massaro J.D và cộng sự (2011) đã tiến hành khảo sát chỉ số dị hợp tử của STR để phục vụ PGT-M bệnh Hemophilia A Quá trình sàng lọc chỉ lựa chọn được 4 STR thỏa mãn yêu cầu (F8Int1, F8Int13, F8Int22, F8Int25.3) với chỉ số dị hợp tử lý cao nhất là 75,5% [4] Còn Ding Q.L và cộng sự

(2012) lựa chọn được 06 STR thỏa mãn yêu cầu (F8Up226, F8Up146, F8Int13, F8Int25, F8Down48 và DXS1073) với chỉ số dị hợp tử lý cao nhất là 74,8% [6]

Fernández R.M và cộng sự (2015) tiến hành PGT-M bệnh Hemophilia A sử dụng 6 STR nằm trên gen hoặc nằm gần gen F8 gồm DXS9901, DXS8087, DXS1073, STR13, DXS1108, STR22 Bốn marker (DXS1073, STR13, STR22, DXS1108) được sử dụng có chỉ số dị hợp tử cao (>90%) [68]

Chen M và cộng sự (2016) sử dụng 5 STR đã tiến hành PGT-M (DXS9901, F8Int9.2, F8CIVS3, F8Int21, F8CIVS22) [78]

Bùi Thị Minh Phượng (2019) sử dụng 4 marker FXS1108, DXS9897, F8Int22, DXS9901 để tiến hành PGT-M [79] Bốn marker được sử dụng có chỉ số dị hợp tử tương ứng là 46,9%, 55,2%, 34,4%, 55,2% Để nâng cao hiệu quả chẩn đoán hơn nữa, nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra bộ 13 STR có chỉ số dị hợp tử cao, khoảng cách từ các STR tới gen

F8 dưới 1Mb Trong các trường hợp sử dụng số lượng ít các marker, hiện tượng ADO và ngoại nhiễm khó có thể được kiểm soát triệt để Mặc dù kết quả thành công, nhưng số lượng STR liên kết với gen F8 không nhiều Nếu áp dụng trong trường hợp khác có thể không tìm thấy đủ marker đầy đủ thông tin để thiết lập quy trình PGT-M Trong khi đó, chúng tôi sử dụng số lượng marker nhiều hơn, ứng dụng được với nhiều trường hợp đột biến gen

Quá trình thiết kế mồi để khuếch đại các STR, chúng tôi tiến hành gắn thêm vào mồi xuôi của mỗi cặp mồi một trình tự tương ứng với mồi huỳnh quang FAM, HEX hoặc NED Mục đích của việc gắn thêm một đoạn oligonucleotide là để sau khi thực hiện phản ứng Multiplex PCR sẽ tiến hành gắn mồi huỳnh quang Chúng tôi không gắn trực tiếp huỳnh quang vào các mồi xuôi ban đầu mà chỉ thiết kế thêm các các trình tự oligonucleotide tương ứng với trình tự của mồi huỳnh quang Mặc dù sẽ cần một công đoạn PCR nữa để gắn mồi huỳnh quang, tuy nhiên chi phí để thiết kế các mồi lại giảm đi rất nhiều so với thiết kế một mồi đã gắn sẵn Thông qua gắn mồi huỳnh quang và phản ứng Multiplex PCR, các sản phẩm khuếch đại khác nhau có độ dài khác nhau và/hoặc có chỉ thị huỳnh quang khác nhau Qua đó làm cơ sở để phân tích bằng phương pháp điện di mao quản.

Kết quả tối ưu hóa quy trình multiplex PCR khuếch đại các STR trên các mẫu máu

Để giảm công sức thực hiện khuếch đại nhiều STR bằng nhiều phản ứng Singleplex PCR, chúng tôi đã tiến hành tối ưu hóa quy trình multiplex PCR khuếch đại đồng thời 13 STR và 1 marker giới tính trong một ống phản ứng. Chúng tôi đã tối ưu hóa quy trình multiplex PCR khuếch đại các STR trên mẫu máu với ba lý do: thứ nhất là cơ sở để tính toán xác định tính đa hình của các STR trước khi tiến hành áp dụng chẩn đoán, thứ hai là cơ sở xây dựng quy trình khuếch đại các STR trên mẫu DNA từ phôi, thứ ba là cơ sở để khuếch đại các STR trên các mẫu DNA của bố, mẹ, con trai phục vụ phân tích liên kết gen, để phát hiện sự di truyền của gen bệnh qua các thế hệ.

Trước khi đưa vào phản ứng Multiplex PCR, chúng tôi tiến hành tính toán nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho từng cặp mồi thông qua các phản ứngSingleplex PCR cho mỗi cặp mồi Nhiệt độ gắn mồi trung bình trên lý thuyết của 14 cặp mồi này là 61,3 0 C Từ đó, tiến hành phản ứng Singleplex PCR theo dải nhiệt độ 55 0 C - 60 0 C - 65 0 C và phân tích sản phẩm trên gel agarose.Kết quả cho thấy cặp mồi X11 và X14 cho sản phẩm tốt nhất ở 65 0 C, cặp mồiX12 và X15 đều có tín hiệu sản phẩm đặc hiệu nhiều ở cả 3 dải nhiệt độ, cặp mồi X13 không có tín hiệu sản phẩm hoặc chỉ có tín hiệu sản phẩm không đặc hiệu ở cả 3 dải nhiệt độ Từ các kết quả tối ưu hóa ở 3 dải nhiệu độ trên, có thể nhận thấy 14 cặp mồi này có nhiệt độ gắn mồi tối ưu không đồng nhất nhau Việc tối ưu nhiệt độ gắn mồi không khả thi. Để khắc phục điều này, chúng tôi sử dụng QIAGEN Multiplex PCR Mastermix với ưu điểm tối ưu điều kiện phản ứng multiplex về cùng một điều kiện chu trình nhiệt chung của nhà sản xuất (với nhiệt độ gắn mồi là 60 0 C), không phụ thuộc nhiều vào thông số của từng cặp mồi trong phản ứng.

Phản ứng Multiplex PCR lần đầu tiên được thiết kế vào năm 1988 bởi Chamberlain J.S và cộng sự khi chẩn đoán bệnh teo cơ Dunchen với 9 đoạn gen đích được nhân lên cùng một lúc [64] Sau thành công đó, phản ứng Multiplex PCR được tối ưu và sử dụng rộng rãi phục vụ nhiều mục đích khác nhau Kĩ thuật có nhiều ưu điểm như tiết kiệm thời gian, hóa chất, nhân lực; nhưng để đạt được khả năng nhân lên nhiều mục tiêu cùng một lúc, phản ứng Multiplex PCR yêu cầu tính tối ưu ở tất cả các yếu tố của một phản ứng [80]. Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành phản ứng Multiplex PCR trên 14 cặp mồi, thông qua nhiệt độ đồng nhất là 60 0 C và điều chỉnh nồng độ từng cặp theo gradient 0,05 àM, chỳng tụi đỏnh giỏ kết quả bằng hỡnh ảnh điện di mao quản và kết luận thành phần phản ứng như trong bảng 3.2. Đa số các tác giả trên thế giới đều sử dụng phản ứng Multiplex PCR để khuếch đại đồng thời nhiều STR cùng lúc, tuy số lượng các STR còn hạn chế

[4], [5], [6], [68] Phản ứng Multiplex PCR trong nghiên cứu của chúng tôi tiến hành thành công trên 14 cặp mồi, qua đó đảm bảo khả năng phân tích cùng lúc nhiều STR

PGT-M là qui trình có tính đặc trưng cao và mỗi chỉ thị có tính thông tin khác nhau trên từng gia đình Do đó cần một số lượng lớn các chỉ thị để đảm bảo cả bộ chỉ thị có thể áp dụng trên quần thể lớn Với bộ chỉ thị có số lượng lớn các marker, nếu sử dụng phản ứng đơn mồi, quy trình sẽ cần được thực hiện đối với tất cả các chỉ thị và trên tất cả các mẫu Tiến hành việc này sẽ gây tốn nhiều thời gian, công sức và hóa chất Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thiết kế phản ứng multiplex PCR khuếch đại đồng thời 14 chỉ thị để phục vụ cho qui trình PGT-M bệnh Hemophilia A So với việc khuếch đại đơn mồi, khi tiến hành lựa chọn từ 14 STR phải khuếch đại trên tối thiểu 3 mẫu của gia đình gồm bố, mẹ và con bị bệnh, tương ứng sẽ cần làm 42 ống PCR, rất tốn kém về hóa chất, kinh phí và công thực hiện Kỹ thuật Multiplex khuếch đại đồng thời 14 STR trong 1 ống PCR chỉ cần làm 3 ống cho 3 mẫu trong gia đình So sánh giữa việc thực hiện 42 ống với 3 ống PCR rõ ràng sẽ giảm được hóa chất, kinh phí và công thực hiện Đặc biệt khi khuếch đại các STR trên sản phẩm WGA bằng phản ứng đơn mồi sẽ cần sử dụng rất nhiều lượng sản phẩm WGA cho tổng 15 phản ứng, qua đó sẽ khiến lượng sản phẩm để dành cho các kĩ thuật liên quan khác sẽ bị thiếu hụt Do đó, việc sử dụng phản ứng Multiplex PCR sẽ đảm bảo lượng mẫu đủ để phục vụ các kĩ thuật khác.

Chỉ số dị hợp tử của các STR

Số lượng alen của một marker càng lớn thì chỉ số dị hợp tử sẽ càng cao, bởi xác xuất gặp kiểu gen dị hợp tử sẽ tăng lên Tính dị hợp tử là yêu cầu cơ bản để một STR trở thành một marker mang thông tin trong quá trình phân tích di truyền liên kết.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các STR được đánh giá trên 103 mẫu DNA từ các mẫu máu của các thành viên không có quan hệ huyết thống, phản ánh đúng tính đa hình của các STR Quá trình khảo sát 13 STR cho thấy có tổng cộng 189 alen và mỗi STR có từ 8 - 24 alen: F8Int21 có 10 alen, DXS1073 có 21 alen, HEMA 154130.5 có 23 alen, HEMA154498.9 có

24 alen, F8Int13.2 có 13 alen, REN90682 có 15 alen, F8Int25.2 có 9 alen, F8Int22 là 8 alen, THLMEInt2 là 18 alen, F8Int1 là 13 alen, stSG604486 là

11 alen, REN90833 là 11 alen, THLMEInt1.1 là 13 alen

Còn tại Đại học Quốc Gia Singapore, Zhao M và cộng sự (2017) đã khảo sát chỉ số dị hợp tử của 13 STR trên 128 đối tượng nữ người Trung

Quốc và 49 phụ nữ người da trắng và đưa ra kết quả 13 STR có tính đa hình cao với quần thể người Singapore nằm trong vòng 0,6 Mb gần F8 (DXS1073, REN90682, REN90833, F8Int25.2, F8Int22, F8Int21, F8Int13.2, F8Int1, stSG604486, HEMA154130.5, TMLHEInt2, TMLHEInt1.1, HEMA154498.9 cùng với AMELX/Y) Tần số dị hợp tử lý thuyết và tần số dị hợp tử quan sát của các marker ở quần thể người da trắng (0,48-0,77 và 0,49-0,84; tương ứng) và người gốc Trung (0,49-0,79 và 0,43-0,78; tương ứng) [57] Tuy nhiên, chỉ số dị hợp tử đại diện cho quần thể nên việc khảo sát các STR cần phải tiến hành cho người Việt Nam.

Trong khi kết quả của Bùi Thị Minh Phượng (2019) khảo sát chỉ số dị hợp tử trên 77 thành viên nữ có quan hệ ruột với 35 bệnh nhân Hemophilia

A (mẹ bệnh nhân, bà, dì, cô, bác…) đối với 4 STR là FXS1108, DXS9897, F8Int22, DXS9901 Nghiên cứu 47 alen khác nhau trong 4 STR được tìm thấy, tần số alen dao động 0,007874 đến 0,259843 và có sự khác nhau về số lượng alen cho mỗi vùng; 10 alen cho FXS1108, 14 alen cho DXS9897, 6 alen cho F8Int22, 17 alen cho DXS9901 Các STR này có chỉ số dị hợp tử thấp hơn trong nghiên cứu của chúng tôi, tương ứng là 46,9%, 55,2%, 34,4%, 55,2% [79]

Chỉ số dị hợp tử quyết định giá trị của STR đóng góp thông tin trong chẩn đoán Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đánh giá về các chỉ số dị hợp tử của 13 chỉ thị STR và nhận thấy tất cả các marker đều có Ho ˃ 0,5 và

He > 0,7; marker có chỉ số Ho thấp nhất là F8Int13.2 (0,55) và cao nhất là REN90682 (0,85); marker có chỉ số He thấp nhất là REN90833, F8Int22, F8Int1 (0,77) và cao nh t là HEMA154130.5 (0,89)ất các đột biến gen F8 ở các gia đình Chỉ số Ho và chỉ số dị

He của một marker càng cao càng có lợi khi áp dụng trong chẩn đoán thực tế Như vậy, bộ chỉ thị trong nghiên cứu của chúng tôi có tính thông tin cao Đồng thời do bộ chỉ thị có tính đặc trưng cho từng cá thể nên chúng tôi tiến hành đánh giá số lượng chỉ thị dị hợp tử của mỗi mẫu máu Toàn bộ 103 mẫu máu trong nghiên cứu đều có ít nhất 1 chỉ thị dị hợp tử (0,97% số mẫu) và phần lớn là có từ 4 - 13 chỉ thị dị hợp tử (95,15% số mẫu) Trong phân tích di truyền liên kết, dị hợp tử là tiêu chuẩn cơ bản để đánh giá tính thông tin của 1 STR Ở một quần thể mà các cá thể mang nhiều STR dị hợp tử, khả năng xây dựng thành công quy trình phân tích di truyền liên kết trên các cá thể trong quần thể đó càng lớn.

Một yêu cầu khác trong lựa chọn các STR phục vụ PGT-M bệnh Hemophilia A là cần sự phân bố đồng đều của các STR ở phía trước và phía sau gen Chúng tôi tiếp tục đánh giá số lượng marker dị hợp tử phía trước và phía sau gen trên từng cá thể Số liệu mô tả trong biểu đồ 3.3 cho thấy 94,1% cá thể có ít nhất 2 chỉ thị dị hợp tử nằm về 2 phía so với gen F8 Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới được thực hiện nhằm thiết lập các chỉ thị STR phục vụ PGT-M Hemophilia A.

Tuy nhiên số lượng STR và chỉ số dị hợp tử chưa cao dẫn tới khả năng áp dụng vào thực tế của các chỉ thị còn rất hạn chế [6], [78].

Nghiên cứu của chúng tôi đã đánh giá được tính đa hình của bộ chỉ thị gồm 13 STR Kết quả cho thấy bộ chỉ thị STR có tần số dị hợp tử quan sát và tần số dị hợp tử cao, liên kết chặt chẽ với gen F8 và phân bố đồng đều ở hai phía của gen, qua đó chúng tôi sử dụng toàn bộ 13 STR này để phục vụ chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A.

Chuẩn hóa quy trình PGT - M trên mẫu tế bào phôi 97 4.2 Đánh giá kết quả chẩn đoán trước làm tổ bệnh

Kỹ thuật multiplex PCR khuếch đại các STR trên mẫu tế bào phôi là kỹ thuật khó hơn trên mẫu máu vì lượng DNA trên mẫu tế bào phôi rất ít (chỉ từ một tế bào), do vậy cần phải tối ưu điều kiện của phản ứng multiplex PCR với mồi STR, mồi giới tính (Amelogenin) trên mẫu các tế bào phôi dư để chẩn hóa thành phần và điều kiện của phản ứng trước khi áp dụng trên phôi bào sinh thiết Kết quả tối ưu nồng độ mồi và chu trình nhiệt phản ứng Multiplex

PCR từ mẫu máu là cơ sở để tối ưu nồng độ mồi và chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR từ mẫu tế bào phôi để khuếch đại các STR.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các kết quả thu được sau khi tối ưu nồng độ mồi cho DNA từ phôi và tối ưu chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR tối ưu cho DNA từ phôi không thay đổi so với nồng độ mồi và chu trình nhiệt tối ưu cho DNA từ máu

Quy trình chẩn đoán PGT-M dựa trên phân tích đa STR liên kết với gen

F8 mang tính đặc trưng cho từng gia đình Các gia đình sẽ được tư vấn di truyền và thiết lập một quy trình PGT-M Hemophilia A riêng Quá trình thiết lập quy trình PGT-M bao gồm bước xác định trực tiếp các đột biến của gia đình và phân tích di truyền liên kết

Qua phân tích di truyền liên kết bước đầu xác định các marker STR đầy đủ thông tin, các STR mang một nửa thông tin phục vụ cho bước chẩn đoán trên mẫu tế bào phôi Trong phân tích di truyền liên kết bệnh Hemophilia A, marker đầy đủ thông tin là marker có 3 alen của bố và mẹ (2 alen của mẹ và

1 alen của bố) khác nhau từng đôi một, qua đó có thể xác định toàn bộ kiểu gen của phôi cũng như xác định được hiện tượng ngoại nhiễm, ADO, trao đổi chéo và mất vật liệu di truyền Marker mang một nửa thông tin là marker chỉ xác định được kiểu gen của phôi ở một số trường hợp và ít khả năng phát hiện các hiện tượng khác Marker không có thông tin là marker không thể phân biệt được kiểu gen của phôi bị bệnh và phôi không bị bệnh

Theo khuyến cáo của ESHRE 2020, cần ít nhất 1 marker STR đầy đủ thông tin nằm trước gen và 1 marker STR đầy đủ thông tin nằm sau gen

[81] Sau khi thiết lập quy trình thành công, các gia đình sẽ được tiến hành kĩ thuật IVF/ICSI và sinh thiết phôi ngày 5 để lấy mẫu xét nghiệm thực hiệnPGT-M

Hình 4.1 Minh họa quy trình PGT-M bệnh Hemophilia A

Trong nghiên cứu của một số tác giả, các bước PGT-M cho bệnh Hemophilia A sử dụng phân tích di truyền liên kết khá phức tạp, chỉ mang tính đại diện cho từng gia đình, quá trình gồm các bước: Thực hiện nhiều phản ứng Single PCR cho từng marker để khuếch đại các vùng STR trên NST X của người mẹ nhằm tìm và lựa chọn marker dị hợp tử ở mẹ; Căn cứ vào các marker dị hợp tử tìm được, sử dụng các cặp mồi tương ứng để tiến hành Multiplex PCR trên mẫu DNA của người mẹ và mẫu DNA bệnh nhân để so sánh và xác định alen đột biến; Sau khi có được alen đột biến, phải tiến hành tối ưu phản ứng multiplex PCR để khuếch đại một nhóm nhỏ các STR này trên single cell thử nghiệm; Sau đó mới áp dụng quy trình trên phôi người mẹ, phân tích haplotype để xác định các phôi không mang gen bệnh và bệnh lý [8], [79].

Như vậy, đối với mỗi gia đình, đều cần phải tiến hành tối ưu phản ứng multiplex cho một nhóm nhỏ các STR phù hợp trên các mẫu đơn tế bào thử nghiệm Trong nghiên cứu của chúng tôi, với việc sử dụng 13 STR có chỉ số dị hợp tử cao, luôn đảm bảo có ít nhất 1 STR dị hợp tử, nên đã đơn giản được quy trình (khuếch đại đồng loạt 14 marker trên mẫu DNA từ máu ngoại vi của bố, mẹ, con hoặc người thân đã rõ tình trạng đột biến gen; Thông báo kết quả để bắt đầu tiến hành IVF; Khuếch đại đồng loạt 14 marker trên mẫu DNA của phôi và phân tích haplotype của phôi)

Hạn chế của kĩ thuật PGT-M là vật liệu di truyền dùng để chẩn đoán ít, chỉ từ vài tế bào phôi do đó có thể dẫn tới chẩn đoán sai Hơn nữa, các kĩ thuật chỉ được thực hiện một lần duy nhất, không đánh giá được sự ổn định và không kết hợp được nhiều phương pháp chẩn đoán làm giảm độ chính xác Để giải quyết vấn đề này, giải pháp đưa ra là lựa chọn chẩn đoán bằng các mẫu sinh thiết phôi nang thay cho phôi giai đoạn phân cắt và tiến hành kỹ thuật khuếch đại toàn bộ hệ gen của các mẫu phôi sinh thiết bằng kĩ thuật WGA

Sử dụng mẫu sinh thiết phôi nang có nhiều ưu điểm hơn do sinh thiết được nhiều phôi bào hơn, khả năng chẩn đoán chính xác cao hơn Do vậy chúng tôi lựa chọn chẩn đoán trên phôi ngày 5 Điều này khác với việc sử dụng phôi ngày 3 nghiên cứu trước đây của tác giả Bùi Thị Minh Phượng

(2019) [79]. Để tiến hành kỹ thuật khuếch đại toàn bộ hệ gen, chúng tôi sử dụng bộ kit REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN) để nhân toàn bộ hệ gen Đây là bộ kit sử dụng nguyên lí MDA được khuyến cáo sử dụng trong thực hiện PGT-

M [81] Đặc điểm của bộ kit này là sản phẩm WGA có kích thước dài(khoảng 10 kb), bao phủ được gen F8 và các trình tự STR, qua đó có thể sử dụng sản phẩm WGA để phục vụ các bước khuếch đại tiếp theo bao gồm nhân gen F8, các kĩ thuật chẩn đoán trực tiếp và Multiplex PCR các STR.

Các phôi sau khi được chẩn đoán PGT-M sẽ được chia thành 3 nhóm: phôi không mang gen bệnh, phôi mang gen bệnh và phôi bị bệnh Những phôi không mang gen bệnh là những phôi ưu tiên được chuyển Trong khi các phôi mang gen bệnh là những phôi sẽ được cân nhắc trong trường hợp không có phôi không mang gen bệnh Đồng thời những phôi không mang gen bệnh khi chưa được sử dụng sẽ được trữ đông bằng phương pháp thủy tinh hóa.

Trong suốt 2 thập kỉ qua, phương pháp PGT-M dựa trên nguyên lý Single cell Multiplex PCR (WGA kết hợp multiplex PCR các marker liên kết) vẫn là phương pháp phổ biến và hiệu quả [82] Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là thời gian thiết lập quy trình cho 1 gia đình kéo dài do phải lựa chọn lại các STR phù hợp cho từng gia đình Trong nghiên cứu của chúng tôi, nhược điểm này được khắc phục hoàn toàn bằng cách lựa chọn trước một bộ chỉ thị có tính dị hợp tử rất cao đối với người Việt Nam, qua đó khi áp dụng với bất kì trường hợp gia đình mang gen người Việt Nam nào đều có thể đảm bảo tính thông tin để phân tích di truyền liên kết Kết hợp với phản ứng Multiplex PCR, thời gian thiết lập quy trình cho các gia đình được giảm xuống rất nhiều, chỉ còn khoảng 3 ngày Với những cải tiến như vậy, bộ chỉ thị của chúng tôi là một công cụ mạnh mẽ đối với PGT-M bệnh Hemophilia A.

Một số đặc điểm của các gia đình tham gia nghiên cứu

Tuổi người vợ có liên quan đến sự suy giảm cả dự trữ buồng trứng và khả năng sinh noãn [84] nên ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh trong ống nghiệm và chuyển phôi, tỷ lệ có thai giảm dần theo tuổi người mẹ Trong độ tuổi sinh đẻ, phụ nữ từ 20 đến 30 tuổi có kết quả thụ tinh trong ống nghiệm tốt nhất [85] Theo Yan J.H và cộng sự (2012), tỷ lệ có thai ở những người mẹ ở nhóm 21-30 tuổi là 59,79%, ở nhóm 31-35 tuổi là 56,53%, ở nhóm 36-

40 tuổi là 47,47%, ở nhóm từ 41 tuổi trở lên là thấp nhất (26,87%) [85] Bảng 3.9 cho thấy độ tuổi trung bình của người vợ khi tham gia nghiên cứu là 31,81±4,12 Độ tuổi này cao hơn so với lứa tuổi tối ưu để sinh đẻ (dưới 30 tuổi) và ảnh hưởng đáng kể tới thành công của kĩ thuật IVF

Trong tất cả các cặp vợ chồng, người chồng đều không mang gen bệnh.

Do đó, tất cả các gia đình đều có khả năng sinh ra được những người con không mang gen bệnh

Theo quy luật di truyền Mendel, các cặp vợ chồng có vợ mang gen và chồng khỏe mạnh có 25% nguy cơ sinh ra người con bị bệnh, 25% khả năng sinh ra người con mang gen bệnh và 50% cơ hội sinh được những người con khỏe mạnh.

Hình 4.2 Sự di truyền bệnh Hemophilia A qua các thế hệ

Trong nghiên cứu của chúng tôi, đa số các cặp vợ chồng tham gia nghiên cứu đều đã sinh con bị bệnh (87,5%), chỉ có 02 cặp vợ chồng không có tiền sử mang thai bị bệnh (12,5%) Có 01 cặp vợ chồng có tiền sử phải đình chỉ thai do chọc hút dịch ối làm xét nghiệm chẩn đoán trước sinh có kết quả thai bị bệnh (6,25%) Kết quả này phản ánh một phần thực trạng về dự phòngHemophilia A chưa đáp ứng được một cách đầy đủ nhu cầu loại trừ gen bệnh trong các thế hệ gia đình ở Việt Nam Mặc dù chẩn đoán trước sinh cho bệnhHemophilia A đã được áp dụng tại các trung tâm xét nghiệm di truyền lớn,nhưng phương pháp này cùng với PGT-M cho bệnh Hemophilia A đều chưa được bảo hiểm y tế chi trả Đây là một nguyên nhân có một tỷ lệ không nhỏ các em bé bị bệnh và mang gen bệnh Hemophilia được sinh ra ngày nay Những cặp vợ chồng mang gen bệnh Hemophilia A đang có nhu cầu sinh con khỏe mạnh có thể lựa chọn chẩn đoán trước sinh hoặc PGT-M Hiện nay ở Việt Nam, chẩn đoán trước sinh được áp dụng một cách rộng rãi hơn do chi phí không cao bằng PGT-M Các phương pháp chẩn đoán trước sinh thường được sử dụng là xét nghiệm vật liệu di truyền thu được từ chọc hút dịch ối, lấy máu gai rau, lấy máu cuống rốn Tuy nhiên, các cặp vợ chồng mang gen bệnh Hemophilia A lựa chọn chẩn đoán trước sinh phải đứng trước nguy cơ đình chỉ thai nghén nếu thai nhi bị bệnh và nhiều nguy cơ khác khi can thiệp vào buồng ối và gai rau như sảy thai, rò ối, nhiễm khuẩn ối, lây các bệnh truyền nhiễm cho thai (HIV, viêm gan B, C, D…), có thể gây ảnh hưởng bất lợi tới thai ở những sản phụ bất đồng nhóm máu Rh với thai… Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 01 cặp vợ chồng có tiền sử đình chỉ thai nghén do có kết quả thai bị bệnh khi chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp chọc hút dịch ối Họ tự nguyện tham gia thực hiện PGT-M với mong muốn cùng lúc có thể tạo ra rất nhiều phôi, tăng lên cơ hội lựa chọn những phôi khỏe mạnh, chuyển vào tử cung của người mẹ để sinh ra những em bé khỏe mạnh Ở những quần thể khác nhau, tần suất của các đột biến gen F8 cũng khác nhau và triệu chứng lâm sàng có tính chất phụ thuộc vào kiểu đột biến. Zahari M và cộng sự (2018) nghiên cứu trên quần thể người Malaysia đa sắc tộc cho thấy, 53% bệnh nhân Hemophilia A nặng xảy ra đảo đoạn intron 22 của gen F8, 3,6% xảy ra đảo đoạn intron 1 [86] Correa S.M và cộng sự

(2019) nghiên cứu trên quần thể người Brazil cho thấy bệnh nhân Hemophilia

A có tỷ lệ đảo đoạn intron 22 chiếm 41%, đảo đoạn intron 1 chiếm 2,6% [87]. Yunis L.K và cộng sự (2018) nghiên cứu trên quần thể người Colombia ở bệnh nhân bị Hemophila A cho thấy tỷ lệ đảo đoạn intron 22 chiếm 42,4%, và đảo đoạn intron 1 chiếm 9,1% [88] Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lưu Vũ Dũng (2014), đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm tỷ lệ cao nhất 38,1%, tiếp theo là đột biến sai nghĩa chiếm tỷ lệ 23,9%, chiếm tỉ lệ cao thứ ba là dạng đột biến mất nucleotid, đột biến vô nghĩa, đột biến thêm nucleotid với tỉ lệ 9,8%.

Tỉ lệ thấp nhất là dạng đột biến ở vị trí nối exon-intron và đột biến mất đoạn lớn chiếm tỷ lệ 4,3% [43] Như vậy, tuy tần suất các đột biến gen F8 khác nhau ở cá quần thể người nhưng tần suất đột biến đảo đoạn intron 22 vẫn chiếm tỷ lệ cao nhất Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với các nghiên cứu trên về mức độ thường gặp của đột biến đảo đoạn intron 22 Trong nghiên cứu của chúng tôi, những đột biến thường gặp ở các gia đình gen bệnh là đột biến đảo đoạn intron 22 (62,5%) Ngoài ra, còn có đột biến exon 14 (31,25%), đột biến exon 11 (6,25%)

PGT-M giúp sinh con không bị bệnh; góp phần cải thiện chất lượng dân số, giảm số người mang gen bệnh Vì vậy, những đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu có nguyện vọng loại bỏ tình trạng mang gen cho thế hệ sau cũng được chấp nhận tham gia nghiên cứu.

Kết quả điều trị IVF/ICSI

AMH (Anti - Mullerian Hormone) là một hormon được sản xuất bởi các tế bào hạt của nang noãn buồng trứng Đây là xét nghiệm quan trọng đánh giá khả năng dự trữ của buồng trứng, đồng thời cũng được dùng để xác định liều đầu FSH và để chọn phác đồ kích thích buồng trứng cho bệnh nhân

[89] Nồng độ AMH giảm theo tuổi và không thay đổi trong mỗi chu kỳ kinh nên có thể thực hiện vào bất kỳ ngày nào của chu kỳ kinh Đây là ưu điểm của xét nghiệm AMH so với xét nghiệm FSH Ở phụ nữ khỏe mạnh, dưới 38 tuổi, chỉ số AMH bình thường nằm trong khoảng từ 2,2 - 6,8 ng/ml Mức AMH thấp cho thấy khả năng dự trữ buồng trứng suy giảm Mức AMH cao và quá cao thường gặp ở phụ nữ bị buồng trứng đa nang [89] Trong nghiên cứu của chúng tôi, AMH trung bình của người vợ là 3,06 ± 2,21 ng/ml, phản ánh khả năng dự trữ buồng trứng tốt Giá trị này cũng phù hợp với độ tuổi trung bình của những người vợ tham gia nghiên cứu.

Số lượng nang noãn thứ cấp (Antral Follicle Count - AFC) được kiểm tra bằng siêu âm qua âm đạo, ngày thứ 2 của chu kỳ kinh Thời gian để một nang trứng nguyên thủy phát triển và trưởng thành mất trung bình 90 ngày.Giai đoạn phát triển từ nang trứng nguyên thuỷ thành nang thứ cấp, mất khoảng 3 tháng Giai đoạn này, không phụ thuộc hormon mà hoàn toàn phụ thuộc vào yếu tố nội tại của buồng trứng Giai đoạn phát triển từ nang thứ cấp đến nang trưởng thành mới cần tác dụng của FSH, LH Các nang thứ cấp đầu chu kỳ kinh sẽ được chiêu mộ thành các nang trưởng thành khi có đủ nồng độ FSH, đây chính là cơ sở của kích thích buồng trứng trong thụ tinh trong ống nghiệm, sử dụng liều FSH cao hơn bình thường để thu được nhiều noãn AFC đã được nghiên cứu rộng rãi để tiên lượng đáp ứng buồng trứng

[90] Bệnh nhân có số nang thứ cấp dưới 4 nang thì liên quan đến đáp ứng kém với kích thích buồng trứng và có tỷ lệ hủy bỏ chu kỳ cao hơn so với những bệnh nhân có trên 4 nang thứ cấp, tỷ lệ có thai thấp hơn trong thụ tinh trong ống nghiệm [91] Trong nghiên cứu của chúng tôi, số nang thứ cấp trung bình là 10,31±6,99 nang (thấp nhất là 2 nang, cao nhất là 26 nang) Kết quả AFC trong nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn nghiên cứu của Trần Thùy Anh (2017) (AFC trung bình ở độ tuổi dưới 35 là 14,94 ± 6,74 nang), Barbakadze và và cộng sự (2015) (AFC trung bình ở độ tuổi dưới 35 là: 13,18 ± 8,64) [89], [92] AFC trung bình giữa các nghiên cứu là khác nhau có thể do cách chọn đối tượng và số lượng đối tượng nghiên cứu.

Liều FSH khởi đầu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình chọn lọc và vượt trội của nang noãn Với liều FSH phù hợp, buồng trứng sẽ thu được nhiều noãn mà không bị quá kích buồng trứng Đã có nhiều nghiên cứu để xác định liều FSH ban đầu, liều FSH thông thường được cho từ 150-250UI/ngày tùy theo từng phác đồ [91] Căn cứ vào khả năng dự trữ buồng trứng của các đối tượng nghiên cứu, phác đồ kích thích buồng trứng sử dụng antagonist đã được tiến hành với liều trung bình FSH kích thích buồng trứng 260,94 ± 46,51 IU/ngày với số ngày sử dụng là 9,56 ± 0,62 Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Trần Thùy Anh

(2017) (liều FSH trung bình là 228,73 ± 79,3 IU/ngày, số ngày dùng là 9,75 ± 1,0) [89], nghiên cứu của Vương Thị Ngọc Lan (2016) (liều FSH trung bình là 224,3 IU/ngày ở nhóm < 36 tuổi và 295 IU/ngày ở nhóm > 36 tuổi, số ngày dùng thuốc là 8,96 ± 1,4 ngày) [93] Nồng độ estrogen trong huyết tương tại ngày tiêm thuốc gây trưởng thành noãn và rụng trứng là 3902,75 ± 2001,04 pg/ml Không có trường hợp nào xuất hiện quá kích buồng trứng

Sau khi thực hiện kích thích buồng trứng, tổng số noãn thu được từ các bệnh nhân tham gia nghiên cứu là 244 noãn, trong đó có 210 noãn tới được giai đoạn trưởng thành chiếm tỉ lệ 86,07%, mỗi bệnh nhân có số noãn trưởng thành trung bình là 13,12 ± 7,54 Số noãn trưởng thành trung bình cao hơn trong nghiên cứu của Kim M.S và cộng sự (2015): số noãn trưởng thành trung bình là 8,4 ± 5,5 mỗi chu kỳ [94], nghiên cứu của Bùi Thị Minh Phượng (2019): số noãn trưởng thành trung bình là 11,5 [79]

Trong nghiên cứu của chúng tôi, trong số 210 noãn trưởng thành có 155 noãn thụ tinh, trung bình mỗi người vợ có noãn được thụ tinh 9,69 ± 5,78 Tỉ lệ thụ tinh thành công là 73,8%, và số phôi nang trung bình là 7,31 ± 4,69 Tỷ lệ thụ tinh thành công trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn trong nghiên cứu của Jaroudi K và cộng sự (2003), Yoeli R và cộng sự (2008), Speyer B. và cộng sự (2019), thấp hơn trong nghiên cứu của Kim M.S và cộng sự

Phân loại chất lượng phôi ngày 5 của chúng tôi dựa theo tiêu chuẩnGardner Trong 117 phôi nang tạo được thì có 85 phôi loại tốt (72,65%), 30 phôi trung bình (25,64%), 2 phôi kém (1,71%) Có 115 phôi thuộc loại tốt và trung bình được tiến hành sinh thiết để chẩn đoán di truyền Chúng tôi không tiến hành PGT-M trên những phôi có chất lượng thấp để tránh tốn kém cho bệnh nhân Nguyên nhân vì kết quả chuyển phôi của những phôi có chất lượng thấp là rất thấp [98], [99].

Kết quả chẩn đoán trước làm tổ của các gia đình

4.2.3.1 Tỉ lệ ADO của các STR

ADO xảy ra khi một trong hai alen không được khuếch đại Trong chẩn đoán bệnh di truyền đơn gen, hiện tượng ADO có thể dẫn tới âm tính giả và do đó quyết định chuyển nhầm phôi mang đột biến; đồng thời cũng có thể xuất hiện dương tính giả do hiện tượng mất alen, từ đó loại bỏ phôi ở trạng thái dị hợp tử trong khi đối với bệnh di truyền lặn, một phôi dạng dị hợp tử vẫn là một sự lựa chọn để chuyển phôi.

Hiện tượng ADO rất phổ biến và là một trong những thách thức của phương pháp WGA, gây ảnh hưởng đến kết quả [100], [101] Theo khuyến cáo của Hiệp hội Sinh sản và Phôi thai Châu Âu (ESHRE) 2020, tỉ lệ ADO trong quá trình WGA trung bình khoảng 20-30% và tỉ lệ ADO chấp nhận được đối với 1 marker để thực hiện chẩn đoán PGT-M là 10% [81] Để tránh việc chẩn đoán sai do hiện tượng ADO, có 2 biện pháp được đưa ra bao gồm lựa chọn các marker có tỉ lệ ADO thấp, và lựa chọn một hệ thống nhiều các marker để nếu marker bị ADO thì còn marker khác phục vụ phân tích Tỉ lệ ADO trong nghiên cứu của chúng tôi tương đương với khuyến cáo của ESHRE (11,72%), đồng thời có nhiều markers có chỉ số dị hợp tử cao, do đó hoàn toàn đảm bảo khả năng phục vụ di truyền liên kết.

4.2.3.2 Kết quả chẩn đoán trước làm tổ

Kỹ thuật phân tích di truyền liên kết sử dụng bộ STR có nhiều ưu điểm do tính bền vững cao, yêu cầu thao tác và kỹ thuật thí nghiệm ít hơn các phương pháp khác, phù hợp với các chẩn đoán với số lượng mẫu lớn Ngoài ra, trong quá trình phân tích trên các gia đình mang gen, ngoài vai trò chẩn đoán và xác định sự di truyền của đột biến qua các thế hệ, các STR bộc lộ rất nhiều khả năng khác bao gồm kiểm soát hiện tượng ADO, hiện tượng nhiễm vật liệu di truyền từ ngoài vào Hiện tượng ADO xảy ra khi sử dụng phương pháp trực tiếp sẽ dẫn tới kết luận sai Đối với phôi dị hợp tử, nếu ADO rơi vào vị trí đột biến alen sẽ dẫn tới kết luận phôi không mang gen bệnh (âm tính giả) và đối mặt với nguy cơ chuyển nhầm một phôi dị hợp tử vào cơ thể người phụ nữ; nếu ADO rơi vào vị trí alen bình thường sẽ dẫn tới kết luận phôi bị bệnh (dương tính giả) và đối mặt với việc loại bỏ phôi dị hợp tử Trong khi đó đối với các gia đình hiếm muộn, việc chuyển một phôi dị hợp tử đột biến vẫn được cân nhắc.

Ngoài ra, các STR cũng có thể phát hiện và xác định vị trí trao đổi chéo Hiện tượng trao đổi chéo là hiện tượng thường xảy ra trong quá trình giảm phân phát sinh giao tử Tỉ lệ phát sinh trao đổi chéo tùy thuộc vào vị trí của locus trên nhiễm sắc thể cũng như khoảng cách giữa 2 locus gen Khi đánh giá về mối liên quan giữa khoảng cách giữa 2 locus gen trên cùng 1 NST với khả năng di truyền liên kết với nhau trong quá trình phát sinh giao tử, người ta sử dụng đơn vị Centimorgan (cM) 1 cM tương ứng với 1% khả năng hiện tượng trao đổi chéo xảy ra và tạo nên hiện tượng hoán vị gen Mặc dù không có công thức quy đổi từ cM sang khoảng cách vật lí (bp) giữa 2 locus gen, nhưng trung bình trên toàn bộ genome của người, 1cM tương ứng với 1.000.000 bp.

Theo thống kê của ESHRE 2020, tỉ lệ chẩn đoán sai trong quy trình IVF/PGT nói chung lên tới 3% và tỉ lệ này còn có thể cao hơn do dữ liệu báo cáo của các trung tâm IVF còn hạn chế [77] Cũng theo nghiên cứu của Wilton (2009) trên 2538 trường hợp PGT-M, có 24 trường hợp chẩn đoán sai dẫn tới đình chỉ thai nghén hoặc sinh con ra bị bệnh [102]

Số lượng đột biến gây bệnh Hemophilia A rất lớn với hơn 2100 đột biến của gen F8 đã được xác định [23] Kỹ thuật PGT-M dựa trên việc xác định trực tiếp đột biến không thể áp dụng cho tất cả hơn 2100 đột biến Bên cạnh đó, hiện tượng ADO ở mẫu tế bào phôi, được xác định trên 20-30% các ca chẩn đoán trước làm tổ, có thể dẫn tới chẩn đoán sai [77] Ngoài ra, ngoại nhiễm cũng là nguyên nhân phổ biến gây chẩn đoán sai trong PGT-M Chính vì vậy, chúng tôi đã sử dụng phương pháp phân tích liên kết gen dựa trên đồng thời mẫu bố, mẫu mẹ, mẫu con, mẫu phôi để đối chiếu sự di truyền của các alen bệnh Sự phân tích này tăng cường khả năng kiểm soát hiện tượng ngoại nhiễm tốt hơn và kiểm soát ADO tốt hơn so với việc không đưa mẫu bố vào nhóm cần phân tích haplotype [79] Ngoài ra, mẫu bố được đưa vào phân tích di truyền liên kết có thể mở rộng thêm khả năng chẩn đoán phôi cho những cặp vợ chồng chưa có con đầu lòng, hoặc con đầu lòng không bị bệnh, con đầu lòng là nữ mang gen hoặc con đầu lòng là nữ khỏe mạnh.

Do vậy, kỹ thuật phân tích liên kết gen sử dụng nhiều STR trên cả mẫu bố, mẫu mẹ, mẫu con, mẫu phôi giúp chẩn đoán trước làm tổ Hemophilia A được ưu tiên lựa chọn vì đồng thời kiểm soát được hai hiện tượng trên và tăng độ chính xác của chẩn đoán.

Từ năm 1998, hàng năm, Liên đoàn Hemophilia thế giới đã thu thập số liệu toàn cầu về Hemophilia Năm 2014, điều tra cho thấy số bệnh nhân rối loạn chảy máu được chẩn đoán trên toàn cầu là 296.066 trong đó có 178.500 bệnh nhân Hemophilia Con số này mới chỉ là một phần của số bệnh nhân thực mắc trong khi số bệnh nhân ước tính là 400.000 người [25] Ở Việt Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh Hemophilia A và khoảng 30.000 người mang gen bệnh Hemophilia A [79] Do vậy nhu cầu điều trị bệnh Hemophilia A là cực kì to lớn Kỹ thuật PGT-M là sự kết hợp giữa kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) tạo phôi với việc chẩn đoán di truyền Kỹ thuật giúp lựa chọn các phôi không mang gen bệnh để chuyển vào tử cung người mẹ, giúp mang thai không bị bệnh và sinh con khỏe mạnh

Như vậy, PGT-M làm giảm gánh nặng về tâm lý và bảo vệ sức khỏe của người phụ nữ do giảm nguy cơ đình chỉ thai nghén Các em bé được sinh ra thông qua quy trình PGT-M sẽ không cần tiến hành sàng lọc gen bệnh hay tư vấn trước hôn nhân khi đến tuổi trưởng thành Xa hơn nữa, loại bỏ được gen bệnh trong quần thể sẽ giúp giảm đi gánh nặng cho hệ thống y tế và góp phần tạo nên những thế hệ người dân khỏe mạnh.

Trong 115 phôi được chẩn đoán, có 70 phôi không đột biến gen F8 (60,87%), 26 phôi dị hợp tử có đột biến gen F8 (22,61%) và 19 phôi (16,52%) bị bệnh do có đột biến gen F8 Như vậy, có 60,87% phôi nang ngày 5 không mang gen bệnh có thể chuyển

Kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Minh Phượng có tổng số 75 phôi ngày

3 được sinh thiết làm xét nghiệm chẩn đoán gen, có 26/75 phôi phát hiện mang đột biến gen gây bệnh Hemophilia A, gồm phôi nam và phôi nữ bị bệnh, chiếm 34,7% Còn lại 49/75 phôi, chiếm tỷ lệ 65,3%, có kiểu hình bình thường; gồm phôi nam, nữ bình thường và phôi nữ mang gen 49 phôi này tiếp tục được nuôi cấy đến giai đoạn phôi nang để đánh giá sự phát triển phôi sau sinh thiết và lựa chọn cấy vào tử cung của mẹ Trong đó, có 35 phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang, chiếm tỷ lệ là 46,7%, số phôi không tiếp tục phát triển thành phôi nang là 14 phôi, chiếm 18,6% [79] Như vậy, tỷ lệ phôi nang không mang gen bệnh có thể chuyển trong nghiên cứu này (46,7%) là thấp hơn trong nghiên cứu của chúng tôi (60,86%) Có sự khác nhau này được giải thích là do trong nghiên cứu của tác giả Bùi Thị Minh Phượng, phôi được sinh thiết chẩn đoán là phôi ngày 3, còn trong nghiên cứu của chúng tôi là phôi nang (ngày 5) Phôi ngày 3 sau sinh thiết có khả năng sống thấp hơn phôi ngày 3 không sinh thiết, nên tỉ lệ phát triển từ phôi ngày 3 đến phôi ngày 5 là thấp hơn so với tỉ lệ phôi để đến ngày 5 mới sinh thiết. Trong 16 cặp vợ chồng có phôi sàng lọc chẩn đoán di truyền, 2 cặp vợ chồng không có phôi không mang gen bệnh nên không tham gia chuyển phôi,

1 cặp vợ chồng có phôi không mang gen bệnh chưa thực hiện chuyển phôi.

Có 13 người vợ đã được chuyển phôi thực hiện trong 19 chu kỳ, trong đó có 6 người vợ được chuyển phôi 2 lần, 7 người vợ được chuyển phôi 1 lần 17 chu kỳ thực hiện chuyển 1 phôi, 2 chu kỳ chuyển 2 phôi, số phôi chuyển trung bình của một chu kỳ là 1,11 ± 0,32 phôi.

Kết quả tỉ lệ có thai lâm sàng/số chu kỳ chuyển phôi là 10/19 (52,6%), tỉ lệ có thai lâm sàng/ số cặp vợ chồng điều trị là 10/16 (62,5%) Tỉ lệ phôi làm tổ 52,4% Có 9 sản phụ đã sinh với 11 trẻ sinh sống (2 trường hợp sinh đôi), các bé đều khỏe mạnh Có 2/13 cặp vợ chồng thất bại với các lần chuyển phôi.

Trước đây những thai phụ là người lành mang gen bình thường được tư vấn chỉ nên sinh con gái, nếu thai nhi là con trai nên đình chỉ Tuy nhiên ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học đặc biệt với kỹ thuật phân tích liên kết gen dựa trên bộ chỉ thị STR sẽ giúp cho các bà mẹ hoàn toàn có khả năng sinh con trai, con gái khỏe mạnh mà không phải chịu ảnh hưởng về tâm sinh lý Đặc điểm di truyền của bệnh Hemophilia A là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể X mà không có alen trên nhiễm sắc thể Y Do đó người con trai chỉ cần nhận một alen từ mẹ là có thể bị bệnh Hemophilia A Trong khi đó người con gái phải nhận từ cả bố và mẹ mới có thể biểu hiện bệnh. Với người bệnh Hemophilia A có khả năng sống như người bình thường vẫn có khả năng sinh con Vì vậy nếu người đàn ông bị bệnh lấy vợ bình thường thì toàn bộ con gái của họ sẽ là người lành mang gen bệnh, con trai của họ hoàn toàn bình thường Vì vậy với những người đàn ông bị bệnh hemophilia

A vẫn có khả năng sinh ra những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh

Người phụ nữ là người lành mang gen bệnh khi thực hiện chẩn đoán trước làm tổ, nếu phôi bình thường về kiểu gen và kiểu hình thì hoàn toàn yên tâm chuyển vào buồng tử cung, nếu phôi có bất thường về kiểu gen thì có thể đình chỉ không chuyển phôi vào buồng tử cung

Định dạng
Số trang	156
Dung lượng	7,02 MB