Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Phan Thị Thanh Hà NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ VI RÚT CĨ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Quang Hòa PGS TS Trương Tuyết Mai Hà Nội - 2024 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn TS Lê Quang Hòa PGS.TS Trương Tuyết Mai Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa tác giả khác công bố Hà Nội, ngày Tập thể hướng dẫn TS Lê Quang Hòa tháng năm Nghiên cứu sinh PGS.TS.Trương Tuyết Mai Phan Thị Thanh Hà ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TL GIÁM ĐỐC TRƯỞNG BAN ĐÀO TẠO i LỜI CẢM ƠN Từ năm 2005 đến nay, năm học Đại học, làm luận văn Thạc sĩ luận án Tiến sĩ Đại học Bách khoa Hà Nội thân yêu, thu nhận nhiều kiến thức quý báu lý thuyết thực hành nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ Sinh học – công nghệ Thực phẩm Tôi vô biết ơn Thầy Cô giáo, Ban Giám đốc Đại học Bách khoa Hà Nội… dạy dỗ, bảo ban giúp đỡ tơi mặt Hồn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa PGS.TS Trương Tuyết Mai tận tình hướng dẫn, bảo, dành nhiều thời gian trao đổi, định hướng trình thực đề tài nghiên cứu viết Luận án Xin chân thành cảm ơn Thầy Cô, cán Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Trường Hóa Khoa học sống nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trình thực báo Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Dinh dưỡng, lãnh đạo đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực phẩm Sinh học phân tử tạo điều kiện, giúp đỡ tơi hồn thành công việc chuyên môn phân công Lời cảm ơn sâu sắc xin gửi tới Gia đình, Bạn bè ln chia sẻ khó khăn, động viên khích lệ tơi vượt qua trở ngại để hoàn thành nhiệm vụ nghiên cứu học tập! Hà Nội ngày tháng năm 20 Nghiên cứu sinh Phan Thị Thanh Hà ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Tính đề tài TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ thách thức an toàn thực phẩm 1.1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.1.2 Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.2 Đặc điểm sinh học vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.2.1 Norovirus 1.2.2 Hepatitis A virus 10 1.2.3 Hepatitis E virus 11 1.2.4 Astrovirus 12 1.3 Quy trình phát định lượng vi rút nhuyễn thể hai mảnh vỏ 13 1.3.1 Các phương pháp tách chiết RNA vi rút 13 1.3.2 Các phương pháp xác định vi rút 18 1.4 Các quy trình phát định lượng vi rút nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa kỹ thuật Real-time RT-PCR 22 1.5 Ứng dụng công nghệ MGB LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy mồi, mẫu dị phản ứng Real-time RT - PCR 27 iii 1.5.1 Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) 28 1.5.2 Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids) 29 1.6 Phương pháp xác định kiểu gen vi rút 30 1.7 Tình hình nghiên cứu lưu hành kiểu gen NoV, HAV, HEV, HAstV giới Việt Nam 31 1.7.1 Tình hình nghiên cứu giới 31 1.7.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 35 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Vật liệu nghiên cứu 38 2.1.1 Vật liệu kiểm soát 38 2.1.2 Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 38 2.1.3 Oligonucleotide 39 2.1.4 Hóa chất 43 2.1.5 Thiết bị 43 2.2 Phương pháp nghiên cứu 44 2.2.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát định lượng RNA HEV HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 44 2.2.2 Áp dụng quy trình xây dựng phát định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ 52 2.2.3 Xác định kiểu gen chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm phát nhuyễn thể hai mảnh vỏ 56 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59 3.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát định lượng RNA HEV HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 59 3.1.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát định lượng RNA HEV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 59 3.1.2 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát định lượng RNA HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 83 3.2 Áp dụng quy trình xây dựng phát vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ 99 3.2.1 Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 99 iv 3.2.2 Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2022 105 3.2.3 So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 năm 2022 110 3.3 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ 114 3.3.1 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử chủng NoV phát nhuyễn thể hai mảnh vỏ 114 3.3.2 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử chủng HEV phát nhuyễn thể hai mảnh vỏ 120 3.3.3 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử chủng HAstV phát nhuyễn thể hai mảnh vỏ 123 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Xuất NTHMV Việt Nam 2020-2021 Hình 1.2 Cấu trúc Norovirus Hình 1.3 Cấu trúc Hepatitis A virus 10 Hình 1.4 Cấu trúc Hepatitis E virus 11 Hình 1.5 Cấu trúc Human Astrovirus 12 Hình 1.6 Bộ mồi phản ứng LAMP 18 Hình 1.7 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR 20 Hình 1.8 Vị trí gắn MGB mẫu dị cấu trúc hóa học MGB 28 Hình 1.9 Cấu trúc nucleotide thông thường nucleotidd LNA 29 Hình 2.1 Quy trình lựa chọn, hiệu chỉnh, thiết kế mồi mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV HAstV 44 Hình 2.2 Quy trình tách dịng trình tự gen đại diện HEV HAstV 45 Hình 2.3 Quy trình phiên mã in vitro tạo chứng dương RNA 47 Hình 2.4 Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV HAstV 48 Hình 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV HAstV 49 Hình 2.6 Tóm tắt quy trình phát định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm NTHMV 52 Hình 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR phát định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm NTHMV theo ISO 15216-1:2013 54 Hình 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR với mồi khuếch đại RNA NoV, HAV, HEV HAstV NTHMV 57 Hình 2.9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với mồi để khuếch đại cDNA NoV, HAV, HEV HAstV NTHMV 57 Hình 3.1 Đặc điểm mồi Schlosser Jothikumar trình tự gen HEV chuẩn WHO 59 Hình 3.2 Độ bao phủ tổ hợp mồi, mẫu dò nghiên cứu Schlosser Jothikumar với hệ gen HEV công bố GenBank 61 Hình 3.3 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV-A 65 vi Hình 3.4 Kết sàng lọc PCR khuẩn lạc E coli DH5α mang đoạn gen đích HEV.A sau biến nạp vào vector pJET1.2 65 Hình 3.5 Kết giải trình tự dịng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.A 66 Hình 3.6 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV.B 66 Hình 3.7 Kết sàng lọc PCR khuẩn lạc E coli DH5α mang đoạn gen đích HEV.B sau biến nạp vào vector pJET1.2 67 Hình 3.8 Kết giải trình tự dịng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.B67 Hình 3.9 Chu trình nhiệt rút gọn phản ứng Real-time RT-PCR phát HEV từ NTHMV 74 Hình 3.10 Kết xác định giới hạn phát với xác suất 95% phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV 76 Hình 3.11 Kết xác định khoảng định lượng phản ứng Real-time RT-PCR phát định lượng HEV NTHMV 80 Hình 3.12 Các đường chuẩn định lượng phản ứng Real-time RT-PCR phát định lượng HEV NTHMV 80 Hình 3.13 Độ bao phủ tổ hợp mồi, mẫu dò nghiên cứu Cann cộng 84 Hình 3.14 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HAstV 87 Hình 3.15 Kết sàng lọc PCR khuẩn lạc E coli DH5α mang đoạn gen đích HAstV sau biến nạp vào vector pJET1.2 87 Hình 3.16 Kết giải trình tự dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HAstV 88 Hình 3.17 Kết xác định giới hạn phát với xác suất 95% phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstV 94 Hình 3.18 Kết xác định khoảng định lượng phản ứng Real-time RT-PCR phát định lượng HAstV NTHMV 97 Hình 3.19 Các đường chuẩn định lượng phản ứng Real-time RT-PCR phát định lượng HAstV NTHMV 97 Hình 3.20 Phân bố nồng độ vi rút mẫu dương tính năm 2016 103 Hình 3.21 Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm NTHMV chợ siêu thị năm 2016 104 vii Hình 3.22 Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm NTHMV theo thời điểm lấy mẫu năm 2016 104 Hình 3.23 Phân bố nồng độ vi rút mẫu dương tính năm 2022 109 Hình 3.24 Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm NTHMV chợ siêu thị năm 2022 109 Hình 3.25 Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm NTHMV theo thời điểm lấy mẫu năm 2022 110 Hình 3.26 So sánh tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm NTHMV năm 2016 năm 2022 111 Hình 3.27 So sánh phân bố nồng độ vi rút mẫu dương tính 111 năm 2016 năm 2022 111 Hình 3.30 Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại vùng gen ORF1-ORF2 NoV GI NoV GII 114 Hình 3.31 Cây phát sinh lồi mẫu NoV GI phát nghiên cứu với trình tự NoV GI tham chiếu từ GenBank 116 Hình 3.32 Phân bố kiểu gen Norovirus GI mẫu phát nghiên cứu 117 Hình 3.33 Cây phát sinh loài mẫu NoV GII phát nghiên cứu với trình tự NoV GII tham chiếu từ GenBank 118 Hình 3.34 Phân bố kiểu gen Norovirus GII mẫu phát nghiên cứu 119 Hình 3.35 Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HEV 121 Hình 3.36 Cây phát sinh lồi mẫu HEV phát nghiên cứu với trình tự HEV tham chiếu từ GenBank 122 Hình 3.37 Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HAstV 123 Hình 3.38 Cây phát sinh loài bốn chủng HAstV phát nghiên cứu 124 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tổng hợp nghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV 17 Bảng 1.2 Nhận xét phương pháp xác định vi rút gây bệnh thực phẩm 21 Bảng 1.3 Tổng hợp mồi mẫu dò sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 1.4 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR 25 Bảng 1.5 Tổng hợp số nghiên cứu vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm Việt Nam 35 Bảng 2.1 Thông tin mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập thị trường 39 Bảng 2.2 Trình tự mồi, mẫu dị sử dụng nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR phát định lượng RNA vi rút từ NTHMV 39 Bảng 2.3 Tổng hợp mồi sử dụng phản ứng Nested RT-PCR xác định kiểu gen vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm NTHMV 41 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng RNA vi rút sử dụng SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit 49 Bảng 2.5 Thơng tin biến phân tích phần mềm SPSS 55 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại cDNA NoV, HAV, HEV HAstV NTHMV 56 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR với mồi để khuếch đại cDNA NoV, HAV, HEV HAstV NTHMV 57 Bảng 3.1 Đặc điểm kỹ thuật tổ hợp mồi Schlosser Jothikumar 60 Bảng 3.2 Đặc điểm kỹ thuật tổ hợp mồi sau hiệu chỉnh ứng dụng công nghệ MGB, LNA 63 Bảng 3.3 Kết tối ưu nồng độ ion Mg2+ hai tổ hợp mồi A B 68 Bảng 3.4 Kết tối ưu nồng độ mồi hai tổ hợp mồi A B 70 Bảng 3.5 Kết tối ưu nồng độ mẫu dò hai tổ hợp mồi A B 71 Bảng 3.6 Thành phần tối ưu phản ứng Realt-time RT-PCR phát HEV 72 Bảng 3.7 Kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi quy trình Real-time RT-PCR phát HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn 73 Bảng 3.8 Tối ưu hóa thời gian gắn mồi kéo dài mạch quy trình Real-time RT-PCR phát HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn 74 ix