Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tửNghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Phan Thị Thanh Hà

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ VI RÚT CÓ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

2 PGS TS Trương Tuyết Mai

Hà Nội - 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướngdẫn của TS Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai Các số liệu, kết quả nêutrong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố

Hà Nội, ngày tháng năm

Tập thể hướng dẫn

TS Lê Quang Hòa PGS.TS.Trương Tuyết Mai

Nghiên cứu sinh

Phan Thị Thanh Hà

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TL GIÁM ĐỐC TRƯỞNG BAN ĐÀO TẠO

LỜI CẢM ƠN

Từ năm 2005 đến nay, trong những năm học Đại học, làm luận văn Thạc sĩ

và luận án Tiến sĩ tại Đại học Bách khoa Hà Nội thân yêu, tôi đã thu nhận được rấtnhiều kiến thức quý báu về lý thuyết cũng như thực hành nghiên cứu thuộc lĩnhvực công nghệ Sinh học – công nghệ Thực phẩm Tôi vô cùng biết ơn các Thầy

Cô giáo, Ban Giám đốc Đại học Bách khoa Hà Nội… đã dạy dỗ, bảo ban giúp đỡtôi về mọi mặt

Hoàn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS

Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dànhnhiều thời gian trao đổi, định hướng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứucũng như viết Luận án Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô, các cán bộ của Trungtâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Trường Hóa vàKhoa học sự sống đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quátrình thực hiện và báo Luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Dinh dưỡng, lãnh đạo vàcác đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực phẩm và Sinh học phân tử đã tạo điềukiện, giúp đỡ tôi hoàn thành công việc chuyên môn được phân công

Lời cảm ơn sâu sắc xin gửi tới Gia đình, Bạn bè luôn chia sẻ khó khăn,động viên khích lệ tôi vượt qua mọi trở ngại để hoàn thành nhiệm vụ nghiên cứu

và học tập!

Hà Nội ngày tháng năm 20

Nghiên cứu sinh

Phan Thị Thanh Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT xii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

5 Tính mới của đề tài 4

1 TỔNG QUAN 5

1.1 Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn thực phẩm 5

1.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 5

1.1.2 Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 6

1.2 Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 8

1.2.1 Norovirus 8

1.2.2 Hepatitis A virus 10

1.2.3 Hepatitis E virus 11

1.2.4 Astrovirus 12

1.3 Quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 13

1.3.1 Các phương pháp tách chiết RNA vi rút 13

1.3.2 Các phương pháp xác định vi rút 18

1.4 Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR 22

1.5 Ứng dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi, mẫu dò trong phản ứng Real-time RT - PCR 27

1.5.1 Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) 28

1.5.2 Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids) 29

1.6 Phương pháp xác định kiểu gen vi rút 30

1.7 Tình hình nghiên cứu sự lưu hành các kiểu gen của NoV, HAV, HEV, HAstV trên thế giới và tại Việt Nam 31

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 31

1.7.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 35

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Vật liệu nghiên cứu 38

2.1.1 Vật liệu kiểm soát 38

2.1.2 Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 38

2.1.3 Oligonucleotide 39

2.1.4 Hóa chất 43

2.1.5 Thiết bị 43

2.2 Phương pháp nghiên cứu 44

2.2.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 44

2.2.2 Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 52

2.2.3 Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 56

3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59

3.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 59

3.1.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 59

3.1.2 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 83

3.2 Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 99

3.2.1 Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 99

3.2.2 Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể

hai mảnh vỏ năm 2022 105

3.2.3 So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022 110

3.3 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 114

3.3.1 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 114

3.3.2 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HEV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 120

3.3.3 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HAstV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 123

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 128

TÀI LIỆU THAM KHẢO 129

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 6

Hình 1.2 Cấu trúc Norovirus 9

Hình 1.3 Cấu trúc Hepatitis A virus 10

Hình 1.4 Cấu trúc Hepatitis E virus 11

Hình 1.5 Cấu trúc Human Astrovirus 12

Hình 1.6 Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP 18

Hình 1.7 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR 20

Hình 1.8 Vị trí gắn của MGB trên mẫu dò và cấu trúc hóa học của MGB 28

Hình 1.9 Cấu trúc của nucleotide thông thường và của nucleotidd LNA 29

Hình 2.1 Quy trình lựa chọn, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV và HAstV 44

Hình 2.2 Quy trình tách dòng trình tự gen đại diện của HEV và HAstV 45

Hình 2.3 Quy trình phiên mã in vitro tạo chứng dương RNA 47

Hình 2.4 Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV 48

Hình 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV 49

Hình 2.6 Tóm tắt quy trình phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV 52

Hình 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo ISO 15216-1:2013 54

Hình 2.8 Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR với mồi ngoài khuếch đại RNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 57

Hình 2.9 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 57

Hình 3.1 Đặc điểm bộ mồi của Schlosser và của Jothikumar trên trình tự gen HEV chuẩn của WHO 59

Hình 3.2 Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Schlosser và Jothikumar với các hệ gen HEV công bố trên GenBank 61

Hình 3.3 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV-A 65

Hình 3.4 Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E coli DH5α mang đoạn gen đích

HEV.A sau biến nạp vào vector pJET1.2 65Hình 3.5 Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.A 66Hình 3.6 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV.B 66Hình 3.7 Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E coli DH5α mang đoạn gen đíchHEV.B sau biến nạp vào vector pJET1.2 67Hình 3.8 Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.B67Hình 3.9 Chu trình nhiệt rút gọn của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV

từ NTHMV 74Hình 3.10 Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% của phản ứngReal-time RT-PCR xác định HEV 76Hình 3.11 Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCRphát hiện và định lượng HEV trong NTHMV 80Hình 3.12 Các đường chuẩn định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện

và định lượng HEV trong NTHMV 80Hình 3.13 Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Cann và cộngsự 84Hình 3.14 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HAstV 87Hình 3.15 Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E coli DH5α mang đoạn gen đíchHAstV sau biến nạp vào vector pJET1.2 87Hình 3.16 Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HAstV 88Hình 3.17 Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% của phản ứngReal-time RT-PCR xác định HAstV 94Hình 3.18 Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCRphát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV 97Hình 3.19 Các đường chuẩn định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện

và định lượng HAstV trong NTHMV 97Hình 3.20 Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016 103Hình 3.21 Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thựcphẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2016 104

Hình 3.22 Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theothời điểm lấy mẫu năm 2016 104Hình 3.23 Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2022 109Hình 3.24 Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thựcphẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2022 109Hình 3.25 Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theothời điểm lấy mẫu năm 2022 110Hình 3.26 So sánh tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMVnăm 2016 và năm 2022 111Hình 3.27 So sánh sự phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính 111năm 2016 và năm 2022 111Hình 3.30 Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại vùng gen ORF1-ORF2của NoV GI và NoV GII 114Hình 3.31 Cây phát sinh loài của các mẫu NoV GI phát hiện được trong nghiên cứuvới các trình tự NoV GI tham chiếu từ GenBank 116Hình 3.32 Phân bố kiểu gen Norovirus GI của các mẫu phát hiện được trong nghiêncứu 117Hình 3.33 Cây phát sinh loài của các mẫu NoV GII phát hiện được trong nghiêncứu với các trình tự NoV GII tham chiếu từ GenBank 118Hình 3.34 Phân bố kiểu gen Norovirus GII của các mẫu phát hiện được trongnghiên cứu 119Hình 3.35 Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HEV 121Hình 3.36 Cây phát sinh loài của các mẫu HEV phát hiện được trong nghiên cứuvới các trình tự HEV tham chiếu từ GenBank 122Hình 3.37 Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HAstV 123Hình 3.38 Cây phát sinh loài của bốn chủng HAstV phát hiện được trong nghiêncứu 124

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV 17

Bảng 1.2 Nhận xét các phương pháp xác định vi rút gây bệnh thực phẩm 21

Bảng 1.3 Tổng hợp các bộ mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 1.4 Chu trình nhiệt của các phản ứng Real-time RT-PCR 25

Bảng 1.5 Tổng hợp một số nghiên cứu về vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm tại Việt Nam 35

Bảng 2.1 Thông tin mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập trên thị trường 39

Bảng 2.2 Trình tự mồi, mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA vi rút từ NTHMV 39

Bảng 2.3 Tổng hợp các bộ mồi sử dụng trong phản ứng Nested RT-PCR xác định kiểu gen vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV 41

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng RNA vi rút sử dụng SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit 49

Bảng 2.5 Thông tin các biến được phân tích bằng phần mềm SPSS 55

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 56

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 57

Bảng 3.1 Đặc điểm kỹ thuật của tổ hợp mồi Schlosser và Jothikumar 60

Bảng 3.2 Đặc điểm kỹ thuật của các tổ hợp mồi sau khi hiệu chỉnh và ứng dụng công nghệ MGB, LNA 63

Bảng 3.3 Kết quả tối ưu nồng độ ion Mg2+ đối với hai tổ hợp mồi A và B 68

Bảng 3.4 Kết quả tối ưu nồng độ mồi đối với hai tổ hợp mồi A và B 70

Bảng 3.5 Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò đối với hai tổ hợp mồi A và B 71

Bảng 3.6 Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HEV 72

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn 73

Bảng 3.8 Tối ưu hóa thời gian gắn mồi và kéo dài mạch của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn 74

Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV trongNTHMV 75Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện với xác suất 95% của phản ứng Real-time RT-PCRxác định HEV 77Bảng 3.11 Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCRphát hiện và định lượng HEV trong NTHMV 78Bảng 3.12 Kết quả phản ứng chéo của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEVtrong NTHMV 82Bảng 3.13 Vị trí trình tự gen HAstV tham chiếu và giá trị nhiệt độ nóng chảy (Tm)của của bộ mồi, mẫu dò của Cann 83Bảng 3.14 Đặc điểm kỹ thuật của trình tự mồi phát hiện HAstV sau khi hiệu chỉnh

và ứng dụng công nghệ LNA 86Bảng 3.15 Kết quả tối ưu nồng độ ion Mg2+ của phản ứng Real-time RT-PCR pháthiện HAstV 89Bảng 3.16 Kết quả tối ưu nồng độ mồi HAstV 90Bảng 3.17 Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò HAstV 91Bảng 3.18 Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HAstV 91Bảng 3.19 Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của phản ứng Real-time RT-PCRphát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn 92Bảng 3.20 Tối ưu hóa thời gian gắn mồi và kéo dài mạch của phản ứng Real-timeRT-PCR phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn 93Bảng 3.21 Giới hạn phát hiện của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstVtrong NTHMV 94Bảng 3.22 Giới hạn phát hiện với xác suất 95% của phản ứng Real-time RT-PCRxác định HAstV 95Bảng 3.23 Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCRphát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV 96Bảng 3.24 Kết quả phản ứng chéo của quy trình Real-time RT-PCR phát hiệnHAstV trong NTHMV 99Bảng 3.25 Tổng hợp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trongNTHMV năm 2016 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu 100

Bảng 3.26 Tổng hợp mức nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trongNTHMV năm 2016 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu 101Bảng 3.27 Tổng hợp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trongNTHMV năm 2022 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu 106Bảng 3.28 Tổng hợp mức nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trongNTHMV năm 2022 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu 107

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết

AiV Aichivirus

CRE Cis-reactive element

DNA Deoxyribonucleic acid

ELISA Enzyme-linked immunosorbent

assay

Phương pháp hấp phụ miễn dịchgắn enzyme

FAO Food and Agriculture Organization

of the Unated Nation

Tổ chức Lương thực và Nôngnghiệp Liên hợp Quốc

FDA Food and Drug Administration Cơ quan quản lý Thực phẩm và

Dược phẩm MỹGuSCN Guanidinium Isothiocyanate

HAV Hepatitis A virus Vi rút viêm gan A

HAstV Human Astrovirus Astro vi rút người

HEV Hepatitis E virus Vi rút viêm gan E

ISO International Organization for

Standardization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tếLNA Locked Nucleic Acids

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

MGB Minor Groove Binders

NAFIQA

D

National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Department

Cục Quản lý Chất lượng Nônglâm sản và Thủy sản – Bộ Nôngnghiệp và Phát triển nông thônNCBI The National Center for Trung tâm thông tin Công nghệ

Biotechnology Information sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ)NoV Norovirus

NTP Nucleoside triphosphatase

NVWA Netherlands Food and Consumer Product Safety Authority Cơ quan An toàn Sản phẩm Tiêudùng và Thực phẩm Hà LanPEG Polyethylene glycol

RNA Acid ribonucleic

RT-LAMP Reverse transcription loop-mediated

isothermal amplification

Phương pháp khuếch đại đẳngnhiệt thông qua cấu trúc vòngphiên mã ngược

RT-PCR Reverse Trancription Polymerase

Chain Reaction

Phương pháp dựa trên phản ứngchuỗi polymerase phiên mã ngượcRASFF Rapid Alert System for Food and

Feed

Hệ thống cảnh báo nhanh về thựcphẩm và thức ăn chăn nuôi

Ta Annealing Temperature Nhiệt độ gắn mồi

Tm Melting Temperature Nhiệt độ nóng chảy

VASEP Vietnam Association of Seafood

Exporters and Producers

Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩuthuỷ sản Việt Nam

VFA Vietnam Food Administration Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y

tếWHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Báo cáo thống kê ngành thủy sản toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nôngnghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể haimảnh vỏ (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 [1] Theo thống kê củaHiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2021, xuất khẩuNTHMV của Việt Nam đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020; trong đó,ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2].Nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước; trong đó, Liên minhchâu Âu (EU) là thị trường nhập khẩu NTHMV lớn nhất, chiếm 62% tổng giá trịxuất khẩu mặt hàng này của Việt Nam ra các thị trường trên thế giới [3] Tuy nhiên,

EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản phẩm nhập khẩu,gây nhiều thách thức đối với ngành nuôi trồng NTHMV ở Việt Nam Tháng 4 năm

2022, trong “Diễn đàn phát triển thủy sản bền vững”, lãnh đạo Bộ Nông nghiệp vàPhát triển Nông thôn đã khẳng định việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vaitrò quan trọng trong việc hoàn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra,trong đó việc bảo đảm kiểm soát chất lượng An toàn thực phẩm từ khâu sản xuấtban đầu đến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4]

Trong những năm qua, tình trạng viêm dạ dày ruột, viêm gan do tiêu thụNTHMV nhiễm vi rút luôn là vấn đề được lưu tâm Theo dấu hiệu lâm sàng, đã xácđịnh được hơn 100 loại vi rút đường ruột có mặt trong thực phẩm bị ô nhiễm; trong

đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) vàAstrovirus ở người (HAstV) là các vi rút gây bệnh thường gặp trong NTHMV [5].Đáng chú ý, một số nghiên cứu về các vi rút này tại Việt Nam đã cho thấy tình trạngđồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm [6-8].

Trước tình hình ô nhiễm thực phẩm do tác nhân vi rút ngày càng tăng cao,cùng với những kết quả về tình trạng đồng nhiễm các tác nhân vi rút, việc phát triểnquy trình phát hiện và định lượng bốn tác nhân vi rút gây bệnh truyền qua thựcphẩm thường gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sức cần thiết [7] Hiện nay,trong khi quy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 có thể ứng dụng để xác định NoV vàHAV trong thực phẩm thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV vàHEV còn chưa được chuẩn hóa, gây nhiều hạn chế trong công tác kiểm nghiệm Vìvậy, việc xây dựng quy trình xác định HAstV và HEV với bộ mồi, mẫu dò đảm bảo

độ bao phủ trên các biến chủng hiện có, đồng thời tối ưu các điều kiện của phản ứngReal-time RT-PCR, cho phép xác định cùng lúc bốn tác nhân NoV, HAV, HEV vàHAstV với một chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 sẽ góp phần rút ngắn thờigian phân tích, hỗ trợ kịp thời cho công tác điều trị.

Bên cạnh đó, các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnhtruyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam còn rất hạn chế Vì vậy, việc xácđịnh đặc điểm sinh học phân tử của vi rút thông qua xác định kiểu gen (genotype) làcông đoạn cần thiết để đánh giá chính xác nguy cơ bùng phát dịch bệnh gây ra bởicác tác nhân vi rút có mặt trong NTHMV, hướng tới đề xuất biện pháp ứng phó kịpthời, ngăn chặn sự lây lan vi rút trong cộng đồng, hạn chế những thiệt hại về sức

khỏe, kinh tế và xã hội Do vậy, luận án “Nghiên cứu xây dựng phương pháp

phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử” đã được thực hiện.

- Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV vàHAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO15216-1:2013

- Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnhtruyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên thị trường

- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thựcphẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

3.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng

RNA của HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

3.1.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA

của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

- Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCRphát hiện HEV

- Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã

in vitro

- Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêttheo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013

- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiệnRNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này

- Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, địnhlượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trìnhnhiệt của ISO 15216-1:2013

3.1.2 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA

của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

- Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCRphát hiện HAstV

- Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên

3.2 Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền

3.3 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh

truyền qua thực phẩm trong NTHMV

- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của NoV phát hiện trong NTHMV

- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HEV phát hiện trong NTHMV

- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HAstV phát hiện trong NTHMV

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

- Thiết kế, hiệu chỉnh bộ mồi, mẫu dò có độ bao phủ cao với các trình tự HEV

và HAstV hiện có trên ngân hàng dữ liệu GenBank

- Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR để có thể phát hiện được RNA của HEV

và HAstV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013; từ đó mở rakhả năng phát hiện và định lượng được 4 tác nhân vi rút NoV, HAV, HEV vàHAstV trong một lần chạy Real-time RT-PCR

- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiệnRNA của HEV và HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh các vi rút này

- Xác định các kiểu gen (genotype) của NoV, HAV, HEV và HAstV nhiễm tạptrong NTHMV, góp phần đánh giá nguy cơ bùng phát dịch bệnh

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Cung cấp một quy trình phân tích cả 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstVvới tính chính xác cao (4 phản ứng Real-time RT-PCR riêng rẽ chạy cùng một chutrình nhiệt) trong NTHMV nói riêng và trong các mẫu thực phẩm, bệnh phẩm, môitrường nói chung để các cơ sở xét nghiệm có thể ứng dụng trong phân tích

- Góp phần nâng cao năng lực kiểm soát an toàn thực phẩm, tăng tính cạnhtranh của NTHMV và các mặt hàng thủy sản xuất khẩu trên thị trường quốc tế

5 Tính mới của đề tài

- Thiết kế, hiệu chỉnh được tổ hợp mồi, mẫu dò phát hiện và định lượng RNAcủa HEV và HAstV có độ bao phủ cao với các trình tự hiện có trên Ngân hàng dữliệu Genbank

- Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA củaHEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO15216-1:2013

- Xác định được tỷ lệ và mức nhiễm tạp của 4 tác nhân NoV, HAV, HEV vàHAstV trong NTHMV trong năm 2016 và 2022 tại Việt Nam

- Xác định được kiểu gen của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMVtrong năm 2016 tại Việt Nam

1 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và

thách thức về an toàn thực phẩm

1.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Theo FAO, nhu cầu đối với các mặt hàng NTHMV (NTHMV) tăng mạnhvào năm 2021 so với 2020 do các hạn chế về COVID-19 đã giảm bớt ở các quốc giatiêu thụ chính những mặt hàng này Trong năm 2021, khoảng 71.000 tấn hàu đãđược nhập khẩu trên toàn thế giới, cao hơn 15.000 tấn so với năm 2020 và thậm chícao hơn 6.000 tấn so với năm 2019 Cũng trong năm 2021, tổng thương mại ngaotrên toàn thế giới tăng, khoảng 287.000 tấn đã được nhập khẩu, nhiều hơn 20.000tấn so với năm 2020 [1]

Việt Nam có đặc điểm địa lý thuận lợi để phát triển hoạt động khai thác vànuôi trồng các loài nhuyễn thể nhờ vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000 km2 nằmbên bờ Tây của Biển Đông - là một biển lớn của Thái Bình Dương, vùng biển đặcquyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 cùng hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầmphá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền [9] Năm

2021, diện tích nhuyễn thể của Việt Nam đạt trên 35.000 ha, sản lượng 471.000 tấn;trong đó, diện tích và sản lượng nuôi ngao chiếm khoảng 50%; cụ thể, năm 2021,diện tích nuôi trên 17.000 ha, sản lượng đạt trên 236.000 tấn Đến nay, nhuyễn thểcủa Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước Theo thống kê của Hiệp hội Chếbiến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu NTHMV của Việt Namnăm 2021 đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020 Trong đó, ngao là sảnphẩm chủ lực, chiếm 73% với gần 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2] Số liệu củaTrung tâm Thương mại Thế giới (ITC) cho thấy các thị trường nhập khẩu chínhNTHMV của Việt Nam là: Liên minh châu Âu EU (Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha,Italy), Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc Trong đó, EU là thị trường nhập khẩuNTHMV lớn nhất, chiếm tỷ trọng 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng này của ViệtNam ra các thị trường trên thế giới [3]

Hình 1.1 Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 [2]

Đáng chú ý, EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sảnphẩm nhập khẩu, đây cũng chính là thách thức lớn đối với ngành nuôi trồngNTHMV Việt Nam Trên thực tế, trong thời gian qua, các lô hàng NTHMV xuấtkhẩu vẫn bị nước ngoài cảnh báo về nguy cơ nhiễm vi rút Mới đây nhất, hàng loạt

lô hàng hàu tươi ướp đá từ Vân Đồn Quảng Ninh bị cảnh báo phát hiện NoV: 10 lôhàng năm 2020 và 2 lô hàng năm 2021 Tháng 4 năm 2022, trong Diễn đàn về pháttriển thủy sản bền vững, Thứ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thônPhùng Đức Tiến đã khẳng định, việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai tròquan trọng trong việc hoàn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra; trong

đó việc bảo đảm kiểm soát chất lượng An toàn thực phẩm từ khâu sản xuất ban đầuđến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4]

1.1.2 Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong

nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Với đặc điểm sinh sống theo hình thức lọc nước để lấy thức ăn, NTHMV làđối tượng thực phẩm có nguy cơ ô nhiễm cao bởi các vi rút và các tác nhân gâybệnh khác có trong môi trường nước Theo các nghiên cứu trên thế giới về nhóm virút gây ô nhiễm nguồn nước có khả năng lây nhiễm sang thực phẩm, có đến hơn

100 loại vi rút được tìm thấy trong đường ruột người Các vi rút này được phân làm

3 nhóm chính theo hội chứng lâm sàng: nhóm vi rút gây viêm dạ dày ruột, vi rút gâyviêm gan và các vi rút gây một số bệnh khác Trong số các vi rút này, Norovirus(NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người(HAstV) là các vi rút thường gặp trong NTHMV [5] Đáng chú ý, thống kê 359 vụngộ độc thực phẩm trong NTHMV từ năm 1980 đến năm 2012 trên thế giới đã chỉ

ra NoV và HAV là hai vi rút gây bệnh phổ biến, chiếm tỉ lệ lần lượt là 83,7% và12,8% [10].

Theo các số liệu thống kê dịch tễ gần đây, NoV được coi là một trong nhữngtác nhân chính gây bệnh truyền qua thực phẩm trên toàn thế giới Ở Mỹ, NoV lànguyên nhân của trung bình 570–800 ca tử vong, 56.000–71.000 ca nhập viện,400.000 ca cấp cứu và 19–21 triệu ca bệnh mỗi năm [11] NoV là vi rút gây bệnhxuất hiện nhiều nhất trong các loại NTHMV, chiếm 83,7% Một nghiên cứu giámsát mức độ nhiễm NoV trong NTHMV được thực hiện bởi Cơ quan An toàn Sảnphẩm Tiêu dùng và Thực phẩm Hà Lan (NVWA) trên 756 mẫu trong khoảng thờigian từ năm 2013 đến năm 2017 đã phát hiện 45,5% mẫu dương tính với NoV [12].Tại Nhật Bản, nghiên cứu về tình hình nhiễm vi rút đường ruột trong NTHMV trên

732 mẫu được thu thập trong 5 năm, từ 2014 đến 2018 đã chỉ ra tồn tại mối liên hệgiữa tỉ lệ nhiễm NoV trong NTHMV với số ca tiêu chảy diễn ra trong cộng đồng.Tại Đông Nam Á, nghiên cứu được thực hiện trên 300 mẫu NTHMV thu thập từ cácchợ tại Thái Lan đã phát hiện NoV trong 12,3% mẫu; trong đó tỉ lệ nhiễm trên hàu

là 14%, ngao là 6% [13]

Hàng năm trên thế giới có khoảng 1,4 triệu người mắc HAV và khoảng 200triệu người mang bệnh nhưng không thể hiện triệu chứng HAV có thể lây truyền từngười sang người hoặc thông qua nước và thực phẩm bị ô nhiễm, đặc biệt ởNTHMV không xử lý nhiệt đủ yêu cầu Lịch sử đã ghi nhận vụ dịch lan truyền rộngrãi nhất tại Thượng Hải, Trung Quốc vào năm 1988 với gần 300.000 trường hợp dotiêu thụ ngao đánh bắt tại vùng nước bị ô nhiễm nước thải [14] Tại Tây Ban Nha,hai vụ dịch lớn do tiêu thụ ngao nhiễm HAV được nhập khẩu từ Peru đã được ghinhận với số ca nhiễm lên tới 184 người năm 1999 và 100 người năm 2008 Liênquan đến hai vụ dịch này, Bộ Y tế Tây Ban Nha đã kích hoạt Hệ thống cảnh báonhanh về thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (RASFF) của châu Âu; hàng loạt hô hàngNTHMV từ Peru vào thời điểm đó đã được cảnh báo và cấm nhập khẩu vào châu

Âu [15] Đặc biệt, nghiên cứu của David Polo và cộng sự đánh giá nguy cơ nhiễm

vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm thực hiện trên 50 mẫu NTHMV được nhậpkhẩu từ Ma rốc, Peru, Hàn Quốc và Việt Nam đã phát hiện tỉ lệ nhiễm HAV lên tới50% trên các mẫu NTHMV đến từ Việt Nam [16]

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, có trên 2,3 triệu người nhiễm HEVmỗi năm với khoảng 70.000 ca tử vong, chủ yếu liên quan đến việc sử dụng thựcphẩm được thu hoạch từ các vùng có nguồn nước bị ô nhiễm với tỷ lệ cao nhất ởĐông và Nam Á [17] Tại Trung Quốc, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của ô nhiễm

nguồn nước đến sức khỏe cộng đồng thông qua tiêu thụ NTHMV tại vịnh Bột Hải

đã tìm thấy HEV trong 17,5% số mẫu thu thập [18] Tại châu Âu, một cuộc điều tranăm 2008 trên 789 du khách trở về từ chuyến du thuyền sang Anh cho thấy có đến

195 người dương tính với vi rút HEV, trong đó 33 người có triệu chứng nhiễmtrùng cấp tính Phân tích nguyên nhân cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ với việc tiêuthụ sò và trai đến từ vùng nước ô nhiễm tại Southampton [19] Nghiên cứu củaRivadulla thực hiện trên 168 mẫu NTHMV tại hai vùng nuôi trồng thủy sản tại TâyBan Nha đã phát hiện 24,4% mẫu nhiễn HEV [20]

Tương tự như NoV, HAstV thường được tìm thấy trong NTHMV được nuôi ởvùng nước ô nhiễm Trẻ em là đối tượng có nguy cơ mắc HAstV cao nhất, theo mộtnghiên cứu năm 2013, có đến 3% trẻ em dưới năm tuổi mắc vi rút này nhập viện mỗinăm [21] Một nghiên cứu khác thực hiện tại Nhật Bản, nơi có 4700 trẻ em trong độtuổi đi học bị ảnh hưởng bởi bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính, HAstV đã được tìm thấytrong 26% mẫu phân Năm 2019, nghiên cứu của Diem Lan Vu và cộng sự thực hiệntrên 384 mẫu bệnh phẩm tại Tây Ban Nha cho thấy tỷ lệ nhiễm HAstV chiếm 13,3%

và được tìm thấy trong 66% các mẫu đồng nhiễm với các loại vi rút khác [22] Một

số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra phương thức lây truyền chính của HAstV là dothực phẩm bị ô nhiễm, điển hình là NTHMV tại các vùng nước bị ô nhiễm Nghiêncứu của Vilarino và cộng sự thực hiện tại Tây Ban Nha trên 41 mẫu NTHMV đã pháthiện 12,2% mẫu nhiễm HAstV [23] Nghiên cứu của David Polo và cộng sự trên 50mẫu NTHMV nhập khẩu từ Ma rốc, Peru, Hàn Quốc và Việt Nam đã phát hiệnHAstV trong 18% số mẫu; đáng chú ý, mẫu NTHMV nhập khẩu từ Việt Nam nhiễmHAstV cũng đồng nhiễm với HAV và NoV nhóm GI [16]

Từ các số liệu về tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm kểtrên, có thể thấy tồn tại nguy cơ nhiễm NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV.Đặc biệt, một số nghiên cứu đã chỉ ra tình trạng đồng nhiễm nhiều vi rút trên cùngmột mẫu, cho thấy tính phức tạp trong chẩn đoán và điều trị Vì vậy, việc nghiêncứu một phương pháp phù hợp cho xác định cả bốn vi rút sẽ là đóng góp hiệu quảtrong quá trình tìm nguyên nhân gây bệnh

1.2 Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực

phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

1.2.1. Norovirus

NoV là một vi rút thuộc họ Caliciviridae, có cấu tạo là một vi rút RNA sợi

đơn dương, có kích thước gần 7,6kb Hạt vi rút của NoV rất nhỏ với đường kínhkhoảng 27-35 nm Trong cùng genocluster, vỏ capsid của vi rút thường rất giống

nhau với khối 20 mặt đối xứng (Hình 1.2) Vỏ capsid gồm có 90 dimer, khối lượngphân tử là 58 kDa [24] NoV tương đối bền trong môi trường Cụ thể, vi rút này cóthể tồn tại trong môi trường với pH dao động từ 2 đến 10; nhiệt độ từ đông lạnh đếnnhiệt độ cao tới 60℃ Đặc biệt, vi rút này có thể tồn tại thời gian dài trên các bềmặt khác nhau; ngay cả khi tiếp xúc với nồng độ clo lên tới 10 ppm [25].

A

B

Hình 1.2 Cấu trúc Norovirus [26, 27].

Cấu trúc hạt vi rút (A); Cấu trúc hệ gen (B)

Phân tích về trình tự chiều dài hệ gen của NoV chỉ ra các chủng vi rút trongmột nhóm gen thường có trên 69% tương đồng về nucleotide Hệ gen của NoVđược chia thành 3 khung đọc mở (ORF1, ORF2, và ORF3) (Hình 1.2) Khung đọc

mở thứ nhất ORF1 (~5 kb) mã hóa một phân tử polyprotein có kích thước 194kDa,phân tử polyprotein này bị phân cắt bởi chính protease của NoV để tạo thành 6 phân

tử protein gồm (1) N-Term, protein chưa rõ chức năng (~48 kDa); (2) NTPnucleoside triphosphatase (~40 kDa) có khả năng liên kết và thủy phân toàn bộNTP; (3) p22 tương tự như vùng N-Term, chưa rõ chức năng (~22kDa); (4) VPg,protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân bản và dịch mã RNA (~16kDa); (5) 3C, 3C-like protease (~19 kDa), có vai trò phân cắt ORF1 polyproteinthành các phân tử protein và (6) RdRp, RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp)(~57 kDa) ORF2 chủ yếu mã hóa protein VP1 có tính biến đổi cao ORF3 mã hóamột protein VP2 cơ bản nhỏ nằm bên trong hạt vi rút, có vai trò tham gia vào quátrình tổng hợp capsid và hình thành hệ gen Trong đó, vùng RdRp tại khu vực giaogiữa ORF1-ORF2 và vùng VP1 là hai vùng chính thường được sử dụng để phânloại đặc điểm di truyền của NoV hiện nay; còn vùng C tương ứng với vùng trình tựnhỏ ở đầu 5′ của VP1 thường được sử dụng để xác định kiểu gen (genotype) củaNoV [27, 28] Nghiên cứu về tính di truyền và đa dạng kiểu gen của NoV những

năm gần đây đã chỉ ra NoV được phân thành 49 kiểu gen thuộc 10 nhóm từ GI đến

GX (9 GI, 27 GII, 3 GIII, 2 GIV, 2 GV, 2 GVI, 1GVII, 1GVIII, 1 GIX và 1 GX)với GI, GII, GIV là những kiểu gen thường gặp ở người; trong đó, NoV GI và NoVGII là hai kiểu gen gây bệnh phổ biến [29, 30]

1.2.2 Hepatitis A virus

HAV là một vi rút RNA với đường kính khoảng 27-32 nm, có cấu trúc đốixứng 20 mặt (Hình 1.3) Về đặc điểm vật lý, HAV có khả năng tồn tại trong môitrường pH từ 3 đến 11 và có thể chịu được nhiệt độ đến 60℃ Hệ gen của HAVgồm một phân tử RNA mạch đơn, dương, có kích thước 7.5 kb HAV có hệ gentương tự với các Picornavirus khác với cấu trúc được chia làm 3 vùng: vùng 5'không dịch mã (5'UTR) chiếm xấp xỉ 10% hệ gen, một khung đọc mở (ORF), vàvùng 3' không mã hóa (3'UTR) [31] (Hình 1.3)

A

B

Hình 1.3 Cấu trúc Hepatitis A virus [31]

Cấu trúc hạt vi rút (A); Cấu trúc hệ gen (B)

Vùng 5' UTR là vùng bảo thủ nhất trong hệ gen của HAV, với độ tương đồng

về trình tự nucleotide lên tới trên 89% trong 7 chủng đại diện cho các kiểu gen I, II,III; do đó, đây cũng là vùng gen được sử dụng để xác định HAV Vùng 5' UTR có

độ dài khoảng 735 đến 745 nucleotid, có liên kết đồng hóa trị với protein 3B được

mã hóa bởi chính hệ gen (protein VPg) và có chứa một vị trí đi vào ribosom(internal ribosomal entry site-IRES) Đầu 5'UTR có cấu trúc RNA bậc hai ở mức độcao, với một vài cấu trúc dạng kẹp tóc phức tạp Khung đọc mở mã hóa cho tất cảcác protein của vi rút, với các vùng như P1 mã hóa cho các protein của lớp vỏ vàvùng P2, P3 cho các protein không cấu trúc, vốn tham gia vào quá trình tổng hợp,sao chép RNA, và sự tạo thành virion Vùng mã hóa cho P1 chứa các protein mang

cấu trúc bao gồm khoảng 2225 đến 2227 nucleotide và mã hóa cho 4 loại proteinchủ yếu của lớp vỏ vi rút là VP1, VP2, VP3 và VP4 Vùng 2BC và P3 chứa bảyprotein phi cấu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D) Vùng 3'UTR có khoảng 40 đến

80 nucleotide chứa trình tự kết thúc dịch mã bao gồm một chuỗi poly(A) có độ biếnđổi cao (tới 20%) giữa các chủng và các dạng đột biến HAV có một kiểu huyếtthanh với sáu kiểu gen dựa trên việc kiểm tra một đoạn 168-nucleotide của vùngVP1-2A, đây cũng chính là vùng gen được sử dụng trong các nghiên cứu định typHAV những năm gần đây [32]

1.2.3 Hepatitis E virus

HEV là vi rút thuộc họ Hepeviridae, vỏ capsid là khối gồm 20 mặt đối xứng

(Hình 1.4) Hệ gen của HEV gồm một phân tử RNA mạch đơn dương Kích thước

hệ gen của HEV ở động vật có vú và các loài cá khoảng 7,2kb; ở gia cầm khoảng6,7kb Về đặc điểm vật lý, HEV có khả năng tồn tại bền vững ở pH từ 2 đến 9 và cókhả năng chịu nhiệt từ 4℃ đến 56℃ [33]

A

B

Hình 1.4 Cấu trúc Hepatitis E virus [34, 35].

Cấu trúc hạt vi rút (A); Cấu trúc hệ gen (B)

Về cấu trúc, hệ gen HEV chứa hai vùng chưa dịch mã ở đầu 5’ và 3’ (NTR);khung đọc mở ORF1 mã hóa cho các protein phi cấu trúc gồm methyltransferase(MeT), RNA helicase (Hel) và RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) cần thiếtcho quá trình sao chép RNA; ORF2 mã hóa cho capsid protein HEV với chiều dài

660 amino acid; ORF3 có độ dài khoảng 113 amino acid, mã hóa cho một proteinchức năng (Hình 1.4) Vùng tiếp giáp (JR) của HEV nằm giữa 2 khung đọc mởORF1 và ORF3 Vì thế, vùng mã hóa cho ORF2 được bao phủ lên khung đọc mởORF3 nhưng không tiếp giáp với ORF1 Ngoài ra, vùng CRE (cis-reactive element)

là vùng thiết yếu cần thiết cho quá trình nhân lên của HEV, vùng CRE thứ nhất phủ

lên đầu 3’ của ORF2 và đầu 3’ của NTR Vùng CRE thứ hai nằm tại vùng JR, cấutrúc vòng (SL) ở vùng JR cũng đóng vai trò quan trọng đối với quá trình nhân bảncủa HEV Vùng bảo thủ nhất của hệ gen HEV là vùng giao ORF2-ORF3, thườngđược sử dụng làm vùng gen mục tiêu trong xác định HEV bằng phương pháp PCR.Trong khi đó, vùng MeT ở đầu 5’ và vùng ORF2 lại là hai vùng gen được nhắm đếntrong các nghiên cứu định typ HEV HEV gồm 7 kiểu gen từ HEV-1 đến HEV-7;trong đó năm kiểu gen đã được tìm thấy ở người gồm HEV-1, HEV-2, HEV-3,HEV-4 và HEV-7; các kiểu gen này lại được phân thành 26 kiểu gen phụ: năm kiểugen phụ thuộc HEV-1 (1a đến 1e), hai kiểu gen phụ thuộc HEV-2 (2a và 2b), mườikiểu gen phụ thuộc HEV-3 (3a đến 3j), bảy kiểu gen phụ thuộc HEV-4 (4a đến 4g)

và hai kiểu gen phụ thuộc HEV-7 (7a và 7b) [35]

1.2.4 Astrovirus

HAstV là vi rút thuộc họ Astroviridae, không có vỏ ngoài, có cấu trúc mặt

cắt hình lục giác, đường kính 28-35 nm, chứa một sợi RNA mạch đơn, dương với

độ dài khoảng 6.800 nucleotides [36] Về đặc điểm vật lý, HAstV tương đối bềnvững; có khả năng tồn tại ngay cả trong môi trường chứa các chất tẩy rửa, clo haydung môi acid với pH dưới 3; ở nhiệt độ từ 4℃ đến 60℃, nồng độ HAstV có daođộng không đáng kể và vẫn duy trì khả năng lây nhiễm [37] Hệ gen của HAstVgồm ba khung đọc mở: ORF1a, ORF1b và ORF 2 (Hình 1.5)

A

B

Hình 1.5 Cấu trúc Human Astrovirus [36] [38].

Cấu trúc hạt vi rút (A); Cấu trúc hệ gen (B)

ORF1a và ORF1b mã hóa các protein phi cấu trúc, gồm hai enzyme serineprotease (Pro) và RNA dependent RNA polymerase (Pol), ORF2 mã hóa protein

capsid và có biến đổi lớn ở đầu 3’ kết thúc Đặc biệt, vùng ORF-X nằm ở vùng giaogiữa ORF1b và ORF2 đã được chỉ ra là vùng chứa các trình tự bảo thủ cao cho phép

phân biệt giữa các chủng HAstV Ngoài ra, hệ gen của HAstV chứa 3 vùng bảo thủ

ở tất cả các chủng HAstV giúp phân biệt họ Astroviridae với các họ vi rút khác như

Picornaviridae và Caliciviridae gồm vùng tín hiệu dịch khung (frameshift signal)

giao ORF1a-ORF1b; trình tự ở đầu ORF2 đóng vai trò vùng promoter khởi đầu đểtổng hợp hệ gen con (sg RNA promoter) và vùng stem-loop ở đầu 3′ kết thúc ở cuốiORF2; các vùng nới trên là các vùng gen thường được sử dụng làm vùng gen mụctiêu để xác định HAstV cũng như phân biệt các kiểu gen của HAstV HAstV đượcphân thành tám kiểu gen từ HAstV1 đến HAstV8, trong đó kiểu gen HAstV1 chiếm

ưu thế với tỉ lệ phát hiện ở các nước châu Á lên đến trên 80% [39]

1.3 Quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể

hai mảnh vỏ

NoV, HAV, HEV và HAstV đều là các vi rút có khả năng chống chịu cao vớicác tác nhân từ môi trường như nhiệt độ, pH, độ ẩm thấp hay cường độ ánh sáng, tiacực tím cao [40] Vì vậy, các vi rút này có thể phát triển ổn định và lưu lại trong môitrường với thời gian từ 2 ngày đến 4 tuần Đáng chú ý, các vi rút gây bệnh truyền quathực phẩm này có liều lây nhiễm thấp, chỉ từ 10 đến 100 phần tử vi rút [41]; do đó, đểphát hiện và định lượng, cần sử dụng những phương pháp có độ nhạy cao Quy trìnhphát hiện và định lượng vi rút trong thực phẩm gồm hai bước chính: (1) Tách chiếtRNA vi rút và (2) Xác định vi rút

1.3.1 Các phương pháp tách chiết RNA vi rút

NTHMV là nhóm thực phẩm tồn tại nhiều thành phần ức chế phản ứng xácđịnh vi rút ở giai đoạn sau tách chiết như các polysacarit, protein và axit béo [42,43]; vì vậy, mục tiêu của giai đoạn này là phân tách các phần tử vi rút khỏi nền mẫuthực phẩm, cô đặc vi rút và loại bỏ các thành phần ức chế nói trên Các phươngpháp tách chiết RNA vi rút có thể được nhóm thành 3 phương pháp chính: (1) rửagiải hạt vi rút – cô đặc vi rút – tách chiết RNA vi rút ; (2) tách chiết trực tiếp RNA

vi rút; (3) rửa giải vi rút bằng proteinase K – tách chiết RNA vi rút.

1.3.1.1 Phương pháp rửa giải hạt vi rút - cô đặc vi rút - tách chiết RNA vi rút

Nguyên tắc của phương pháp rửa giải – cô đặc là các hạt vi rút có trong thực

phẩm được rửa bằng một dung dịch đệm thích hợp, sau đó cô đặc để thu được các virút Phương pháp này đã được áp dụng từ những năm 70 của thế kỷ trước để táchchiết các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong hàu [44, 45] Ở giai đoạn rửagiải, dung dịch kiềm ở pH 9 – 10,5 thường được sử dụng để tách vi rút khỏi bề mặtthực phẩm [46, 47] Tuy nhiên, trong trường hợp giai đoạn cô đặc sau đó sử dụngnguyên tắc trao đổi ion hoặc siêu ly tâm, môi trường đệm trung tính thường được ưutiên sử dụng Tiếp theo, việc cô đặc bằng kết tủa vi rút sau quá trình rửa giải được

sử dụng để tăng nồng độ vi rút, giúp nâng cao độ nhạy Một số phương pháp cô đặcthường được sử dụng gồm: kết tủa bằng polyethylene glycol (PEG) hay các kỹ thuậtnhư siêu ly tâm, sử dụng màng vi lọc, cô đặc bằng phương pháp miễn dịch hay phântách cation Cuối cùng, giai đoạn tách chiết RNA đóng vai trò quyết định đến sựthành công của quy trình xác định vi rút, đặc biệt đối với giai đoạn phiên mã ngược

do enzyme phiên mã ngược có tính nhạy cảm cao với các chất ức chế Mục tiêuchung của các phương pháp tách chiết RNA là thu được sản phẩm RNA tinh khiết,nồng độ cao mà vẫn đảm bảo tính toàn vẹn của RNA Để tách chiết RNA vi rút trênnền mẫu thực phẩm, các phương pháp sử dụng hợp chất hóa học như cetrimoniumbromide (CTAB), phenol, chloroform, sephadex, chelex, GuSCN hay các bộ kit sửdụng hạt từ silica thường được sử dụng Nhìn chung, các phương pháp dựa trênnguyên tắc hóa học thường cho phép xử lý một số chất ức chế: chelex hoặcsephadex cho phép loại muối và một số protein, CTAB cho phép loại bỏ cácpolysaccharide, GuSCN lại có khả năng ly giải vượt trội các mô, hòa tan vi rút màvẫn duy trì tính toàn vẹn của RNA nhờ khả năng biến tính mạnh mẽ các RNase Sảnphẩm thương phẩm điển hình nhất cho nhóm các phương pháp dựa trên nguyên tắchóa học là Trizol (Invitrogen, Mỹ) với sự kết hợp của ba thành phần guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform Với một quy trình đơn giản, hiệu quả kinh tế cao,Trizol đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu Tuy nhiên, một số nghiêncứu gần đây cũng chỉ ra việc sử dụng Trizol hay các giải pháp hóa học trong táchchiết chưa đảm bảo loại bỏ hoàn toàn các tác nhân gây ức chế phản ứng Bên cạnh

đó, việc tồn dư phenol, GuSCN hoặc các thành phần hóa học khác từ giai đoạn xử

lý thu RNA cũng làm giảm chất lượng của sản phẩm RNA [48-51] Trong khi đó,các phương pháp dựa trên nguyên tắc miễn dịch hay trao đổi ion thường mang lạihiệu quả cao hơn do khả năng phân tách đặc hiệu vi rút khỏi các tác nhân ức chế cótrong nền mẫu thực phẩm [52]

1.3.1.2 Phương pháp tách chiết trực tiếp RNA vi rút

Các phương pháp tách chiết RNA trực tiếp từ thực phẩm thường sử dụng

guanidinium isothiocyanate (GuSCN) và phenol để ly giải lớp vỏ capsid, thu RNAcho bước tinh sạch tiếp theo Phương pháp này đặc biệt được áp dụng đối với thựcphẩm giàu protein hoặc chất béo Nghiên cứu của Stals năm 2011 sử dụng phươngpháp tách chiết RNA trực tiếp đã cho phép tách chiết 106 phiên bản hệ gen NoVGI/GII từ 10g thực phẩm chế biến sẵn [53] Ở đối tượng NTHMV, nghiên cứu củaHusman năm 2007 đã tách chiết thành công 10 đơn vị RT-PCR vi rút từ 0,15g tuyếntiêu hóa hàu bằng phương pháp tách chiết RNA trực tiếp kết hợp với sử dụng hạt từzirconium [54] Năm 2006, phương pháp này cũng đã được Boxman sử dụng để pháthiện NoV từ hàu và trai trong một vụ dịch tại Hà Lan với tỉ lệ dương tính với NoV ởhàu là 12,5% và ở trai là 38,5% [55] Ở một khía cạnh khác, nghiên cứu năm 2007của Baert lại chỉ ra việc sử dụng phương pháp tách chiết RNA trực tiếp để xác địnhNoV trong tuyến tiêu hóa của các NTHMV cho độ nhạy thấp hơn so với các phươngpháp tách chiết và cô đặc khác [48] Dù vậy, năm 2009, nghiên cứu của Neonen đãchứng minh điều ngược lại khi lựa chọn phương pháp tách chiết RNA trực tiếp làphương pháp chính để khẳng định sự có mặt của NoV trong các mẫu hàu trong một

vụ dịch năm 2007 [56] Sản phẩm thường được sử dụng nhất trong các nghiên cứutách chiết trực tiếp RNA vi rút là Trizol Tuy nhiên, phương pháp tách chiết RNAtrực tiếp bằng Trizol thường phải xử lý vấn đề về việc tồn dư phenol từ giai đoạn xử

lý thu RNA do luôn tồn tại một lượng phenol bão hòa trong pha lỏng Với khả năngphá hủy mạnh mẽ protein, lượng phenol tồn dư này có thể ức chế các enzyme được

sử dụng cho giai đoạn phân tích tiếp theo Bên cạnh đó, do tính độc của Trizol (đặcbiệt là thành phần phenol), những năm gần đây, các nghiên cứu tách chiết dựa trênrửa giải vi rút bằng proteinase K kết hợp tách chiết RNA vi rút bằng nguyên tắc miễndịch hay trao đổi ion thường được sử dụng [57]

1.3.1.3 Rửa giải vi rút bằng proteinase K – Tách chiết RNA vi rút

Phương pháp tách chiết vi rút dựa trên việc sử dụng enzyme proteinase K kếthợp tách chiết RNA vi rút đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu tách chiết các

vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm từ mô tiêu hóa của NTHMV Bằng việc sửdụng enzyme phân hủy protein, dưới tác dụng nhiệt, ngoài các protein từ tế bàoNTHMV, các RNase cũng bị biến tính, giúp bảo toàn số lượng RNA thu được trongquá trình tách chiết Ở giai đoạn xử lý ban đầu này, việc băm nhỏ các mô tuyến tiêuhóa của NTHMV cũng góp phần làm tăng hiệu quả của proteinase K Tiếp đến, thu

vi rút và tách chiết RNA bằng việc phá hủy lớp vỏ capsid của vi rút, từ đó giải

phóng các RNA Cho đến nay, phương pháp này đã được ứng dụng để tách chiết virút từ nhóm NTHMV với độ tin cậy được khẳng định trong nhiều nghiên cứu, đặcbiệt là các nghiên cứu của Le Guyader và cộng sự [58-61] Năm 2013, Tổ chức tiêuchuẩn Quốc tế ISO (International Organization for Standardization) đã công bố tiêuchuẩn kỹ thuật ISO/TS 15216-1:2013 phát hiện và định lượng NoV và HAV trongthực phẩm với quy trình tách chiết sử dụng proteinase K ủ ở 37℃và 60oC, ly tâm

để thu vi rút; RNA được tách chiết bằng việc sử dụng dung dịch muối chaotropic làGuSCN để phá vỡ lớp vỏ capsid của virus; RNA sau đó được hấp thụ vào hạt silica

để thực hiện quá trình tinh sạch; RNA của vi rút sau khi đã tinh sạch được giảiphóng ra khỏi hạt silica vào dung dịch đệm trước khi tiến hành phản ứng Real-timeRT-PCR [62] Việc ra đời tiêu chuẩn ISO/TS 15216-1:2013 đã góp phần địnhhướng cho những nghiên cứu về vi rút gây bệnh trên đối tượng mẫu thực phẩm nóichung và NTHMV nói riêng

1.3.1.4 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết vi rút trong NTHMV

Việc nghiên cứu phát triển các phương pháp tách chiết nhằm tăng độ thu hồi,góp phần cải thiện độ nhạy luôn là vấn đề được lưu tâm Năm 1980, nghiên cứu củaMetcalf chỉ ra các vi rút được tập trung chủ yếu ở mô tiêu hóa đã định hướng chocác nghiên cứu sau này [63] Lập luận này sau đó đã được chứng minh trong cácnghiên cứu xác định HAV và một số vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm kháctrong tuyến tiêu hóa của hàu và ngao Năm 2011, nghiên cứu của Maalouf phân tíchNoV từ hàu đã chỉ ra việc tập trung vào tuyến tiêu hóa, chỉ chiếm 1/10 khối lượngmỗi cá thể hàu đã cho phép tăng độ nhạy lên 100 lần [64] Việc tập trung tách chiết

vi rút từ tuyến tiêu hóa đã mang lại nhiều ưu điểm: giúp tăng độ nhạy phát hiện,giảm thời gian tách chiết và đặc biệt giảm đáng kể các tác nhân gây ức chế phảnứng RT-PCR [65] Quy trình tách chiết vi rút từ NTHMV gồm các giai đoạn: ly giải

vi rút khỏi mô tiêu hóa, tách chiết và cô đặc thu RNA từ vi rút Khối lượng mẫu sửdụng cho quá trình tách chiết thông thường từ 1,5g đến 2g tuyến tiêu hóa Cácnghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV được tổng hợp ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV

NoV Proteinase K GuSCN, hạt từ silica ISO 15216 : 2019 [66]

HAV Proteinase K GuSCN, hạt từ silica ISO 15216 : 2019 [66]

HEV Đệm kiềm PEG, hạt từ silica Grodzki, 2014 [67]

Đệm kiềm, Proteinase K, GuSCN, màng silica Rivadulla, 2019 [68]

HAstV Proteinase K Hạt từ silica Suffredini, 2020 [69]

Proteinase K GuSCN, màng sợi

thủy tinh Le Cann, 2004 [70]

Hiện nay, quy trình tách chiết NoV và HAV theo tiêu chuẩn ISO 1:2013 đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu Trên HEV, năm 2019, Rivadullanghiên cứu về tình hình nhiễm vi rút này trong mẫu nhuyễn thể tại vùng Tây BắcTây Ban Nha sử dụng bộ kit NucleoSpin RNA virus (Macherey-Nagel, Dürem,Germany) đã đem lại hiệu quả phát hiện cao [68] Đáng chú ý, bằng việc sử dụngProteinase K và GuSCN ở giai đoạn tách chiết RNA, chỉ khác biệt ở bước tinh sạchbằng màng silica, quy trình này sử dụng kỹ thuật tách chiết gần như tương đồng vớiquy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 Đặc biệt, quy trình tách chiết RNA vi rút kếthợp giữa proteinase K và hạt từ silica cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu xácđịnh HAstV trong mẫu NTHMV của Suffredini năm 2020 [69]

15216-Từ các nghiên cứu trên, có thể thấy việc tách chiết RNA của HEV và HAstVtheo quy trình được nêu trong tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 là hoàn toàn khả thi.Việc ứng dụng quy trình ISO 15216-1:2013 để tách chiết đồng thời nhóm bốn vi rútgây bệnh truyền qua thực phẩm có nguy cơ cao trong NTHMV (NoV, HAV, HEV,HAstV) sẽ góp phần đáng kể trong việc rút ngắn thời gian phân tích, nâng cao hiệuquả kinh tế

1.3.2 Các phương pháp xác định vi rút

1.3.2.1 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng phiên

mã ngược (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)

Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng phiên mã ngược(RT-LAMP) là phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt được sử dụng phổ biến nhấttrong số các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic hiện có; với kỹ thuật này,việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước

Ra đời vào năm 2000, kỹ thuật RT-LAMP sử dụng đặc tính chuyển vị mạch củaenzyme Bst DNA polymerase và 4 cặp mồi nhắm đến 6 vùng khác nhau trên genmục tiêu [71] (Hình 1.6) Nhờ việc tạo ra các cấu trúc vòng đơn nhánh (loopstructures), quá trình khuếch đại có thể diễn ra tại một nhiệt độ mà không cần thôngqua giai đoạn biến tính như ở kỹ thuật PCR Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếpsản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trộicủa phương pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích

Hình 1.6 Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP [72]

Công trình đầu tiên sử dụng kỹ thuật RT-LAMP để phát hiện vi rút gây bệnhtruyền qua thực phẩm là nghiên cứu của Fukuda và các cộng sự vào năm 2006 [73].Dựa trên việc sử dụng gen mục tiêu là vùng đi từ đầu C của gen mã hóa RNA-dependent RNA polymerase đến đầu N của gen mã hóa VP1 để xác định NoV,nghiên cứu đã đạt được độ nhạy trong khoảng 102-103 phiên bản/phản ứng tùy thuộcvào kiểu gen Khi được thử nghiệm trên các mẫu phân từ các vụ dịch, độ tươngđồng kết quả giữa phương pháp RT-LAMP và RT-PCR đạt gần 100% Trong mộtnghiên cứu tương tự, Yoda và các cộng sự (2007) đã thiết kế 3 tổ hợp mồi đểkhuếch đại các trình tự gen mục tiêu tương ứng với nhóm GI, GII thường gặp và

GIII ít gặp Độ nhạy của phương pháp RT-LAMP dao động từ 7-200 phiênbản/phản ứng tùy thuộc vào kiểu gen của chủng NoV [74] Tuy nhiên, các nghiêncứu này cũng như một số nghiên cứu về vi rút bằng phương pháp RT-LAMP kháctrên thế giới tính đến thời điểm hiện tại đều được thực hiện trên mẫu bệnh phẩm vớilượng vi rút lớn

1.3.2.2 Phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược

(Reverse transcription polymerase chain reaction)

Phần lớn các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm là các RNA vi rút, do đó

kỹ thuật xét nghiệm dựa trên việc khuếch đại RNA đang ngày càng được phát triển,cho phép khắc phục hạn chế về độ nhạy của các phương pháp miễn dịch [75] Vớikhả năng khuếch đại chính xác một trình tự gen mục tiêu lên hàng tỉ lần, kỹ thuậtdựa trên phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) là kỹ thuật được sửdụng phổ biến nhất trong số các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic để phát hiện vi rúttrong NTHMV hiện nay Kỹ thuật RT-PCR gồm hai giai đoạn chính: giai đoạn thứnhất, chuyển mRNA sang cDNA sử dụng enzyme phiên mã ngược Reverse-transcriptase (RT) và giai đoạn thứ hai, khuếch đại DNA bằng enzyme tổng hợpDNA polymerase RNA trước tiên được cô đặc và tinh sạch để loại bỏ cáccarbohydrate, chất béo và một số phức hợp khác có thể gây ức chế phản ứng khuếchđại Các mồi đặc hiệu được sử dụng để khuếch đại chính xác các trình tự mục tiêu,phân biệt với các vi rút và vi khuẩn khác có thể có mặt trong mẫu Lý tưởng nhất,một cặp mồi có thể bao phủ tất cả các biến thể của chủng vi rút, những mồi vớinhiệt độ biến tính thấp và nhiệt độ nóng chảy cao được ưu tiên Các mồi cần đượcphát triển để có thể xác định nhiều chủng nhưng vẫn đảm bảo đủ độ đặc hiệu chophép phân định chính xác vi rút mục tiêu có trong mẫu thực phẩm [76-78]

1.3.2.3 Phương pháp RT-PCR thời gian thực (Real-time RT-PCR)

Tương tự như kỹ thuật RT-PCR, trước tiên mRNA được chuyển sang cDNAnhờ enzyme phiên mã ngược Reverse-transcriptase (RT); tiếp theo đó, phản ứngReal – time PCR được thực hiện Kỹ thuật Real-time RT-PCR được giới thiệu lầnđầu tiên vào năm 1996 bởi Ken Livak và các cộng sự thuộc công ty AppliedBiosystems Mỹ, bằng khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng chuỗipolymerase dựa trên sự hoạt động của các chất nhuộm huỳnh quang, Real-time PCR

đã trở thành bước tiến lớn trong công nghệ sinh học của thế kỷ 20 [79] Hình 1.7 thểhiện nguyên tắc phản ứng Real-time PCR

Hình 1.7 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR [79]

Khác với phản ứng PCR thông thường, Real-time PCR có khả năng pháthiện và định lượng trực tiếp sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ của phản ứng Phảnứng Real-time PCR được thực hiện trong một thiết bị gia nhiệt có khả năng chiếusáng từng mẫu với một chùm ánh sáng có chiều dài bước sóng nhất định Bêncạnh đó, thiết bị này xác định đồng thời bước sóng ánh sáng phát ra từ phân tửphát huỳnh quang bị kích hoạt trong ống PCR Từ đó, cho phép xác định được tínhiệu huỳnh quang thay đổi sau mỗi chu kỳ do số lượng phân tử DNA được tổnghợp tăng lên Vì vậy, có thể tính được lượng sản phẩm DNA thu được sau phảnứng Như vậy, bên cạnh quy trình PCR thông thường của phản ứng tổng hợpchuỗi, đoạn DNA được nhân lên trong phản ứng Real-time PCR sẽ được phát hiệntại mỗi thời điểm diễn ra phản ứng (Real-time) Real-time PCR gồm hai quá trìnhdiễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang

tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn DNA tạo thành Các nghiên cứu trong thờigian gần đây đã chỉ ra kỹ thuật Real-time RT-PCR hiệu quả trong việc cải thiện độnhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại, giảm thời gian phân tích và hạn chế hiện tượngnhiễm tạp, trở thành phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện, định lượng vi rút trongcác mẫu NTHMV [80, 81]

1.3.2.4 Đánh giá các phương pháp phát hiện vi rút gây bệnh

Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp xác định vi rút gây bệnhtruyền qua thực phẩm được thể hiện ở Bảng 1.2

Thiết kế mồi phức tạp, không cókhả năng định lượng

[74]

RT-PCR Giới hạn phát hiện thấp Không có khả năng định lượng

Độ nhạy, độ đặc hiệu phụ thuộcvào hiệu quả các giai đoạnchuẩn bị và mồi phản ứng

[82]

Real-time RT-PCR Kết quả hiển thị trực tiếp,

không cần khẳng định sau giai đoạn PCR

Có thể định lượng

Độ nhạy, độ đặc hiệu phụ thuộcvào hiệu quả các giai đoạnchuẩn bị và mồi phản ứng

[82]

Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp trình bày ở Bảng 1.2 đã đượcminh chứng qua nhiều nghiên cứu Năm 2003, nghiên cứu so sánh hiệu quả của baphương pháp phát hiện NoV trên 244 mẫu bệnh phẩm của Rabenau và cộng sự đãchỉ ra phương pháp RT-PCR có độ nhạy cao nhất (94,1%), sau đó đến phương pháp

sử dụng kính hiển vi điện tử (58,3%) và ELISA (31,3%) [83] Năm 2011, nghiêncứu so sánh độ nhạy của 2 phương pháp RT-PCR (Argene Calici/AstV Consensuskit và Cepheid NoV Primer&Probe Set) với phương pháp ELISA trên 61 mẫu bệnhphẩm cho thấy độ nhạy nhận được tương ứng là 92,8%, 91,2% và 78,9%; độ đặchiệu đạt 100% trên cả 3 phương pháp [84] Năm 2016, nghiên cứu của Soltan vàcộng sự xác định Rotavirus trên 108 mẫu bệnh phẩm bằng năm phương pháp:phương pháp ELISA, phương pháp kính hiển vi điện tử, phương pháp RT-PCR vàphương pháp Real-time RT-PCR thương phẩm, cho kết quả tỉ lệ mẫu dương tínhnhận được lần lượt là: 29,4%; 31%; 51,4% và 56,9% [82] Từ các kết quả nghiêncứu trên, có thể nhận thấy phương pháp Real-time RT-PCR đang là phương pháp có

độ đặc hiệu và độ nhạy cao nhất, được ưu tiên sử dụng trong phát hiện và địnhlượng các vi rút từ NTHMV

Năm 2013, Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế ISO (International Organization forStandardization) đã công bố quy trình chuẩn định lượng NoV và HAV trong mẫuthực phẩm với mã số ISO/TS 15216-1:2013 [62], theo đó phương pháp định lượng

vi rút bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR là phương pháp tiêu chuẩn được sử dụngtrong phát hiện và định lượng vi rút trong NTHMV, giúp các nhà khoa học trên toàncầu có định hướng hiệu quả hơn trong nghiên cứu về nhóm các vi rút gây bệnhtruyền qua thực phẩm trong NTHMV [66]

Tại Việt Nam, quy định về việc giám sát định kỳ vi rút trong NTHMV đãđược nêu tại Khoản 3 Điều 19 Thông tư số 33/2015/TT-BNNPTNT của Bộ Nôngnghiệp và Phát triển Nông thôn Theo đó, mẫu NTHMV phát hiện NoV không đượcphép tiêu thụ trực tiếp làm thực phẩm dưới dạng tươi sống; đồng thời các mẫu thuhoạch tại các vùng này cần phải được theo dõi giám sát đến khi đạt yêu cầu Có thểthấy, kỹ thuật Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút trong NTHMV với

độ nhạy lý thuyết đạt đến ngưỡng 1 bản sao/phản ứng là kỹ thuật phù hợp nhất đápứng quy định về giám sát vi rút trong NTHMV hiện nay [85]

1.4 Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn

thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR

Hiện nay, trong khi quy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 đã có thể ứng dụngtrong xác định NoV và HAV thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện tácnhân HAstV và HEV còn riêng lẻ Các thông số chi tiết của phản ứng Real-timeRT-PCR phát hiện NoV, HAV, HEV, HAstV trong các nghiên cứu gần đây trênthế giới được tổng hợp tại Bảng 1.3 và Bảng 1.4

Bảng 1.3 Tổng hợp các bộ mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu phát hiện NoV, HAV, HEV và HAstV

Vị trí vùng khuếch đại

Tác giả, năm

NoV GI

NV1LCR CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC

NVGG1p TGG ACA GGA GAY CGC RATCT

NoV GII

COG2R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA

HAV

HAV240 GGA GAG CCC TGG AAG AAA G

Vị trí vùng khuếch đại

Tác giả, năm

HEV.Fb GTG CCG GCG GTG GTT TCT G

HEV.R GCG AAG GGG TTG GTT GGA TG

HEV.P TGACMG GGTTGATTCTC AGCC

HAstV

AV2 GCT TCT GAT TAA ATC AAT TTT AA

Bảng 1.4 Chu trình nhiệt của các phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện NoV, HAV, HEV, HAstV

Tác nhân

vi rút

Thông tin bộ mồi gốc

(Tác giả, năm công bố)

Chu trình nhiệt

TLTK Phiên mã

ngược

Hoạt hóa

Kéo dài mạch

Số chu kỳ

NoV GI ISO 15216 55℃60 phút 95℃5 phút 95℃15 giây 60℃60 giây 65℃60 giây 45 [66]NoV GII ISO 15216 55℃60 phút 95℃5 phút 95℃ 15 giây 60℃60 giây 65℃60 giây 45 [66]HAV ISO 15216 55℃60 phút 95℃5 phút 95℃15 giây 60℃60 giây 65℃60 giây 45 [66]

HEV

Jothikumar, 2006 50℃30 phút 95℃2 phút 95℃15 giây 60℃40 giây 45 [86, 88]

50℃60 phút 95℃5 phút 95℃15 giây 60℃60 giây 65℃60 giây 45 [86, 89]Schlosser, 2014 50℃30 phút 95℃15 phút 95℃10 giây 55℃20 giây 72℃15 giây 45 [87, 88, 90]

HAstV

50℃60 phút 95℃10 phút 95℃15 giây 60℃60 giây 45 [70, 92]

Bảng 1.3 và Bảng 1.4 thể hiện thông tin về bộ mồi, mẫu dò và chu trình nhiệtcủa phản ứng Real-time RT-PCR sử dụng trong các nghiên cứu phát hiện NoV,HAV, HEV, HAstV trên thế giới Hiện nay, các bộ mồi xác định NoV GI, NoV GII

và HAV đã được mô tả trong quy trình chuẩn ISO 15216-1:2013; theo đó phản ứngReal-time RT-PCR xác định NoV GI và NoV GII sử dụng bộ mồi hướng tới vùnggiao nhau giữa ORF1 và ORF2, trong khi bộ mồi xác định HAV tập trung vào vùng5’NCR, đều là vùng bảo thủ của các chủng vi rút này Các bước của phản ứng Real-time RT-PCR gồm: phản ứng phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 55℃trong

60 phút, hoạt hóa enzyme polymerase ở nhiệt độ 95℃trong 5 phút, tiếp đến thựchiện 45 chu kỳ với 3 bước chuyển nhiệt: biến tính ở 95℃trong 15 giây, bắt cặp ở60℃trong 60 giây và kéo dài mạch ở 65℃trong 60 giây

Đối với HEV, theo kết quả khảo sát của Tổ chức Y tế thế giới WHO(World Health Organization), bộ mồi được thiết lập năm 2006 bởiJothikumar [86] khuếch đại đoạn gen với kích thước 69bp ở vùng ORF3 là

bộ mồi được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu phát hiện HEV [93].Năm 2013, trong nghiên cứu so sánh 5 bộ mồi phát hiện HEV khác nhau,Mokhtari đã chỉ ra bộ mồi của Jothikumar năm 2006 chính là bộ mồi có độnhạy cao nhất, cho phép phát hiện cả 7 kiểu gen của HEV [94] Năm 2021,

bộ mồi của Jothikumar cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu củaMacaluso tại Ý để phân tích HEV trên mẫu NTHMV với chu trình nhiệt củaphản ứng Real-time RT-PCR hoàn toàn tương tự chu trình của ISO 15216,chỉ khác biệt ở nhiệt độ giai đoạn phiên mã ngược [89] Ngoài bộ mồi củaJothikumar năm 2006, bộ mồi của Schlosser thiết kế năm 2014 [87] khuếchđại 81bp ở vùng ORF3 của HEV cũng là một bộ mồi được ứng dụng trongnhiều nghiên cứu [93] Đáng chú ý, nghiên cứu của Cuevas-Ferrando tại TâyBan Nha năm 2020 sử dụng cùng lúc hai bộ mồi của tác giả Jothikumar vàSchlosser để phát hiện HEV trong mẫu nước thải với quy trình tham khảoquy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 [88] Ở nghiên cứu này, tác giả Cuevas-Ferrando đã thực hiện tối ưu quy trình Real-time RT-PCR và có một số khácbiệt so với quy trình chuẩn như: nhiệt độ và thời gian của giai đoạn phiên mãngược (nhiệt độ và thời gian thấp hơn so với quy trình chuẩn); thời gian củagiai đoạn hoạt hóa enzyme polymerase (so với quy trình chuẩn, thời gian dàihơn với bộ mồi của Schlosser và rút ngắn hơn với bộ mồi của Jothikumar);nhiệt độ, thời gian của bước bắt cặp mồi và kéo dài mạch (so với quy trìnhchuẩn, bộ mồi của Schlosser có nhiệt độ bắt cặp thấp hơn và nhiệt độ kéo dài