Mục tiêu của luận án là xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn tại Việt Nam bằng phương pháp hình thái học. Xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG ĐỖ NGỌC ÁNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Ký sinh trùng Y học Mã số: 62 72 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 Công trình hồn thành HỌC VIỆN QN Y Cán hƣớng dẫn khoa hoc: PGS.TS Nguyễn Khắc Lực PGS.TS Trần Thanh Dƣơng Phản biện 1: PGS.TS Lê Thanh Hòa Cơ quan: Viện CNSH, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS Đoàn Huy Hậu Cơ quan: Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng vào hồi …… giờ, ngày…… tháng……năm…… Có thể tìm thấy luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Bệnh sán gan lớn (SLGL) người động vật Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) Fasciola gigantica (Cobbold, 1885) gây Đây bệnh nhiệt đới bị lãng quên, lây truyền từ động vật sang người thông qua đường thực phẩm Trong 25 năm qua, tồn giới có khoảng 17 triệu người mắc bệnh 180 triệu người sống vùng nguy nhiễm SLGL Theo Tổ chức Y tế giới (WHO), 2,4 triệu người 70 quốc gia bị ảnh hưởng bệnh SLGL F hepatica F gigantica phân biệt dựa vào hình thái phương pháp hình thái bộc lộ nhiều hạn chế Dạng trung gian (Fasciola sp.) với hình thái kiểu gen hỗn hợp F hepatica F gigantica, xuất nhiều nơi giới bao gồm Việt Nam, khó xác định lồi hình thái Vì vậy, nơi tồn dạng trung gian, giám định loài SLGL, bên cạnh phương pháp hình thái học, ứng dụng sinh học phân tử cần thiết Hiện nay, liệu hình thái phân tử SLGL Việt Nam hạn chế Vì vậy, nghiên cứu hình thái phân tử SLGL cần thiết Đó lý tiến hành đề tài “ t v ts s t s t t Mục tiêu nghiên cứu Xác định số số hình thái phân loại sán gan lớn Việt Nam phương pháp hình thái học Xác định thành phần lồi phân tích số đặc điểm phân tử sán gan lớn Việt Nam Tính khoa học, tính tính thực tiễn đề tài - Bằng việc kết hợp hình thái học sinh học phân tử với gen nhân gen ty thể để nhận dạng, xác định loài SLGL thập vùng địa lý khác Việt Nam nên kết giám định lồi khách quan, xác, tin cậy - Đề tài SLGL Việt Nam có tính đa hình hình thái di truyền với F gigantica dạng trung gian Fasciola sp tồn khu vực địa lý vật chủ khác - Bước đầu tần suất F gigantica dạng trung gian Fasciola sp Việt Nam mà trước chưa nghiên cứu công bố - Cung cấp liệu ban đầu, làm sở cho nghiên cứu tìm hiểu khác biệt bệnh học, đáp ứng miễn dịch… vật chủ nhiễm F gigantica dạng trung gian Fasciola sp Bố cục luận án Luận án gồm 151 trang, gồm: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (36 trang); Đối tượng phương pháp nghiên cứu (29 trang); Kết nghiên cứu (43 trang); Bàn luận (36 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang); 40 bảng số liệu, 29 hình 146 tài liệu tham khảo Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sán gan lớn Fasciola spp bệnh sán gan lớn (Fasciolosis) 1.1.1 Đặc điểm sinh học Fasciola spp - Các loài sán gan lớn phân bố chúng Sán gan lớn (SLGL) thuộc ngành giun dẹt, lớp sán lá, giống Fasciola Hiện tại, giống Fasciola gồm có lồi: F hepatica (Linnaeus, 1758), F gigantica (Cobbold, 1855), F nyanzae (Leiper, 1910) F jacksoni (Cobbold, 1869) Trong đó, F hepatica F gigantica loài gây bệnh chủ yếu người động vật F hepatica phân bố rộng rãi khắp giới, F gigantica phân bố chủ yếu khu vực có khí hậu nhiệt đới Châu Á, Châu Phi - Đặc điểm hình thái sán gan lớn Hì t sán trườ t : F hepatica trưởng thành có kích thước - 15 x 20 – 30 mm F gigantica giống F hepatica, nhiên chiều dài tới 75 mm F gigantica thường thon dài, F hepatica thường ngắn rộng Hì t trứ : Trứng F hepatica giống với trứng F gigantica Trứng F hepatica (150 x 90 μm) nhỏ trứng F gigantica (200 x 100 μm) - Vòng đời sinh học: Vòng đời SLGL đặc biệt lớp sán Chúng có vật chủ phụ ốc, sau hình thành nang thực vật thủy sinh trước nhiễm vào vật chủ theo đường ăn uống Trong đó, hầu hết loại sán khác vòng đời qua vật chủ phụ trước xâm nhập vào vật chủ Hình 1.2 Vịng đời sinh học sán gan lớn - Các yếu tố ảnh hƣởng tới vòng đời sán gan lớn Sự phát triển giai đoạn vòng đời SLGL phù thuộc nhiều vào điều kiện môi trường vật chủ trung gian Trung gian truyền bệnh SLGL loài ốc thuộc họ Lymnaeidae Sự phân bố loài ốc vật chủ trung gian hoàn toàn phù hợp với phân bố SLGL Ở Việt Nam, loài ốc nước Lymaea viridis Lymaea swinhoei xác định vật chủ trung gian chủ yếu SLGL - Quá trình sinh sản, vấn đề lai chuyển gen sán gan lớn Theo K Cwilinski CS (2016), SLGL hình thức sinh sản: tự giao phối, giao phối chéo sinh sản vơ tính Các hình thức sinh sản gặp tự nhiên thực nghiệm Ở số quốc gia Nhật Bản, Việt Nam Hàn Quốc, dạng trung gian Fasciola sp với các thể mang kiểu gen pha trộn loài cá thể lai với gen nhân lồi cịn gen ty thể lồi xác định (còn gọi cá thể chuyển gen) Dạng trung gian ghi nhận gây bệnh người động vật 1.1.2 Triệu chứng, chẩn đoán bệnh Fasciola spp - Triệu chứng lâm sàng: Các triệu chứng bệnh SLGL người thường xuất sau bị nhiễm ấu trùng tuần phụ thuộc vào số lượng sán ký sinh Bệnh chia làm thời kỳ: ủ bệnh, tồn phát, tiềm tàng mạn tính Thời kỳ tồn phát với biểu rõ ràng nên bệnh nhân thường khám phát bệnh Thời kỳ kéo dài - tháng với triệu chứng thường gặp là: sốt, đau bụng vùng hạ sườn phải, rối loạn tiêu hóa, mề đay, gan lách to… - Đặc điểm cận lâm sàng: Các xét nghiệm có giá trị chẩn đốn là: tăng bách cầu toan %, có lên đến 83 %; Siêu âm gan thấy tổn thương hình tổ ong Xét nghiệm ELISA máu dương tính với kháng thể kháng sán gan; Tìm trứng có giá trị chẩn đốn định tỷ lệ dương tính thấp (< %) 1.2 Tỷ lệ nhiễm SLGL ngƣời động vật - Trên giới: Nhiễm SLGL động vật ăn cỏ phổ biến toàn giới, tỷ lệ nhiễm trung bình từ 30 % đến 50 % Ở người, theo Mas-Coma S CS (2004), tồn giới có khoảng 2,4 đến 17 triệu người có nguy nhiễm SLGL, tập trung chủ yếu Châu Á Châu Phi Theo Tổ chức Y tế giới (WHO), 2,4 triệu người 70 quốc gia bị ảnh hưởng bệnh SLGL - Ở Việt Nam: Theo số nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL trâu, bò dao động khoảng từ 30 đến 60% Tỷ lệ nhiễm SLGL trâu thường cao bò mùa mưa tỷ lệ nhiễm thường cao mùa khô Ở người, theo Đặng Thị Cẩm Thạch (2008), tính đến tháng năm 2008 số bệnh nhân nhiễm SLGL > 5.000 người Còn theo Nguyễn Văn Đề CS (2012), tính đến năm 2012, bệnh SLGL Việt Nam lưu hành 52 tỉnh/thành với số người mắc > 20.000 người 1.3 Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola spp 1.3.1 Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola sp phương pháp xác định loài chủ yếu sử dụng hình thái học sinh học phân tử dựa thị phân tử gen ty thể gen nhân tế bào * Phƣơng pháp hình thái học Theo Periago CS (2008), dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), SLGL phân loại thành: nhóm giống với F hepatica (1,65 - 2,76), nhóm giống F gigantica (3,43 - 5,50) nhóm Fasciola sp (2,77 - 3,42) Theo Srimuzipo P CS (2000), dựa vào chiều dài SLGL chia làm nhóm: nhóm nhỏ (< 25 mm), nhóm trung bình (25 - 35 mm) nhóm lớn (> 35 mm) * Phƣơng pháp sinh học phân tử RFLP-PCR giải trình tự công cụ thường lựa chọn Các thị cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể, vùng giao gen ITS1, ITS2 28S thuộc hệ gen nhân thường sử dụng Simsek CS (2011) sử dụng gen cox1 enzyme RsaI AluI để phân biệt F gigantica F hepatica Ichikawa M CS (2010) sử dụng vùng gen chứa đoạn giao gen ITS1 enzyme RsaI để phân biệt F hepatica, F gigantica dạng trung gian Dạng trung gian xác định có nhiều bất thường hình thái phân tử theo hướng phù hợp với loài nên khó xếp loại F hepatica hay F gigantica Vì thế, Mas-Coma CS (2009) cho rằng, dựa vào hệ gen nhân hệ gen ty thể để giám định loài SLGL khơng xác mà cần kết hợp hệ gen 1.3.2 Tính đa hình di truyền di truyền sán gan lớn - Tính đa hình số gen thuộc hệ gen ty thể: Tính đến hết năm 2016, có hệ gen ty thể hồn thiện SLGL giải mã cơng bố ngân hàng gen Chiều dài toàn hệ gen ty thể Fasciola sp 14453 bp, F hepatica 14462 bp F gigantica 14478 bp, bao gồm 12 gen, vùng mã hóa rRNA, 22 vùng mã hóa tRNA, vùng khơng mã hóa số tiểu phần khác - Tính đa hình số gen thuộc hệ gen nhân tế bào: Các vùng giao gen ITS-1 (khoảng 430 bp) ITS2 (khoảng 360 bp) thị phân tử quan trọng để xác định loài SLGL Trên đoạn ITS-2, F hepatica F gigantica có vị trí khác biệt số bị khuyết F gigantica Trên đoạn ITS-1, F gigantica có vị trí khác biệt so với F hepatica Dạng trung gian SLGL có trình tự ITS-1, ITS-2 giao thoa, pha trộn F hepatica F gigantica 1.3.3 Tình hình nghiên cứu xác định lồi sán gan lớn Việt Nam Trước đây, phương pháp giám định hình thái học, số tác giả cho F hepatica F gigantica có mặt Viêt Nam Tuy nhiên, với hỗ trợ sinh học phân tử hầu hết nghiên cứu sau cho SLGL Việt Nam F gigantica dạng trung gian Các nghiên cứu sinh học phân tử chủ yếu lựa chọn gen nad1 cox1 thuộc hệ gen ty thể ITS1, ITS2 thuộc hệ gen nhân Do Việt Nam tồn cá thể dạng trung gian (bao gồm cá thể lai) nên số nghiên cứu sử dụng đơn hệ gen ty thể hệ gen nhân kết luận chưa thực đầy đủ, cụ thể thành phần loài SLGL Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, địa điểm thời gian nghiên cứu 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu - Nghiên cứu hình thái: 316 cá thể SLGL trưởng thành thu từ trâu, bò, dê, cừu 01 cá thể SLGL thu từ người - Nghiên cứu xác định lồi phân tích đặc điểm phân tử: gen cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể vùng giao gen ITS-1, ITS-2 thuộc hệ gen nhân 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu * Địa điểm thu thập mẫu: Miền Bắc (4 tỉnh): Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Điện Biên; Miền Trung-Tây Nguyên (gọi tắt Miền Trung, tỉnh): Nghệ An, Quảng Nam, ĐắkLắk, Phú Yên, Khánh Hịa, Ninh Thuận; Miền Nam (4 tỉnh): Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Tháp, Cần Thơ; * Địa điểm phân tích hình thái phân tử: Học viện Quân y, Hà Nội; 2.1.3 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2013 đến 1/2017 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mơ tả có phân tích dựa kết đặc điểm hình thái phân tử SLGL 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 2.2.2.1 Cỡ mẫu xác định số hình thái - Cỡ mẫu xác định số hình thái tính theo công thức Z2 SD2 /2 n , tham khảo giá trị tỷ số chiều dài/chiều rộng nghiên cứu ( ) Wannasan A CS (2014) quần thể SLGL Thái Lan tính n = 211 Thực tế, tổng số 317 cá thể SLGL toàn vẹn đo đạc số hình thái - Chọn mẫu thu thập mẫu SLGL: cá thể vật chủ trâu, bò, dê, cừu thu thập ngẫu nhiên từ đến 20 SLGL Các mẫu sán thu thập cá thể sán có hình thái tồn vẹn Trong đó, Miền Bắc 121 cá thể, Miền Trung 137 cá thể Miền Nam 59 cá thể; 126 cá thể sán thu từ 15 cá thể bò, 178 sán từ 16 cá thể trâu, sán từ cá thể dê, sán từ cá thể cừu cá thể sán thu từ người - Ghi nhãn mẫu SLGL: mẫu sán dán nhãn ký hiệu với thông tin: năm thu thập, vật chủ, địa điểm thu thập thứ tự mẫu địa điểm Ví dụ: mẫu 15Tr-HN1, thu thập năm 2015 từ trâu (Tr = trâu; B = Bò; C = cừu; D = Dê) Hà Nội Đây cá thể SLGL ghi mẫu năm 2015 Hà Nội 2.2.2.2 Cỡ mẫu giám định lồi phân tích đặc điểm sinh học phân tử - Cỡ mẫu giám định loài + Số lượng SLGL: 224 cá thể sán động vật 01 người SLGL động vật lựa chọn cho thuộc khu vực địa lý vật chủ khác + Chọn mẫu giám định loài sinh học phân tử: Mỗi cá thể vật chủ tiến hành giám định lồi khơng q 10 sán Số lượng sán loại vật chủ sau: bò 106 cá thể, trâu 108 cá thể sán, dê cá thể, cừu cá thể người cá thể - Cỡ mẫu xác định đặc điểm phân tử: 17 trình tự gen cox1, trình tự gen nad1, 16 trình tự ITS1 16 trình tự ITS2 Cụ thể Bảng 2.1: Bảng 2.1 Danh sách mẫu gen đích giải trình tự TT Ký hiệu 15Tr-HN1 15Tr-VP1 SLGL-N Năm thu thập 2015 2015 2010 Nơi thu thập Hà Nội Vĩnh Phúc Hà Nội Gen đƣợc giải trình tự Vật chủ cox1 nad1 ITS1 ITS2 Trâu X X X X Trâu X X X X X Ngƣời X X X 6 10 11 12 13 14 15 16 17 10B-HN1.8 10B-HN1.9 15Tr-NA5 10B-NA1.2 09B-QN1.1 15Tr-KH1 16D-NT1 16D-NT2 16C-NT1 16C-NT2 09B-TN1.1 14B-CT2 15Tr-ĐT1 15Tr-ĐT2 2010 2010 2015 2010 2009 2015 2016 2016 2016 2016 2009 2014 2015 2015 Hà Nội Hà Nội Nghệ An Nghệ An Quảng Nam Khánh Hòa Ninh Thuận Ninh Thuận Ninh Thuận Ninh Thuận Tây Ninh Cần Thơ Đồng Tháp Đồng Tháp Bò Bò Trâu Bò Bò Trâu Dê Dê Cừu Cừu Bò Bò Trâu Trâu X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.2.3 Các phƣơng pháp kỹ thuật sử dụng nghiên cứu hình thái - Các số/chỉ tiêu hình thái khảo sát, xác định: chiều dài thể (BL), chiều rộng thể (BW), tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân (VS-P) - Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu: Vật liệu bảo quản làm tiêu sán, vật liệu đo đạc kích thước sán - Các phương pháp kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: Kỹ thuật làm tiêu sán gan lớn thuốc nhuộm Carmin; Xác định số hình thái theo phương pháp Periago CS (2006, 2008) - Phân nhóm sán gan lớn theo hình thái: theo Srimuzipo CS (2000) dựa vào chiều dài theo Periago CS (2008) dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng 2.2.4 Các phƣơng pháp kỹ thuật sử dụng giám định lồi, phân tích đặc điểm phân tử 2.2.4.1 Các số/chỉ tiêu nghiên cứu sinh học phân tử: kích thước sản phẩm PCR; số lượng, kích thước mảnh cắt giới hạn; tỷ lệ tương đồng nucleotide; số nucleotide (nu), acid amin (aa) sai khác; tỷ lệ nucleotide A, T, G, C 2.2.4.2 Hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu - Hóa chất, sinh phẩm Bảng 2.2 Các mồi kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng Gen đích Cox1 Nad1 ITS1 ITS2 Tên Sản Trình tự Nguồn mồi phẩm JB3 5’-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3’ Bowles 450bp CS, 1992 JB4.5 5’-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3’ Ita10 5′-AAGGATGTTGCTTTGTCGTGG-3′ Itagaki 630bp CS, 2005 Ita2 5′-GGAGTACGGTTACATTCACA-3′ ITS1-F 5′-TTGCGCTGATTACGTCCCTG-3’ Itagaki 680bp CS, 2005 ITS1-R 5′-TTGGCTGCGCTCTTCATCGAC-3′ ITS2-F 5’-TGTGTCGATGAAGAGCGCAG-3’ Itagaki 550bp CS, 2005 ITS2-R 5’-TGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3’ Các sinh phẩm chạy PCR; Các enzyme RsaI, AluI, MspI, KpnI (Thermo, Mỹ); Các hóa chất chạy điện di tách chiết ADN - Các thiết bị chủ yếu đƣợc sử dụng nghiên cứu gồm: buồng mix PCR, máy PCR, máy ly tâm lạnh, máy vortex, máy điện di, máy chụp gel… 2.2.4.3 Các phương pháp, kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu - Kỹ thuật tách chiết kiểm tra nồng độ ADN tổng số từ SLGL trưởng thành - Khuyếch đại gen SLGL phản ứng PCR: Phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl thực với chu trình nhiệt: chu kỳ 94 oC/10 phút, 35 chu kỳ [94 oC/30 giây, 53oC với gen cox1, 55 oC/45 giây với gen khác, 72 oC 40 giây], sau chu kỳ 72 oC/10 phút cuối chu kỳ oC - Cắt giới hạn sản phẩm PCR (RFLP): Tổng thể tích cắt giới hạn 16 μl, gồm: μl sản phẩm PCR, μl enzyme giới hạn, μl đệm 10X, μl H2O Hỗn dịch ủ 37 oC có lắc - 12 ghi hình máy UVP (Canada) - Điện di sản phẩm PCR sản phẩm cắt giới hạn gel Agarose - Đọc phân tích trình tự máy ABI 3130xl Gentic Analyzer 2.2.4.4 Phân loại sán gan lớn kỹ thuật PCR-RFLP - Phân loại SLGL theo Simsek S CS (2011) dựa vào kết PCR-RFLP với cặp mồi JB3, JB4.5 enzyme RsaI, AluI Bảng 2.3 Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi JB3, JB4.5 kích thƣớc mảnh cắt giới hạn với enzyme RsaI, AluI Loài sán F hepatica F gigantica Sản phẩm PCR với Sản phẩm cắt giới mồi JB3, JB4.5 (bp) hạn với RsaI (bp) 450 450 450 180, 270 Sản phẩm cắt giới hạn với AluI (bp) 340, 110 450 - Phân loại SLGL theo Ichikawa M CS (2010) dựa vào kết PCR-RFLP với cặp mồi ITS1-F, ITS1-R enzyme RsaI Bảng 2.4 Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R kích thƣớc mảnh cắt giới hạn với enzyme RsaI Loài sán F hepatica Fasciola sp F gigantica Sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R (bp) 680 680 680 Sản phẩm cắt giới hạn với RsaI (bp) 360, 100, 60 360, 170, 100, 60 360, 170, 60 - Cá thể xác định F hepatica F gigantica thị phân tử hệ gen ty thể hệ gen nhân cá thể thuộc lồi - Cá thể dạng trung gian phân loại làm nhóm theo K Cwiklinski CS (2016), bao gồm: Nhóm các thể có kiểu gen hỗn hợp (hệ gen nhân có dạng tổ hợp lồi F hepatica F gigantica) nhóm cá thể lai (cá thể có hệ gen nhân thuộc lồi cịn hệ gen ty thể thuộc loài kia) 2.2.4.5 Xác định đặc điểm phân tử sán gan lớn dựa vào đa hình kiểu gen đơn bội (haplotype): Kiểu gen đơn bôi gen nghiên cứu xác định dựa vào so sánh với trình tự tham chiếu ngân hàng gen 2.3 Đạo đức y đức nghiên cứu: Các vấn đề nghiên cứu Hội đồng khoa học Hội đồng y đức Viện SR - KST - CT Trung ương thông qua cho phép tiến hành Nghiên cứu bảo đảm vấn đề đạo đức y đức nghiên cứu y sinh học, tuân thủ nguyên tắc bảo mật thông tin đối tượng nghiên cứu Các số liệu, liệu nghiên cứu đảm bảo đầy đủ, khách quan, trung thực 2.4 Xử lý phân tích kết nghiên cứu 2.4.1 Xử lý số liệu hình thái: Số liệu hình thái đo đạc, tính tốn phân loại dựa vào kích thước chiều dài theo Srimuzipo CS (2000) tỷ số chiều dài/chiều rộng theo Periago CS (2008) 2.4.2 Xử lý số liệu sinh học phân tử: Trình tự mẫu so sánh phân tích ngân hàng gene, phả hệ phân tích trình tự phần mềm Maga 6, mức độ tương đồng thành phần nu A, C, G, T đoạn gen tính tốn cơng cụ nucleotide composition phần mềm Bioedit Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xác định số số hình thái phân loại SLGL vào hình thái học 3.1.1 Xác định số số hình thái sán gan lớn 3.1.1.1 Kết x ts ỉs ì t s - Đối với sán gan lớn thu thập từ động vật Trong 316 cá thể SLGL thu động vật có 120 cá thể Miền Bắc (37,97 %), 137 cá thể Miền Trung (43,36 %) 59 cá thể Miền Nam (18,67 %) a b Hình 3.2 Chiều dài SLGL thu từ Điện Biên Bắc Giang năm 2010 (a: Mẫu SLGL bò Điện Biên; b: mẫu SLGL bò Bắc Giang) Bảng 3.1 Một số số hình thái SLGL khu vực nghiên cứu Chỉ số hình thể (mm) BL BW BL/BW VS-P Giá trị Min - Max X ± SD Min - Max X ± SD Min - Max X ± SD Min - Max X ± SD Miền Bắc ( n= 120 ) 16,00 - 36,00 26,55 ± 3,70 6,00 - 12,00 9,87 ± 1,15 1,73 - 4,46 2,72 ± 0,46 14,50 - 33,00 23,38 ± 3,50 Miền Trung (n = 137) 13,00 - 46,00 26,78 ± 5,02 6,50 - 15,00 9,21 ± 1,32 1,69 - 6,57 2,95 ± 0,63 12,00 - 43,50 24,13 ± 4,96 Miền Nam (n = 59) 18,00 - 45,00 30,96 ± 6,96 5,00 - 13,00 9,05 ± 1,91 1,58 - 5,83 3,51 ± 0,86 16,00 - 42,00 28,21 ± 6,81 Chung (n=316) 13,00 - 46,00 27,47 ± 5,27 5,00 - 15,00 9,43 ± 1,43 1,58 - 6,57 2,97 ± 0,68 12,00 - 43,50 24,61 ± 5,18 11 Hình 3.6 (1) Hình 3.7 (2) Sản phẩm PCR (với mồi JB3, JB4.5) mảnh cắt giới hạn enzyme RsaI AluI số mẫu SLGL Hình 3.6a: giếng 1-7: sản phẩm PCR; M: thang DNA chuẩn 50bp; Hình 3.6b: giếng 1-7 sản phẩm cắt giới hạn; giếng M: thang DNA chuẩn 50bp Hình 3.7a: giếng 1-4: sản phẩm cắt với RsaI, M: thang DNA 50bp; Hình 3.7b: giếng 1-4: sản phẩm cắt với AluI, M: thang DNA 50bp; giếng 5: chứng âm + Với enzyme AluI: Cả 225 mẫu sản phẩm PCR không bị cắt enzyme AluI, phù hợp với F gigantica - Kết thẩm định số cá thể SLGL dựa vào so sánh trình tự nucleotide đoạn gen cox1 với ngân hàng gen So sánh trình tự nucleotide chứa phần gen cox1 với ngân hàng gen cho thấy, 17 trình tự phù hợp với F gigantica Đoạn gen cox1 có nhóm kiểu gen đơn bội, đa số thuộc nhóm H8-CO1.FgVN (11 trình tự: 15Tr-HN1, 15TrVP1, 15Tr-DT2, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 10B-NA1.2, 16D-NT1, 16D-NT2, 16C-NT1, 16C-NT2 SLGL-N); cịn lại thuộc nhóm H9-CO1.FgVN (1 trình tự, 15Tr-KH1); H5-CO1.FgVN (1 trình tự, 09B-TN1.1); H4-CO1.FgVN (1 trình tự, 15Tr-NA5) H3-CO1.FgVN (3 trình tự, 15Tr-DT1, 09B-QN1.1, 14B-CT2) - Kết phân tích quan hệ phả hệ SLGL Việt Nam dựa vào thị cox1 a b Hình 3.8 (a) Hình 3.10 (b) Cây phả hệ xác định mối quan hệ loài chủng Fasciola spp dựa trình tự đoạn gen cox1 (447 bp) gen nad1 (535bp), xây dựng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap 1.000 lần lặp lại 12 3.2.1.2 Kết s bằ dự v ỉt e ty t d1 Đối với đoạn gen nad1, mẫu có trình tự phù hợp với F gigantica Trên đoạn gen có kiểu gen đơn bội, nhóm H1-ND1.FgVN với trình tự 15Tr-HN, 15Tr-VP1, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 16D-NT1, 16C-NT1 SLGL-N 01 trình tự thuộc nhóm H5-ND1.FgVN (15Tr-NA5) 3.2.1.3 Kết k uế e , s bằ PCR-RFLP dự v ỉt e ITS1 v e zy e Rs I - Kết khếch đại gen ITS-1 Với cặp mồi ITS1-F ITS1-R, toàn 225 mẫu DNA SLGL nhân gen thành công Tất cho band kết có kích thước khoảng 680 bp - Kết phân loại loài SLGL phƣơng pháp PCR-RFLP dựa vào thị gen nhân ITS-1 enzyme RsaI Hình 3.11 Minh họa sản phẩm PCR cắt giới hạn với RsaI đoạn gen 680bp Trong 225 cá thể sán phân tích, có 184 cá thể thuộc nhóm F gigantica (81,78 %), 41 cá thể thuộc nhóm Fasciola sp (18,22 %) Bảng 3.16 Phân bố loài SLGL theo khu vực địa lý Loài SLGL Miền Bắc Miền Trung Miền Nam Tổng F gigantica (n, %) Fasciola sp.(n, %) 67 (76,14) 21 (23,86) 68 (80,95) 16 (19,05) 49 (92,45) (7,55) 184 (81,78) 41 (18,22) Tổng (n, %) 88 (100,0) 84 (100,0) 53 (100,0) 225 (100,0) Cả Miền Bắc, Miền Trung Miền Nam tồn cá thể SLGL dạng trung gian (Fasciola sp.) Tần suất xuất cá thể trung gian khu vực Miền Bắc cao (23,86 %) thấp khu vực Miền Nam (7,55 %) Bảng 3.17 Phân bố lồi SLGL theo vật chủ Lồi SLGL Bị Trâu Dê Cừu Người Tổng F gigantica (n, %) Fasciola sp (n, %) 88 (83,02) 18 (16,98) 90 (83,33) 18 (16,67) 3 2 184 (81,78) 41 (18,22) Tổng (n, %) 106 (100,0) 108 (100,0) 225 (100,0) SLGL loài động vật trâu, bò, dê, cừu tồn cá thể trung gian Cá thể SLGL người loài F gigantica 13 Bảng 3.18 Phân bố lồi theo nhóm kích thƣớc chiều dài SLGL Nhóm kích thƣớc F gigantica (n, %) Nhỏ 43 (68,25) Trung bình 123 (88,49) Lớn 18 (78,26) 184 (81,78) Tổng Fasciola sp (n, %) 20 (31,75) 16 (11,51) (21,74) 41 (18,22) Tổng (n, %) 63 (100,0) 139 (100,0) 23 (100,0) 225 (100,0) SLGL nhóm kích thước tồn cá thể có kiểu gen dạng trung gian (Fasciola sp.) Tần suất xuất cá thể trung gian nhóm SLGL có kích thước nhỏ cao (31,75 %) thấp nhóm SLGL có kích thước trung bình (11,51 %) - Kết phân loại SLGL dựa vào thị gen nhân ITS-1 Dựa trình tự đoạn giao gen ITS1, trình tự phù hợp với F hepatica, 11 trình tự phù hợp với F gigantica trình tự thuộc kiểu trung gian 11 trình tự thuộc nhóm H0-ITS1.FgVN SLGL-N, 16D-NT2, 16C-NT1, 16C-NT2, 10BHN1.8, 09B-QN1.1, 09B-TN1.1, 14B-CT2, 15Tr-VP1, 15Tr-NA5, 15Tr-DT1 Có trình tự thuộc nhóm H1-ITS1.FgVN 15Tr-HN1, thuộc nhóm H2ITS1.FgVN 16D-NT1 thuộc nhóm H3-ITS1.FgVN 10B-NA1.2 Có trình tự thuộc nhóm H5-ITS1.FgVN 10B-HN1.9 15Tr-DT2 - Kết phân tích mối quan hệ phả hệ chủng SLGL Việt Nam dựa vào thị gen ITS-1 100 F.g_AB514855.1(ITS1Zambia) F.g_AB207142.1(ITS1Zambia) FasVN4-ITS1(16Cuu-NT1) FasVN3-ITS1(16D-NT2) FasVN1-ITS1(SLGL-N) AB514853.1_F.g(ITS1-Thailand) FasVN5-ITS1(16Cuu-NT2) FasVN06-ITS1(10B-HN1.8) FasVN08-ITS1(09B-QN1.1) FasVN10-ITS1(09B-TN1.1) FasVN11-ITS1(14B-CT2) 62 FasVN13-ITS1(15Tr-VP1) FasVN14-ITS1(15Tr-NA5) F.g_AB207143.1(ITS1Indonesia) F.g_AB207144.1(ITS1Thailand) F.g_AB385614.1(ITS1Vietnam) F.g_AB514854.1(ITS1Thailand) 72 F.g_AB514857.1(ITS1Vietnam) F.g_KC476171.1(ITS1Bangladesh) F.g_LC076127.1(ITS1Egypt) F.sp_AB207146.1(ITS1Japan) 76 F.sp_AB211238.1(ITS1Korea) KF425321.1_F.g(ITS1-Egypt) 90 FasVN15-ITS1(15Tr-DT1) FasVN12-ITS1(15Tr-HN1) 92 35 FasVN2-ITS1(16D-NT1) FasVN09-ITS1(10B-NA1.2) AB514866.1_F.sp(ITS1-Japan) F.g_KC424482.1(ITS1Bangladesh) AB514847.1_F.h(ITS1-Uruguay) 62 FasVN07-ITS1(10B-HN1.9) FasVN16-ITS1(15Tr-DT2) F.h_AB207140.1(ITS1Australia) F.h_AB207141.1(ITS1Ireland) 29 F.h_LC076147.1(ITS1Egypt) F.h_LC076196.1(ITS1Egypt) F.sp_AB207145.1(ITS1Japan) F.sp_AB385611.1(ITS1Vietnam) F.sp_AB514861.1(ITS1China) 41 F.h_KJ689325.1(ITS1Peru) F.h_KJ689333.1(ITS1Peru) F.h_GQ231546.1(ITS2Tunissi) AF040935.1_P.westermani(ITS1-Malaysia) 0.05 Hình 3.12 Cây phả hệ xác định mối quan hệ loài chủng Fasciola spp dựa trình tự đoạn giao gen ITS1 (432 bp), xây dựng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap 1.000 lần lặp lại 14 Hình rằng, cá thể 15Tr-DT2 10B-HN1.9 có quan hệ gần gũi với F hepatica (AB514847.1, Uruguay) Fasciola sp (AB514866.1, Nhật Bản) Còn lại có quan hệ gần gũi với F gigantica (AB514853.1, Thái Lan) 3.2.1.4 Kết s bằ ỉt e ITS-2 - Kết khuếch đại đoạn gen ITS-2 phân nhóm SLGL Kết nhân đoạn giao gen ITS2 cặp mồi ITS2-F ITS2-R cho thấy, toàn ADN 225 cá thể cho kết PCR với band kích thước 540 bp điện di gel agarose % Dựa trình tự đoạn giao gen ITS2, có trình tự phù hợp với F gigantica Có kiểu gen đơn bội trình tự H0-ITS2.FgVN (6 trình tự), H1ITS2.FgVN (5 trình tự) H6-ITS2.FgVN (2 trình tự) Khơng có trình tự cá thể thuộc nhóm H2, H3, H4 H5-ITS2.FgVN - Kết phân tích mối quan hệ phả hệ chủng SLGL Việt Nam dựa vào thị gen ITS-2 Hình 3.14 Cây phả hệ xác định mối quan hệ loài chủng Fasciola spp dựa trình tự đoạn giao gen ITS2 (360 bp), xây dựng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap 1.000 lần lặp lại Hình cho thấy, 11 cá thể 15Tr-NA5, SLGL-N, 14B-CT2, 09B-TN1.1, 09B-QN1.1 15Tr-ĐT1… có quan hệ gần gũi với F gigantica 02 cá thể SLGL 10B-HN1.9 15Tr-ĐT2 có quan hệ gần gũi với F hepatica Fasciola sp trình tự ITS2 cịn lại khơng hồn thiện, có bất thường nucleotide số 435 Kết phân tích PCR-RFLP với gen nhân gen ty thể khơng có mẫu SLGL thuộc nhóm F hepatica chủng Với thị gen cox1, mẫu SLGL phù hợp với F gigantica Tuy nhiên, thị ITS1 chi có 41/225 15 (18,22 %) cá thể thuộc nhóm SLGL trung gian (Fasciola sp.), lại 184/225 (81,78 %) cá thể thuộc nhóm F gigantica Bảng 3.21 Bảng liên quan phân loại hình thái với kết phân tích lồi PCR-RFLP SLGL thu từ động vật Phân loại theo BL/BW F hepatica-like Fasciola sp.-like F gigantica-like Tổng số Kết phân loại PCR-RFLP (n, %) F gigantica Fasciola sp 67 (36,61) 25 (60,98) 75 (40,98) 11 (26,83) 44 (22,41) (12,19) 183 (100,0) 41 (100,0) Tổng số (n, %) 92 (41,07) 86 (38,39) 46 (20,54) 224 (100) Bảng 3.22 Bảng liên quan phân loại hình thái với kết phân tích lồi PCR-RFLP mẫu đƣợc so sánh trình trình tự Tên mẫu 15Tr-HN1 15Tr-VP1 15Tr-KH1 15Tr-NA5 15Tr-DT1 15Tr-DT2 10B-HN1.8 10B-HN1.9 09B-QN1.1 10B-NA1.2 09B-TN1.1 14B-CT2 16D-NT1 16D-NT2 16C-NT1 16C-NT2 SLGL-N Chỉ số hình thái BL/ BL BW BW 23,0 11,0 2,09 26,0 10,0 2,60 30,5 10,0 3,05 30,5 11,0 2,77 36,5 12,0 3,04 35,0 9,0 3,89 26,0 11,0 2,36 25,0 10,5 2,38 29,0 7,0 4,14 29,5 11,0 2,68 40,0 13,0 3,08 24,0 6,0 4,0 19,0 7,0 2,71 20,0 6,5 3,08 21,0 6,5 3,23 22,0 6,0 3,67 30,5 9,5 3,21 Phân nhóm theo tỷ lệ BL/BW F hepatica-like F hepatica-like Fasciola sp.-like Fasciola sp.-like Fasciola sp.-like F gigantica-like F hepatica-like F hepatica-like F gigantica-like F hepatica-like Fasciola sp.-like F gigantica-like F hepatica-like Fasciola sp.-like Fasciola sp.-like F gigantica-like - Phân nhóm theo BL Nhỏ Trung bình Trung bình Trung bình Lớn Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Trung bình Kết luận lồi theo SHPT Fasciola sp., trộn lẫn F gigantica Fasciola sp., trộn lẫn F gigantica F gigantica Fasciola sp., lai F gigantica Fasciola sp., lai F gigantica Fasciola sp., trộn lẫn F gigantica F gigantica Fasciola sp., trộn lẫn F gigantica F gigantica F gigantica F gigantica Các kết phân loại SLGL theo hình thái phân tử cho thấy, phân loại hình thái không tương đồng với phân loại sinh học phân tử 3.2.2 Kết xác định số đặc điểm phân tử 3.2.2.1 Kết xác định số đặc điểm phân tử thị gen cox1 Kết so sánh ngân hàng gen cho thấy, 17 mẫu có tỷ lệ tương đồng cao với SLGL Các trình tự tương đồng cao với F gigantica Fasciola sp (tỷ lệ tương đồng trung bình > 98 %), tương đồng thấp với F hepatica (tỷ lệ tương đồng trung bình thấp < 94 %) So sánh trình tự nucleotide đoạn gen cox1 SLGL Việt Nam F gigantica (KF543342.1, Trung Quốc) cho thấy, có 11 vị trí xuất sai khác số nucleotide sai khác tối đa chủng không Số nucleotide sai khác cụ thể 16 chủng SLGL Việt Nam so với chủng Fasciola sp (KF543343.1, China) không Tuy nhiên, so với chủng F hepatica (AF216697.1, Australia) số nucleotide sai khác > 25 Hình 3.16 Minh họa số vị trí có sai khác nucleotide gen cox1 17 mẫu SLGL Việt Nam so với SLGL giới Nucleotide số 67, 75, 93 117 F hepatica (AF216697.1-Autralia) có khác biệt so với F gigantica (KF543342.1, Trung Quốc) Fasciola sp (KF543343.1, China) so với SLGL Việt Nam Riêng chủng 15TrNA5 09B-TN1.1 khơng có vị trí cắt enzyme RsaI (GTAC) AluI (AGCT) Nucleotide A vị trí 189 thay G giống F hepatica (AF216697.1-Autralia, M93388.1) Tất mẫu SLGL nghiên cứu khơng có vị trí nhận diện cắt AluI (AGCT), vị trí lại xuất F hepatica (AF216697.1, Autralia) 3.2.2.2 Kết xác định số đặc điểm phân tử thị gen nad1 Tỷ lệ tương đồng đoạn gen nad1 SLGL nghiên cứu với loài SLGL khẳng định công bố ngân hàng gen sau: so với F gigantica (AB385616.1, Việt Nam) tỷ lệ tương đồng 99,4 %; so với Fasciola sp (AB536756.1, Việt Nam), mẫu 15Tr-NA5 có tỷ lệ tương đồng 98,5 %, mẫu lại tương đồng 99,6 %; so với F hepatica (AB477361.1, Trung Quốc) tỷ lệ tương đồng SLGL Việt Nam < 91,4 % Có vị trí nucleotide xuất sai khác chủng SLGL nghiên cứu so với chủng F gigantica (AB385616.1, Vietnam) Chủng SLGL phân lập từ người (SLGL-N), 15Tr-VP1, 15Tr-HN1, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 16DNT1 16C-NT1 có vị trí sai khác, sai khác dẫn tới sai khác acid amin vị trí số 38 so với F gigantica (AB385616.1, Vietnam) tương đồng hoàn toàn so với Fasciola sp (AB536756.1, Việt Nam) Riêng chủng 15Tr-NA5 có vị trí sai khác nucleotide, dẫn đến sai khác so với F gigantica (AB385616.1, Vietnam) vị trí acid amin số 79 3.2.2.3 Kết xác định số đặc điểm phân tử đoạn giao gen ITS-1 Kết phân tích cho thấy, đoạn ITS1 hầu hết chủng SLGL nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng > 99,0 % chủng với với Fasciola giới 14/16 chủng SLGL Việt Nam có tỷ lệ tương đồng với F gigantica cao với F hepatica 2/16 chủng (10B-HN1.9 15Tr-DT2) có kết ngược lại, tương đồng với F hepatica cao với F gigantica 17 Bảng 3.28 Các vị trí có sai khác nucleotide SLGL Việt Nam SLGL giới đoạn giao gen ITS1 Loài/Chủng SLGL F gigantica F gigantica F gigantica F gigantica F gigantica F gigantica F hepatica F hepatica F hepatica F hepatica F hepatica Fasciola sp Fasciola sp Fasciola sp SLGL_N 16D-NT1 16D-NT2 16C-NT1 16C-NT2 10B-HN1.8 10B-HN1.9 09B-QN1.1 10B-NA1.2 09B-TN1.1 14B-CT2 15Tr-HN1 15Tr-VP1 15Tr-NA5 15Tr-DT1 15Tr-DT2 Vị trí biến đổi nu trình tự đoạn giao gen ITS1 24 114 208 286 306 T T T A T T T T A T T T T A T T T T A T T T T A T T T T A T C A C T C C A C T C C A C T C C A C T C C A C T C T T T A T C A C T C C A C T C T T T A T Y T T W T T T T A T T T T A T T T T A T T T T A T C A C T C T T T A T Y T T T C T T T A T T T T A T Y T T A T T T T A T T T T A T T T T A T C A C T C Mã số Quốc gia AB514853.1 AB207143.1 KC476171.1 AB514855.1 AB514857.1 KF425321.1 AB514847.1 AB207140.1 AB207141.1 KJ689325.1 LC076147.1 AB211238.1 AB385611.1 AB514861.1 Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Thailand Indonesia Bangladesh Zambia Vietnam Egypt Uruguay Australia Ireland Peru Egypt Korea Vietnam China Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam So sánh tương đồng nucleotide đoạn giao gen ITS1 cho thấy, hầu hết chủng SLGL nghiên cứu sai khác không nucleotide so với SLGL F gigantica ngân hàng gen Tuy nhiên, riêng mẫu 10B-HN1.9 15Tr-DT2 có vị trí nucleotide có sai khác với F gigantica Các sai khác biến đổi theo hướng phù hợp với F hepatica Fasciola sp 3.2.2.4 Kết xác định số đặc điểm phân tử đoạn giao gen ITS-2 Kết phân tích rằng, ngoại trừ cá thể 10B-HN1.9 15Tr-ĐT2, các thể SLGL nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng với F gigantica 18 (KF543340.1, China) đạt 99.7% Riêng cá thể 10B-HN1.9 15Tr-ĐT2 tương đồng với F gigantica 98,3% với F hepatica 100% Hình 3.20 Minh họa vị trị có sai khác nucleotide đoạn giao gen ITS2 SLGL Việt Nam so với SLGL giới Hình cho thấy, số vị trí cá thể 10B-HN1.9 15Tr-ĐT2 biến đổi theo hướng giống với F hepatica vị trí 207 231 C chuyển thành T, vị trí 270 276 T chuyển thành C, vị trí 334 A thành G Ngồi 10B-HN1.9 15Tr-ĐT2 có nu T chèn thêm vào vị trí 327 làm cho vị trí giống với F hepatica Trong mẫu khác sán F gigantica khơng có vị trí Bảng 3.30 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn giao gen ITS2 SLGL Việt Loài/Chủng SLGL F gigantica Fasciola sp F hepatica 09B-TN1.1 14B-CT2 09B-QN1.1 10B-HN1.8 10B-HN1.9 SLGL-N 15Tr-NA5 15Tr-DT1 15Tr-DT2 15Tr-VP1 16D-NT2 16c-NT1 16c-NT2 Nam giới Vị trí có sai khác nucleotide 207 218 231 270 276 327 334 C T T C C C C T C C C T C C C C T T T T T T C T T T T T C C C C C T T C C C C T C C C T C C C C T C C T T T T C T T T C T T T T T C C T T T T C T T T C T T T T T T T T - A G G A A A A G A A A G A A A A Mã số Quốc gia KF543340.1 Trung Quốc KF543341.1 Trung Quốc AB973396.1 Ireland Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam Bảng cho thấy, có vị trí xuất sai khác đoạn ITS-2 chủng SLGL Việt Nam so với F gigantica (KF543340.1, China) Các chủng 10B-HN1.9 15Tr-DT2 có sai khác, sai khác theo hướng biến đổi giống với Fasciola sp F hepatica Các chủng lại khơng có sai khác so với F gigantica (KF543340.1, China) 19 Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 Về kết xác định số số hình thái phân lồi sán gan lớn dựa vào hình thái 4.1.1 Về kết xác định phân tích số số hình thái Về kết xác định số số hình thái sán gan lớn Việt Nam Trong nghiên cứu này, số hình thái xác định, đo đạc theo phương pháp Periago CS (2006, 2008) Về hình thái chung, hầu hết mẫu SLGL có dạng thon dài, vai hẹp phù hợp với hình thái F gigantica Tuy vậy, có khơng cá thể có kích thước ngắn, bầu, vai rộng hình dạng giống với hình thái F hepatica (ví dụ mẫu Điện Biên-Hình 3.2a) Trong số này, nhiều cá thể khơng quan sát thấy trứng tử cung Đối với SLGL phân lập từ động vật, BL dao động từ 13,00 đến 46,00 mm (trung bình 27,47 ± 5,27 mm), BW dao động từ 5,00 đến 15,00 mm (trung bình 9,43 ± 1,43 mm), tỷ số BL/BW dao động từ 1,58 đến 6,57 (trung bình 2,97 ± 0,68) VS-P dao động từ 12 đến 43,5 mm (trung bình 24,61 ± 5,18) Đối với mẫu SLGL người, số BL, BW, BL/BW VS-P có giá trị 30,50 mm, 9,50 mm, 3,21 26,50 mm Nhìn hình dạng ngồi, mẫu SLGL người có hình dáng ngồi điển hình lồi F gigantica chiều dày thể mỏng mẫu SLGL thu từ động vật Ngoài ra, quan sát tử cung khơng thấy có trứng sán Điều mẫu SLGL người thu từ vị trí lạc chỗ nên chưa trưởng thành hoàn toàn, mẫu SLGL thu từ động vật lấy từ đường dẫn mật nên cá thể trường thành Phân tích, so sánh số hình thái sán gan lớn Việt Nam với sán gan lớn giới khu vực Khi so sánh kích thước chiều dài SLGL nghiên cứu với F hepatica F gigantica Iran (quần thể SLGL định danh) thấy rằng, chiều dài SLGL vật chủ nghiên cứu lớn F hepatica ngắn F gigantica (p < 0,05) Phân tích chiều dài SLGL Iran cho thấy, chiều dài F hepatica F gigantica chủng Iran khơng có khoảng gối lên nhau, chiều dài F hepatica ngắn rõ rệt so với F gigantica (11,47 - 30,02 mm 29,97 - 62,39 mm) Nếu lấy số để tham chiếu chiều dài SLGL Việt Nam có kích thước trung gian F hepatica F gigantica Các kết so sánh số VS-P tương tự kết so sánh chiều dài Chỉ số BL/BW nghiên cứu dao động từ 1,58 - 6,57, trung bình 2,97 ± 0,68 So sánh với quần thể SLGL chủng Iran, số lớn F hepatica (2,97 ± 0,68 so với 2,24 ± 0,03; p < 0,05) nhỏ F gigantica (2,97 ± 0,68 so với 5,74 ± 0,07; p < 0,05) Kết tương tự so sánh số BL/BW nghiên cứu với số BL/BW số quần thể F hepatica F gigantica chủng nghiên cứu Periago CS (2006, 2008) Riêng mẫu SLGL người nghiên cứu này, hình thái 20 ngồi điển hình F gigantica số BL/BW 3,21 nằm vị trí trung gian F hepatica F gigantica Tuy nhiên, mẫu SLGL thu từ người cá thể lạc chỗ ký sinh, chưa trưởng thành nên so sánh hay phân nhóm mẫu sán có phần chưa thực xác Từ kết phân tích rằng, số số kích thước SLGL Việt Nam nằm khoảng giao thoa loài F hepatica F gigantica Mặc dù quần thể SLGL đem so sánh không tương đồng địa lý vật chủ thu thập đặc điểm hình thái nhiều cá thể khơng điển hình, giống với F hepatica F gigantica rõ ràng gợi ý giả thuyết tồn dạng trung gian và/hoặc loài SLGL Việt Nam 4.1.2 Về kết phân loại sán gan lớn dựa vào hình thái Về kết phân loại sán gan lớn Dựa kết số chiều dài, SLGL phân làm nhóm nhỏ, trung bình lớn dựa theo cơng bố trước Srimuzipo P CS (2000) Theo cách phân nhóm này, SLGL Việt Nam chủ yếu thuộc nhóm có kích thước nhỏ (29,43 %) trung bình (62,34 %) Nhóm có kích thước lớn chiếm 8,23 % Các nhóm hình thài thấy vùng miền vật chủ khác Riêng mẫu SLGL người, kích thước chiều dài thuộc nhóm trung bình Tỷ lệ nhóm nhỏ, trung bình lớn nghiên cứu có khác biệt so với Wannasan A CS (2014) nghiên cứu quần thể SLGL Thái Lan Sự khác biệt việc thu thập mẫu vật chủ vùng địa lý khác Mặt khác, nghiên cứu chưa khảo sát hình thái yếu tố tác động khác dạng nhị bội hay tam bội, dinh dưỡng vật chủ, tuổi vật chủ… SLGL cịn phân loại thành nhóm: giống với F hepatica (F hepaticalike), giống Fasciola sp (Fasciola sp.-like) giống với F gigantica (F giganticalike), dựa vào số chiều dài/chiều rộng theo Periago CS (2008) Theo cách phân loại này, nhóm F hepatica-like chiếm tỷ lệ cao với 44,30 %, nhóm Fasciola sp.-like (dạng trung gian) chiếm tỷ lệ 38,61 % nhóm F gigantica-like chiếm tỷ lệ thấp với 17,09 % Theo phân loại này, nhóm hình thái gặp tất vùng miền vật chủ Tuy nhiên, theo số tác giả, phân loại SLGL theo theo phương pháp Periago CS (2006, 2008) khơng thực xác, khu vực tồn cá thể lai với sán vùng giao thoa, nơi loài Fasciola tồn song song Nghiên cứu Ghavami CS (2009) Iran dẫn chứng Phân tích, so sánh hình thái học sán gan lớn nghiên cứu với số nghiên cứu trƣớc Việt Nam Một số nghiên cứu khác Việt Nam cho thấy có đa hình hình thái SLGL Kết giám định loài sinh học phân tử phát tồn dạng trung gian Fasciola sp., thể tam bội nghiên cứu trước góp phần giải thích tính đa dạng hình thái SLGL Việt Nam Điều lần chứng minh nơi tồn cá thể SLGL dạng trung gian việc phân loại SLGL hình thái gặp nhiều khó khăn Ngồi ra, kích thước SLGL cịn 21 phụ thuộc vào sán thể lưỡng bội, tam bội hay hỗn hợp, vấn đề chưa phân tích nên kết có giới hạn định Mặc dù vậy, kết cung cấp liệu quan trọng hình thái cho thấy hình thái SLGL Việt Nam có tính đa hình 4.2 Kết xác định thành phần lồi phân tích số đặc điểm phân tử sán gan lớn Việt Nam 4.2.1 Về kết xác định thành phần loài sán gan lớn Việt Nam Để xác định lồi SLGL, chúng tơi sử dụng PCR-RFLP hệ gen nhân (đoạn giao gen ITS1) hệ gen ty thể (1 đoạn gen cox1) Dựa thị gen cox1, toàn 225 cá thể SLGL thuộc nhóm F gigantica Tuy nhiên, kết cắt giới hạn RsaI có 10 chủng SLGL động vật không phù hợp với lý thuyết F gigantica (không bị cắt giới hạn làm mảnh) Điều giải thích kết giải trình tự cho thấy đoạn ADN gen cox1 phân tích, vị trí nhận dạng cắt giới hạn enzyme RsaI (GT/AC) có nu bị biến đổi, A chuyển thành G Chính thay đổi làm cho enzyme RsaI không nhận diện vị trí cắt nên sản phẩm PCR khơng bị cắt giới hạn điều cho thấy gen cox1 SLGL Việt Nam có tính đa hình di truyền Dựa thị ITS1, phương pháp PCR-RFLP có 41 cá thể thuộc dạng trung gian, 184 mẫu F gigantica Như vậy, phương pháp PCR-RFLP dựa phân tích thị gen nhân (ITS1) gen ty thể (cox1), nghiên cứu xác định kiểu gen SLGL Việt Nam F gigantica dạng trung gian (Fasciola sp.) 4.2.2 Về số đặc điểm phân tử sán gan lớn Việt Nam 4.2.2.1 Một số đặc điểm phân tử thị gen ty thể cox1 Toàn 17 trình tự chứa đoạn gen cox1 phù hợp với F gigantia Kết so sánh trình tự phù hợp với kết phân tích PCR-RFLP Dựa vào số nucleotide sai khác với F gigantica (KF543342.1, Trung Quốc), SLGL Việt Nam có 11 điểm đa hình với tổng số nucleotide sai khác tối đa có kiểu gen đơn bội (haplotype) Cụ thể: 11 trình tự thuộc nhóm H8-CO1.FgVN 15Tr-HN1, 15TrVP1, 15Tr-DT2, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 10B-NA1.2, 16D-NT1, 16D-NT2, 16C-NT1, 16C-NT2 SLGL-N; nhóm H4-CO1.FgVN, H5-CO1.FgVN, H9CO1.FgVN có trình tự, tương ứng 15Tr-NA5, 09B-TN1.1, 15Tr-KH1; có trình tự nhóm H3-CO1.FgVN 15Tr-DT1, 14B-CT2 09B-QN1.1 4.2.2.2 Một số đặc điểm phân tử thị gen ty thể nad1 Đoạn gen nad1 phân tích có kích thước 535 bp Tồn trình tự so sánh phù hợp với F gigantica Các chủng SLGL-N, 15Tr-VP1, 15Tr-HN1, 10B-HN1.8, 10B-HN1.9, 16D-NT1, 16C-NT1 có vị trí sai khác giống so với F gigantica (AB385616.1, Việt Nam) xếp vào nhóm haplotype H1ND1.FgVN, kiểu sai khác chủng 15Tr-NA5 khác chủng lại nên xếp vào nhóm H2-ND1.FgVN Như vậy, dựa vào trình tự đoạn gen nad1 này, ghi nhận có haplotype SLGL Việt Nam Các phân tích gen nad1 rằng, SLGL Việt Nam có quan hệ gần gũi với F gigantica Châu Á so 22 với F gigantica Châu Âu, Châu Phi xa so với F hepatica Một mặt cho thấy tính đa hình di truyền gen nad1 SLGL Việt Nam 4.2.2.3 Một số đặc điểm phân tử thị gen nhân ITS1 Một số nghiên cứu cho đoạn 680 bp khuếch đại cặp mồi ITS1-F, ITS1-R có điểm khác biệt F gigantica F hepatica Đối với SLGL Việt Nam, với đoạn gen 680 bp này, thể 10B-HN1.9 15TrDT2 (trong số 16 cá thể giải trình tự) có đoạn ITS1 tương đồng hồn tồn với F hepatica thuộc haplotype H1 (KF982049.1, Iran), Fasciola sp (AB385611.1, Việt Nam; AB207145.1, Nhật Bản) Điều đáng nói là, cá thể lại có hệ gen ty thể phù hợp với F gigantica Như vậy, cá thể có gen nhân thuộc F hepatica cịn gen ty thể thuộc F gigantica Theo số nghiên cứu, cá thể cá thể lai, kết lai F gigantica (dòng mẹ) F hepatica (dòng bố) Các cá thể dạng xác nhận SLGL Việt Nam số nước khu vực Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản, giới Ngồi phân tích tồn đoạn dài 680 bp, phần trình tự 432 bp hồn chỉnh đoạn ITS1 phân tích Kết so sánh cho thấy, có khơng q vị trí nu sai khác SLGL Việt Nam so với SLGL giới Các sai khác nằm vị trị số 24, 114, 208, 286 306 giống Mas-Coma S CS (2014) thông báo Có kiểu gen đơn bội từ H0-ITS1FgVN đến H5ITS1FgVN, với 11 cá thể thuộc nhóm H0-ITS1.FgVN, cá thể thuộc nhóm H1ITS1.FgVN, cá thể thuộc nhóm H2-ITS1.FgVN, cá thể thuộc nhóm H3ITS1.FgVN cá thể thuộc nhóm H5-ITS1.FgVN 4.2.2.4 Một số đặc điểm phân tử thị gen nhân ITS2 Đoạn ITS2 SLGL Việt Nam Thế giới chia làm nhóm, nhóm dài 361 bp (F gigantica) nhóm 362 bp (F hepatica) So sánh trình tự nhóm thấy có vị trí xuất sai khác nu số 207 (C/T), 218 (T/C), 231 (C/T), 270 (T/C), 276 (T/C), 327(-/T) 334 (A/G) Đáng lưu ý, ví trí số 327 nhóm 361 bp vị trí khuyết, cịn nhóm 362 bp “T” Theo số tác giả, đặc điểm khác biệt nu đoạn giao gen ITS2 khác biết ví trí 327 đoạn gen có tính định phân biệt F gigantica F hepatica Đặc điểm số tác giả sử dụng để xác định cá thể lai ngoại lồi hay lai chéo ngược quần thể SLGL Trình tự ITS2 SLGL Việt Nam có kiểu gen đơn bội H0-ITS2.FgVN, H1-ITS2.FgVN H6-ITS2.FgVN Trong số 13 trình tự ITS2 phân tích, có trình tự thuộc nhóm H6-ITS2.FgVN 10B-HN1.9 (Hà Nội) 15Tr-DT2 (Đồng Tháp) có kích thước 362 bp, 11 trình tự ITS2 lại 361 bp (H0ITS2.FgVN H1-ITS2.FgVN) Kết so sánh trình tự cho thấy, nhóm H0ITS2.FgVN H1-ITS2.FgVN phù hợp với SLGL F gigantica, nhóm H6ITS2.FgVN phù hợp với F hepatica Trên phả hệ, nhóm H0-ITS2.FgVN H1-ITS2.FgVN thuộc nhánh F gigantica, cịn nhóm H6-ITS2.FgVN thuộc nhánh F hepatica Điều lần cho thấy cá thể SLGL 10B- 23 HN1.9 (Hà Nội) 15Tr-ĐT2 (Đồng Tháp) có gen nhân ITS2 phù hợp với F hepatica giống ITS1 Còn lại trình tự khơng phân tích kiểu gen đơn bội xuất lỗi từ vị trí 435 Theo Wannasan A CS (2014), tượng pha trộn kiểu gen loài F gigantica F hepatica Riêng chủng SLGL phân lập từ người có gen nhân gen ty thể phù hợp với F gigantica Kết giám định loài cá thể sán PCR-RFLP dựa thị cox1, ITS1 phù hợp với kết so sánh trình tự với ngân hàng gen Từ kết phân tích cho thấy cá thể SLGL phân lập từ người F gigantica chủng KẾT LUẬN Về hình thái phân loại sán gan lớn Việt Nam theo hình thái học Sán gan lớn Việt Nam có chiều dài dao động từ 13,00 đến 46,00 mm (trung bình 27,47 ± 5,27 mm), chiều rộng 5,00 - 15,00 mm (trung bình 9,43 ± 1,43 mm), tỷ số chiều dài/chiều rộng 1,58 - 6,57 (trung bình 2,97 ± 0,68), khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân 12,00 - 43,50 (trung bình 24,61 ± 5,18 mm) Có đa hình hình thái sán gan lớn Việt Nam Dựa theo chiều dài thể, đa số sán gan lớn thuộc nhóm nhỏ (29,43 %) nhóm trung bình (62,34 %); nhóm kích thước lớn chiếm 8,23 % Các kiểu hình thái gặp khu vực địa lý vật chủ khác Về thành phần loài số đặc điểm sinh học phân tử sán gan lớn Việt Nam 2.1 Về thành phần loài Trong số 225 cá thể SLGL Việt Nam nghiên cứu này, có 81,78 % cá thể F gigantica 18,22 % cá thể dạng trung gian Fasciola sp (không xếp loại F gigantica hay F hepatica) Cả F gigantica Fasciola sp xuất vùng địa lý vật chủ khác (trâu, bò, dê, cừu, người) 2.2 Về đặc điểm phân tử Nghiên cứu bước đầu cho thấy: - SLGL Việt Nam có tính đa hình di truyền, bao gồm loại: + F gigantica chiếm 81,78 %: cá thể có gen ty thể gen nhân phù hợp với F gigantica chủng ngân hàng gen + Dạng trung gian Fasciola sp (không xếp loại F gigantica hay F hepatica) chiếm 18,22 %, cá thể chia làm nhóm: Nhóm cá thể có kiểu gen nhân hỗn hợp lồi sán F gigantica F hepatica; Nhóm cá thể lai với gen ty thể phù hợp với F gigantica hệ gen nhân phù hợp với F hepatica - Đối với đoạn gen cox1: Đoạn nucleotide chứa phần gen cox1 tất mẫu SLGL phân tích phù hợp với F gigantica Trên đoạn nucleotide kích 24 thước 450 bp chứa phần đoạn gen cox1 có kiểu gen đơn bội (haplotype), với kiểu H8-CO1.FgVN gặp phổ biến - Đối với đoạn gen nad1: Đoạn gen nad1 mẫu SLGL phân tích có trình tự phù hợp với F gigantica Trên đoạn gen phân tích ghi nhận có kiểu gen đơn bội, với kiểu H1-CO1.FgVN gặp phổ biến - Đối với đoạn giao gen ITS1 Đoạn ITS1 có kiểu gen: kiểu phù hợp với F gigantica, kiểu phù hợp F hepatica kiểu hỗn hợp Trên đoạn gen phân tích có kiểu gen đơn bội Trong kiểu H0-ITS1.FgVN phù hợp hoàn toàn với F gigantica chủng gặp phổ biến (11/16) Kiểu H5-ITS1.FgVN phù hợp với F hepatica, gặp 2/16 trình tự phân tích - Đối với đoạn giao gen ITS2 Đoạn ITS2 có kiểu: kiểu phù hợp với F gigantica, kiểu phù hợp F hepatica kiểu hỗn hợp Trên đoạn gen phân tích có kiểu gen đơn bội H0-ITS2.FgVN, H1-ITS2.FgVN (phù hợp với F gigantica) H6-ITS2.FgVN (phù hợp với F hepatica) KIẾN NGHỊ - Khi phân loại sán gan lớn Việt Nam không nên dựa vào đặc điểm hình thái mà cần phối hợp với khảo sát đồng thời gen nhân gen ty thể để kết thẩm định loài sán gan lớn xác - Tiếp tục phân tích, so sánh biến đổi di truyền, khác biệt đáp ứng miễn dịch vật chủ nhiễm cá thể sán gan lớn dạng trung gian Fasciola sp so với nhiễm cá thể sán gan lớn F gigantica - Tiếp tục thu thập thêm phân tích đặc điểm phân tử sán gan lớn gây bệnh người để thấy tính đa hình, biến đổi di truyền sán gan lớn gây bệnh người động vật DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Duy Bắc, Hà Huỳnh Hồng Vũ, Huỳnh Hồng Quang, Trần Thanh Dương, Nguyễn Khắc Lực (2016), Đặc điểm số số hình thái sán gan lớn thu thập Việt Nam, Tạp chí Y học Việt Nam, Tập 446, Tháng 9, Số 1, tr: 5-9 Đỗ Ngọc Ánh, Lê Trần Anh, Phạm Văn Minh, Trần Thanh Dương, Nguyễn Khắc Lực (2016), So sánh hình thái sán gan lớn trưởng thành thu thập trâu bò Việt Nam, Tạp chí phịng chống Sốt rét bệnh Ký sinh trùng, Số (93), tr: 78-83 Đỗ Ngọc Ánh, Bùi Văn Tuấn, Nguyễn Thu Hương, Trần Thanh Dương, Đặng Thị Cẩm Thạch, Nguyễn Văn Thoại, Nguyễn Đức Tân, Nguyễn Hữu Hưng, Nguyễn Khắc Lực (2016), Xác định loài sán gan lớn phân lập từ động vật Việt Nam kỹ thuật PCR-RFLP dựa thị gen ty thể COI gen nhân ITS2, Tạp chí phịng chống Sốt rét bệnh Ký sinh trùng, Số (94), tr: 23-30 ... Xác định số số hình thái phân loại sán gan lớn Việt Nam phương pháp hình thái học Xác định thành phần lồi phân tích số đặc điểm phân tử sán gan lớn Việt Nam Tính khoa học, tính tính thực tiễn... (ITS1) gen ty thể (cox1), nghiên cứu xác định kiểu gen SLGL Việt Nam F gigantica dạng trung gian (Fasciola sp.) 4.2.2 Về số đặc điểm phân tử sán gan lớn Việt Nam 4.2.2.1 Một số đặc điểm phân tử thị... gigantica (KF543340.1, China) 19 Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 Về kết xác định số số hình thái phân lồi sán gan lớn dựa vào hình thái 4.1.1 Về kết xác định phân tích số số hình thái Về kết xác định số số