Luận văn thạc sĩ nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật polymerase chain reaction trong chẩn đoán viêm âm đạo cổ tử cung do chlamydia trachomatis tại bệnh viện đại học y thái bình

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Trần Thị Hòa NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM ÂM ĐẠO - CỔ TỬ CUNG DO Chlammydia trachomatis TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS LƯƠNG XUÂN HIẾN Hà Nội, Năm 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Chlamydia trachomatis .3 1.2 Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis .6 1.2.1 Nuôi cấy .6 1.2.2 Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays – EIAs) .7 1.2.3 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody - DFA) .8 1.2.4 Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) 1.3 Các nghiên cứu Chlamydia trachomatis giới nƣớc 10 1.3.1 Các nghiên cứu giới .10 1.3.2 Các nghiên cứu nƣớc 18 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 23 2.1.1 Đối tƣơn g nghiên cƣ́ u 23 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 23 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.2 PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U 23 2.2.1 Phƣơng pháp chọn mẫu cỡ mâu 23 2.2.2 Kỹ thuật xét nghiệm 24 2.2.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 24 2.2.2.2 Xử lý mẫu .24 2.2.2.3 Tách chiết ADN 25 2.2.2.4 Tối ƣu hóa phản ứng PCR 25 2.2.2.5 Xác định độ nhạy phản ứng PCR 29 2.2.2.6 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng 30 2.2.2.7 Xác điṇ h tỷ lê ̣nhiêm Chlamydia trachomatis bệnh nhân viêm âm đạo , cổ tƣ̉ cung đến khám bệnh viện Đại học Y Thái Bình t tháng đến tháng 10 năm 2011 31 2.2.2.8 Điê di, phân tích kết qua.̉ 31 n 2.2.3 Xƣ̉ lý số liêu 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .33 3.1 Tối ƣu hoá phản ƣ́ ng PCR phat́ hiên Chlamydia trachomatis 33 3.1.1 Nồng độ MgCl2 33 3.1.2 Nồng độ mồi 35 3.1.3 Thời gian nhiệt độ gắn mồi 37 3.1.4 Số chu kỳ 40 3.2 Độ nhạy kỹ thuật PCR 43 3.3 Độ đặc hiệu kỹ thuật PCR 44 3.4 Kết xét nghiệm kỹ thuật PCR 44 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .50 DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen vi khuẩn Chlamydia trachomatis… Hình 1.2 Chu kỳ vịng đời vi khuẩn C.trachomatis… Hình 1.3 Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis số nƣớc Châu Âu 10 Hình 3.1 Ảnh điện di kết tối ƣu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL1/KL2 34 Hình 3.2 Ảnh điện di kết tối ƣu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6… 35 Hình 3.3 Ảnh điện di kết tối ƣu nồng độ mồi KL5/KL6… 36 Hình 3.4 Ảnh điện di kết tối ƣu nồng độ mồi KL1/KL2 36 Hình 3.5 Ảnh diện di kết tối ƣu nhiệt độ gắn mồi KL1/KL2 .38 Hình 3.6 Ảnh diện di kết tối ƣu nhiệt độ gắn mồi KL5/KL6 .38 Hình 3.7 Ảnh diện di kết tối ƣu thời gian gắn mồi KL5/KL6… 39 Hình 3.8 Ảnh diện di kết tối ƣu thời gian gắn mồi KL1/KL2… 40 Hình 3.9 Ảnh diện di kết tối ƣu chu kỳ phản ứng… 40 Hình 3.10 Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai lần vi khuẩn C trachomatis… 43 Hình 3.11 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm 45 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR lần thứ nhất… 41 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR lần thứ nhất… .42 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR lần 42 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR lần 2… 43 Bảng 3.5 Kết xét nghiệm C.trachomatis 45 Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo độ tuổi… 46 Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo khu vực… 47 56 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT C trachomatis Chlamydia trachomatis DFA Direct Fluorescent Antibody EIAs Enzyme Immuno Assays LPS Lipopolysaccharide MOMP Major Outer Membrane Protein NAATs Nucleic Acid Amplication Tests PCR Polymerase Chain Reaction TPHA Treponema Pallidum Hemagglutination Assay 58 MỞ ĐẦU Hiện nay, vấn đề nóng bỏng chăm sóc sức khỏe sinh sản mà nƣớc giới đối mặt bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục Viêm đƣờng sinh dục Chlamydia trachomatis đƣợc coi bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục đứng đầu giới Nhiễm Chlamydia trachomatis thƣờng gây viêm niệu đạo, viêm cổ tử cung Tuy nhiên nế u không điề u tri ̣có thể dân đêń ng nhƣ cać biêń chƣ́ viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngồi tử cung, vơ sinh tổn thƣơng ống dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn cao Tổ chức Y tế giới ƣớc tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm Chlamydia trachomatis đƣợc phát [34] Bệnh Chlamydia trachomatis hay gặp ngƣời trẻ tuổi, độ tuổi sinh đẻ Các nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên Tại Châu Âu từ năm 1996-2003, số bệnh nhân nhiễm Chlamydia trachomatis tăng gấp đôi, Hoa Kỳ số tăng 14% giai đoạn 2000-2005 [15, 18] Ở Việt Nam khoảng vài năm gần vấn đề nhiễm khuẩn Chlamydia trachomatis đƣợc ý Một vài nghiên cứu đƣa tỷ lệ khoảng 30% trƣờng hợp đến khám phụ khoa có tiết dịch đƣờng âm đạo bất thƣờng Chlamydia trachomatis Nguy hiểm nhiễm Chlamydia trachomatis qua đƣờng sinh dục có tới 75% nữ giới 50% nam giới mắc bệnh mà khơng có triệu chứng, ngƣời bệnh hồn tồn khơng biết nhiễm vi khuẩn [2,9] Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis ngƣời ta thƣờng dùng xét nghiệm nuôi cấy- tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định nhiễm Chlamydia trachomatis Tuy nhiên xét nghiệm có hạn chế phải bảo đảm vi khuẩn cịn sống q trình vận chuyển đến phịng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng rộng rãi y học để phát tồn vi sinh vật mẫu bệnh phẩm Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) NAATs có độ nhạy độ đặc hiệu cao, nhiều nghiên cứu xem PCR tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị xét nghiệm chẩn đoán khác Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm cho phép xác định tồn vi khuẩn dịch âm đạo, tử cung bệnh nhân Với mong muốn đóng góp vào cơng tác chăm sóc sức khỏe nói chung cơng tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứ u ứ ng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung Chlamydia trachomatis Bệnh viện Đại học Y Thái Bình” với mục tiêu: - Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thực phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis - Xác điṇ h tỷ lê ̣ nhiêm cổ tử cung Chlamydia trachomatis bệnh nhân viêm âm đạo, Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Chlamydia trachomatis Chlamydia trachomatis thuộc chi Chlamydia, họ Chlamydiaceae, lớp Chlamydiae, ngành Chlamydiae, giới Bacteria [2, 9] Về hình thái quan sát dƣới kính hiển vi quang học, vi khuẩn có hình cầu hình bầu dục, kích thƣớc khác nhau, vi khuẩn Gram âm có màng lipopolisaccharide Vì thiếu số enzyme tổng hợp hợp chất cao sử dụng cho tế bào, vi khuẩn phải ký sinh nội bào bắt buộc, khả sống sót bên ngồi tế bào Hệ gen Chlamydia trachomatis gồm phân tử DNA dài 1.042.519 nucleotide với 894 trình tự mã hóa cho protein Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen vi khuẩn Chlamydia trachomatis ( Theo Deborah Dean et al., (2009) Predicting Phenotype and Emerging Strains among Chlamydia trachomatis Infections, CDC Home Vol 15.(9)) Chlamydia trachomatis (C.trachomatis) chứa đến 10 plasmid có kích thƣớc 7.5 kb Trình tự nucleotide plasmid trình tự bảo thủ cao (có dƣới 1% nucleotide thay thế), chứa khung đọc mở (Open Reading Frame) mã hoá gen kháng nguyên Mặc dù chức plasmid chƣa xác định hết nhƣng trình NC20s 30s 40s M NC: Chứng âm, khơng có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion) Hình 3.8 Ảnh diện di kết tối ưu thời gian gắn mồi KL1/KL2 3.1.4 Số chu kỳ Phản ứng PCR tiến hành với hai cặp mồi, số chu kỳ với cặp mồi đƣợc thay đổi để thu đƣợc kết tốt thời gian ngắn Phản ứng PCR vòng đƣợc tiến hành với số chu kỳ 20, 25 30 chu kỳ Với cặp mồi KL5/KL6, phản ứng đƣợc chuẩn bị khối lƣợng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG Chu trình nhiệt: 37°C 15 phút biến tính ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC; phút 59ºC; phút 72°C) 20, 25, 30 chu kỳ, bƣớc kéo dài 20 phút 72°C giữ 4°C Sau tiến hành phản ứng PCR vòng 2, phản ứng đƣợc chuẩn bị khối lƣợng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl 2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, µl sản phẩm phản ứng PCR vòng 1,0.05 U UNG theo chu kỳ Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC, 40s 55ºC, phút 72°C) 20, 25, 30 chu kỳ bƣớc kéo dài phút 72°C Quan sát kết điện di hình 3.9 34 56 9M Hình 3.9 Ảnh diện di kết tối ưu chu kỳ phản ứng Giếng số đến giếng số 3: 20 chu kỳ PCR lần 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần Giếng số đến giếng số 6: 25 chu kỳ PCR lần 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần Giếng số đến giếng số 9: 30 chu kỳ PCR lần 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần Kết thấy giếng số 3, số số 7, với tổng số 50 chu kỳ phản ứng PCR kết khếch đại tốt giếng số (25 chu kỳ với cặp mồi KL5/KL6 25 chu kỳ PCR lần với cặp mồi KL1/KL2) Giếng số số hiệu khuếch đại thấp, không sử dụng Các giếng khác cho băng điện di rõ nét nhƣng chúng tơi khơng sử dụng thời gian xét nghiệm dài Giếng số cho băng nhỏ giếng số thành phần nguyên liệu phản ứng cạn kiệt dẫn đến đứt gãy DNA chu kỳ biến tính cịn lại Kết tƣơng tự với giếng số số Vì chúng tơi lựa chọn 25 chu kỳ với cặp mồi KL5/KL6 25 chu kỳ PCR lần với cặp mồi KL1/KL2 để thực phản ứng PCR phát vi khuẩn C trachomatis Với kết rút ngắn thời gian tiến hành hai phản ứng PCR xuống cịn Từ kết trên, chúng tơi chọn đƣợc điều kiện tối ƣu cho phản ứng PCR nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl số chu kỳ tối ƣu cho phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis Điều kiện tối ƣu kỹ thuật PCR nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl nồng độ mồi đƣợc thể qua bảng sau: Bảng 3.1: Thành phần phản ứng PCR vịng Thành phần phản ứng PCR Thể tích Mastermix 2X 12.5µl H2O khử ion vơ trùng 4.4µl MgCl2 (mM) 2.1µl 2.1mM Mồi KL5/KL6 1µl 0.4 pmol UNG 0.05 µl 0.05 U DNA template 5µl Tổng Nồng độ 25µl Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vịng Nhiệt độ Thời gian (phút : giây) Số chu kỳ 37ºC 15:00 95ºC 10:00 94ºC 01:00 59ºC 01:00 72ºC 01:00 72ºC 20:00 4ºC ∞ 25 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR vòng Thành phần phản ứng PCR Thể tích Mastermix 2x 12.5µl H2O khử ion vơ trùng 9µl Nồng M ̣ gCl2 (mM) 1.5µl 1.5mM Nồng độ mồi 1µl 0.4 pmol PCR product 1µl Tổng Nồng độ 25µl Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vòng Nhiệt độ Thời gian (phút : giây) Số chu kỳ 95ºC 10:00 94ºC 01:00 55ºC 00:40 72ºC 01:00 72ºC 20:00 4ºC ∞ 25 3.2 Độ nhạy kỹ thuật PCR Phản ứng PCR gồm hai lần chạy đƣợc thực với mẫu chứng dƣơng plasmid có nồng độ khác nhau: 101, 102, 103, 104 sao/µl sử dụng 10 µl để điện di gel agarose 1% M Hình 3.10 Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai vòng vi khuẩn C.trachomatis Kết điện di (hình 3.10) cho thấy phản ứng dƣơng tính (quan sát đƣợc băng DNA sau nhuộm ethidium bromide) mẫu có từ 10 plasmid trở lên Dựa kết đánh giá độ nhạy kỹ thuật PCR, lựa chọn nồng độ DNA chuẩn để làm chứng dƣơng cho phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis mẫu bệnh phẩm 101 Sử dụng chứng dƣơng nồng độ làm giảm nguy ngoại nhiễm khuếch tán sản phẩm PCR lần trình chuyển sản phẩm khuếch đại lần sang tuýp thứ hai Độ nhạy thuận lợi cho thực tế phát bệnh số lƣợng vi khuẩn mẫu bệnh phẩm thấp Tuy so với nghiên cứu Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini Esteban Serra, phản ứng nested PCR sử dụng hai cặp oligonucleotides (KL5/KL6 KL1/KL2) làm mồi phát 10 EB phản ứng mẫu sinh học khác nhau, độ nhạy phản ứng chƣa cao Do đề xuất thử nghiệm PCR điều kiện nghiêm ngặt nhằm tăng giá trị độ nhạy 3.3 Độ đặc hiệu kỹ thuật PCR Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi KL1, KL2 đƣợc thực với mẫu DNA vi khuẩn Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci mẫu DNA có sẵn phịng thí nghiệm nhƣ: mẫu DNA ngƣời, Escherichia Coli, Mycobacteria Tuberculosis, Hepatitis B virus, Human Papilloma virus Các phản ứng sau thực đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% cho kết âm tính Điều chứng tỏ độ đặc hiệu cao 100% phản ứng PCR, không khuếch đại sản phẩm đối tƣợng khác kể loài Chlamydia khác 3.4 Kết xét nghiệm kỹ thuật PCR Phản ứng hai vịng NAATs có độ nhạy độ đặc hiệu cao Tuy nhiên khả ngoại nhiễm lớn Để giảm thiểu nguy ngoại nhiễm, chúng tơi sử dụng bốn phịng riêng biệt, để pha mix, để chuẩn bị mẫu PCR lần 1, tạo phản ứng PCR lần phòng điện di Trong phản ứng sử dụng dUTP thay cho dCTP đồng thời sử dụng enzyme Uracyl-N-Glycosylase (UNG) nồng độ 0,05U Enzyme có tác dụng phân cắt liên kết N- glycosylic Uracyl glucose sản phẩm ngoại nhiễm có chứa dUTP phản ứng thành dUTP tự do, vơ hiệu hố amplicon nhiễm từ đợt PCR trƣớc tránh đƣợc kết dƣơng tính giả Do vậy, trƣớc thực chu kỳ khuếch đại chu trình PCR, cần ủ bệnh phẩm 37ºC 15 phút với enzyme UNG để phá trình tự sản phẩm PCR nhiễm từ đợt trƣớc Các chu trình khuếch đại làm bất hoạt hoạt tính UNG với nhiệt độ 55ºC Sau chạy xong chu kỳ khuếch đại, ủ mẫu 72ºC thời gian 20 phút để bất hoạt hồn tồn hoạt tính UNG, khơng gây cản trở cho việc đọc kết PCR Kết dƣơng tính giả cịn đƣợc loại trừ chứng âm thực đồng thời với xét nghiệm mẫu nhƣng thay DNA khuôn nƣớc khử ion vô trùng Kết âm tính giả đƣợc hạn chế đến mức thấp phản ứng có độ nhạy cao, phát đƣợc kết dƣơng tính có mặt 10 EB Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm đƣợc thể hình 3.11 NC1 M4 Hình 3.11 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm NC: Chứng âm, khơng có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion) Giếng số 1,3,4: Mẫu bệnh phẩm dương tính Giếng số 2: Mẫu bệnh phẩm âm tính Giếng số 5: Chứng dương M: Thang DNA 100 bp Fermentas với kích thước vạch 100 bp Tỷ lệ dƣơng tính C.trachomatis số bệnh nhân đến khám phòng khám Sản phụ khoa, bệnh viện Đại học Y Thái Bình thể bảng 3.5 PCR Số lượng Tỷ lệ phần trăm Dƣơng tính 80 36.9 % Âm tính 137 63.1 % Tổng 217 100% Bảng 3.5 Kết xét nghiệm C.trachomatis Trong số 217 bệnh nhân có biểu viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng đến tháng 10 năm 2011 có 80 ngƣời có kết dƣơng tính với C.trachomatis chiếm tỷ lệ 36.9% Kết cao nghiên cứu Trần Thị Lợi đối tƣợng viêm âm đạo, cổ tử cung năm 1999 có tỷ lệ 32.5% [8]; bệnh viện da liễu thành phố Hồ Chí Minh năm 2008 với xét nghiệm PCR tỷ lệ 35.7% [6]; bệnh viên phong da liễu Quy Hòa 12.1% [5] Trong nghiên cứu tỷ lệ thấp bệnh viên phong da liễu Quy Hịa cỡ mẫu cịn Kết cao nhiều so với nghiên cƣ́ u của Farhad B Hashemi và côṇ g sƣ ̣ Iran năm 2006 [16] Tuy nhiên nghiên cứu Sóc Trăng đối tƣợng phụ nữ mại dâm tỷ lệ dƣơng tính với C.trachomatis 48.4% [3], cao nghiên cứu Kết xét nghiệm chƣa phản ánh đƣợc tồn quần thể cịn có đối tƣợng nhiễm bệnh nhƣng khơng có biểu viêm nhiễm nên không khám, xét nghiệm lần đƣợc áp dụng Thái Bình Vì vậy, với kết dƣơng tính cao nhƣ trên, đề xuất việc triển khai xét nghiệm vi khuẩn C.trachomatis bệnh viện Đại học Y Thái Bình đối tƣợng nữ có khơng có biểu viêm nhiễm sinh dục nhằm kiểm soát lây nhiễm vi khuẩn qua đƣờng tình dục Đồng thời đề nghị tiến hành nghiên cứu thêm cỡ mẫu lớn để khẳng định kết Tiếp tiến hành thống kê số bệnh nhân theo nhóm tuổi Kết thu đƣợc thể bảng 3.6 Bệnh nhân theo nhóm Số mẫu dương tuổi tính 35 (n=88) 32 36.4% Tỷ lệ Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo độ tuổi Kết cho thấy nhóm dƣới 25 tuổi có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C.trachomatis cao nhất, chiếm 40.6% Nghiên cứu tác giả Bulhak Koziol V cộng [33] tỉnh Balan cho thấy tỷ lệ dƣơng tính với vi khuẩn 39.5%, gần tƣơng đƣơng với kết chúng tơi Sự khác biệt tỷ lệ dƣơng tính nhóm dƣới 25 tuổi 35 tuổi có ý nghĩa thống kê với p