Luận án tiến sĩ y học đặc điểm sinh học phân tử của escherichia coli mang gen mcr 1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã thanh hà, hà nam, năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG ======================== NGUYỄN THỊ TUYẾT MAI ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA Escherichia coli MANG GEN mcr-1 KHÁNG COLISTIN PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI VÀ VẬT NUÔI, THỰC PHẨM VÀ NƯỚC TẠI XÃ THANH HÀ, HÀ NAM, NĂM 2015 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG =========================== NGUYỄN THỊ TUYẾT MAI ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA Escherichia coli MANG GEN mcr-1 KHÁNG COLISTIN PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI VÀ VẬT NUÔI, THỰC PHẨM VÀ NƯỚC TẠI XÃ THANH HÀ, HÀ NAM, NĂM 2015 Chuyên ngành : VI SINH Y HỌC Mã số : 62 72 01 15 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN HUY HOÀNG PGS.TS VŨ THỊ TƯỜNG VÂN HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Lời tơi muốn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Huy Hồng, Phó trưởng Khoa Vi khuẩn- Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, thầy hướng dẫn khoa học, giúp đỡ tơi, tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Vũ Thị Tường Vân, nguyên Trưởng khoa Vi sinh-Bệnh viện Bạch Mai, giáo viên đồng hướng dẫn, ln nhiệt tình giúp đỡ, khơng truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm chuyên môn quý báu mà học sống suốt trình học tập thực nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến Ths Vũ Thị Ngọc Bích-nghiên cứu sinh thuộc Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford Việt Nam (OUCRU), người bạn đồng hành tơi suốt q trình thực đề tài, sẵn sàng hợp tác, hỗ trợ chia sẻ kinh nghiệm quý báu giải trình tự gen suốt q trình tơi thực nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS Trần Diệu Linh-Phòng Quản lý chất lượng -Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương chia sẻ kiến thức kinh nghiệm thực tế quý báu nghiên cứu giải trình tự gen Tôi xin chân trành cảm ơn Ths Phạm Duy Thái- nhân viên phòng nghiên cứu Kháng Kháng sinh hỗ trợ nhiều thực kỹ thuật khó nghiên cứu kỹ thuật PFGE Tơi xin chân thành cảm ơn em Vũ Thị Thu Hiền, Hoàng Thị An Hà, Hoàng Thị Mai Hương -Các học viên học Phòng nghiên cứu kháng kháng sinh hỗ trợ tôi, bàn bạc, chia sẻ kinh nghiệm suốt q trình tơi làm nghiên cứu Phòng Kháng kháng sinh Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Tôi xin chân thành cảm ơn em Thương, em Diệp Trung tâm nghiên cứu Oxford đồng hành tơi suốt q trình thực kỹ thuật giải trình tự gen Tơi xin bày lời cảm ơn chân thành tới TS Trương Thái Phương lãnh đạo Khoa Vi sinh, anh chị em phòng Virus miễn dịch sinh học phân tử, phòng mơi trường, phịng KSĐ tập thể khoa Vi sinh hỗ trợ, tạo điều kiện cho học tập hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới bạn học viên học nghiên cứu sinh, anh, chị bạn Phịng thí nghiệm Kháng sinh Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương OUCRU quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ trình thực nghiên cứu hồn thành luận án Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới: −Ban giám đốc, Khoa Vi sinh bệnh viện Bạch Mai −Ban giám đốc toàn thể cán Khoa Vi khuẩn, viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Tôi xin trân trọng cảm ơn quỹ NAFOSTED hỗ trợ kinh phí từ đề tài Mã số: 108.02-2017.320 tiến sỹ Trần Huy Hồng làm chủ nhiệm để chúng tơi hồn thành nghiên Cuối tơi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ cha mẹ tôi, cha mẹ chồng ủng hộ, động viên, thương u, chăm sóc, khích lệ chồng, anh, chị, em người bên tôi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận án Hà Nội, ngày tháng .năm 2022 Nguyễn Thị Tuyết Mai LỜI CAM ĐOAN Tơi Nguyễn Thị Tuyết Mai, nghiên cứu sinh khóa 36, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, chuyên ngành Vi sinh y học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn TS Trần Huy Hoàng PGS.TS Vũ Thị Tường Vân Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Người viết cam đoan Nguyễn Thị Tuyết Mai DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - ADN - AK - A baumanni - bp - CAZ - CIP - CLSI - CS - CTX - E Coli - ESBL - FEP - GM - IMP - IS - K pneumoniae - KKS - KS - LB - mcr-1 Axit deoxyribonucleic Amikacin Acinetobacter baumanni cặp bazơ Ceftazidime Ciprofloxacin Viện Tiêu chuẩn lâm sàng Phòng xét nghiệm (Clinical and Laboratory Standards Institute) Colistin Cefotaxime Escherichia coli Enzym ly giải vòng β-lactam phổ rộng (Extended-spectrum β-lactamase) Cefepim Gentamicin Imipenem Trình tự chèn (Insert sequence) Klebsiella pneumoniae Kháng kháng sinh Kháng sinh Luria-Bertani Mobilized colistin resistance mediated colistin resistance - MEM Meropenem - MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) - MLST Phân loại trình tự đa vị trí (Multi Locus Sequence Typing) - NST Nhiễm sắc thể -N Nước - PCR Phản ứng chuỗi (Polymerase Chain Reaction) - PN Phân người - PĐVN Phân động vật nuôi - PFGE Điện di xung trường (Pulsed-field Gel Electrophoresis) - P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa - Replicon plasmid Đơn vị chép plasmid - TĂ Thức ăn - WGS Giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn (Whole Genome Sequence) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng sinh đề kháng kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cơ chế tác dụng 1.1.3 Sự đề kháng kháng sinh 1.1.4 Các nguyên nhân gây gia tăng lan truyền chủng vi khuẩn kháng kháng sinh 15 1.1.5 Colistin 19 1.2 Vi khuẩn gram âm đường ruột thực trạng kháng kháng sinh vi khuẩn gram âm đường ruột 25 1.2.1 Vi khuẩn gram âm đường ruột 25 1.2.2 Thực trạng kháng kháng sinh vi khuẩn gram âm đường ruột 26 1.3 Đặc điểm vi sinh vật học tình hình kháng colistin E coli 27 1.3.1 Đặc điểm vi sinh vật học 27 1.3.2 Các nghiên cứu gen mcr-1 kháng colistin E coli vi khuẩn gram âm đường ruột giới Việt Nam 28 1.3.3 Một số đặc điểm gen mcr-1 plasmid chủng E coli kháng colistin 32 1.4 Các kĩ thuật phát kháng kháng sinh kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng phát gen kháng kháng sinh 33 1.4.1 Kĩ thuật phát kháng kháng sinh 33 1.4.2 Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh 34 1.4.3 Kỹ thuật PCR phát gen kháng kháng sinh 36 1.4.4 Kỹ thuật RADP PCR 36 1.4.5 Kỹ thuật điện di xung trường 36 1.4.6 Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn 37 1.4.7 Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing 37 1.4.8 Kỹ thuật giải trình tự gen 38 1.5 Các vấn đề cần giải nghiên cứu 38 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Địa điểm nghiên cứu 40 2.2 Thiết kế nghiên cứu 40 2.3 Thời gian nghiên cứu 40 2.4 Đối tượng nghiên cứu 40 2.5 Cỡ mẫu nghiên cứu 41 2.6 Phương pháp lấy mẫu kỹ thuật xét nghiệm 45 2.6.1 Kĩ thuật nuôi cấy phân lập vi khuẩn 45 2.6.2 PCR phát gen mcr-1 46 2.6.3 Kỹ thuật định danh vi khuẩn máy MALDI TOF 48 2.6.4 Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu 49 2.6.5 Phân tích mối liên hệ kiểu gen kỹ thuật PFGE 54 2.6.6 Kỹ thuật giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn 55 2.6.7 Kỹ thuật tiếp hợp đánh giá lan truyền gen mcr -1 qua plasmid 58 2.7 Biến số số nghiên cứu 59 2.8 Phương pháp thu thập thông tin 60 2.9 Xử lý phân tích số liệu 60 2.10 Khống chế sai số 60 2.11 Đạo đức nghiên cứu 60 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 62 3.1 Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người động vật nuôi, thực phẩm nước xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015 62 3.1.1 Đặc điểm chung loại mẫu thu thập nghiên cứu 62 3.1.2 Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E coli mang gen mcr-1 phân lập từ người người, động vật nuôi, thực phẩm nước 63 3.1.3 Tỷ lệ chủng vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 phân lập từ người, động vật nuôi, thực phẩm nước 64 3.1.4 Mức độ nhạy cảm colistin chủng E coli mang gen mcr-1 66 3.1.5 Tỷ lệ phân bố gen mcr-1 NST plasmid chủng E coli 67 3.1.6 Mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng E coli mang gen mcr-1 phân người động vật nuôi, thức ăn nước 68 3.2 Đặc điểm sinh học phân tử chủng vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 phân lập nghiên cứu 70 3.2.1 Các gen kháng kháng sinh chủng E coli mang gen mcr-1 70 3.2.2 Mối liên hệ kiểu gen chủng vi khuẩn mang gen mcr-1 72 3.2.3 Đặc điểm sinh học phân tử chủng E coli mang gen mcr-1 kỹ thuật giải trình tự tồn hệ gen 78 3.3 Kết xác định đặc điểm plasmid, chế lan truyền qua trung gian plasmid cấu trúc di truyền động chủng vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 80 3.3.1 Xác định đặc điểm plasmid mang gen mcr-1 80 3.3.2 Xác định khả lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid chủng vi khuẩn 85 3.3.3 Xác định cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1 86 CHƯƠNG BÀN LUẬN 89 4.1 Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người, vật nuôi, thực phẩm nước xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015 89 4.1.1 Một số đặc điểm quần thể thu thâp mẫu nghiên cứu 89 4.1.2 Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người, động vật nuôi, thực phẩm nước xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015 90 4.1.3 Mức độ nhạy cảm colistin chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin 92 4.1.4 Sự phổ biến chủng E coli mang gen mcr-1 NST plasmid 95 4.1.5 Đặc điểm kháng kháng sinh chủng E coli mang gen mcr-1 cộng đồng nghiên cứu 96 4.2 Đặc điểm sinh học phân tử chủng vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 phân lập nghiên cứu 98 4.2.1 Các gen kháng kháng sinh 98 4.2.2 Mối liên hệ kiểu gen chủng E coli mang gen mcr-1 kỹ thuật PFGE 100 4.2.3 Đặc điểm sinh học phân tử chủng E coli mang gen mcr-1 kỹ thuật giải trình tự tồn bộ gen 102 4.3 Hạn chế hướng nghiên cứu 110 KẾT LUẬN 113 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 111 KIẾN NGHỊ 115 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 H041 H041 H041 H041 H041 H041 H041 H041 H043 H043 H043 H043 H043 H043 H043 H043 H045 H045 H045 H045 H045 H045 H045 H045 H061 H061 H061 H061 H061 H061 H061 H061 H062 H062 H062 H062 H062 H062 H062 H062 H063 H063 H063 Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau F94 F95 HS152 HS153 HS154 HS155 W106 W107 F102 F103 HS168 HS169 HS170 HS171 W115 W116 AS74 AS75 F110 HS184 HS185 W123 W124 W125 AS87 F90 F91 HS147 HS148 HS157 W102 W103 F100 F101 HS164 HS165 HS166 HS167 W113 W114 AS78 AS79 F96 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 H063 H063 H063 H063 H063 H063 H063 H068 H068 H068 H068 H068 H068 H069 H069 H069 H069 H069 H069 H076 H076 H076 H076 H076 H076 H076 H076 H076 H076 H081 H081 H081 H081 H081 H081 H081 H081 H081 H102 H102 H102 H102 H102 Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Rau Thịt Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Rau Thịt Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước giếng Nước giếng Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người F97 HS156 HS158 HS159 W108 W109 W110 F113 F114 HS189 HS190 W128 W129 F86 F87 HS141 HS142 W98 W99 AS83 AS84 F106 F107 HS176 HS177 HS178 HS179 W119 W120 AS76 F88 F89 HS143 HS144 HS145 HS146 W100 W101 AS86 F115 F116 HS191 HS192 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 H102 H102 H104 H104 H104 H104 H104 H104 H104 H104 H104 H110 H110 H110 H110 H110 H110 H110 H110 H111 H111 H111 H111 H111 H111 H111 H111 H111 H111 H114 H114 H114 H114 H114 H114 H114 H114 H114 H114 H117 H117 H117 H117 Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Hòa Ngãi Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Nước mưa Nước giếng Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt W130 W131 AS82 F104 F105 HS172 HS173 HS174 HS175 W117 W118 F111 F112 HS186 HS187 HS188 HS204 W126 W127 AS80 AS81 F98 F99 HS160 HS161 HS162 HS163 W111 W112 AS15 AS16 F20 F21 HS39 HS40 HS51 HS52 W28 W29 AS27 AS30 F22 F23 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 H117 H117 H117 H117 H117 H119 H119 H119 H119 H119 H119 H119 H119 H119 H127 H127 H127 H127 H127 H127 H127 H127 H130 H130 H130 H130 H130 H130 H130 H130 H130 H130 H131 H131 H131 H131 H131 H131 H131 H131 H136 H136 H136 Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Nước giếng Nước mưa Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Nước giếng Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Phân động vật Phân động vật Rau HS22 HS23 HS24 W30 W31 AS14 F25 F26 HS35 HS36 HS37 HS38 W15 W16 AS17 AS18 F27 F28 HS41 HS53 W22 W23 AS31 AS32 F30 F31 HS47 HS48 HS54 W20 W21 W97 AS28 AS29 F15 F29 HS45 HS46 HS50 W19 AS25 AS26 F16 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 H136 H136 H136 H136 H136 H136 H136 H137 H137 H137 H137 H137 H137 H137 H137 H137 H137 H138 H138 H138 H138 H138 H138 H138 H138 H142 H142 H142 H142 H142 H142 H142 H142 H144 H144 H144 H144 H144 H144 H144 H145 H145 H145 Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Quang Trung Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Phân động vật Rau Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau F17 HS25 HS26 HS27 HS28 W26 W27 AS23 AS24 F13 F14 HS29 HS30 HS31 HS32 W32 W33 AS21 AS22 F18 F19 HS33 HS34 W24 W25 AS19 AS20 F24 HS42 HS43 HS44 HS49 W17 AS65 F68 HS106 HS107 HS108 W77 W78 AS12 AS13 F66 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 H145 H145 H145 H145 H145 H145 H145 H146 H146 H146 H146 H146 H146 H146 H146 H146 H146 H146 H147 H147 H147 H147 H147 H147 H147 H147 H147 H147 H147 H150 H150 H150 H150 H150 H150 H150 H150 H150 H151 H151 H151 H151 H151 Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước mưa Nước tưới Phân động vật Rau Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người F67 HS124 HS125 HS200 W81 W82 W83 AS61 AS62 F64 F65 HS103 HS104 HS105 HS201 W74 W75 W76 AS66 F69 F70 F71 HS115 HS116 HS117 HS118 W84 W85 W86 AS67 AS73 F72 F73 HS131 HS132 HS133 W79 W80 AS55 AS56 F56 F57 HS91 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 H151 H151 H151 H151 H151 H152 H152 H152 H152 H152 H152 H152 H152 H152 H152 H153 H153 H153 H153 H153 H153 H153 H153 H153 H153 H154 H154 H154 H154 H154 H154 H154 H154 H155 H155 H155 H155 H155 H155 H155 H155 H156 H156 Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Rau HS92 HS93 W59 W60 W68 AS57 AS58 F58 F59 HS94 HS95 HS96 HS97 W66 W67 AS53 AS54 F54 F55 HS88 HS89 HS90 W56 W57 W58 AS71 F82 F83 HS112 HS113 HS114 W93 W94 F78 F79 HS126 HS127 HS128 HS203 W91 W92 AS68 F74 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 H156 H156 H156 H156 H156 H156 H168 H168 H168 H168 H168 H168 H168 H168 H171 H171 H171 H171 H171 H171 H171 H171 H175 H175 H175 H175 H175 H175 H175 H175 H175 H181 H181 H181 H181 H181 H181 H181 H181 H192 H192 H192 H192 Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước mưa Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Phân động vật Thịt Rau F75 HS109 HS110 HS111 W87 W88 AS60 F62 F63 HS100 HS101 HS102 W72 W73 AS72 F76 F77 HS121 HS122 HS123 W134 W135 AS69 AS70 F84 F85 HS119 HS120 HS202 W95 W96 AS59 F60 F61 HS98 HS99 W69 W70 W71 AS41 AS42 F42 F43 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468 H192 H192 H192 H192 H192 H192 H192 H192 H192 H193 H193 H193 H193 H193 H193 H193 H193 H193 H193 H193 H193 H193 H194 H194 H194 H194 H194 H194 H194 H194 H194 H194 H197 H197 H197 H197 H197 H197 H197 H197 H197 H198 H198 Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Phân người Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Phân người Phân người Nước giếng Nước mưa Nước tưới Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước giếng Nước mưa Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Nước giếng Nước mưa Nước tưới Phân động vật Phân động vật HS136 HS3 HS61 HS62 HS63 W44 W45 W46 W47 AS51 AS52 F52 F53 HS1 HS134 HS135 HS2 HS75 HS76 W63 W64 W65 AS49 AS50 F50 F51 HS71 HS72 HS73 HS74 W61 W62 AS35 AS36 F36 F37 HS85 HS86 W38 W39 W40 AS47 AS48 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 495 496 497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 H198 H198 H198 H198 H198 H198 H198 H198 H198 H199 H199 H199 H199 H199 H199 H199 H202 H202 H202 H202 H202 H202 H202 H202 H202 H202 H202 H204 H204 H204 H204 H204 H204 H204 H204 H205 H205 H205 H212 H212 H212 H212 H212 Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Dương Xá Dương Xá Dương Xá Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước mưa Nước mưa Nước mưa Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người F48 F49 HS81 HS82 HS83 HS84 W53 W54 W55 AS39 AS40 F40 F41 HS140 HS251 HS87 AS45 AS46 F46 F47 HS137 HS138 HS59 HS60 W50 W51 W52 F32 F33 HS67 HS68 HS69 HS70 W34 W35 W139 W18 W43 AS33 AS34 F34 F35 HS77 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550 551 552 553 554 H212 H212 H212 H212 H212 H217 H217 H217 H217 H217 H217 H217 H217 H217 H217 H220 H220 H220 H220 H220 H220 H220 H220 H220 H220 H220 H221 H221 H221 H221 H221 H221 H221 H221 H221 H228 H228 H228 H228 H228 H228 H228 H228 Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Ứng Liêm Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Thịt Thịt Rau Phân người Phân người Phân người HS78 HS79 HS80 W36 W37 AS43 AS44 F44 F45 HS55 HS56 HS57 HS58 W48 W49 AS37 AS38 F38 F39 HS139 HS4 HS64 HS65 HS66 W41 W42 AS105 F127 F128 HS242 HS243 HS244 HS245 W155 W156 AS96 AS97 F131 F132 F133 HS228 HS229 HS230 555 556 557 558 559 560 561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 577 578 579 580 581 582 583 584 585 586 587 588 589 590 591 592 593 594 595 596 597 H228 H228 H234 H234 H234 H234 H234 H234 H236 H236 H236 H236 H236 H236 H236 H236 H236 H236 H238 H238 H238 H238 H238 H238 H238 H238 H238 H248 H248 H248 H248 H248 H248 H248 H248 H248 H248 H250 H250 H250 H250 H250 H250 Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Nước giếng Nước mưa Thịt Rau Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người W136 W161 F134 F135 HS240 HS241 W137 W138 AS100 AS99 F138 F139 HS233 HS234 HS235 HS236 W141 W142 AS92 F121 F122 HS209 HS210 HS211 HS247 W149 W150 AS107 AS94 F125 F126 HS216 HS217 HS218 HS219 W153 W154 AS98 F136 F137 HS231 HS232 HS248 598 599 600 601 602 603 604 605 606 607 608 609 610 611 612 613 614 615 616 617 618 619 620 621 622 623 624 625 626 627 628 629 630 631 632 633 634 635 636 637 638 639 640 H250 H250 H252 H252 H252 H252 H252 H252 H252 H252 H252 H252 H257 H257 H257 H257 H257 H257 H257 H257 H257 H259 H259 H259 H259 H259 H259 H259 H259 H259 H264 H264 H264 H264 H264 H264 H264 H264 H264 H264 H264 H266 H266 Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Phân người Nước giếng Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật HS249 W140 AS88 AS89 F119 F120 HS206 HS207 HS208 HS246 W147 W148 AS106 F144 F145 HS220 HS221 HS222 HS223 W157 W158 AS95 F129 F130 HS224 HS225 HS226 HS227 W159 W160 AS90 AS91 AS93 F123 F124 HS212 HS213 HS214 HS215 W151 W152 AS103 AS104 641 642 643 644 645 646 647 648 649 650 651 652 653 654 655 656 657 658 659 660 661 662 663 664 665 666 667 668 669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 H266 H266 H266 H266 H266 H266 H269 H269 H269 H269 H269 H269 H269 H269 H273 H273 H273 H273 H273 H273 H273 H273 H275 H275 H275 H275 H275 H275 H275 H275 H275 H275 H276 H276 H276 H276 H276 H276 H276 H276 H276 H284 H284 Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Mậu Chử Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Dương Xá Dương Xá Thịt Rau Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật F141 F142 HS238 HS239 W145 W146 AS102 F140 F143 HS237 HS250 W143 W144 AS101 AS117 AS118 F149 F151 HS256 HS265 W164 W165 AS113 AS114 AS122 F157 F158 HS252 HS253 W162 W163 W168 AS115 AS116 F147 F150 HS254 HS255 HS264 W166 W167 AS63 AS64 684 685 686 687 688 689 690 691 692 693 694 695 696 697 698 699 700 701 702 703 704 705 706 707 708 709 710 711 712 713 714 715 716 717 718 719 720 721 722 723 724 725 H284 H284 H284 H284 H284 H284 H284 H284 H306 H306 H306 H306 H306 H306 H306 H306 H306 H309 H309 H309 H309 H309 H309 H309 H314 H314 H314 H314 H314 H314 H314 H314 H314 H314 H314 H321 H321 H321 H321 H321 H321 H321 Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Dương Xá Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Thạch Tổ Rau Thịt Phân người Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Rau Thịt Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Phân động vật Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Phân người Phân người Phân người Nước mưa Nước giếng Nước tưới Phân động vật Phân động vật Thịt Rau Nước mưa Nước giếng Nước tưới F80 F81 HS129 HS130 HS198 HS199 W89 W90 AS108 AS109 F154 F155 HS260 HS261 W175 W176 W177 AS110 F152 F159 HS262 HS263 W178 W179 AS119 AS120 AS121 F146 F153 HS257 HS258 HS259 W172 W173 W174 AS111 AS112 F148 F156 W169 W170 W171