Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh
Định nghĩa
Kháng sinh là các hợp chất do vi sinh vật sản sinh hoặc được tổng hợp hóa học, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các tác nhân gây bệnh với nồng độ rất thấp.
Cơ chế tác dụng
Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động sẽ phát huy tác dụng bằng cách:
- Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ví dụ nhóm penicillin, nhóm cephalosporin, vancomycin
Gây rối loạn chức năng màng nguyên tương, đặc biệt là chức năng thẩm thấu chọn lọc, dẫn đến sự thoát ra ngoài của các thành phần ion bên trong tế bào Các loại kháng sinh như polymyxin và daptomycin có thể gây ra hiện tượng này.
- Ức chế sinh tổng hợp protein, ví dụn nhóm aminoglycoside, nhóm macrolid
- Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic, ví dụ nhóm quinolon
- Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hoá cần thiết cho tế bào như kháng sinh nhóm sulfamid [6]
Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Sự đề kháng kháng sinh
Kháng sinh có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn, nhưng khi vi khuẩn vẫn phát triển trong môi trường có kháng sinh, hiện tượng này được gọi là đề kháng kháng sinh Vi sinh vật đa kháng kháng sinh (MDRO) chủ yếu là các vi khuẩn có khả năng kháng một hoặc nhiều loại kháng sinh Một số vi khuẩn, như tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) hay vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE), mặc dù chỉ kháng một loại kháng sinh, vẫn được coi là đa kháng kháng sinh.
1.1.3.1 Phân loại đề kháng kháng sinh
Có 2 loại đề kháng: là đề kháng giả và đề kháng thật
Đề kháng giả là tình trạng có biểu hiện giống như đề kháng nhưng không phải do nguyên nhân di truyền Khi kháng sinh được đưa vào cơ thể, hiệu quả của nó phụ thuộc vào ba yếu tố: kháng sinh, người bệnh và vi khuẩn Đề kháng giả có thể xuất phát từ một trong ba yếu tố này hoặc là sự kết hợp của hai hoặc cả ba yếu tố.
- Đề kháng thật: có 2 loại là đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được
Đề kháng tự nhiên của vi khuẩn là khả năng không bị ảnh hưởng bởi một số loại kháng sinh nhất định, ví dụ như P aeruginosa không nhạy cảm với penicillin G và S aureus không chịu tác dụng của colistin Ngoài ra, các vi khuẩn không có vách như Mycoplasma cũng không bị tác động bởi các kháng sinh beta-lactam, vốn ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào Đề kháng tự nhiên thường mang tính chất đặc trưng cho từng loại vi khuẩn cụ thể.
Đề kháng thu được ở vi khuẩn xảy ra khi một biến cố di truyền, như đột biến hoặc nhận gen đề kháng, biến vi khuẩn từ trạng thái nhạy cảm thành có khả năng kháng kháng sinh Các gen đề kháng có thể tồn tại trên nhiễm sắc thể, plasmid hoặc transposon của vi khuẩn, và thường mang tính chất riêng biệt của từng cá thể trong loài Đề kháng thu được là yếu tố chính góp phần vào tình hình kháng kháng sinh hiện nay Nghiên cứu về kháng kháng sinh tập trung vào việc phân tích những biến đổi di truyền của vi khuẩn do đề kháng thu được, nhằm hiểu rõ hơn về cách thức thay đổi tính đề kháng của chúng.
1.1.3.2 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn
Sự chọn lọc tự nhiên dẫn đến các đột biến gen nhằm thích nghi với môi trường, đặc biệt là trong bối cảnh kháng kháng sinh Hầu hết các kháng sinh hiện có trong lâm sàng đều phát sinh từ các đột biến gen hoặc biến đổi của các gen biểu hiện, gây ra tình trạng kháng thuốc Hiểu rõ về sinh học và gen học của kháng kháng sinh là yếu tố quan trọng để hạn chế sự lây lan của kháng kháng sinh và cải thiện hiệu quả điều trị lâm sàng.
Vi khuẩn thích ứng và phát triển khả năng kháng kháng sinh chủ yếu thông qua hai cơ chế gen học: đột biến gen, liên quan đến hoạt động của thuốc kháng sinh, và tiếp nhận DNA mã hóa gen kháng từ bên ngoài qua lây truyền ngang (Horizontal Gene Transfer - HGL).
Từ các gen kháng kháng sinh này sẽ tổng hợp ra các protein chức năng, tạo ra các cơ chế kháng khác nhau [69]
1.1.3.3 Đột biến kháng thuốc Đột biến kháng thuốc xảy ra khi có một tập hợp nhỏ trong quần thể vi khuẩn nhạy cảm với thuốc kháng sinh phát triển các đột biến gen ảnh hưởng tới hoạt động của thuốc kháng sinh Nhóm vi khuẩn này vẫn tồn tại khi có mặt của thuốc kháng sinh Khi đột biến xảy ra, kháng sinh đã loại bỏ hết quần thể nhạy cảm và chỉ còn các vi khuẩn kháng kháng sinh chiếm ưu thế Các đột biến kháng thuốc thông qua các cơ chế sau:
- Làm thay đổi đích tác động
Vi khuẩn có khả năng thay đổi vị trí tác động của kháng sinh, dẫn đến việc kháng sinh không còn hiệu quả Chẳng hạn, A baumannii kháng lại imipenem, trong khi P aeruginosa kháng ticarcillin và imipenem do sự biến đổi trong cấu trúc gắn kết protein của chúng.
Kháng sinh nhóm quinolon hoạt động bằng cách ức chế gen mã hóa enzym ADN gyrase và topoisomerase IV trong tế bào vi khuẩn Một ví dụ điển hình là tính kháng quinolon của S typhi, xảy ra do đột biến điểm trong các gen mã hóa enzym này trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn.
- Thay đổi các con đường chuyển hóa thông qua sự thay đổi mạng lưới điều hòa
Enzym là những chất xúc tác sinh học có khả năng biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của kháng sinh Điển hình là enzym beta-lactamase, có khả năng phá hủy penicillin, đã được phát hiện trước khi kháng sinh này được sử dụng vào đầu những năm 1940 Sau đó, nhiều loại enzym beta-lactamase khác cũng đã được phát hiện, có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem Hiện tại, đã có hơn 890 loại enzym kháng kháng sinh được xác định, vượt quá số lượng kháng sinh đã được sản xuất, và phần lớn các gen mã hóa cho các enzym này nằm trên các plasmid, cho phép chúng dễ dàng truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác.
- Làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất, giảm sự hấp thu thuốc
Việc giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn là một cơ chế quan trọng trong sự kháng thuốc, đặc biệt là đối với tetracyclin, trong khi các vi khuẩn kháng nhóm aminoglycosid thường làm mất hệ thống vận chuyển qua màng Các kháng sinh beta-lactam xâm nhập vào vi khuẩn thông qua các kênh vận chuyển (porin), nhưng khi vi khuẩn biến đổi và mất các kênh này, sự tác động của nhóm kháng sinh này sẽ bị hạn chế.
Cơ chế bơm đẩy (efflux pump) của kháng sinh nhóm quinolon ở vi khuẩn E coli và P aeruginosa thường liên quan đến hệ thống vận chuyển ion qua màng tế bào.
Vi khuẩn đã phát triển các cơ chế kháng thuốc phức tạp để chống lại tác động của kháng sinh qua hàng trăm năm tiến hóa tự nhiên Sự đề kháng với kháng sinh xảy ra qua nhiều con đường khác nhau, với mỗi loài vi khuẩn có cơ chế kháng ưu tiên riêng Chẳng hạn, vi khuẩn sản sinh enzym beta-lactamase để kháng thuốc, trong khi vi khuẩn gram dương lại biến đổi vùng gắn kháng sinh trên vách, cụ thể là penicillin-binding proteins (PBPs).
Hình 1.2: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn
1.1.3.4 Lây truyền ngang từ gen chuyển (Horizontal Gene Transfer-HGT)
Việc tiếp nhận DNA mã hóa gen kháng kháng sinh từ môi trường bên ngoài qua lây truyền ngang là một hiện tượng phổ biến trong kháng kháng sinh Vi khuẩn có khả năng thu nhận các gen kháng kháng sinh thông qua ba cơ chế chính: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp.
Biến nạp là hình thức tiếp nhận DNA ngoại lai đơn giản, nhưng chỉ một số vi khuẩn tự nhiên có khả năng này để phát triển tính kháng Sự lây lan vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện thường liên quan đến cơ chế tiếp hợp, một phương pháp chuyển gen hiệu quả qua tiếp xúc giữa tế bào cho và tế bào nhận thông qua pili giới tính, đặc biệt phổ biến ở đường tiêu hóa dưới khi sử dụng kháng sinh Tiếp hợp sử dụng các yếu tố di truyền động (MGEs) để chia sẻ thông tin di truyền, trong đó có yếu tố kháng kháng sinh Plasmid và transposon là hai MGEs quan trọng, đóng vai trò chủ chốt trong sự phát triển và lây lan vi khuẩn kháng thuốc Một trong những cơ chế hiệu quả để tích lũy gen kháng là thông qua integron, cho phép integraz chèn các cassette gen vào nhiễm sắc thể với trình tự ADN đặc biệt, giúp biểu hiện các gen mới.
Hình 1.3: Các cơ chế truyền gen ngang: tiếp hợp (A), biến nạp (B), tải nạp (C) và thông qua các yếu tố truyền gen (D)
(nguồn: Christian von Wintersdorff (2016), Dissemination of Antimicrobial Resistance in Microbial
Ecosystems through Horizontal Gene Transfer)[102]
Các nguyên nhân gây gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
1.1.4 Các nguyên nhân gây gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
Tốc độ gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh đang diễn ra nhanh chóng trên toàn cầu và tại Việt Nam, đe dọa hiệu quả điều trị và làm tăng gánh nặng bệnh truyền nhiễm Nhiều nguyên nhân góp phần vào sự gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng thuốc, và có thể khái quát các yếu tố nguy cơ liên quan đến tình trạng này.
1.1.4.1 Lạm dụng sử dụng kháng sinh
Lạm dụng kháng sinh trong cộng đồng đang trở thành vấn đề nghiêm trọng, đặc biệt ở các quốc gia đang phát triển, nơi mà kháng sinh có thể dễ dàng mua mà không cần đơn thuốc Tại Việt Nam, tỷ lệ sử dụng kháng sinh không kê đơn lên tới 55,2%, trong khi ở Bangladesh là 45,7% và tại Grana là 36,1% Việc tự điều trị bằng kháng sinh không đúng cách đang góp phần làm gia tăng kháng thuốc, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng.
Thiếu kiến thức về việc sử dụng kháng sinh có thể dẫn đến những sai lầm nghiêm trọng như quên uống thuốc, ngừng điều trị khi cảm thấy tốt hơn, hoặc sử dụng kháng sinh khi không có nhiễm khuẩn Điều này có thể gây ra tình trạng kháng thuốc và làm giảm hiệu quả của các phương pháp điều trị Hơn nữa, việc không đủ khả năng chi trả cho một đợt điều trị đầy đủ cũng có thể khiến vi khuẩn không bị tiêu diệt hoàn toàn, dẫn đến nguy cơ tái phát bệnh.
* Sử dụng kháng sinh trong bệnh viện
Nhiễm khuẩn bệnh viện là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tính kháng kháng sinh của vi khuẩn toàn cầu, tạo điều kiện cho sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh không chỉ trong bệnh viện mà còn ra ngoài cộng đồng Quản lý chất thải bệnh viện là vấn đề cần chú ý, với nhiều nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy nước thải bệnh viện không qua xử lý được thải trực tiếp ra cống sinh hoạt, đồng ruộng và sông ngòi Thiếu nước cho vệ sinh và việc thải rác sinh hoạt gần nguồn nước làm tăng nguy cơ lây lan các tác nhân gây bệnh, bao gồm vi khuẩn kháng kháng sinh, ra ngoài cộng đồng.
* Do sử dụng kháng sinh không hợp lý
Khi sử dụng kháng sinh sẽ tạo ra áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng thuốc
Sử dụng kháng sinh không hợp lý và thường xuyên làm gia tăng nguy cơ kháng kháng sinh ở vi khuẩn Tại các quốc gia đang phát triển, thầy thuốc thường kê đơn kháng sinh dựa trên kinh nghiệm, với liều cao và kéo dài, mà không dựa vào kết quả xét nghiệm Áp lực từ bệnh nhân khiến thầy thuốc phải kê đơn kháng sinh ngay cả khi không có chỉ định điều trị Ngoài ra, nhiều người tin rằng kháng sinh tiêm có hiệu quả hơn kháng sinh uống, dẫn đến việc sử dụng rộng rãi kháng sinh tiêm mặc dù chỉ cần điều trị bằng kháng sinh uống thông thường.
1.1.4.2 Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi
Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách ở người đã dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh, nhưng ảnh hưởng của việc sử dụng kháng sinh ở động vật cũng không kém phần nghiêm trọng Nhiều câu hỏi khó khăn cần được giải quyết liên quan đến việc đánh giá mối liên hệ giữa sự lây truyền vi khuẩn kháng kháng sinh qua chuỗi thức ăn, chẳng hạn như cách xác định tỷ lệ kháng kháng sinh từ động vật sang người và cơ chế lây truyền kháng kháng sinh giữa hai đối tượng này.
Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi đang làm gia tăng tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn, với khoảng 50% lượng kháng sinh sản xuất ra ở Bắc Mỹ và Châu Âu được dùng trong thức ăn cho gia súc và gia cầm Đa số kháng sinh này được sử dụng như phụ gia để phòng bệnh và tăng trọng, bất chấp sức khỏe của động vật, dẫn đến sự kháng thuốc của các vi khuẩn như Salmonella và E coli, từ đó có thể gây bệnh cho con người qua thực phẩm Tại Đan Mạch, năm 1994, trong khi chỉ 24kg vancomycin được sử dụng cho con người, thì có đến 24.000 kg apoparcin, một dẫn xuất của vancomycin, được dùng trong chăn nuôi, cho thấy mối liên hệ giữa việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc.
Enterococcus faecium kháng vancomycin là một chủng vi khuẩn nguy hiểm, thường được phát hiện ở người do tiêu thụ các sản phẩm thịt bị ô nhiễm Sự cấm sử dụng apoparcin tại Đan Mạch vào năm 1995, Đức vào năm 1996 và toàn Liên minh châu Âu vào năm 1997 đã dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ nhiễm khuẩn này.
Sự giảm rõ rệt của Enterococcus faecium kháng vancomycin trên người cho thấy khả năng kiểm soát sự gia tăng của vi khuẩn kháng thuốc thông qua việc sử dụng kháng sinh Vấn đề kháng kháng sinh không chỉ xảy ra giữa người với người hay giữa động vật với động vật, mà còn liên quan đến một “hệ sinh thái” bao gồm động vật, thức ăn, môi trường và con người Các gen kháng kháng sinh của vi khuẩn tồn tại trong nhiều môi trường khác nhau, và nghiên cứu cho thấy kháng kháng sinh từ động vật có thể có nguồn gốc từ người và ngược lại Sự lây lan này diễn ra qua “chuỗi thức ăn”, tuy nhiên, việc đánh giá mức độ lây lan của nó gặp nhiều khó khăn.
Tình trạng lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi tại Việt Nam đang trở nên phổ biến, khi người dân thường cho lợn và gà ăn cám có chứa kháng sinh để phòng bệnh mà không kiểm soát liều lượng Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách sẽ dẫn đến sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc Hơn nữa, nếu thịt động vật được tiêu thụ khi vẫn còn dư lượng kháng sinh, người tiêu dùng sẽ vô tình hấp thụ những chất này vào cơ thể.
Theo nghiên cứu của Dương Thị Toan và cộng sự, 100% trong số 20 trang trại chăn nuôi được khảo sát tại tỉnh Bắc Giang đã sử dụng kháng sinh cho mục đích phòng ngừa và điều trị bệnh.
Trong ngành chăn nuôi thịt lợn, có 17 loại kháng sinh được sử dụng, trong đó 6 loại phổ biến nhất bao gồm Norfloxacine (60,0%), Tylosine (60,0%), Gentamycine (55,0%), Colistine (45,0%), Enrofloxacine (40,0%) và Streptomycine (35,0%) Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh cho vật nuôi tại các trang trại hiện nay vẫn chưa được quản lý chặt chẽ và hợp lý Một nghiên cứu cho thấy có đến 50% mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt và gà thịt phát hiện ít nhất một loại kháng sinh, với tỷ lệ phát hiện các loại kháng sinh như Tylosine (20-30%), Sulfadiazine (30-40%), Chlortetracycline (20-30%), Doxycycline (0-30%) và Sulfamethazine (10-20%).
Nghiên cứu của Phạm Kim Đăng và cộng sự tại Hải Phòng chỉ ra rằng kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi gà, không chỉ để phòng và trị bệnh mà còn để kích thích sinh trưởng ở liều thấp Tuy nhiên, nhận thức của người chăn nuôi về việc sử dụng kháng sinh còn hạn chế, cùng với quản lý hành chính trong sản xuất và kinh doanh chưa hiệu quả, dẫn đến tỷ lệ hộ có nhận thức đúng và sử dụng an toàn kháng sinh vẫn rất thấp.
Hình 1.4: Lây truyền kháng kháng sinh qua chuỗi thức ăn
1.1.4.3 Một số các nguyên nhân khác
• Chất lượng kháng sinh kém
Khi bảo quản kháng sinh ở nhiệt độ trên 25°C, hoạt tính của chúng sẽ bị giảm, và kháng sinh quá hạn sử dụng hoặc có hàm lượng thấp không chỉ không tiêu diệt được vi khuẩn gây bệnh mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc Thêm vào đó, nhiều kháng sinh bán tại các nước đang phát triển không đạt đủ hàm lượng như ghi trên nhãn, với thành phần chủ yếu là bột mì trong các loại thuốc giả Theo nghiên cứu, khoảng 65% trong số 751 hoạt chất đã bị làm giả tại hơn 28 quốc gia trên thế giới.
• Gia tăng sự đi lại quốc tế
Sự phát triển kinh tế và du lịch quốc tế đã thúc đẩy gia tăng di chuyển giữa các quốc gia, dẫn đến việc lây lan các chủng vi khuẩn kháng thuốc Chẳng hạn, vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 ở Anh đã có nguồn gốc từ Ấn Độ, cho thấy mối liên hệ rõ ràng giữa du lịch và sự lây lan của kháng sinh.
• Hệ thống giám sát kháng sinh
Colistin
Colistin (polymyxin E) là một hỗn hợp gồm các chuỗi polypeptide colistin A và B, được phát hiện lần đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1949 Chất này được tách ra từ quá trình lên men của vi khuẩn Bacillus polymyxa var colistinus, một chủng vi khuẩn có mặt trong mẫu đất của tỉnh.
Kể từ khi được đưa vào lâm sàng năm 1959, colistin đã được sử dụng để điều trị các nhiễm khuẩn do vi khuẩn gram âm Tuy nhiên, do tác dụng phụ không mong muốn như độc tính trên thận và thần kinh, colistin dần bị thay thế bởi kháng sinh aminoglycosid Điều này dẫn đến việc sử dụng colistin trong lâm sàng giảm đáng kể từ đầu những năm 1970 đến đầu những năm 2000.
Sự gia tăng của các vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc như P aeruginosa, A baumannii và K pneumonia, cùng với sự xuất hiện của các chủng siêu kháng thuốc mang gen NDM-1, đã dẫn đến việc colistin được sử dụng trở lại như một "lựa chọn tối ưu" cho các trường hợp vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1, kháng lại toàn bộ các kháng sinh khác.
Colistin đang được sử dụng trở lại như một “lựa chọn tối ưu” cho các trường hợp nhiễm khuẩn gram âm kháng toàn bộ kháng sinh khác, nhờ vào việc nó không được kê đơn phổ biến trong thời gian dài, giúp bảo toàn hiệu quả điều trị Colistin vẫn giữ vai trò là bức tường thành vững chắc chống lại vi khuẩn, đặc biệt trong bối cảnh các gen đề kháng như NDM-1, OXA và KPC đang gia tăng, khiến vi khuẩn trở nên bất trị với carbapenems – kháng sinh ưu tiên cho nhiễm khuẩn gram âm như E coli và Klebsiella spp Do đó, colistin trở thành lựa chọn cuối cùng để đối phó với tình trạng kháng thuốc nghiêm trọng hiện nay.
Các polymyxin có tác dụng diệt khuẩn ngay cả với tế bào ở trạng thái nghỉ, thuốc làm thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng tế bào
Colistin tác động chủ yếu lên màng tế bào vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn gram âm, thông qua việc liên kết với lipopolysaccharid (LPS) và phospholipid Cơ chế này giúp colistin tiêu diệt vi khuẩn bằng nhiều cách khác nhau, bao gồm sự can thiệp vào cấu trúc màng tế bào.
Mg 2+ là hai ion có vai trò quan trọng trong việc ổn định phân tử LPS Colistin, một phân tử cationic, cạnh tranh với các cation này để thay thế chúng từ nhóm phosphate của màng lipid, dẫn đến sự gián đoạn màng ngoài tế bào và rò rỉ các chất bên trong, gây chết vi khuẩn Thuốc cũng liên kết với lipid A, một phần của nội độc tố trong phân tử LPS, và nhiều nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng colistin có khả năng ngăn chặn tác dụng và độc tính của vi khuẩn.
Một số báo cáo cho thấy polymyxin có thể hoạt động qua cơ chế khác ngoài việc tác động lên màng tế bào vi khuẩn, do đó, cơ chế chính xác mà colistin tiêu diệt vi khuẩn vẫn chưa được làm rõ.
Hình 1.5: Cơ chế tác dụng của colistin trên màng vi khuẩn gram âm
1.1.5.2 Phổ tác dụng của colistin
Thuốc kháng lại hầu hết các trực khuẩn hiếu khí Gram (-), bao gồm
Acinobacter (MIC = 0,25 – 1μg/ml), P aeruginosa, Klebsiella spp, Enterobacter,
E coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Yersinia pseudotuberculosis, Morganella morganii và Haemophilus influenzae Phần lớn các loại vi khuẩn nhạy cảm có MIC từ 0,01 đến 4μg/ml Đối với các chủng P aeruginosa nhạy cảm với thuốc, nồng độ
Natural resistance to colistin is observed in various bacteria, including Gram-positive bacteria, Gram-negative cocci, Proteus, Providencia, Mycobacteria, and anaerobic bacteria Colistin is primarily effective against Gram-negative bacteria in the lungs, specifically targeting pathogens such as Pseudomonas aeruginosa, E coli, Klebsiella, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Haemophilus, Bordetella pertussis, Pasteurella, Citrobacter, and Acinetobacter.
1.1.5.3 Sự đề kháng với colistin
Vi khuẩn gram âm có khả năng phát triển sự đề kháng với colistin thông qua hai cơ chế chính: đột biến và thích nghi Đột biến là quá trình di truyền xảy ra ở mức độ thấp và không cần sự hiện diện liên tục của kháng sinh, trong khi thích nghi yêu cầu điều kiện kháng sinh thường xuyên Đáng lưu ý, hầu hết các vi khuẩn này cho thấy sự đề kháng chéo hoàn toàn giữa colistin và polymycin B.
Nghiên cứu về sự đề kháng với polymycin của P aeruginosa cho thấy rằng sự thay đổi của màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm sự thay đổi trong LPS, nồng độ protein đặc hiệu, thành phần Mg2+ và Ca2+ của vỏ tế bào, cũng như lipid, liên quan đến sự hình thành đề kháng Một nghiên cứu gần đây trên loài Yersinia chỉ ra rằng hệ thống bơm Kali ra ngoại bào có thể liên quan đến đề kháng đối với polymycin B Mặc dù chưa có báo cáo về cơ chế enzym của vi khuẩn đối với colistin, nhưng B polymyxa phân loài Colistinus được biết đến là có khả năng sản xuất colistinase, gây bất hoạt colistin.
1.1.5.4 Tình hình sử dụng colistin
Colistin đã bị cấm sử dụng cho con người từ những năm 1970 do độc tính cao trên thận Tuy nhiên, nhờ hiệu quả trong việc điều trị các chủng vi khuẩn gram âm, colistin được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để phòng bệnh và tăng trưởng Kể từ năm 2000, colistin đã trở lại lâm sàng, đặc biệt cho các trường hợp nhiễm trùng do vi khuẩn gram âm đa kháng.
Colistin, một loại kháng sinh, đã được phê duyệt sử dụng trong chăn nuôi gà tại Mỹ từ năm 1998, nhưng không được cấp phép ở Canada Tuy nhiên, nông dân có thể tự nhập khẩu colistin mà không cần giấy phép, dẫn đến việc sử dụng rộng rãi trong sản xuất thịt lợn Tại EU, colistin đã được phép sử dụng từ những năm 1950, chủ yếu để kiểm soát vi khuẩn gram âm trong gia súc, gia cầm, cừu, dê và thỏ Trung Quốc là quốc gia tiêu thụ colistin lớn nhất, với khoảng 90% trong số 17,5 triệu tấn sản xuất vào năm 2014 được sử dụng trong nông nghiệp Trong khi đó, tại 22 nước châu Âu, tiêu thụ polymyxins, bao gồm colistin, trong thực phẩm động vật đạt 545,2 tấn vào năm 2012, với sự đa dạng lớn giữa các quốc gia Việc lạm dụng colistin trong chăn nuôi đã dẫn đến sự phát triển của siêu vi khuẩn kháng thuốc, gây ra mối lo ngại về sức khỏe cộng đồng.
Tại Việt Nam, việc kiểm soát sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi vẫn còn nhiều hạn chế Nghiên cứu của Nguyễn T Nhung và cộng sự tại 12 trang trại chăn nuôi lợn và gà ở Tiền Giang cho thấy, để sản xuất 1 kg thịt gà và lợn, trung bình lần lượt là 94,7 mg và 563,6 mg kháng sinh được sử dụng Trong số 8 loại kháng sinh quan trọng, có 3 loại đã được sử dụng trên trang trại lợn Đặc biệt, tỷ lệ E coli phân lập cho thấy kháng ampicillin cao, điều này cảnh báo về nguy cơ kháng thuốc trong chăn nuôi.
Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng sinh ở gà và lợn lần lượt là 97,8% và 94,4%, với các loại kháng sinh như ciprofloxacin (73,3% và 21,1%), gentamicin (42,2% và 35,6%), colistin (22,2% và 24,4%) Gen kháng colistin mcr-1 đã được phát hiện với tỷ lệ 19-22% Theo nghiên cứu của Dương Thị Toan (2014) tại Bắc Giang, việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi chưa được quản lý chặt chẽ, phụ thuộc vào khuyến cáo của công ty sản xuất và kinh nghiệm người chăn nuôi Có hơn 17 loại kháng sinh được sử dụng, trong đó Norfloxacine và Tylosine đều chiếm 60% Nghiên cứu của Phạm Kim Đăng tại Hải Phòng cho thấy người chăn nuôi sử dụng ít nhất 38 loại kháng sinh từ hơn 10 nhóm khác nhau, không chỉ để phòng trị bệnh mà còn với liều thấp để kích thích sinh trưởng Các kháng sinh như salinomycin và chlortetracycline được sử dụng phổ biến để tăng trưởng bằng cách trộn vào thức ăn.
Vi khuẩn gram âm đường ruột và thực trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gram âm đường ruột
Vi khuẩn gram âm đường ruột
Vi khuẩn gram âm đường ruột thuộc họ Enterobacteriaceae có hình dạng que, chiều dài từ 1 μm đến 5 μm Chúng là các trực khuẩn gram âm hiếu kị khí tùy tiện, không lên men oxidase, có khả năng lên men đường glucose và có thể di động hoặc không di động Các loài gây bệnh phổ biến ở người bao gồm nhiều loại khác nhau.
Salmonella, Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella và Shigella đều là những vi khuẩn gây bệnh nghiêm trọng Trong số đó, E coli nổi bật như một loại trực khuẩn đường ruột, thường hiện diện trong hệ tiêu hóa của người và động vật Đây là vi khuẩn phổ biến nhất trong nhóm vi khuẩn ái khí của đường tiêu hóa, mang lại nhiều lợi ích nhưng cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây hại cho sức khỏe con người.
Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram âm đường ruột hiện nay
Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram âm đường ruột, đặc biệt là với nhóm kháng sinh β-lactam, đang gia tăng đáng kể do sự xuất hiện của các gen di động mã hóa enzym biến đổi thuốc Dưới áp lực chọn lọc, các vi khuẩn này đã chuyển từ cơ chế đề kháng tự nhiên như bơm đẩy và giảm tính thấm màng sang cơ chế đề kháng thông qua các gen di động, dẫn đến sự lây truyền ngang và mở rộng dịch tễ, đặc biệt là đối với vi khuẩn E coli.
K pneumoniae – nguyên nhân chính gây nhiễm trùng huyết hiện nay Những ổ vi khuẩn chứa gen chuyển kháng kháng sinh thường khó quan sát sự thay đổi về kiểu hình nên việc theo dõi và kiểm soát sự đề kháng carbapenem lại đặc biệt trở nên khó khăn đối với họ vi khuẩn Enterobacteriaceae [48]
Vi khuẩn gram âm đường ruột có khả năng gây ra nhiễm trùng nghiêm trọng như nhiễm khuẩn huyết, và nhiều vi khuẩn trong nhóm này đang trở nên kháng với các kháng sinh hiện có, đặc biệt là các chủng vi khuẩn sinh ESBL Hơn nữa, nhiều gen kháng kháng sinh đã được phát hiện, bao gồm các enzym kháng carbapenem (CRE), như KPC, OXA-48 và NDM-1, mà carbapenem được coi là “nhóm lựa chọn ưu tiên” trong điều trị nhiễm khuẩn gram âm đường ruột.
Gần đây, đã xuất hiện các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1, cho thấy khả năng kháng colistin - kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” dành cho các nhiễm khuẩn gram âm kháng hầu hết các loại kháng sinh khác.
Các chủng vi khuẩn gram âm đường ruột kháng kháng sinh hiện diện không chỉ trong bệnh viện mà còn trong môi trường sống và thực phẩm hàng ngày.
Đặc điểm vi sinh vật học và tình hình kháng colistin của E coli
Đặc điểm vi sinh vật học
Họ Escherichia, được phát hiện lần đầu tiên bởi Escherich vào năm 1885, là đại diện tiêu biểu cho họ vi khuẩn đường ruột, bao gồm nhiều loài khác nhau.
E coli, E adecarboxylase, E blattae, E fergusonii, E hermanii và E vulneris Trong số đó, E coli có vai trò quan trọng nhất và được chọn là loài điển hình của họ Escherichia
E coli là trực khuẩn Gram (-) Kớch thước trung bỡnh 2 đến 3 àm X 0,5 àm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn cố thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng E coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động
E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ, khí tuỳ tiện Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 40°C Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 – 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có váng mỏng, những ngày sau dưới đáy ống có thể thấy cặn
Sau 8 – 10 giờ trên môi trường thạch thường, khuẩn lạc có thể được quan sát bằng kính lúp Sau 24 giờ, kích thước khuẩn lạc đạt khoảng 1,5 mm, với hình thái điển hình dạng II, nhưng cũng có thể xuất hiện dạng R hoặc M.
E coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi Tất cả E coli đều lên men lactose và sinh hơi trừ ngoại lệ E coli loại EIEC
E coli có khả năng sinh indol, không sinh H2S Không sử dụng được nguồn carbon của citrat trong môi trường Simmons Có decarboxylase vì vậy có khả năng khử carboxyl của lysin, ornitin, arginin và acid glutamic Betagalactosidase dương tính Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) âm tính
• Kháng nguyên: Cấu trúc kháng nguyên của E coli rất phức tạp
Kháng nguyên O, một loại kháng nguyên than của vi khuẩn, là yếu tố quan trọng nhất, với bản chất là lipopolysaccharide Nó có khả năng chịu nhiệt và đóng vai trò là nội độc tố của vi khuẩn, với tổng cộng 170 yếu tố khác nhau.
Kháng nguyên K: Khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và được chia thành 3 loại: A, B và L trong đó kháng nguyên A, L chịu nhiệt, B không chịu nhiệt
Kháng nguyên H: là kháng nguyên long của vi khuẩn, có khoảng 40 type, không chịu nhiệt
Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E coli đựợc chia thành các type huyết thanh Dựa vào tính chất gây bệnh, E coli được chia thành 07 loại sau đây
EPEC (Entero pathogenic E coli): E coli gây bệnh đường ruột
ETEC (Entero toxigenic E coli): E coli sinh độc tố ruột
EIEC (Entero invasive E coli) E coli xâm nhập đường ruột
EAEC (Entero adherent E coli): E coli bám dính đường ruột
EHEC (Entero haemorrhagic E coli): E coli gây chảy máu đưòng ruột
UPEC (Uropathogenic E coli): E coli gây nhiễm khuẩn tiết niệu NMEC (New born meningitis E coli): E coli gây viêm màng não trẻ sơ sinh.
Các nghiên cứu về gen mcr-1 kháng colistin của E coli và các vi khuẩn
Vào đầu tháng 2/2015, nhóm nghiên cứu của Liu và cộng sự đã gây chấn động giới khoa học khi phát hiện gen mcr-1 kháng colistin ở vi khuẩn E coli, lây truyền qua plasmid, trong khi trước đó, kháng colistin chỉ được biết đến là lây truyền dọc do đột biến nhiễm sắc thể Qua phương pháp giải trình tự gen và so sánh mẫu, nhóm nghiên cứu đã chứng minh cơ chế lây truyền ngang của gen mcr-1 Gen này được phát hiện ở các chủng E coli và K pneumoniae thu thập từ 5 thành phố trong khoảng thời gian từ tháng 4/2011 đến 12/2014, với tỷ lệ nhiễm mcr-1 lần lượt là 15% ở mẫu thịt sống, 21% ở động vật và 1% ở bệnh nhân nội trú.
Kể từ phát hiện đầu tiên của Liu và cộng sự, đã có ít nhất 30 quốc gia trên toàn thế giới, thuộc tất cả các châu lục, tiến hành nghiên cứu về chủng vi khuẩn mang gen mcr-1 Dưới đây là một số nghiên cứu tiêu biểu mà tác giả đã ghi nhận.
Hình 1.6: Biểu đồ phân bố các nước có vi khuẩn mang gen mcr-1 kháng colistin
Nghiên cứu của Ajum MF và cộng sự phát hiện các chủng E coli và Salmonella mang gen mcr-1 tại một trang trại lợn ở Anh Đặc biệt, chủng E coli này không chỉ mang enzym sinh ESBLs mà còn chứa plasmid mang gen mcr-1 là ISApII.
Fernandes MR và các cộng sự đã phân lập thành công một chủng E coli mang gen mcr-1 từ bệnh nhân tiểu đường bị nhiễm trùng bàn chân tại Brazil Nghiên cứu này bao gồm phân tích toàn bộ bộ gen từ động vật và môi trường, góp phần quan trọng trong việc hiểu biết về sự lây lan của kháng kháng sinh.
Chủng E coli với kiểu chuỗi (ST) 101 và plasmid IncX4 đã được phát hiện gần đây trong họ Enterobacteriaceae từ thực phẩm, động vật và các mẫu người trên nhiều lục địa khác nhau.
Nghiên cứu của Wong, Sally CY và cộng sự từ 8/12/2015 đến 8/1/2016 tại một bệnh viện đại học ở Hồng Kông đã giám sát các chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae và A baumannii mang gen mcr-1 Kết quả cho thấy có 05 chủng Enterobacteriaceae kháng colistin mang gen mcr-1 được phân lập từ bệnh nhân có tiền sử điều trị bằng colistin, trong đó 04 chủng là E coli, chiếm tỷ lệ 0,4% trong tổng số các chủng Enterobacteriaceae phân lập trên lâm sàng.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự hiện diện của các chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin trong nước thải tưới cây, chất thải từ trang trại nuôi lợn và thịt gà ở Tây Ban Nha, Đức, Nam Mỹ, cũng như từ người và thịt gà tại Thụy Sỹ Tại Đan Mạch, trong chương trình giám sát kháng sinh, các nhà nghiên cứu đã phát hiện một chủng E coli mang gen mcr-1 từ một bệnh nhân nhiễm trùng máu, đồng thời mang hai gen kháng thuốc ESBL (CTX-M-55) và AmpC (CMY-2) cephalosporinase Thêm vào đó, năm chủng E coli mang gen mcr-1 được phân lập từ năm mẫu thịt gà cũng có chứa một trong những gen kháng thuốc này.
2 hoặc cả 2 gen ESBL (SHV-12) và AmpC (CMY-2) cephalosporinase Các chủng từ người và động vật mang gen CTX-M-55 cũng giống với các chủng được phân lập từ Châu Á [19]
Tại Trung Quốc, sau khi phát hiện chủng E coli mang gen mcr-1 của Liu và cộng sự, Dan-xia Gua và các đồng nghiệp cũng đã tìm thấy chủng K pneumoniae và E coli mang gen MCR-1 được phân lập từ mẫu phân của một trẻ em bị tiêu chảy.
Nghiên cứu của Patrick McGann và cộng sự đã phát hiện chủng E coli sinh
ESBL mang gen mcr-1 được phân lập từ 1 bệnh nhân nhiễm trùng đường niệu tại
Một nghiên cứu tại Bangladesh đã phân lập thành công chủng E coli đầu tiên mang gen mcr-1 kháng colistin từ bùn thải đô thị Chủng vi khuẩn này còn cho thấy tính đa kháng thuốc, kháng với 11 loại kháng sinh khác nhau.
Nghiên cứu gần đây của Yao, Xu và cộng sự đã phát hiện chủng vi khuẩn E coli THSJ02 mang gen mcr-1, được phân lập từ mẫu cánh gà tại một siêu thị.
Chủng vi khuẩn từ Quảng Châu, Trung Quốc cho thấy khả năng kháng tất cả các loại kháng sinh trừ doxycycline và tigecycline Phân tích gen bằng phương pháp Sanger xác định chủng này thuộc kiểu ST 167, mang gen kháng colistin mcr-1 cùng với nhiều gen kháng kháng sinh khác như bla NDM-9, fosA3, rmtB, bla CTX-M-65 và floR Đặc biệt, sự hiện diện đồng thời của hai gen kháng mcr-1 và bla NDM-9 là một mối nguy hiểm đáng lưu ý trong nghiên cứu này.
NDM-9 trên chủng E coli trong thịt bán lẻ có thể lây truyền gen kháng kháng sinh vào cộng đồng qua đường tiêu hóa của con người, gây ra nguy cơ nghiêm trọng khi thuốc kháng sinh có thể không còn hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn gram âm Do đó, việc giám sát chặt chẽ việc sử dụng colistin ở cả người và động vật hiện nay là cực kỳ cần thiết và cấp bách.
Nghiên cứu ban đầu tại Việt Nam cho thấy nhóm nghiên cứu của chúng tôi và một số nhóm khác đã phát hiện các chủng E coli mang gen mcr-.
1 kháng colistin ở trong môi trường, thực phẩm, nước và ở người [9, 60]
Nghiên cứu của Surbhi Malhotra-Kumar và cộng sự đã thực hiện sàng lọc gen mcr-1 trên 24 chủng E coli sinh ESBL từ mẫu phết trực tràng của gà và lợn tại hai trang trại ở Văn Lâm, Hưng Yên và Hoài Đức, Hà Nội trong giai đoạn 2014-2015 Kết quả cho thấy 37,5% (9/24) chủng E coli từ gà và lợn mang gen mcr-1, tất cả đều kháng colistin với MIC là 4 mg/L.
8 mg/L Giải trình tự gen mcr-1 thấy 100% giống gen mcr-1 phát hiện ở Trung
Nghiên cứu chỉ xác định một số ít chủng E coli mang gen mcr-1 trong vật nuôi tại trang trại, nhưng chưa đánh giá khả năng lây lan vào nguồn nước, thức ăn và người nông dân Do đó, chưa có cái nhìn tổng quát về tỉ lệ E coli mang gen mcr-1 trong cộng đồng, bao gồm người, động vật nuôi, thức ăn và nước, cũng như cơ chế lan truyền của các chủng này Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào đặc tính sinh học phân tử để cung cấp cơ sở khoa học về cơ chế lây truyền của E coli mang gen mcr-1 kháng colistin từ các nguồn khác nhau ở vùng nông thôn Bắc Bộ.
Một số đặc điểm về gen mcr-1 và plasmid của các chủng E coli kháng colistin
Cơ chế kháng colistin ở một số chủng Enterobacteriaceae chủ yếu do đột biến di truyền, liên quan đến các thành phần pmrAB và phoPQ cùng với gen điều hòa mgrB Sự thay đổi lipid A trong vi khuẩn làm giảm ái lực của chúng với polymyxin.
Gần đây, Liu và các cộng sự đã phát hiện gen mcr-1 kháng colistin qua plasmid trong các chủng E coli và K pneumoniae từ phân động vật, thịt và bệnh phẩm ở Trung Quốc Gen mcr-1 mã hóa một phosphoethanolamine transferase, dẫn đến việc bổ sung phosphoethanolamine vào lipid A Kể từ báo cáo đầu tiên, đã có hơn 150 bài viết về mcr-1, cho thấy gen này đã tồn tại không bị phát hiện trong nhiều thập kỷ và phổ biến hơn ở động vật so với con người, đặc biệt là ở E coli, với tỷ lệ nhiễm đang gia tăng Gần đây, một gen kháng colistin thứ hai với 76,7% sự tương đồng nucleic với mcr-1 cũng đã được báo cáo từ Bỉ Mặc dù phần lớn các chủng mang mcr-1 vẫn nhạy cảm với các kháng sinh khác, nhưng tần suất thất bại trong điều trị colistin đối với các nhiễm trùng này vẫn chưa được ghi nhận Nghiên cứu của Liu cho thấy mcr-1 có khả năng tạo ra mức độ kháng colistin khác nhau trong các mầm bệnh gram âm của ESKAPE và dẫn đến biến đổi lipid A trong các chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng.
Cho đến nay, các nghiên cứu đã tìm ra các biến thể của gen mcr-1, kí hiệu từ mcr-1.1-mcr-1.10 [58, 65]
1.3.3.2 Cấu trúc plasmid mang gen mcr-1
Nghiên cứu của Liu và cộng sự đã sử dụng phương pháp giải trình tự gen để phân tích cấu trúc của 4 plasmid mang gen mcr-1 từ 04 chủng E coli kháng colistin.
Hình 1.7: Cấu trúc của 04 plasmid mang gen mcr-1 bằng giải trình tự của các chủng E coli phân lập được: pHNSHP45: plasmid từ chủng E coli của phân lợn; 03 plasmid khác
(pE15004, pE15015 và pE15017) được phân lập từ ba chủng E coli lâm sàng
Nghiên cứu về plasmid typing mang mcr-1 cho thấy các týp plasmid phổ biến hiện nay là: IncHI2, IncI2 và IncP [46]
Các kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh và các kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phát hiện các gen kháng kháng sinh
Kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh
Phương pháp này nhằm đánh giá độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh
Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Phương pháp này nhằm đánh giá độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh
Kháng sinh được đặt trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Meuler-Hinton có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh được thể hiện qua đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh Mặc dù kỹ thuật này đơn giản, dễ thực hiện và chi phí thấp, nhưng độ chính xác của nó không cao.
1.4.1.2 Kĩ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC)
Phương pháp này nhằm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu cần thiết để ức chế sự phát triển của vi khuẩn, từ đó hỗ trợ trong việc lựa chọn và tính toán liều lượng kháng sinh hiệu quả.
Nguyên lý của phương pháp này là nuôi cấy các chủng vi khuẩn thử nghiệm trên đĩa thạch Meuler-Hinton với nồng độ kháng sinh khác nhau Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định khi mật độ khuẩn lạc ≤ 3 Mặc dù đây là phương pháp chính xác để xác định tính nhạy cảm của kháng sinh đối với vi khuẩn, nhưng kỹ thuật phức tạp và thời gian thực hiện lâu khiến nó khó áp dụng trong lâm sàng.
Kỹ thuật E-test cho phép xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh bằng cách sử dụng thanh giấy chứa các phổ kháng sinh với nồng độ khác nhau Thanh giấy này được đặt lên đĩa thạch đã trải huyền dịch vi khuẩn, giúp phát hiện khả năng ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp nhất tại điểm gãy trên phổ kháng sinh Từ đó, bác sĩ có thể tính toán liều điều trị hiệu quả cho bệnh nhân.
Kỹ thuật E-test dễ thực hiện, cho kết quả nhanh, chính xác nhưng khá đắt tiền.
Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh
Plasmid là một yếu tố ADN ngoài nhiễm sắc thể, phổ biến ở hầu hết các chủng vi khuẩn, và có thể được xác định qua quy trình ly giải tế bào và điện di trên thạch Plasmid đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng kháng sinh, vì phần lớn các gen kháng kháng sinh của vi khuẩn nằm trên plasmid và có khả năng lây truyền giữa các loài vi khuẩn thông qua quá trình tiếp hợp.
Bảng 1.2 Ví dụ một số lasmid mang gen kháng kháng sinh [27, 28, 80, 55]
Vi khuẩn Loại plasmid Gen kháng kháng sinh trên plasmid
Khả năng truyền plasmid kháng kháng sinh*
E coli FII; A/C; B/O bla CTX-M-, bla SHV, bla TEM- và NDM-1 Có
Citrobacter A/C, L/M ArmA, DHA, SHV Có
Các tác giả đã thành công trong việc thử nghiệm khả năng truyền plasmid kháng kháng sinh trong phòng thí nghiệm Các chủng vi khuẩn "cho" mang plasmid kháng kháng sinh, trong khi các chủng "nhận" bao gồm E coli J53 và DH5-α.
Việc phát hiện và phân loại plasmid dựa vào đặc tính gen và các gen ổn định, đặc biệt là gen quy định sự nhân lên của plasmid Năm 1971, Hedges và cộng sự lần đầu tiên đưa ra khái niệm phân loại plasmid dựa trên tính ổn định trong quá trình tiếp hợp Đến năm 1988, Couturier và cộng sự đã áp dụng kỹ thuật Southern-blotting để phân loại plasmid, nhưng phương pháp này có độ đặc hiệu thấp và phức tạp, không phù hợp cho phân tích số lượng mẫu lớn Năm 2005, Carattoli và cộng sự phát triển kỹ thuật PCR-based replicon typing, giúp khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu của plasmid quan trọng trong vi khuẩn đường ruột Kỹ thuật này hiện đang được sử dụng để phân loại plasmid mang gen kháng kháng sinh, tuy nhiên vẫn còn hạn chế trong việc phân loại các plasmid thuộc nhóm Inc cổ điển.
1.4.2.2 Kỹ thuật Southern blotting phát hiện plasmid mang gen kháng kháng sinh Đây là kỹ thuật được áp dụng rộng rãi để phát hiện các plasmid mang gen kháng kháng sinh
Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng enzym S1 để cắt các ADN mạch đơn của vi khuẩn, đồng thời giữ lại plasmid Sau đó, plasmid được điện di trên thạch và chuyển sang màng để phát hiện, kết quả sẽ được ghi lại trên phim.
1.4.2.3 Nghiên cứu khả năng truyền plasmid kháng kháng sinh
Thông qua hình thức tiếp hợp, plasmid được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận qua ống pili bằng phương pháp bơm đẩy Kỹ thuật này hiện đang được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu khả năng truyền plasmid mang gen kháng kháng sinh trong quần thể vi khuẩn Tại Việt Nam, kỹ thuật này cũng được sử dụng để phân tích đặc tính của các vi khuẩn mang plasmid kháng kháng sinh.
Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh
Nguyên lý của quá trình tổng hợp ADN trong tế bào là dựa trên cơ chế bán bảo tồn, trong đó một cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để tổng hợp đoạn ADN sau mỗi chu kỳ nhiệt của PCR Đoạn gen đặc hiệu này có thể được phát hiện thông qua thạch điện di Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học, sinh học và nông nghiệp, với các mục đích đa dạng như phát hiện nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn và nhận diện các gen kháng kháng sinh.
Kỹ thuật RADP PCR
Nguyên lý: sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên đơn có kích thước ngắn khoảng
Quá trình nhiệt của phản ứng PCR cho phép các đoạn mồi 10 nucleotid gắn vào nhiều vị trí khác nhau trên ADN, giúp khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn gen vi khuẩn có kích thước từ 100-1000 bp Nhờ vào sự khác biệt trong các đoạn ADN của các chủng vi khuẩn, chúng ta có thể so sánh mối liên quan giữa các chủng trong các nghiên cứu dịch tễ học.
Kỹ thuật điện di xung trường
Kỹ thuật PFGE sử dụng enzym thích hợp để cắt ADN thành các phân đoạn từ 1-1000kb, sau đó điện di để phân tách các đoạn này Phương pháp này cho phép xác định mối liên quan và nguồn gốc của các chủng vi khuẩn qua việc so sánh các đoạn ADN Hiện nay, PFGE được xem là tiêu chuẩn vàng trong phân loại và xác định nguồn gốc vi khuẩn Tại Việt Nam, kỹ thuật này được áp dụng để phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh.
Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn
Tất cả các chủng vi khuẩn đều có một hoặc nhiều ARNm phân bố xung quanh nhiễm sắc thể, với trình tự các operon có tính bảo tồn cao Do đó, vi khuẩn có thể được định loại thông qua việc sử dụng các đoạn dò nhắm trực tiếp vào trình tự ADN mã hóa cho các ARN thông tin này.
1.4.6.2 Kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP)
Nguyên lý của phương pháp này là cắt ADN nhiễm sắc thể hoặc plasmid của vi khuẩn bằng enzym giới hạn thành các đoạn nhỏ Những đoạn ADN này được phân tách qua điện di trên thạch và chuyển lên màng nitrocellulose Tiếp theo, các đoạn ADN cắt sẽ được lai ghép với đoạn ADN dò đặc hiệu đã được đánh dấu phóng xạ Các đoạn ADN có trình tự axit nucleic bổ sung phù hợp sẽ gắn với đoạn dò, cho phép phân biệt chúng dựa vào sự khác biệt về số lượng và kích thước Kỹ thuật này hiện đang được áp dụng để phân tích các đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn kháng đa kháng sinh.
Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing
Kỹ thuật MLST là phương pháp hiệu quả nhất để phân loại kiểu gen của nhiều loại vi khuẩn, được đánh giá cao hơn so với PFGE và RFLP Đây là một trong những kỹ thuật "thư viện" hiếm hoi, giúp xếp hạng và phân loại, đặc biệt trong nghiên cứu dịch tễ học của các chủng A baumannii Kỹ thuật này cho phép xác định các chủng gây dịch, kháng kháng sinh và sinh độc tố, từ đó giám sát sự lây truyền của chúng trong nước và toàn cầu.
Kỹ thuật giải trình tự gen
Trong nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh, kỹ thuật giải trình tự gen đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các gen kháng kháng sinh và phân tích plasmid mang gen này Phương pháp này được coi là cách chính xác nhất để đánh giá các đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Phương pháp giải trình tự gen Sanger bằng điện di mao quản được xem là chuẩn vàng trong giải trình tự gen hiện nay, đặc biệt trong nghiên cứu kháng kháng sinh, khi nó thường được sử dụng để giải trình tự các gen kháng có kích thước dưới 2 kb Tuy nhiên, với nhu cầu nghiên cứu cấu trúc các yếu tố di truyền di động từ 4 đến 10 kb hoặc các plasmid mang gen kháng có kích thước từ vài chục đến hàng trăm kb, phương pháp này không đáp ứng được yêu cầu.
Các phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, ra đời vào năm 2005, đã khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống Kỹ thuật này không chỉ có tốc độ nhanh mà còn cho phép thực hiện song song nhiều trình tự trong vài tuần, trong khi phương pháp Sanger có thể mất hàng năm Mặc dù các đoạn trình tự (read) ngắn hơn và có độ chính xác thấp hơn so với phương pháp Sanger, nhưng với số lượng read lớn bao phủ toàn bộ vùng ADN cần giải trình tự, chúng sẽ được ghép lại để tạo thành trình tự ADN cuối cùng với độ chính xác cao, gọi là giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequence - WGS) Độ chính xác của WGS phụ thuộc vào việc phân tích dữ liệu thu được, trong đó độ tin cậy của dữ liệu thường dựa vào coverage, với giá trị 20X được sử dụng để so sánh các hệ gen và tìm sự khác biệt ở từng nucleotide.
Các vấn đề cần giải quyết trong nghiên cứu
- Tỉ lệ các chủng E coli mang gen mcr-1 trong cộng đồng (môi trường nước, thức ăn) như thế nào?
Nghiên cứu về sự tồn tại của các chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin trong hệ tiêu hóa của những người khỏe mạnh đã chỉ ra rằng những người này có thể tiếp xúc với môi trường và thực phẩm bị ô nhiễm bởi các chủng vi khuẩn này Việc xác định sự hiện diện của E coli kháng colistin trong cơ thể người lành mạnh có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá nguy cơ lây lan kháng kháng sinh trong cộng đồng.
- Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin như thế nào?
- Các chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin có đặc điểm sinh học phân tử như ra sao? Cơ chế lan truyền của các chủng này như thế nào?
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm thu thập mẫu được thực hiện tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam, bao gồm bảy thôn: An Hòa, Dương Xá, Quang Trung, Ứng Liêm, Hòa Ngãi, Mậu Chử và Thạch Tổ Các xét nghiệm phân tích vi sinh sẽ được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Kháng sinh thuộc Khoa Vi khuẩn tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Phòng thí nghiệm Kháng sinh thuộc Khoa Vi khuẩn tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương là địa điểm thực hiện xét nghiệm giải trình tự toàn bộ bộ gen của vi khuẩn (WGS).
Sử dụng thiết kế mô tả cắt ngang cho toàn bộ nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu VN V1.1 Hà Nam được thực hiện nhằm xác định tình trạng kháng kháng sinh của hệ vi khuẩn chí ở người tình nguyện khỏe mạnh tại Việt Nam, cũng như các tác động của việc sử dụng kháng sinh trong cộng đồng vào năm 2015 Tất cả các mẫu được thu thập sẽ được lưu giữ trong tủ lạnh -70 ºC tại phòng thí nghiệm kháng kháng sinh, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
Cỡ mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu cho mục tiêu 1
Nghiên cứu này là một nghiên cứu mô tả cắt ngang nhằm xác định tỷ lệ lưu hành gen mcr-1 trong phân người, phân động vật, nước và thực phẩm Để ước tính cỡ mẫu, chúng tôi áp dụng công thức p x (1-p) n = Z 2 (1-/2) x d 2, trong đó n là số chủng cần nghiên cứu, p là tỷ lệ dự đoán, Z1-/2 là hệ số tin cậy với độ tin cậy 95% (Z (1-α/2) = 1,96), và d là độ chính xác tuyệt đối (d=0.05).
Theo các nghiên cứu trước, tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin trong phân người được báo cáo là 17,6% Do đó, tổng số mẫu phân người được sử dụng để xác định tỷ lệ E coli mang gen mcr-1 là 222 mẫu (n=222).
Theo các nghiên cứu trước đây, tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin trong phân động vật đã được báo cáo là 7,9% Do đó, tổng số mẫu phân động vật được sử dụng để xác định tỷ lệ E coli mang gen mcr-1 là 112 (n=112).
Theo các nghiên cứu trước đây, tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin trong thực phẩm được báo cáo là 15% Do đó, số mẫu thực phẩm cần xác định tỷ lệ E coli mang gen mcr-1 là 189 (n9).
Theo báo cáo nghiên cứu trước, tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin trong nước là 10% Do đó, cần xác định số mẫu nước để đánh giá tỷ lệ này.
E coli mang gen mcr-1 là 138 (n8)
Nghiên cứu đã lựa chọn mẫu từ phân của người, động vật nuôi, thức ăn và nước (nước mưa, nước giếng, nước tưới) của 80 hộ gia đình tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam Các mẫu được cấy trên môi trường chọn lọc MAC bổ sung colistin 0.5 µg/ml để thu thập các chủng vi khuẩn gram âm mang gen mcr-1, bao gồm cả những chủng kháng colistin và những chủng nhạy cảm Những mẫu có vi khuẩn mọc sẽ được chọn từ 3-5 khuẩn lạc màu hồng nhạt để cấy chuyển tiếp trên thạch và ủ ở 37 ºC trong 24 giờ.
Việc chọn lựa 1 hoặc 2 khuẩn lạc từ mẫu cấy nhằm nâng cao khả năng phát hiện các chủng E coli mang gen mcr-1 là rất quan trọng trong nghiên cứu Các chủng này sẽ được bảo quản trong môi trường thích hợp để đảm bảo tính toàn vẹn và khả năng phân tích sau này.
LB có glycerol 20% trong tủ -70 º C để làm các thử nghiệm trong nghiên cứu
Nghiên cứu đã thu thập được số lượng mẫu và số lượng chủng như sau (Bảng 2.1)
Bảng 2.1 Số lượng mẫu và chủng phân lập được sử dụng trong nghiên cứu
Loại mẫu Số lượng mẫu Số lượng chủng
Số lượng cụ thể các chủng vi khuẩn được nghiên cứu trong từng kỹ thuật xét nghiệm như sau:
PCR đã được sử dụng để phát hiện gen mcr-1 trực tiếp từ 1224 chủng mẫu thu thập, như được trình bày trong Bảng 2.1 Các mẫu dương tính với mcr-1 đã được nuôi cấy và định danh vi khuẩn E coli để xác định sự hiện diện của gen này.
Toàn bộ các chủng dương tính với mcr-1
Nghiên cứu xác định tính nhạy cảm của các chủng E coli mang gen mcr-1 đối với colistin bằng kỹ thuật kháng sinh đồ vi pha loãng cho thấy tất cả các chủng E coli dương tính với mcr-1.
Xác định tính nhạy cảm kháng sinh thông qua kỹ thuật định lượng nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu (MIC) là một phương pháp quan trọng Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn các chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin, được nuôi cấy và định danh dựa trên các tiêu chí cụ thể.
✓ Lấy toàn bộ các chủng có MIC colistin từ 8->16
✓Các chủng có kháng colistin có cùng một giá trị =4 trong cùng 1 mẫu: chọn đại diện ngẫu nhiên 1-2 chủng
✓Các chủng có giá trị kháng colistin ở ngưỡng trung gian =2: lựa chọn đại diện theo hình thức lấy ngẫu nhiên
✓Các chủng có giá trị kháng colistin ở ngưỡng nhạy cảm 90% từ PFGE sẽ sử dụng toàn bộ
Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu
- Thu thập mẫu phân người trong hộ gia đình
- Thu thập mẫu phân động vật nuôi trong hộ gia đình
- Thu thập mẫu thực phẩm sử dụng trong hộ gia đình: thịt gà, thịt lợn, rau…
- Thu thập mẫu nước giếng, nước mưa, nước tưới của hộ gia đình
Quy trình thu thập mẫu của đề tài ICF Ha Nam VN 1.1
Kỹ thuật xét nghiệm PCR phát hiện gen mcr-1
Cấy mẫu trên môi trường tăng sinh chọn lọc với colistin Thu thập chủng vi khuẩn gram âm kháng colistin → Phát hiện gen mcr-1 từ chủng thu thập
Xác định tỷ lệ chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ phân người và vật nuôi, thực phẩm, nước tại xã Thanh
Hà, huyện Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015
Nuôi cấy và định danh vi khuẩn trên máy MALDI TOF
Cấy chủng vi khuẩn gram âm kháng colistin mang gen mcr-1 trên môi trường thạch thường, ủ 37 º C trong 18-24h Lựa chọn các khuẩn lạc phân lập được tiến hành định danh
Đánh giá mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E coli mang gen mcr-1 là rất quan trọng, đặc biệt đối với colistin và một số kháng sinh phổ biến khác Việc thu thập các chủng E coli giúp xác định khả năng kháng thuốc, từ đó hỗ trợ trong việc phát triển các biện pháp điều trị hiệu quả hơn.
Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu (MIC)
Phân tích mối liên hệ kiểu gen của các chủng
E coli mang gen mcr-1 thu thập được
Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử chủng E coli mang gen mcr-1 đã phân lập được
Xác định cơ chế lan truyền của gen mcr-1 của các chủng E coli
Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen (WGS) Xác định cấu trúc di truyền của các yếu tố di
Phân loại các plasmid mang gen mcr-1
Phương pháp lấy mẫu và kỹ thuật xét nghiệm
Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Các mẫu nghiên cứu được nuôi cấy và phân lập theo quy trình sau:
Để chuẩn bị môi trường thạch MacConkey có bổ sung colistin 0,5 µg/ml, bạn cần sử dụng thạch MacConkey từ hãng Oxoid, UK và colistin bột từ Sigma, USA Đầu tiên, cân lượng thạch tương ứng với số mẫu cần cấy, sau đó hòa thạch trong nước cất theo tỷ lệ hướng dẫn của nhà sản xuất và tiệt trùng ở 121ºC trong 15 phút Sau khi tiệt trùng, để thạch nguội xuống 40ºC rồi bổ sung colistin với nồng độ 0,5 µg/ml, nhẹ nhàng lắc đều.
Để tiến hành lấy mẫu phân từ người và động vật, sử dụng 1 ống lấy mẫu và cấy trên thạch MacConkey có bổ sung colistin 0.5 µg/ml, ủ ở nhiệt độ 37 ºC trong 18-24 giờ Đối với mẫu nước và thực phẩm, lấy 1 ống dung dịch canh thang LB + glycerol 20% để lưu trữ, sau đó cấy trên thạch MacConkey có bổ sung colistin 0.5 µg/ml và ủ ở 37 ºC trong 18-24 giờ Cuối cùng, chuẩn bị thạch thường (Nutrient Agar - hãng Oxoid, UK).
Bước 4: Trên mỗi đĩa cấy, chọn 3-5 khuẩn lạc màu hồng nhạt và chuyển từng khuẩn lạc sang thạch thường, ủ ở 37 ºC trong 18-24 giờ Nếu đĩa chỉ mọc 1 đến 2 khuẩn lạc, hãy lấy 1-2 khuẩn lạc đó để nghiên cứu Ghi lại số lượng chủng tương ứng với mỗi mẫu nghiên cứu Các đĩa không có vi khuẩn mọc sẽ được ghi nhận là mẫu không có chủng vi khuẩn gram âm kháng colistin.
Chuẩn bị ống eppendorf lưu chủng: 1,5ml LB broth + glycerol 20% (LB broth hang Oxoid, UK)
Bước 5: Kiểm tra các chủng được cấy trên thạch để xác định tính thuần khiết bằng mắt thường Nếu phát hiện các chủng có sự nhiễm chéo giữa hai loại khuẩn lạc, cần tiến hành cấy lại từ đầu.
Các đĩa chủng thuần sẽ được đánh mã số và lưu trữ trong ống Eppendorf chứa 1,5ml LB broth với 20% glycerol, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -70 ºC để phục vụ cho các thử nghiệm nghiên cứu.
PCR phát hiện gen mcr-1
Các chủng vi khuẩn gram âm kháng colistin đã được phân lập trên thạch thường từ mẫu đờm ở nhiệt độ 37°C Để thu nhận mẫu cho phản ứng PCR, lấy 4-5 khuẩn lạc và hòa tan trong 200 µl dung dịch đệm PBS, sau đó đun cách thủy ở 95°C trong 5 phút Tiến hành ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút để thu nước nổi làm khuôn mẫu.
2.6.2.2 Quy trình xét nghiệm PCR phát hiện mcr-1:
Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen mcr-1 kháng colistin của vi khuẩn thông qua phản ứng PCR Quá trình khuếch đại này được thực hiện nhiều lần, cho phép tổng hợp hàng triệu bản sao của đoạn gen từ một vài phân tử ADN ban đầu Kết quả có thể được phát hiện bằng cách nhuộm, điện di sản phẩm và chụp hình dưới đèn UV.
▪ Mồi cho phản ứng PCR: chúng tôi sử dụng trình tự mồi được thiết kế bởi Liu và cộng sự (2016)[57]
Trình tự của mồi như sau:
Kích thước gen mcr-1: 309 bp
▪ Thiết lập và tối ưu phản ứng PCR để phát hiện gen mcr-1 Thành phần phản ứng PCR phát hiện gen mcr-1:
Thành phần phản ứng 1 mẫu (àl)
2X Master-Mix (GoTaqđ ADN Polymerase: 400àM dATP, 400àM dGTP, 400àM dCTP, 400àM dTTP và 3mM MgCl2)
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Các bước Nhiệt độ Thời gian
Biến tính 94 º C 4 phút Biến tính 94 º C 36 giây 30 chu kỳ
Bước 1: Chuẩn bị mẫu ADN đã được tách chiết cần làm PCR Ghi sơ đồ xét nghiệm
Bước 2: Pha dung dịch Master-Mix + mồi + nước cất tương ứng với số mẫu cần làm, trộn đều và chia đều mỗi tube PCR 18 àl
Quá trình phát hiện gen mcr-1 bao gồm các bước quan trọng như sau: Sau khi chuẩn bị mẫu, nhỏ 2 μl AND mẫu vào mỗi ống nghiệm Tiếp theo, thực hiện quá trình khuếc đại trên máy PCR để tạo ra sản phẩm cần thiết Sản phẩm PCR sau đó sẽ được điện di trên thạch điện di agarose nồng độ 1,5% và 3 μg/100 ml thạch Redsafe - chất nhuộm DNA trong đệm TAE 1X trong 30 phút Cuối cùng, gel sẽ được chụp lại bằng máy chụp ảnh gel để phát hiện gen mcr-1.
Bước 6: Phân tích kết quả PCR là rất quan trọng để đánh giá chất lượng phản ứng Sử dụng mẫu chứng dương và chứng âm cùng với thang chuẩn ladder 1000 kb, phản ứng PCR được coi là hợp lệ khi mẫu chứng dương mcr-1 cho band của gen mcr-1, trong khi mẫu chứng âm không xuất hiện band Các mẫu có band kích thước tương đương với chứng dương được xác định là chứa chủng vi khuẩn gram âm mang gen mcr-1.
Hình 2.1 Hình ảnh minh họa kết quả pcr phát hiện gen mcr- 1
Kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng máy MALDI TOF
Hệ thống định danh MALDI TOF sử dụng kỹ thuật khối phổ để xác định dấu ấn protein đặc trưng của vi khuẩn và vi nấm Phổ protein này cho phép định danh chính xác từng loại vi sinh vật bằng cách so sánh với thư viện mẫu của các dòng vi khuẩn và vi nấm đã biết.
- Chuẩn bị chủng thuần: cấy chủng cần định danh trên thạch thường trong 24 giờ
- Phết mỗi mẫu khuẩn lạc thuần lên một vị trí (spot) của đĩa MALDI target
- Để mẫu khô ở nhiệt độ phòng
- Cho 1 àl dung dịch HCCA Matrix lờn mỗi vị trớ mẫu và để khụ ở nhiệt độ phũng
- Cho đĩa MALDI target vào máy để thực hiện định danh
- Kết quả có Score ≥ 2: Độ tin cậy cao, có thể chính xác đến cấp độ loài
- Kết quả có Score < 2: loại bỏ mẫu do không phải là chủng E coli Kiểm tra chất lượng bằng hóa chất nội kiểm IVD Bacterial Test Standard (IVD BTS)
Sau khi định danh các chủng bằng máy MALDI TOF, sẽ tiến hành thêm test indole Nếu kết quả định danh trên máy cho thấy chủng đó là E coli, thì chủng này sẽ được xác nhận.
MALDI TOF được xác định là E coli và test indole (+)
Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu
Đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu (MIC) được thực hiện qua hai kỹ thuật chính: kỹ thuật vi pha loãng trong canh thang (Broth microdilution MIC test) để xác định MIC của colistin, và kỹ thuật pha loãng trong thạch (agar dilution MIC test) dùng để đánh giá các kháng sinh khác.
Các bước thực hiện của kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu bao gồm:
Lựa chọn kháng sinh cần đánh giá
Chuẩn bị dung dịch kháng sinh stock, chủng cần đánh giá, chủng QC
Cho chủng vào các đĩa/tube/plate có nồng độ KS tùy từng phương pháp sử dụng và ủ
Xác định nồng độ kháng sinh cuối cần pha và cách phiên giải kết quả Đánh giá QC
2.6.4.1 Kỹ thuật vi pha loãng trong canh thang (Broth microdilution MIC test)
Bước 1: Chuẩn bị môi trường và chủng chuẩn: Chúng tôi sử dụng môi trường là dung dịchMueller-Hinton Broth (MHB) (Oxoid, UK) Chủng E coli ATCC
Chủng 25922 và E coli ATCC 13846 được sử dụng để kiểm tra chất lượng (QC) môi trường, đảm bảo rằng các chủng vi khuẩn gram âm có khả năng phát triển tốt trên mỗi mẻ môi trường đã được chuẩn bị.
Bước 2: Chuẩn bị chủng 24 giờ: Cấy riêng rẽ các chủng chuẩn E coli ATCC
25922, E coli ATCC 13846 và các chủng nghiên cứu trên thạch thường, ủ ở 37 º C trong vòng 18-24 giờ
Bước 4: Chuẩn bị dung dịch colistin Stock: Colistin sulfat stock 51200 àg/ml Bước 5: Chuẩn bị dung dịch colistin pha loãng:
- Pha loóng 1/10: 50 àl stock + 450 àl nước cất để được dung dịch colistin
Để chuẩn bị dung dịch colistin nồng độ 512 àg/ml, sử dụng 900 àl MHB kết hợp với 100 àl colistin nồng độ 5120 àg/ml Tiếp theo, hạ bậc nồng độ colistin xuống 64 àg/ml bằng cách pha theo tỷ lệ 1 dung dịch kháng sinh với 7 MHB.
- Thờm 800 àl dung dịch chứa colistin 64 àg/ml vào 12 ống tube vụ trựng Hỳt
Trong thí nghiệm này, 50 µl dung dịch MHB không có kháng sinh được thêm vào tất cả các giếng của plate Sử dụng pipet đa kênh (12 kênh), 50 µl dung dịch colistin 64 µg/ml được hút vào các giếng hàng A, sau đó trộn đều và lấy 50 µl để chuyển sang các giếng hàng C Quá trình này được lặp lại cho đến giếng cuối cùng, bỏ đi 50 µl ở hàng cuối cùng Các giếng của plate được phân chia dung dịch colistin đã được pha loãng ở các nồng độ khác nhau theo sơ đồ đã được thiết lập.
Cho thờm 50 àl MHB khụng cú colistin sang một plate khỏc để đỏnh giỏ sự phát triển của các chủng trong môi trường MHB của mỗi mẻ chạy
Để chuẩn bị canh khuẩn 10^6 McFarland cho plate kháng sinh, bạn cần pha loãng canh khuẩn 10^8 McFarland với nước muối 0.9% Cụ thể, hãy trộn 900 µl MHB với 100 µl canh khuẩn 10^8 McFarland và khuấy đều để đạt được nồng độ mong muốn.
100 àl canh khuẩn đó pha + 900 àl MHB trộn đều Dung dịch cuối cựng là canh khuẩn 10 6 Mcfarland
Bước 7: Hỳt 50 àl canh khuẩn 10 6 Mcfarland vào plate cú cỏc nồng độ colistin đã pha ở trên bao gồm cả chủng ATCC E coli ATCC 25922 và E coli ATCC
Giếng chứng âm (Negative control - NC) không chứa canh khuẩn, được sử dụng để kiểm tra môi trường MHB Để xác định tính hiệu quả của môi trường MHB, canh khuẩn được đưa vào plate có chứa môi trường này mà không có kháng sinh.
Bước 8: Trộn đều và ủ các plate ở nhiệt độ 35 ± 2 º C trong 16-20 giờ
- Điều kiện để kết quả đạt:
+ Giếng chứng âm: không có vi khuẩn mọc ở tất cả các nồng độ + Giếng kiểm tra môi trường MHB: Vi khuẩn mọc tốt
+ Giếng E coli ATCC 25922: MIC colistin trong khoảng: 0.25 àg/ml -2 àg/ml
+ E coli ATCC 13846: MIC colistin: 2-4 àg/ml
Kết quả nghiên cứu cho thấy MIC của chủng vi khuẩn là nồng độ colistin tối thiểu có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn ở đáy giếng, được xác định bằng mắt thường Việc giải thích kết quả MIC colistin được thực hiện dựa trên tiêu chuẩn nhạy và kháng của CLSI 2018.
+ Chủng cú MIC colistin ≤ 2 àg/ml: Nhạy với colistin + Chủng cú MIC colistin >2 àg/ml: Khỏng với colistin
2.6.4.2 Kỹ thuật pha loãng trong thạch (agar dilution MIC test): được sử dụng để đánh giá các kháng sinh còn lại
Mục đích của phương pháp pha loãng trong thạch là xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh đối với các chủng vi khuẩn đường ruột, theo khuyến cáo của CLSI.
Nguyên lý của các kỹ thuật này là tăng dần nồng độ kháng sinh trong môi trường nuôi cấy, cho đến khi đạt được nồng độ đủ cao để ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
Bước 1: Cấy riêng rẽ chủng chuẩn E coli ATCC 25922, P aeruginosa ATCC
27853 và các chủng nghiên cứu ra đĩa thạch Mueller Hinton (Becton Dikinson, Mỹ), ủ ở 35-37 o C trong 18 – 24 giờ
Bước 2: Pha loãng bậc 2 các loại kháng sinh (Sigma, Mỹ) trong đệm PBS vô trùng: + Nhóm β-lactam: Ampicillin
+ Nhóm Carbapenem: Imipenem (IPM), Meropenem (MEM);
+ Nhóm Cephalosporins: Ceftazidime (CAZ), Cefotaxime (CTX); Cefepim (FEP) + Nhóm Aminoglycosid (gentamicin (GM), amikacin (AK))
+ Nhóm Sulfamid: Sulfamethoxazon và trimethoprim (SXT) + Nhóm Fluoroquinolones: Ciprofloxacin (CIP);
Bước 3: Chuẩn bị các đĩa thạch Mueller-Hinton có chứa kháng sinh theo các nồng độ đã pha loãng
Bước 4: Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
- Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc của các chủng đã nuôi cấy hòa tan vào
2 ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy lắc vortex
- Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 của thang McFarland
Pha loãng 100 lần huyền dịch vi khuẩn bằng cách lấy 20 µl huyền dịch và cho vào 2 ml nước muối sinh lý vô trùng, từ đó tạo ra huyền dịch có nồng độ 10^6 vi khuẩn/ml.
Hút 0,5 ml huyền dịch vi khuẩn có nồng độ 10^6 vi khuẩn/ml và cho vào mỗi giếng của phiến inox 32 giếng, theo sơ đồ số của các chủng như được trình bày dưới đây.
Bước 5: Cấy các chủng đã chuẩn bị lên đĩa thạch có chứa kháng sinh Sử dụng bộ đinh cấy inox 32 đầu để chấm vào các giếng trên phiến, sau đó nhẹ nhàng đặt lên đĩa thạch không có kháng sinh mà không ấn sâu chân đinh vào thạch Đảm bảo thực hiện chính xác chỉ một lần và không di chuyển.
- Tiếp tục chấm và đặt lên các đĩa thạch đã có sẵn kháng sinh từ nồng độ thấp đến nồng độ cao
- Cuối cùng trước khi kết thúc, chấm vào đĩa thạch MH không có kháng sinh một lần nữa để làm chứng
- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho khô
Bước 6: Ủ ở 37 º C trong vòng 18-24 giờ, đọc kết quả
Để đảm bảo chất lượng xét nghiệm, tất cả các chủng vi khuẩn đều mọc tốt ở hai đĩa đầu và cuối mà không chứa kháng sinh Nồng độ kháng sinh tối thiểu cần thiết để ức chế sự phát triển của hai chủng chuẩn phải nằm trong khoảng cho phép theo tiêu chuẩn CLSI.
Năm 2018, nghiên cứu đã xác định 10 loại kháng sinh và đo nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu (MIC) của các chủng vi khuẩn, phân loại chúng thành nhạy (S), trung gian (I) và kháng (R) dựa trên bảng kết quả so sánh (Bảng 2.4) [78, 96].
Bảng 2.3 Diễn giải kết quả đọc MIC của các kháng sinh
Để đọc kết quả, cần bắt đầu từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất Nồng độ MIC được xác định tại đĩa môi trường nơi vi khuẩn bị ức chế phát triển, dẫn đến mật độ vi khuẩn giảm rõ rệt, chỉ còn lại 1-3 khuẩn lạc mọc.
Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
Kỹ thuật PFGE được áp dụng để phân tích mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Phương pháp này giúp xác định nguồn gốc và mối quan hệ của các chủng vi khuẩn ở các khu vực và thời điểm khác nhau thông qua việc so sánh các đoạn ADN của chúng.
Kỹ thuật PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) sử dụng enzym đặc hiệu để cắt DNA thành các đoạn khác nhau Các đoạn DNA này sau đó được phân tách bằng phương pháp điện di, cho phép phân tích chính xác các kích thước đoạn từ 1 kb trở lên.
1000 kb Các đoạn AND của các chủng vi khuẩn sẽ được so sánh để phân biệt sự giống và khác nhau của các chủng vi khuẩn
- Tách chiết ADN của vi khuẩn trong đệm thạch
- Lấy một khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1 và chủng chuẩn
Salmonella Braenderup H9812 trên đĩa thạch LB được nuôi cấy qua đêm ở 37 º C cấy vào 10ml môi trường LB lỏng, lắc 120 vòng/phút ở 37ºC trong 6-8 giờ Ly tâm
4000 vòng x 20 phút loại dịch nổi thu cặn tế bào vi khuẩn
Trộn cặn tế bào với 200 µl dung dịch TE, sau đó thêm 200 µl dung dịch thạch Seakem gold 1% đã chuẩn bị trong đệm TBE 0,5X Trộn đều hỗn hợp và nhỏ vào khuôn tạo gel để tạo plug, sau đó chờ cho thạch đông lại.
- Chuyển các plug sang các tube 2ml có chứa 2ml dung dịch ly giải tế bào
- Ủ các tube ở 55ºC qua đêm trong bể ủ nhiệt, lắc nhẹ nhàng Cắt ADN vi khuẩn bằng enzym giới hạn XbaI
The chromosomal DNA of bacteria isolated in agar was cut using the restriction enzymes XbaI (for E coli, Enterobacter spp., and K pneumoniae) and ApaI (for Acinetobacter) at a concentration of 40 U per agar piece, incubated at 37ºC for 14-16 hours.
Sản phẩm cắt ADN sẽ được phân tích bằng phương pháp điện di sử dụng bộ điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif) Quá trình này diễn ra trên thạch Seakem gold 1% với hiệu điện thế 6V/cm trong 19 giờ ở nhiệt độ 14°C Thời gian cho mỗi xung dao động từ 25 đến 60 giây, và góc điện trường được thiết lập ở 120 độ.
Sau khi thực hiện điện di gel, các mẫu sẽ được nhuộm bằng dung dịch ethidium bromide và chụp ảnh Các đoạn cắt ADN của các chủng vi khuẩn sẽ được so sánh với nhau và với chủng chuẩn S braenderup H9812, được chạy song song để làm thang chuẩn.
- Phân tích mối liên hệ kiểu gen của các chủng vi khuẩn E coli kháng colistin mang gen mcr-1 bằng phần mềm Bionumeric- 6.5 để tạo cây phả hệ.
Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn
Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen giúp xác định trình tự nucleotide của vi khuẩn, từ đó đánh giá mối liên hệ kiểu gen và các gen kháng kháng sinh Phương pháp này cũng cho phép nghiên cứu các yếu tố di truyền liên quan đến sự kháng thuốc của các chủng vi khuẩn, góp phần quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế kháng kháng sinh.
Quy trình giải trình tự gen các chủng E coli được mô tả chi tiết ở phần Phụ lục 7 Vật liệu nghiên cứu: Mô tả chi tiết ở Phụ lục 6
Tóm tắt các bước thực hiện:
- Các chủng E coli mang gen mcr-1 được nuôi cấy trong môi trường LB ở 37 o C từ 18- 24 giờ
- Tách ADN tổng số bằng hệ thống tách chiết tự động QIAcube (Qiagen)
- Định lượng ADN bằng kit và máy đo nồng độ Qubit (ThermoFisher Scientific)
- Thiết lập thư viện ADN sử dụng kit NexteraXT (Illumina) theo hướng dẫn của nhà sản xuất
- Giải trình tự gen bằng máy MiSeq (Illumina), sử dụng bộ kit MiSeq Reagent
- Thực hiện lắp giáp de novo assembly để xây dựng bộ gen của vi khuẩn của mỗi chủng từ dữ liệu các đoạn ADN ngắn trên phần mềm SPASdes v3.14.1[19]
Sử dụng phần mềm Resfinder và cơ sở dữ liệu Plasmidfinder giúp tìm kiếm gen kháng kháng sinh và phân loại plasmid Phương pháp MLST được áp dụng để xác định kiểu trình tự của từng chủng vi khuẩn.
- IQ-TREE v1.6.11 được sử dụng để thiết lập cây phả hệ[72]
- Các bước xử lý và phân tích trình tự tiếp theo (Hình 2.2) được thực hiện tại
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (phối hợp với Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Trường Đại học Oxford - OUCRU)
Phân tích in silico cho phép xác định vị trí của gen mcr-1, liệu nó nằm trên nhiễm sắc thể hay plasmid Sự kết hợp giữa dữ liệu từ trình tự đọc ngắn và trình tự đọc dài của kỹ thuật Oxford Nanopore đã giúp xây dựng cấu trúc gen của plasmid mang gen mcr-1.
Hình 2.2 Các bước phân tích dữ liệu WGS để xác định các đặc điểm phân tử của chủng mang gen mcr-1
Xác định sequence type ST (MLST)
Ngân hàng trình tự hệ gen (NCBI)
Các đoạn trình tự (Raw reads)
Kiểm tra chất lượng (Fast QC)
Loại bỏ các đoạn kém chất lượng và adaptor (Trimmomatic)
Xác định biến thể so với hệ gen chuẩn (Snippy)
Lắp ráp de novo (SPAdes)
Chọn hệ gen chuẩn phù hợp (MASH)
Gióng hàng các trình tự (MAFFT)
Loại bỏ các đoạn tái tổ hợp (Gubbins)
KS (Resfinder) Phân loại plasmid (Plamid finder)
Cấu trúc mang gen kháng KS (RATT, ISfinder)
Thiết lập cây phả hệ (IQ-Tree)
Kỹ thuật tiếp hợp đánh giá sự lan truyền gen mcr -1 qua plasmid
Bước 1: Chuẩn bị chủng nhận:
+ Cấy chủng “nhận” E coli J53 vào 5ml mụi trường LB + 100 àg/ml Sodium azide (Sigma, Mỹ), ủ 37 o C qua đêm
+ Hỳt 50 àl hỗn dịch nuụi cấy chứa vi khuẩn E coli J53 sang đĩa thạch
MacConkey (Oxoid, Anh) + 100 àg/ml Sodium azide, ủ 37 o C qua đờm
+ Cấy chuyển 1 khuẩn lạc E coli J53 sang bình tam giác chứa môi trường
LB, ủ 37 o C qua đêm, lắc nhẹ
Bước 2: Chuẩn bị chủng cho:
+ Cấy chủng vi khuẩn “cho” (chủng có plasmid mang gen kháng kháng sinh mcr-1 đã kiểm tra bằng PCR ) lên đĩa thạch MacConkey có chứa 2 g/ml meropenem, ủ 37 o C qua đêm
+ Chọn một khuẩn lạc chủng “cho” cấy sang 3ml canh thang LB có chứa 2g/ml meropenem, ủ 37 o C trong 5-6 giờ (OD 600=0,5)
Bước 3: Thực hiện tiếp hợp
- Ly tâm hỗn dịch nuôi cấy chứa chủng cho và chủng nhận: 6.000 vòng/phút x
5 phút Loại bỏ nước nổi
- Cho 600 àl nước muối sinh lý vào rửa cặn chủng
- Ly tõm 6.000 vũng/phỳt x 5 phỳt Loại bỏ nước nổi để lại 100 àl, bổ sung thờm 100 àl LB rồi nhẹ nhàng hũa tan cặn
- Hoàn nguyên tube chứa E coli J53 với 1 ml LB Trộn nhẹ
- Cho 100 àl cặn E coli J53 vào mỗi tube cú 100 àl cặn chủng nghiờn cứu
- Hỳt 25 àl hỗn hợp chủng cho và chủng nhận + 75 àl nước muối sinh lý cấy lờn đĩa thạch MacConkey chứa 2 àg/ml MEM + 100 àg/ml Sodium azide, ủ 37 o C qua đêm
Chỗ hỗn hợp cần ủ thêm 2 tiếng, sau đó hủy 25 µl hỗn hợp chủng và thêm 75 µl nước muối sinh lý Tiến hành cấy lên đĩa thạch MacConkey với nồng độ 2 µg/ml MEM.
100 àg/ml Sodium azide, ủ 37 o C qua đờm
Bước 4: Xác định kết quả tiếp hợp
- Chọn khuẩn lạc E coli J53 màu đỏ tươi mọc trên môi trường chọn lọc (chứa sodium azide và meropenem) cấy sang đĩa thạch MHA
Kiểm tra gen mcr-1 trong các chủng E coli J53 được thực hiện bằng kỹ thuật PCR, nhằm xác nhận sự thành công của quá trình tiếp hợp trong việc truyền gen qua plasmid Sự hiện diện của gen mcr-1 trong các chủng E coli J53 là bằng chứng cho việc truyền gene hiệu quả.
“chủng cho” là các chủng E coli mang gen mcr-1 nằm trên plasmid.
Biến số và chỉ số trong nghiên cứu
- Thông tin chung về các loại mẫu thu thập được: loại mẫu, số lượng mẫu, địa điểm, thời gian thu thập mẫu
Số lượng chủng E coli được thu thập từ nhiều loại mẫu khác nhau, bao gồm mẫu phân người, phân động vật như chó, gà, vịt, lợn, mẫu thịt từ lợn và gà, cũng như mẫu môi trường như nước mưa, nước giếng và nước tưới.
- Tỷ lệ chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin được phân lập từ phân người
- Tỷ lệ chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin được phân lập từ các mẫu phân động vật nuôi
- Tỷ lệ chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin được phân lập từ thực phẩm (thịt, rau)
- Tỷ lệ chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin được phân lập từ nước (nước mưa, nước giếng, nước tưới)
- Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin
- Mối liên hệ kiểu gen các chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin bằng kỹ thuật PFGE
- Mối liên hệ về kiểu gen và sequence type của các chủng E coli mang gen mcr-1 trong nghiên cứu
- Cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid của các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1
Cấu trúc di truyền của các yếu tố di động chứa gen mcr-1 ở các chủng E coli được phân lập trong nghiên cứu đã được phân tích và so sánh với cấu trúc của các yếu tố di động mang gen mcr-1 từ một số chủng E coli phân lập trên lâm sàng.
Phương pháp thu thập thông tin
Các thông tin được thu thập theo phiếu điều tra in sẵn và được tiến hành bởi các nghiên cứu viên đã được tập huấn (Phụ lục 1)
Xử lý và phân tích số liệu
- Quản lý số liệu bằng phần mềm exel
- Phân tích đặc tính SHPT: Sử dụng phần mềm FinchTIVI, DNA-blast, Bio- numeric-6.5, Inter plasmid Analyzing tool
- Kết quả được trình bày dưới dạng bảng, đồ thị, biểu đồ
Khống chế sai số
- Các qui trình lấy mẫu được thực hiện theo quy trình chuẩn của dự án ICF Ha Nam VN V1.1(Phụ lục 1)
- Chủng chuẩn quốc tế E coli ATCC 25922 được thử nghiệm song song với các chủng E coli mang gen mcr-1 về tính nhạy cảm kháng sinh theo tiêu chuẩn
- Sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen mcr-1 bằng kĩ thuật PCR và giải trình tự gen
- Giải trình tự toàn bộ bộ gen được thực hiện tại viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Bộ dữ liệu thu được đảm bảo chất lượng với Q score >30
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người và động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015
và động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015
3.1.1 Đặc điểm chung về các loại mẫu được thu thập trong nghiên cứu
Bảng 3.1 Số lượng các loại mẫu thu thập theo các thôn và hộ gia đình tại xã
Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam năm 2015 Địa điểm thu thập(thôn)
Số hộ được thu thập
Số mẫu phân người thu thập
Số mẫu phân động vật được thu thập
Số mẫu thực phẩm được thu thập
Số mẫu môi trường được thu thập
Nghiên cứu được thực hiện trong 6 tháng tại 80 hộ gia đình thuộc 7 thôn của xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam vào năm 2015 Các mẫu phân người (n&5), phân động vật nuôi trong nhà (n2), thức ăn của hộ gia đình (n9) và nước (gồm nước mưa, nước giếng và nước tưới, n9) đã được thu thập vào tháng thứ 2 của nghiên cứu Tất cả các mẫu đều được lựa chọn ngẫu nhiên.
3.1.2 Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
Các mẫu đã được cấy trên môi trường thạch MacConkey với nồng độ 0,5 àg/ml Từ mỗi mẫu cấy, chúng tôi đã lựa chọn từ 1 đến 5 khuẩn lạc màu hồng để phân tích.
Các chủng Enterobacteriaceae đã được tiến hành PCR để phát hiện gen mcr-1 và xác định các chủng E coli mang gen này Kết quả thu được từ quá trình nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của gen mcr-1 trong các chủng E coli.
Bảng 3.2: Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E coli mang gen mcr-1 phân lập được từ phân người, phân động vật, thực phẩm và nước
Enterobacteriaceae mọc trên môi trường MAC + 0.5 àg/ml colistin
Tỷ lệ mẫu có E coli mang gen mcr-1
Phân động vật nuôi (PĐVN) 122 97 (79,5%) 42 34,4
Trong tổng số 725 mẫu phân người, phân động vật, thức ăn, nước được cấy trờn mụi trường thạch MacConkey cú chứa 0,5 àg/ml colistin cú 546 mẫu cú
Enterobacteriaceae (khuẩn lạc màu hồng) chiếm 75,3%
Tất cả các mẫu phân người, phân động vật, thức ăn và nước đều phát hiện có chủng E coli mang gen mcr-1 Tỷ lệ mẫu có E coli mang gen mcr-1 được xác định là 36,6% ở phân người, 34,4% ở phân động vật, 3,8% ở thức ăn và 8,4% ở nước.
3.1.3 Tỷ lệ chủng vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
Tổng số chủng Enterobacteriaceae thu thập được là 1224 chủng Sau khi thực hiện PCR để xác định E coli mang gen mcr-1, các chủng này được xác định MIC đối với colistin bằng kỹ thuật kháng sinh vi pha loãng trong thạch Kết quả cho thấy sự hiện diện của E coli kháng colistin.
Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ chủng vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
Trong tổng số 1224 chủng Enterobacteriaceae được phân lập, có 649 chủng từ phân người, 271 chủng từ phân động vật nuôi, 201 chủng từ thức ăn và 103 chủng từ nước Đặc biệt, có 398 chủng E coli mang gen mcr-1.
236 chủng phân lập từ phân người chiếm 36,4% trong đó 15,3% có biểu hiện kiểu
Phân người (n= 649) Phân động vật (n'1) Thức ăn (n 1) Môi trường (n3)
Tỷ lệ chủng vi khuẩn E.coli mang gen mcr-1
Chủng E.coli mang gen mcr-1 có kháng colistin Chủng E.coli mang gen mcr-1 không kháng colistin Chủng Enterobacteriacea không phải E.coli
Trong nghiên cứu, tỷ lệ phần trăm động vật chiếm 36,6%, trong đó 10,3% có biểu hiện kiểu hình và 26,2% có biểu hiện kiểu gen Đối với 47 chủng phân lập từ thức ăn, tỷ lệ này là 23,3%, với 11,4% có biểu hiện kiểu hình và 11,9% có biểu hiện kiểu gen Ngoài ra, 16 chủng phân lập từ nước chiếm 15,5%, trong đó 9,7% có biểu hiện kiểu hình và 5,8% có biểu hiện kiểu gen (Biểu đồ 3.1).
Sự phổ biến của các chủng E coli mang gen mcr-1 trong các mẫu như phân người, phân động vật nuôi, thức ăn và nước trong hộ gia đình được thể hiện qua biểu đồ heatmap Mỗi dòng ngang đại diện cho số mẫu từ một hộ gia đình, trong đó màu đỏ chỉ ra các mẫu có sự hiện diện của E coli mang gen mcr-1, còn màu hồng biểu thị cho các mẫu không có gen này.
Trong nghiên cứu này, các mẫu phân người (PN1, PN2, PN3, PN4) và mẫu phân động vật (PĐVN1, PĐVN2, PĐVN3) được thu thập từ cùng một hộ gia đình Ngoài ra, mẫu thức ăn (TĂ) và các mẫu nước (N1, N2, N3) cũng được lấy từ hộ gia đình đó để phục vụ cho việc phân tích.
Biểu đồ 3.2: Heatmap sự phân bố của các chủng E coli mang gen mcr-1 ở 69 hộ gia đình
Mã hộ PN1 PN2 PN3 PN4 PĐVN1 PĐVN2 PĐVN3 TĂ1 N1 N2 N3
Mẫu dương tính với mcr-1
Mẫu Âm tính với mcr-1
Nghiên cứu về sự phổ biến của các chủng E coli mang gen mcr-1 trong các mẫu phân người, phân động vật, thức ăn và nước trong hộ gia đình cho thấy rằng 69/80 hộ gia đình có sự hiện diện của chủng E coli này Các chủng E coli mang gen mcr-1 được phát hiện ở cả mẫu phân của các cá nhân trong cùng hộ gia đình và/hoặc phân động vật, thức ăn và nước uống Đặc biệt, tỷ lệ hộ gia đình có hơn 2 loại mẫu với sự hiện diện của chủng E coli mang gen mcr-1 là 47,8% (33/69 hộ).
E coli mang gen mcr-1 là 37,7% (26/69 hộ) (Biểu đồ 3.2) 3.1.4 Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E coli mang gen mcr-1
Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu colistin của các chủng
E coli mang gen mcr-1 phân lập được
* Ghi chú: PN: phân người; PĐVN: phân động vật nuôi; TĂ: thức ăn; N: nước
Nghiên cứu đánh giá độ nhạy cảm với colistin của 398 chủng E coli mang gen mcr-1 cho thấy một tỷ lệ cao các chủng có biểu hiện kiểu gen nhưng không có biểu hiện kiểu hình, cụ thể là 71,7% ở mẫu phân động vật nuôi và 58,1% ở phân người Trong số 160 chủng mang gen mcr-1 có biểu hiện kiểu hình kháng colistin, 80% (128/160 chủng) có MIC colistin từ 4 àg/ml Các chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin được phát hiện ở cả bốn loại mẫu: phân người, phân động vật nuôi, thức ăn và nước.
3.1.5 Tỷ lệ phân bố của gen mcr-1 trên NST và plasmid của các chủng E coli
Bảng 3.4 Sự phân bố của các chủng E coli mang gen mcr-1 nằm trên NST và plasmid
Chủng mang gen mcr-1 nằm trên NST
Chủng mang gen mcr-1 nằm trên Plasmid
Chủng mang gen mcr-1 nằm trên NST và Plasmid
* Ghi chú: PN: phân người; PĐVN: phân động vật; TĂ: thức ăn; N: nước
Gen mcr-1 kháng colistin đã được phát hiện ở các chủng E coli, với 71,2% gen nằm trên plasmid và 26,4% trên NST Đáng chú ý, có hai chủng E coli mang gen mcr-1 đồng thời trên cả plasmid và NST.
NST và plasmid trong đó 01 chủng phân lập từ nước và 01 chủng từ động vật 100% gen mcr-1 có subtype là mcr-1.1
3.1.6 Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E coli mang gen mcr-1 trong phân người và động vật nuôi, thức ăn và nước
Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu với các chủng E coli mang gen mcr-1
Mức độ kháng Loại mẫu AM CAZ CTX FEP GM AK CIP IMP MEM SXT
* Ghi chú: PN: phân người; PĐVN: phân động vật nuôi; TĂ: thức ăn; N: nước
Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng kháng sinh của các chủng E coli mang gen mcr-1 trong phân người, phân động vật nuôi, thức ăn và nước cho thấy mức độ đề kháng cao với các nhóm kháng sinh thông thường Các chủng E coli đề kháng ampicillin có tỷ lệ từ 97,6% đến 100%, với MIC > 128 µg/ml Đối với gentamicin, tỷ lệ kháng là từ 29,2% đến 49,4%, và 70/109 chủng có MIC ≥ 64 µg/ml Về ciprofloxacin, tỷ lệ kháng dao động từ 39,6% đến 81,3%, trong đó hơn 50% số chủng có MIC ≥ 16 µg/ml Cuối cùng, SXT có tỷ lệ đề kháng rất cao, từ 71,7% đến 93,9%, với 238/240 chủng có MIC > 16 µg/ml.
Bảng 3.6 Số lượng các chủng E coli mang gen mcr-1 đa kháng kháng sinh
Số chủng kháng toàn bộ kháng sinh nhóm β- lactam
* Ghi chú: PN: phân người; PĐVN: phân động vật nuôi; TĂ: thức ăn; N: nước
Tỷ lệ các chủng vi khuẩn mang gen đa kháng kháng sinh rất cao, với hơn 50% chủng E coli kháng từ 3 nhóm kháng sinh trở lên Đặc biệt, có 7 chủng kháng toàn bộ kháng sinh nhóm β-lactam, trong đó có 6 chủng được phân lập từ phân người và 1 chủng từ phân động vật.
Nghiên cứu đã thực hiện thử uôinghiệm phát hiện khả năng sinh ESBL của
Nghiên cứu đã phát hiện 277 chủng E coli mang gen mcr-1, trong đó có 7 chủng sinh ESBL, bao gồm 4 chủng từ phân người và 3 chủng từ phân động vật Đặc biệt, có 2 chủng cho thấy sự tương đồng giữa kiểu hình và kiểu gen, với khả năng sinh ESBL và biểu hiện kháng toàn bộ nhóm β-lactam.
3.2 Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
3.2.1 Các gen kháng kháng sinh của các chủng E coli mang gen mcr-1
Giải trình tự toàn bộ bộ gen 87 chủng E coli mang gen mcr-1, kết quả phân tích các gen kháng kháng sinh như sau:
Biểu đồ 3.3: Heatmap sự có mặt các gen KKS của các chủng E coli mang gen mcr-1 được xác định bằng giải trình tự toàn bộ bộ gen (n)
BÀN LUẬN
Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam
4.1.1 Một số đặc điểm về quần thể thu thâp mẫu nghiên cứu
Quần thể nghiên cứu bao gồm 80 hộ gia đình từ 7 thôn thuộc xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam, với đa dạng nghề nghiệp, trong đó nông dân chiếm tỷ lệ cao nhất (45,3%), tiếp theo là trẻ em/học sinh (34,3%), và công nhân, cán bộ (16,6%), trong khi nhóm nghề thủ công, buôn bán chỉ chiếm 3,8% Hầu hết các hộ gia đình đều nuôi động vật, và các mẫu được thu thập bao gồm phân của người khỏe mạnh, phân động vật, thức ăn (rau, thịt), cùng với nước tưới, nước giếng và nước mưa Những mẫu này phản ánh sự lây lan của KKS trong cộng đồng thông qua chuỗi thức ăn, khi gia súc gia cầm tiêu thụ thức ăn có chứa kháng sinh.
Vi khuẩn kháng thuốc ngày càng phát triển trong gia súc và gia cầm, dẫn đến nguy cơ xâm nhập vào cơ thể con người thông qua thực phẩm, môi trường như nước, hoặc tiếp xúc trực tiếp Điều này đặt ra thách thức lớn cho sức khỏe cộng đồng và yêu cầu các biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt hơn.
4.1.2 Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm,
Chúng tôi đã xác định tỷ lệ E coli mang gen mcr-1 kháng colistin bằng cách phân tích hai loại tỷ lệ: tỷ lệ mẫu chứa chủng E coli mang gen mcr-1 và tỷ lệ chủng E coli mang gen này.
E coli mang gen mcr-1 trong tổng số chủng Enterobacteriaceae phân lập được trong nghiên cứu
Nghiên cứu tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam cho thấy tỷ lệ E coli mang gen mcr-1 kháng colistin ở người và động vật nuôi cao, lần lượt là 36.6% và 34.4%, so với nghiên cứu của Liu và cộng sự tại Trung Quốc Ngoài ra, chủng E coli này cũng được phát hiện trong các mẫu thức ăn tại hộ gia đình (3.8%) và trong nước giếng sinh hoạt, nước mưa, nước tưới (8.4%).
Nghiên cứu về phân lập Enterobacteriaceae cho thấy tỷ lệ E coli mang gen mcr-1 trong các chủng vi khuẩn đường ruột rất cao, đạt 36,4% trong số các chủng được phân lập từ phân người.
Trong nghiên cứu, 36,6% chủng Enterobacteriaceae được phân lập từ phân động vật, nước và thức ăn cho thấy tỷ lệ cao của chủng E coli mang gen mcr-1, đạt 23,3% và 15,5% tương ứng Các tỷ lệ này tương đồng với tỷ lệ các mẫu chứa chủng E coli mang gen mcr-1.
Nghiên cứu cho thấy các chủng E coli mang gen mcr-1 không chỉ xuất hiện ở động vật, mà còn liên quan đến việc sử dụng colistin kéo dài trong chăn nuôi, nơi colistin thường được dùng như một thuốc tăng trưởng.
Vi khuẩn không chỉ tồn tại trong cộng đồng dân cư với tỷ lệ cao mà còn hiện diện trong môi trường thực phẩm và nước, bao gồm nước sinh hoạt, nước tưới và nước mưa.
Từ thực trạng này, nhóm nghiên cứu đưa ra giả thuyết rằng có thể các chủng
E coli mang gen mcr-1 tồn tại ở động vật do việc lạm dụng colistin trong chăn nuôi một thời gian dài đã gây ô nhiễm môi trường (thức ăn, nước uống, nước tưới) làm lây lan nhanh các chủng kháng này qua “chuỗi thức ăn” làm cho tỷ lệ nhiễm các chủng kháng này ở người cũng rất cao Nhóm nghiên cứu tiếp tục đi sâu vào đánh giá toàn cảnh thực trạng này và phân tích các đặc điểm sinh học phân tử của các chủng này để chứng minh giả thuyết nghiên cứu Để đánh giá sự lây lan của các chủng E coli mang gen mcr-1 trong hộ gia đình theo chuỗi thức ăn, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra sự lây lan của các chủng E coli mang gen mcr-1 theo hộ gia đình Kết quả cho thấy trong số 80 hộ gia đình được khảo sát, chúng tôi đã phát hiện được các chủng E coli mang gen mcr-1ở 69 hộ (86,2%) Tỷ lệ tìm thấy > 2 loại mẫu trong cùng hộ gia đình có chủng E coli mang gen mcr-1 là 47,8%, tỷ lệ hộ gia đình có > 2 người cùng sống trong một hộ gia đình đều có chủng E coli mang gen mcr-1 là 37,7%, (Hình 3.1, Hình 3.2) Đây là một trong những bằng chứng cho thấy có thể có sự lan truyền các chủng E coli mang gen mcr-1 trong hộ gia đình giữa người và động vật thông qua môi trường sinh hoạt như nước, thức ăn bị ô nhiễm
So sánh với các nghiên cứu tương tự tại Việt Nam, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ chủng E coli mang gen mcr-1 trong phân động vật tương đương với nghiên cứu của Malhotra-Kumar, với tỷ lệ 37.5% từ phân động vật ở trang trại Văn Lâm, Hưng Yên (2014-2015) và nghiên cứu của HH Phương về thịt heo tại TP Hồ Chí Minh năm 2018 với tỷ lệ 35,8% Tuy nhiên, tỷ lệ E coli mang gen mcr-1 ở phân người trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn nhiều, với 7,8% từ người bán thịt heo Sự khác biệt này có thể do quần thể nghiên cứu khác nhau, trong khi quần thể của chúng tôi tại các hộ gia đình có chăn nuôi có nguy cơ lây lan cao hơn.
Nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đã khảo sát đồng bộ thực trạng các chủng E coli mang gen mcr-1 ở người, động vật và môi trường (nước, thức ăn) tại một khu vực nông thôn Bắc Bộ.
So sánh với các nghiên cứu tương tự ở Châu Á và trên thế giới, tỷ lệ mẫu E coli mang gen mcr-1 trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn so với một số nghiên cứu tại Trung Quốc, Nhật Bản và Pháp Các nghiên cứu ở Trung Quốc, Nhật Bản và Pháp chủ yếu tập trung vào phân động vật, phân nông dân và thức ăn trong giai đoạn 2015.
Năm 2016, tỷ lệ E coli mang gen mcr-1 được ghi nhận là 21% trong phân động vật tại Trung Quốc, cùng với 8,47% trong phân động vật và 4,84% trong phân của người nông dân làm việc tại nông trại.
Nhật; Tại Pháp 5,9% E coli mang gen mcr-1 ở thức ăn Tỷ lệ E coli mang gen mcr-
1 ở tất cả các nguồn trong cộng đồng (phân động vật, phân người, thức ăn, nước) tại
Việt Nam có thể cao hơn các nước khác về tỷ lệ kháng colistin do việc lạm dụng colistin trong chăn nuôi, dẫn đến ô nhiễm môi trường và lây truyền mầm bệnh qua chuỗi thức ăn Điều này cảnh báo về sự hiện diện của E coli mang gen mcr-1 kháng colistin trong cộng đồng Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu mức độ kháng colistin của các chủng E coli mang gen mcr-1, sự phân bố của chúng trên NST và plasmid, cũng như đánh giá tình trạng kháng kháng sinh của các chủng này để hiểu rõ hơn về khả năng lây lan trong cộng đồng.
4.1.3 Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin
Trong số 398 chủng E coli mang gen mcr-1 phân lập được có 160 chủng
Trong nghiên cứu, 40,2% các chủng E coli thể hiện kiểu hình kháng colistin (MIC > 2 µg/ml), với sự hiện diện của gen mcr-1 ở tất cả bốn loại mẫu (phân người, phân động vật, nước, thức ăn) Các chủng E coli mang gen mcr-1 có MIC = 4 µg/ml chiếm tỷ lệ cao nhất (80%), trong khi 21 chủng có MIC > 16 (5,2%) được phân lập từ các mẫu khác nhau, bao gồm 5 chủng từ phân người, 4 chủng từ phân động vật, 7 chủng từ nước và 5 chủng từ thức ăn Nghiên cứu của Katarzyna Ćwiek và cộng sự tại Ba Lan cũng ghi nhận tỷ lệ cao tương tự, với 52,9% các chủng E coli mang gen mcr-1 thể hiện kiểu hình và 88,8% có khả năng kháng thuốc.
Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
4.2.1 Các gen kháng kháng sinh
Kết quả đánh giá tình trạng kháng kháng sinh (KKS) của 277 chủng E coli mang gen mcr-1 cho thấy tình trạng KKS rất đáng báo động, với tỷ lệ kháng cao đối với các kháng sinh như AM, GM, CIP và SXT Chúng tôi đã lựa chọn 87 chủng E coli mang gen mcr-1 để tiến hành nghiên cứu sâu hơn.
Kết quả phân tích giải trình tự toàn bộ bộ gen (WGS) cho thấy nhiều gen kháng sinh (KKS) thuộc các nhóm khác nhau được phát hiện trên các chủng E coli mang gen mcr-1 Chúng tôi đã xác định được 46 loại gen KKS thuộc 9 nhóm kháng sinh, với nhóm β-lactam có 9 gen KKS chiếm ưu thế, trong đó ampC đạt 95,4%, bla TEM-1 54,0% và bla TEM-135 24,1% Đối với nhóm aminoglycosid, có 14 gen KKS, với kdpE chiếm 58,6%, aadA2 49,5%, aadA 42,5%, APH6-Id 39,8%, và AAC (3)-IIa 14,9%.
The study reveals that the IIb-11.5% resistance gene group includes two quinolone genes, qnrS1 at 43.7% and qnrS2 at 5.8% Additionally, within the trimethoprim resistance genes, five were identified, with dfrA12 being the most prevalent at 49.4%, followed by dfrA14 at 19.5% Furthermore, eight sulfonamide genes were detected, with sul1 at 12.6%, sul2 at 44.8%, and sul3 at 56.3%, highlighting the significant presence of these resistance genes.
Gen KKS nhóm phenicol có 4 gen trong đó gen chiếm ưu thế bao gồm catlI-13,8%; cmlA6-44,8%; floR-52,8%; gen KKS nhóm tetracyclin có tetM-32,2%
Các gen sinh ESBL được phát hiện trên plasmid bao gồm blaTEM-1 (47 chủng), bla TEM-135 (21 chủng), bla CTX-M-14 (1 chủng) và bla CTX-M-55 (2 chủng) Nghiên cứu cũng ghi nhận 38 gen điều hòa bơm đẩy có mặt ở hầu hết các chủng E coli mang gen mcr-1.
Kết quả cho thấy tương ứng với kết quả tỷ lệ KKS kiểu hình cao ở các chủng
E coli mang gen mcr-1 gặp ở tất cả các loại mẫu phân người, phân động vật, thức ăn và mội trường, rất nhiều các kiểu gen KKS đã được ghi nhận ở các chủng E coli mang gen mcr-1 tương ứng (Bảng 3.7) Biểu hiện kiểu gen KKS có tỷ lệ cao hơn rất nhiều so với biểu hiện kiểu hình KKS gặp ở các chủng phân lập từ phân người và phân động vật ở các KS nhóm β-lactam (CAZ, CTX, FEP)- tỷ lệ KKS trên kiểu hình là 9,6%, 9,6%, 5,8% ở người và 0%, 3,1%, 1% ở động vật trong khi đó tỷ lệ các chủng mang gen KKS của nhóm này ở các mẫu phân người là 34.6% và ở phân động vật là 21.9% Tương tự với các KS nhóm aminoglycozid (GM, AK) với sự khác biệt giữa tỷ lệ KKS kiểu hình và tỷ lệ mang gen KKS ở mẫu phân người là 42,3% và 73,1%, ở phân động vật là 37,5% và 81,3% KS nhóm quinolone (CIP) có biểu hiện kiểu hình và kiểu gen tương đương nhau trong khi đó KS SXT có biểu hiện kháng kiểu hình cao hơn kiểu gen (90,4% so với 76,9% ở phân người; 84,4% và 81,3% ở phân động vật) Mặc dù biểu hiện của kiểu hình KKS của một chủng vi khuẩn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như môi trường ngoại cảnh, sự có mặt của cac ion kim loại…nhưng gen KKS là một yếu tố chính tạo nên sự đề kháng KS [21] Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng trên kiểu hình chỉ phản ánh một phần nổi của tình trạng kháng kháng sinh thật sự của các chủng này Điều này cũng một lần nữa cho thấy để đánh giá đầy đủ tình trạng KKS của chủng vi khuẩn cần phải đánh giá song song cả kiểu hình và kiểu gen của KS
Hầu hết các gen kháng kháng sinh (KKS) thuộc nhóm kháng sinh β-lactam, aminoglycoside, quinolon và sulfonamid đều nằm trên plasmid, điều này làm tăng khả năng lan truyền KKS Sự hiện diện của các gen này giải thích tỷ lệ kháng kháng sinh cao đối với các loại kháng sinh này.
Có 38 gen điều hòa bơm đẩy xuất hiện ở hầu hết các chủng vi khuẩn, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hệ thống bơm đẩy, giúp đẩy kháng sinh ra ngoài tế bào Sự hiện diện của các gen này tạo điều kiện thuận lợi cho việc hình thành các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc.
So sánh đặc điểm kháng kháng sinh (KKS) của các chủng E coli mang gen mcr-1 phân lập từ cộng đồng với các nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy: Nghiên cứu của Katarzyna Ćwiek tại Ba Lan cho thấy 88,2% các chủng E coli mang gen mcr-1 có chứa các gen KKS như β-lactam (bla TEM), tetracyclin (tetA, tetB), và sulfonamid (sul1, sul2, sul3) Tỷ lệ gen tìm thấy trong nghiên cứu này cao hơn so với nghiên cứu của chúng tôi, điều này có thể được giải thích bởi sự khác biệt trong các kỹ thuật phát hiện gen và vùng địa lý nghiên cứu.
Nghiên cứu của Akiyo Nakano và cộng sự tại 72 trang trại ở Nhật Bản đã phát hiện các chủng E coli mang gen mcr-1 cùng với các gen bla từ mẫu phân động vật Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, không ghi nhận sự hiện diện của các gen CTX-M- từ mẫu phân động vật.
Nghiên cứu tại Việt Nam của Nguyễn Quốc Phong và cộng sự đã phát hiện 1 chủng mang gen bla CTX-M-14 và 2 chủng mang gen bla CTX-M-55 từ mẫu phân người Đồng thời, nghiên cứu cũng đánh giá sự phổ biến của gen mcr-1 ở các chủng E coli có sinh enzym β-lactamase trong các mẫu thức ăn sống bán lẻ tại Nha Trang, với các gen phổ biến được xác định là bla TEM và bla CTX-M.
Nghiên cứu cho thấy gen bla CTX-M-1 và bla CTX-M-9 là hai loại gen phổ biến ở các chủng E coli mang gen mcr-1, có khả năng sinh enzym β-lactamase trên người và động vật Trong nghiên cứu của chúng tôi, chỉ phát hiện một chủng E coli mang gen bla CTX-M-14 và hai chủng E coli khác cũng mang gen bla CTX-M-14, tất cả đều được phân lập từ phân người Đây là những gen ít gặp, do đó cần có các nghiên cứu theo dõi dọc để đánh giá tình hình trong cộng đồng.
4.2.2 Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật PFGE
Việc nghiên cứu mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E coli mang gen mcr-1 được phân lập từ phân người, động vật, thức ăn và nước trong hộ gia đình là cần thiết Điều này giúp hiểu rõ cơ chế lan truyền gen kháng kháng sinh (KKS) của các chủng E coli, từ đó đề xuất các biện pháp hiệu quả nhằm ngăn chặn và giảm thiểu sự lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn KKS trong cộng đồng.
Trước khi kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (next-generation sequencing) được phát triển, kỹ thuật PFGE đã đóng vai trò quan trọng trong việc xác định mối liên hệ kiểu gen và đánh giá khả năng lan truyền kháng kháng sinh (KKS) của vi khuẩn Nghiên cứu của chúng tôi đã chọn lọc 240 chủng E coli mang gen mcr-1, bao gồm 136 chủng được phân lập từ phân người và 57 chủng từ phân động vật.
33 chủng từ nước và 14 chủng từ thức ăn nhằm đánh giá mối liên hệ kiểu gen ban đầu từ các chủng này
Kết quả phân tích PFGE cho thấy sự đa dạng rõ rệt về kiểu gen ở các chủng E coli mang gen mcr-1, với 61,3% (147/240 chủng) có độ tương đồng gen ≥ 90%, được phân bố trong 58 nhóm kiểu gen Ngược lại, 38,7% (93/240) các chủng không có mối liên hệ gen và thể hiện sự phân bố kiểu gen phong phú Trong số 58 nhóm kiểu gen có độ tương đồng cao, có 40 nhóm chứa các cụm chủng được phân lập từ một mẫu, bao gồm các nhóm 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 18, 19, 21, 23, 24, 25, 26.
Có 18 nhóm kiểu gen giống nhau nhưng được phân lập từ các hộ khác nhau và/hoặc các loại mẫu khác nhau bao gồm các nhóm 2, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 33, 35,
36, 38, 43, 44, 45, 46, 47, 53 Trong số đó, nhóm kiểu gen số 20, 22 và 38 có các chủng phân lập trong cùng 1 hộ gia đình có kiểu gen giống nhau Nhóm kiểu gen số
Nghiên cứu đã xác định 20 chủng vi khuẩn E coli, trong đó có 4 nhóm kiểu gen, bao gồm 2 chủng phân lập từ phân người và 2 chủng từ phân động vật tại thôn Mậu Chử Nhóm kiểu gen số 22 có 3 chủng, với 2 chủng từ phân của 2 thành viên trong cùng một hộ gia đình và 1 chủng từ hộ khác ở thôn Thạch Tổ Nhóm kiểu gen số 38 cũng có 3 chủng, trong đó 1 chủng từ nước và 1 từ phân động vật trong cùng một hộ, cho thấy sự lan truyền gen KKS mcr-1 giữa người và động vật Các nhóm kiểu gen 2, 6, 22, 38, 43, 45, 46 có chủng vi khuẩn phân lập từ phân, thức ăn và nước trong cùng một thôn, đặc biệt là nhóm kiểu gen 43 với 2 chủng từ nước của 2 hộ khác nhau Điều này cho thấy khả năng lây nhiễm vi khuẩn từ động vật vào nguồn nước, gây ô nhiễm Nhóm kiểu gen 45 và 46 cũng cho thấy sự liên quan giữa ô nhiễm nước và thực phẩm từ cùng một thôn Dương Xá, củng cố giả thuyết về lây truyền qua chuỗi thức ăn Nghiên cứu của Nguyen T Nhung và cộng sự tại Hà Nội cũng chỉ ra rằng nguồn nước thải ô nhiễm chứa gen mcr-1, góp phần vào sự lan truyền gen này trong môi trường nước Các nhóm kiểu gen khác như 12, 14, 16, 33, 35, 36, 44, 47, 53 có chủng vi khuẩn giống nhau nhưng không tìm thấy mối liên quan dịch tễ, có thể do sự lây nhiễm đã trở nên rộng rãi Kết quả PFGE cho thấy 93 chủng không có mối liên quan kiểu gen nhưng có sự phân bố kiểu gen đa dạng, có thể do gen mcr-1 chủ yếu nằm trên plasmid, dẫn đến lây truyền ngang và tạo ra tính đa dạng này.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
Nghiên cứu đã đánh giá thực trạng kháng thuốc và đặc điểm của các chủng E coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng nông thôn Hà Nam Sử dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, nghiên cứu đã chỉ ra sự lây truyền của các chủng E coli và gen mcr-1 qua plasmid Những phát hiện này giúp hiểu rõ cơ chế kháng kháng sinh và nguồn lây nhiễm, từ đó làm cơ sở cho các biện pháp phòng ngừa sự lây lan trong cộng đồng Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian, kinh phí và cỡ mẫu, nghiên cứu chưa thể giải quyết toàn bộ các vấn đề về dịch tễ, vi sinh và sinh học phân tử, vì vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để làm rõ nguồn lây nhiễm và các yếu tố nguy cơ liên quan.
Trong cộng đồng, vi khuẩn E coli mang gen mcr-1 có thể xuất hiện từ nhiều nguồn khác nhau như thức ăn, đất và nước thải Do đó, cần thiết phải tiến hành các nghiên cứu can thiệp để đưa ra giải pháp hạn chế sự lây nhiễm và lan truyền của vi khuẩn này cũng như các vi khuẩn kháng kháng sinh khác trong cộng đồng.
Trong mục tiêu 2 của nghiên cứu, chúng tôi đã cố gắng so sánh đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E coli mang gen mcr-1 với các chủng E coli phân lập tại một số vùng ở Việt Nam trong giai đoạn 2016 – 2018 nhằm đánh giá sự thay đổi về mặt gen học Tuy nhiên, do chỉ thu thập được một số lượng nhỏ chủng E coli mang gen mcr-1 trên lâm sàng (n=7), việc so sánh trở nên hạn chế Do đó, cần thực hiện các nghiên cứu tiếp theo trên cộng đồng để đánh giá sự thay đổi theo thời gian của các chủng E coli mang gen mcr-1 Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam tổng hợp các mẫu từ phân người, phân động vật nuôi, thức ăn và môi trường nước nhằm đánh giá tình trạng kháng colistin của các chủng E coli mang gen mcr-1 tại một vùng nông thôn Bắc Bộ, từ đó cung cấp cái nhìn tổng quan về thực trạng kháng kháng sinh của các chủng này trong cộng đồng.
Nghiên cứu đã xác định các chủng E coli mang gen mcr-1 kháng colistin đang lưu hành trong cộng đồng, đồng thời xác định các replicon plasmid của chúng Điều này giúp làm sáng tỏ cơ chế lây lan của các chủng E coli này trong cộng đồng.
Nghiên cứu đã xác định cấu trúc của một số replicon plasmid phổ biến và các transposon chứa gen mcr-1 trong chủng E coli lưu hành trong cộng đồng, từ đó cung cấp thêm hiểu biết về gen học của các chủng này.