Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VÕ VĂN HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA CHÓ MẮC BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO VIRUS PARVO TYPE (CPV2) GÂY RA VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG CPV2 LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số: 64 01 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2023 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS Bùi Trần Anh Đào PGS.TS Lê Văn Phan Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên Hội Thú y Phản biện 2: PGS.TS Sử Thanh Long Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS.TS Phạm Công Hoạt Bộ Khoa học Công nghệ Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi phút, ngày tháng năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Canine parvovirus type (CPV2) gây Bệnh viêm ruột tiêu chảy chó Bệnh có tỷ lệ mắc tỷ lệ chết cao, thường gặp chó năm tuổi chó chưa phịng bệnh vắc xin Bệnh xuất với số triệu chứng điển hình như: ủ rũ, bỏ ăn, sốt cao, nơn mửa, nước nhanh chóng tiêu chảy phân có lẫn máu (Appel & cs., 1979; Hayes & cs., 1979; Vickers, 2017) Mặc dù Việt Nam có số nghiên cứu virus parvo bệnh gây chó, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phần vấn đề đơn lẻ Chưa có nghiên cứu tồn diện bệnh lý học phân tích tồn hệ gen CPV2 Do CPV2 thường xuyên có biến đổi di truyền để hình thành nên biến chủng virus mới, cần nghiên cứu liên tục giải mã phân tích gen CPV2 để xác định nguồn gốc tiến hóa biến đổi di truyền chủng CPV2 gây bệnh chó theo khơng gian thời gian khác 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định đặc điểm bệnh lý chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy virus parvo gây đặc điểm sinh học phân tử chủng virus parvo phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam để định hướng cơng tác chẩn đốn, điều trị bệnh lâm sàng chế tạo vắc xin phòng bệnh tương lai 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định tỷ lệ mắc bệnh, đặc điểm sinh lý sinh hóa máu, triệu chứng, bệnh tích đại thể, bệnh tích vi thể chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy virus parvo gây ra, mức độ gây hại đến quan phận virus parvo thể chó mắc bệnh, nhằm đưa khuyến cáo cho cơng tác phịng trị bệnh - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử vùng gen VP2 toàn bộ gen virus CPV2 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam, từ cung cấp thơng tin cập nhật chủng virus parvo lưu hành, làm định hướng chế tạo vắc xin phòng bệnh 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Là cá thể chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy CPV2 mẫu virus parvo phân lập từ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy mang đến khám điều trị phòng khám thú y 2Vet số phịng khám thú y khu vực phía Bắc Việt Nam (Hà Nội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh) 1.3.2 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 12 năm 2021 1.3.3 Địa điểm nghiên cứu - Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, - Phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Hệ thống Thú y 2Vet số phòng khám khu vực phía Bắc Việt Nam 1.4 NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây cơng trình nghiên cứu có tính hệ thống nghiên cứu đồng thời gen chủng vi rút CPV2 lưu hành, gây bệnh đàn chó Việt Nam lần sử dụng phương pháp hố mơ miễn dịch để xác định phân bố CPV2 tổ chức chó mắc VRTC CPV2 gây Việt Nam Các công bố đề tài thông tin khách quan bệnh chó nước ta 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài góp phần bổ sung hồn thiện thêm hiểu biết bệnh viêm ruột tiêu chảy virus parvo type gây chó Việt Nam Luận án tài liệu tham khảo thống tương đối tồn diện bệnh CPV2 chó khu vực phía bắc Việt Nam 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Góp phần giúp cho bác sĩ thú y nâng cao hiệu việc chẩn đoán, chẩn đoán phân biệt, tiên lượng, điều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy virus parvo type 2, đưa khuyến cáo nhằm phòng ngừa giảm thiểu thiệt hại bệnh gây PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS PARVO Virus parvo có đường kính nhỏ (~25 nm), khơng có vỏ bao phủ Cấu trúc ba chiều CPV2 xác định nhờ sử dụng tia X (Tsao & cs., 1991; Xie & Chapman, 1996) Virus có gen DNA thẳng, sợi đơn âm, kích thước khoảng 5.2kb, chứa hai khung đọc mở (ORF1 ORF2) Một số mã hóa hai protein khơng cấu trúc NS1 NS2 khung khác mã hóa hai protein cấu trúc khác VP1 VP2 Các đặc tính kháng nguyên virus parvo chó bị ảnh hưởng thay axit amin trình tự VP2 (Strassheim, 1994) CPV2 thuộc chi Protovirus parvo, họ Parvoviridae, đưa vào loài Carnivore protovirus parvo theo Uỷ ban quốc tế phân loại virus (Fernandes & cs., 2011) 2.2 BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO VIRUS PARVO TRÊN CHÓ 2.2.1 Dịch tễ học Năm 1967, virus parvo lần phát tác nhân gây bệnh tiêu hóa hơ hấp chó (Binn & cs., 1970) Sau đó, virus lấy tên CPV1 (Lamm & cs., 2008) Các tác nhân gây bệnh phân lập liệu cho thấy loài thuộc họ Parvoviridae (Parrish & cs., 1988), sau virus đặt tên CPV2 Do thiếu khả miễn dịch từ trước quần thể chó, virus lây lan nhanh chóng đến năm 1980, virus báo cáo phổ biến toàn giới (Pollock, 1984) 2.2.2 Triệu chứng lâm sàng Viêm ruột viêm tim hai thể bệnh mô tả ban đầu nhiễm CPV2 Ngày nay, viêm tim CPV2 thấy nhiễm bệnh tử cung lúc mang thai chó tuần tuổi sinh từ chó mẹ chưa tiêm phịng Viêm ruột cấp tính biểu phổ biến bệnh chủ yếu gặp chó tháng tuổi Dấu hiệu lâm sàng ban đầu không đặc hiệu, bao gồm chán ăn, mệt mỏi sốt Các dấu hiệu điển hình sau bao gồm nơn mửa tiêu chảy, ruột non có chất nhầy xuất huyết Tình trạng nước, protein, sốc thường diễn nhanh chóng chó mắc viêm ruột tiêu chảy CPV2 (Prittie, 2004) 2.2.3 Bệnh tích 2.2.3.1 Bệnh tích đại thể Virus xâm nhập trực tiếp gián tiếp thơng qua tiếp xúc phân chó bị bệnh qua đồ vật dính virus vào thể gây tổn thương mạnh ống tiêu hóa đặc biệt dày, ruột, mô bạch huyết, mô tạo máu gây tử vong (Decaro & cs., 2006) Tổn thương đại thể thu bao gồm sung huyết xuất huyết nghiêm trọng ống tiêu hóa, nhiều ruột, lịng ruột chứa nhiều niêm dịch máu, xuất mảng nhợt nhạt ruột, tim, ứ huyết mạch máu 2.2.3.2 Bệnh tích vi thể Bệnh tích vi thể đặc trưng sung huyết, xuất huyết hạch lâm ba, niêm mạc dày ruột tuyến tụy bị đứt nát bong tróc Theo Vieira & cs (2008), quan sát tiêu phổi nhận thấy vách phế nang đứt nát có tượng phù lịng phế nang 2.2.4 Sự thay đổi tiêu sinh lý, sinh hóa máu chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy CPV2 Số lượng bạch cầu đếm chó mắc viêm ruột CPV2 thường thấp, với đó, giảm bạch cầu nhẹ phát chủ yếu Các thay đổi huyết học phá hủy tế bào tiền thân tạo máu loại bạch cầu khác tủy xương quan điều khiển lympho khác tuyến ức, hạch bạch huyết lách PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy virus parvo type (VRTC CPV2) - Nghiên cứu xác định tỷ lệ mắc bệnh VRTC CPV2 theo địa phương, giống, nhóm tuổi, giới tính, tình trạng tiêm chủng - Xác định triệu chứng lâm sàng chó mắc bệnh VRTC CPV2 - Xác định tiêu lâm sàng chó mắc bệnh VRTC CPV2 - Xác định thay đổi tiêu huyết học chó mắc bệnh VRTC CPV2 - Xác định tổn thương đại thể chó mắc bệnh VRTC CPV2 - Xác định tổn thương vi thể chó mắc bệnh VRTC CPV2 - Xác định phân bố virus parvo quan chó mắc bệnh VRTC CPV2 3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử chủng virus parvo phân lập 3.1.2.1 Phân tích trình tự nucleotide acid amin gen VP2 - Nhân gen VP2 CPV2 - Phân tích trình tự nucleotide acid amin gen VP2 CPV2 - Xây dựng sinh học phân tử dựa kết giải trình tự vùng gen VP2 3.1.2.2 Phân tích trình tự nucleotide acid amin gen CPV2 - Nhân đoạn gen CPV2 phản ứng PCR - Phân tích trình tự nucleotide amino acid gen chủng CPV2 - Xây dựng phả hệ chủng virus CPV2 dựa trình tự nucleotide gen 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phương pháp thu thập số liệu trực tiếp phòng khám - Căn vào hệ thống sổ theo dõi phần mềm quản lý để tổng hợp số liệu dịch tễ phịng khám Các ca chó mắc VRTC CPV2 tiến hành ghi chép thông tin: tuổi, giới tính, giống, tiền sử bệnh, thơng tin bệnh án, vào mẫu phiếu điều tra để tổng hợp số liệu 3.2.2 Phương pháp xác định chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy CPV2 * Dựa vào điều tra dịch tễ, triệu chứng lâm sàng * Chẩn đoán Kit test nhanh CPV2 (Canine virus parvo One - step Test Kit) * Dựa vào bệnh tích q trình mổ khám chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy virus parvo (theo quy trình Melanie J Dobromylskyj, Royal Veterinary College, https://doi.org/10.12968/coan.2015.20.10.565) * Dựa vào kết chạy phản ứng PCR 3.2.3 Phương pháp làm xét nghiệm huyết học sinh hóa máu chó bị bệnh viêm ruột tiêu chảy CPV2 Máu chó mắc bệnh lấy phòng khám nhà khách hàng bác sĩ thú y, sau tiến hành xét nghiệm thu kết 3.2.4 Phương pháp mổ khám quan sát biến đổi bệnh lý đại thể Chó mắc bệnh cố định bàn mổ, mổ khám theo quy trình Melanie J Dobromylskyj, Royal Veterinary College, https://doi.org/10.12968/coan.2015.20.10.565) 3.2.5 Phương pháp làm tiêu bệnh lý vi thể - Tiến hành thu mẫu quan hạch, dày, ruột, tim gan,… ngâm dung dịch formol trung tính 10% - Phương pháp làm tiêu vi thể theo quy trình tẩm đúc paraffin, nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) thường quy phịng thí nghiệm mơn Bệnh lý thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3.2.6 Phương pháp nhuộm hố mơ miễn dịch Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch theo quy trình nhuộm 18 bước với kháng thể đặc hiệu phịng thí nghiệm mơn Bệnh lý thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3.2.7 Phương pháp PCR - Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình nhà sản xuất - Phương pháp PCR: Mẫu DNA sau tách chiết sử dụng cho phản ứng PCR 3.2.8 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm phản ứng PCR chạy điện di thạch agarose đọc máy chụp gel UV 3.2.9 Phương pháp giải trình tự gen xây dựng phả hệ Trong nghiên cứu tiến hành gửi sản phẩm PCR đạt yêu cầu đến công ty BASE DNA Sequencing (Malaysia) để giải trình tự Cơng ty giải trình tự gen theo phương pháp Sanger Các trình tự gen chỉnh so sánh phần mềm Geneious Prime (https://www.geneious.com/prime) BioEdit Cây sinh học phân tử phân tích phần mềm MEGA X, sử dụng phương pháp Neighbor-Joining với giá trị Bootstrap 1000 (https://www.megasoftware.net) Các chủng CPV2 tham chiếu st sử dụng nghiên cứu thu thập từ liệu ngân hàng gen giới (GenBank) 3.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU - Dùng kiểm định test T so sánh giá trị trung bình mẫu so sánh trung bình hai mẫu - Để kiểm định quan hệ hai yếu tố tơi dùng kiểm định chi bình phương - Sử dụng phần mềm thống kê SAS để thông kê xử lý số liệu - Sử dụng ứng dụng Excel - Dữ liệu trình tự gen thu phân tích xử lý phần mềm Bioedit) MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0) PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA CPV2 TRÊN CHÓ 4.1.1 Tỷ lệ mắc viêm ruột tiêu chảy CPV2 chó theo địa phương Qua khảo sát 681 chó có biểu lâm sàng mệt mỏi, nơn mửa, tiêu chảy, phân lẫn máu phòng khám thú y địa phương thời gian từ tháng 06/ 2017 đến tháng 09/2020, xác định tỷ lệ mắc VRTC CPV2 kít test nhanh, kết trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy virus parvo type theo địa phương Số chó đến khám Số chó mắc VRTC Tỷ lệ mắc CPV2 (con) CPV2 (con) (%) Hà Nội 306 42 13,73 Vĩnh Phúc 131 23 17,56 Bắc Giang 136 25 18,38 Bắc Ninh 108 18 16,67 Tổng số 681 108 15,86 Địa phương Kết cho thấy tỷ lệ chó mắc VRTC CPV2 số tỉnh phía bắc Việt Nam 108/681 (15,86%), tỷ lệ bệnh Virus parvo chó cao Bắc Giang (18,38%) thấp Hà Nội (13,73%), nhiên khơng có khác có ý nghĩa địa phương (P>0,05) 4.1.2 Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy CPV2 theo lứa tuổi Kết nghiên cứu 108 chó mắc VRTC CPV2 (bảng 4.2) cho thấy có sai khác tỉ lệ mắc CPV2 chó bị bệnh viêm ruột theo lứa tuổi (P12 tháng Tỷ lệ mắc (%) 6,48 54 50,00 31 28,70 16 14,82 4.1.3 Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy CPV2 theo giống Trong nghiên cứu tỷ lệ chó mắc VRTC CPV2 phân tích theo giống chó nội chó ngoại nhập (bao gồm giống ngoại lai) (bảng 4.3) Qua khảo sát 108 chó mắc VRTC CPV2, kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm giống chó ngoại nhập 75% cao so với tỷ lệ mắc giống nội 25% (P 0,05) Bảng 4.4 Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy virus parvo type theo giới tính Đực Cái Số chó mắc VRTC Số chó mắc VRTC CPV2 CPV2 (con) theo giới tính (con) 108 Tỷ lệ mắc (%) 57 52,78 51 47,22 4.1.5 Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy CPV2 theo tình trạng tiêm chủng Để đánh giá khả bảo hộ vắc xin, tiến hành đánh giá tình hình tỷ lệ mắc VRTC CPV2 chó theo tình trạng tiêm phịng, chó mắc VRTC CPV2 phân loại theo tiêu chí: chưa tiêm vắc xin, tiêm mũi vắc xin, tiêm mũi vắc xin, tiêm mũi vắc xin Kết khảo sát thể bảng 4.5 Bảng 4.5 Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy virus parvo type theo tình trạng tiêm chủng Tình trạng Chưa tiêm vắc xin Đã tiêm vắc xin mũi Đã tiêm vắc xin mũi Đã tiêm vắc xin mũi Số chó mắc (con) 108 Số chó mắc theo tình trạng vắc xin (con) 82 18 Tỷ lệ mắc (%) 75,93 16,67 4,63 2,77 Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh chó tiêm vắc xin (26/108) thấp nhiều so với chó chưa tiêm vắc xin (82/108) (P