Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN MINH TÂM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN HEMOPHILIA A TRƯỚC LÀM TỔ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN MINH TÂM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN HEMOPHILIA A TRƯỚC LÀM TỔ Ngành: Khoa học Y sinh Mã số: 72 01 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Nguyễn Duy Bắc TS Nguyễn Thanh Tùng HÀ NỘI - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu đề tài luận án toàn số liệu đề tài nghiên cứu có tên “Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR phân tích trình tự lặp ngắn chẩn đốn bệnh Hemophilia A trước chuyển phơi Hà Nội” Mã số 01C-08/11-2017-3, Sở KH CN thành phố Hà Nội Kết đề tài thành nghiên cứu tập thể mà thành viên Tơi Chủ nhiệm đề tài tồn thành viên nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài vào luận án để bảo vệ lấy tiến sỹ Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Nguyễn Minh Tâm LỜI CẢM ƠN Tơi hồn thành luận án với nỗ lực cố gắng thân Trong trình học tập nghiên cứu, nhận giúp đỡ động viên thầy, cô, đồng nghiệp người thân Tôi xin chân thành cảm ơn: Đảng ủy, Ban giám đốc Học viện Quân y, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Nam học muộn Hà Nội, Phòng sau Đại học - Học viện Quân y, Bộ môn Giải phẫu - Học viện Quân Y cho phép, tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập hồn thành luận án Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: GS.TS Nguyễn Duy Bắc - Trưởng phòng đào tạo, Học viện Quân Y TS Nguyễn Thanh Tùng - Phó giám đốc viện Mơ phơi lâm sàng Quân đội người Thầy tận tình, hết lịng học trị, trực tiếp hướng dẫn, bảo, cung cấp cho kiến thức phương pháp luận quý báu suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Ngọc Anh - chủ nhiệm Bộ mơn, TS Đặng Tiến Trường - phó Chủ nhiệm Bộ môn thầy cô Bộ môn Giải phẫu Học viện Quân Y giúp đỡ q trình học tập nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Mai - Giám đốc Trung tâm Hemophilia - Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, ThS Lê Thị Thu Hiền - Giám đốc Bệnh viện nam học muộn Hà Nội đồng nghiệp giúp đỡ tơi q trình thu thập số liệu nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô Hội đồng Chấm luận án đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tơi hồn thành luận án Cuối tơi xin gửi lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bên cạnh, động viên, chia sẻ khó khăn để tơi n tâm học tập hoàn thành luận án! Nghiên cứu sinh Nguyễn Minh Tâm MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh Hemophilia A 2 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh Hemophilia A 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh, chẩn đoán, nguyên tắc điều trị bệnh Hemophilia A……… 1.1.3 Di truyền tỷ lệ mắc bệnh Hemophilia A6 1.1.4 Bệnh học phân tử bệnh Hemophilia A 1.2 Quy trình thụ tinh ống nghiệm 12 1.2.1 Kích thích buồng trứng 12 1.2.2 Chọc hút nỗn 13 1.2.3 Kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm cổ điển tiêm tinh trùng vào bào tương noãn 14 1.2.4 Sinh thiết phôi 14 1.2.5 Đông lạnh rã đông phôi 1.2.6 Chuyển phôi 16 17 1.3 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A 17 1.3.1 Lựa chọn phôi có nhiễm sắc thể giới tính XX 18 1.3.2 Kỹ thuật chẩn đoán trực tiếp đột biến gen F8 19 1.3.3 Kỹ thuật chẩn đốn gián tiếp thơng qua phân tích liên kết gen F8 22 1.4 Tình hình chẩn đoán di truyền trước làm tổ bệnh Hemophilia A giới Việt Nam 28 1.4.1 Trên giới 28 1.4.2 Tại Việt Nam 29 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU31 2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 31 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.1.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 32 2.2.2 Phương pháp chọn mẫu cách tính cỡ mẫu 32 2.2.3 Phương tiện vật liệu nghiên cứu 33 2.2.4 Các kỹ thuật sử dụng 2.3 Các tiêu nghiên cứu 2.4 Xử lý số liệu 34 50 53 2.5 Sơ đồ nghiên cứu 53 2.6 Đạo đức nghiên cứu 55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1 Đánh giá tính đa hình thị STR liên kết với gen F8 phục vụ chẩn đốn trước làm tổ mẫu phơi bào phụ nữ mang gen bệnh Hemophilia A 56 3.1.1 Kết STR lựa chọn công cụ Tin sinh học 56 3.1.2 Kết tối ưu hóa quy trình multiplex PCR khuếch đại STR mẫu máu 57 3.1.3 Chỉ số dị hợp tử STR 63 3.1.4 Chuẩn hóa quy trình PGT - M mẫu tế bào phôi 67 3.2 Đánh giá kết chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho số cặp vợ chồng mang gen bệnh 73 3.2.1 Một số đặc điểm gia đình tham gia nghiên cứu 73 3.2.2 Kết điều trị IVF/ICSI 75 3.2.3 Kết chẩn đoán trước làm tổ cho gia đình mang gen bệnh 77 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 85 4.1 Đánh giá tính đa hình thị STR liên kết với gen F8 phục vụ chẩn đốn trước làm tổ mẫu phơi bào phụ nữ mang gen bệnh Hemophilia A 86 4.1.1 Lựa chọn marker công cụ tin Sinh học ngân hàng gen 86 4.1.2 Kết tối ưu hóa quy trình multiplex PCR khuếch đại STR mẫu máu 88 4.1.3 Chỉ số dị hợp tử STR 90 4.1.4 Chuẩn hóa quy trình PGT - M mẫu tế bào phôi 92 4.2 Đánh giá kết chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho số cặp vợ chồng mang gen bệnh 96 4.2.1 Một số đặc điểm gia đình tham gia nghiên cứu 96 4.2.2 Kết điều trị IVF/ICSI 99 4.2.3 Kết chẩn đoán trước làm tổ gia đình mang gen bệnh 102 KẾT LUẬN 108 KIẾN NGHỊ 111 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Phần viết tắt ADO AF AFC AMH : : : : ASRM : DNA DOP PCR ESHRE FISH 10 FSH 11 hCG 12 13 Ho He 13 hMG 14 ICSI 15 16 IVF LH 17 MDA 18 19 20 Multiplex PCR NST PCR 21 PGD 22 PGDIS Phần viết đầy đủ Allele dropout (mất alen) Amplification failure (khuếch đại thất bại) Antral Follicle Count (số lượng nang thứ cấp) Anti Mullerian Hormone American Society for Reproductive Medicine (Hiệp hội y học sinh sản Hoa Kỳ) : Deoxyribonucleic acid Degenerate Oligonucleotide Primed PCR (PCR mồi thối : hóa) European Society for Human Reproduction and Embryology : (Hiệp hội phôi sinh sản người Châu Âu) Fluorescence in situ hybridization (kỹ thuật lai huỳnh quang : chỗ) : Follicle Stimulating Hormone (hormone kích thích nang trứng) Human Chorionic Gonadotropin (Gonadotropin chiết xuất từ : nước tiểu thai phụ) : Observed Heterozygosity (tần số dị hợp tử quan sát) : Expected Heterozygosity (tần số dị hợp tử lý thuyết) Human Menopausal Gonadotropin (Gonadotropin chiết xuất từ : nước tiểu phụ nữ mãn kinh) Intracytoplasmic Sperm Injection (tiêm tinh trùng vào bào tương : noãn) : In vitro fertilization (thụ tinh ống nghiệm) : Luteinizing Hormone Multiple Displacement Amplification (khuếch đại thay đa : điểm) : Multiplex PCR (PCR đa mồi) : Nhiễm sắc thể : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) Preimplantation Genetic Diagnosis (chẩn đoán di truyền trước : chuyển phôi) : PGD International Society (hiệp hội Quốc tế PGD) TT Phần viết tắt 23 PGT : 24 PGT-A : 25 PGT-M : 26 27 28 29 30 RNA SNP STR Single PCR WGA : : : : : Phần viết đầy đủ Preimplantation Genetic Testing (xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi) Preimplantation genetic testing for aneuploidy (xét nghiệm di truyền phát bất thường lệch bội nhiễm sắc thể) Preimplantation genetic testing for monogenic disorders (xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi cho bệnh di truyền đơn gen) Ribonucleic acid Single nucleotide polymorphism (đa hình đơn nucleotide) Short Tandem Repeat (trình tự lặp ngắn) Single PCR (PCR đơn mồi) Whole Genome Amplification (khuếch đại toàn hệ gen) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần D2 42 Bảng 2.2 Thành phần Mastermix 42 Bảng 2.3 Trình tự mồi khuếch đại thị STR 44 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng Singleplex PCR (tổng thể tích phản ứng 20µl) Bảng 2.5 Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng Singleplex PCR 45 46 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng Multiplex PCR gắn màu huỳnh quang 46 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR gắn màu huỳnh quang Bảng 2.8 Thông tin mồi huỳnh quang 47 47 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản 47 Bảng 2.10 Chu trình nhiệt biến tính DNA 48 Bảng 2.11 Phân loại phơi nang 57 Bảng 3.1 Thông tin STR lựa chọn 61 Bảng 3.2 Nồng độ mồi phản ứng multiple PCR cho DNA từ máu 66 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR tối ưu cho DNA từ máu Bảng 3.4 Tần số alen 13 STR 68 69 Bảng 3.5 Kết tính tốn số Ho, He 70 Bảng 3.6 Kết định lượng sản phẩm WGA đo phương pháp Qu-bit Bảng 3.7 Nồng độ mồi tối ưu cho DNA từ phôi 76 Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR tối ưu cho DNA từ phôi Bảng 3.9 Một số đặc điểm gia đình tham gia nghiên cứu 77 Bảng 3.10 Tình trạng mang thai sinh cặp vợ chồng 78 Bảng 3.11 Tần suất đột biến gen F8 gia đình Bảng 3.12 Kết điều trị IVF/ICSI79 74 79 76