Ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật

Virus khơng có cấu trúc tế bào dưới tế bào, genome chỉ chứa một trong hai loại acid nucleic, ký sinh bắt buộc trong tế bào cảm thụ, sinh sản theo cấp số nhân và di truyền được nòi giống;

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC TẾ HỒNG BÀNG

GVHD: TS Nguyễn Tuấn Anh

PGS.TS Nguyễn Thị Nga Học viên: Hồ Cao Quốc Thịnh – 2326080032

Nguyễn Đoàn Tường Uyên - 2326080046 Học phần: Thực hành Y sinh học di truyền

Chuyên đề:

ỨNG DỤNG

KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH LƯỢNG VI

SINH VẬT

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024

2

MỤC LỤC

I TỔNG QUAN 3

1 Định nghĩa vi sinh vật: 3

2 Kỹ thuật PCR và Real-time PCR: 10

3 Ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật: 20

II BỆNH LÝ COVID–19 22

1 Mức độ lan truyền của COVID-19: 22

2 Triệu chứng của COVID-19: 23

3 Cơ chế sinh bệnh: 24

4 Phương pháp định lượng virus Sar CoV-2: 25

III VIÊM GAN SIÊU VI B 34

1 Phân loại viêm gan siêu vi B: 35

2 Triệu chứng của bệnh viêm gan B: 36

3 Các đường lây nhiễm của bệnh Viêm gan siêu vi B: 37

4 Cấu trúc Virus Viêm gan B: 38

5 Cơ chế gây bệnh: 39

6 Một số chỉ số trong xét nghiệm quan trọng trong viêm gan siêu vi B: 40

7 Phương pháp định lượng Hepatitis B virus (HBV): 40

III VIÊM GAN SIÊU VI C 46

1 Tổng quan: 46

2 Khả năng gây bệnh: 48

3 Dịch tễ học Viêm Gan C: 48

4 Đường lây truyền: 49

5 Một số xét nghiệm quan trọng trong viêm gan siêu vi C: 50

7 Phương pháp định lượng Hepatitis C virus (HCV): 51

Vi khuẩn là những đơn bào không có màng nhân (procaryote) và cùng với virus hợp thành môn Vi sinh vật học, tiếng Anh gọi là Microbiology Vi khuẩn có đầy đủ các đặc điểm của một sinh vật, nhưng virus thì không hoàn toàn

Virus không có cấu trúc tế bào (dưới tế bào), genome chỉ chứa một trong hai loại acid nucleic, ký sinh bắt buộc trong tế bào cảm thụ, sinh sản theo cấp số nhân và di truyền được nòi giống; kích thước rất bé (từ 10 nm đến 300 nm) và chỉ nhìn được dưới kính hiển vi điện tử, vị trí phân loại của virus chưa rõ ràng, chúng được nghiên cứu trong môn Vi sinh vật học

Prion, một loại mầm bệnh mới đơn giản hơn virus (Virus-like agents: Prions) Vào những năm 90 của thế kỷ XX, một tác nhân gây bệnh mới đã được phát hiện là prion Prion là những protein không bình thường, nó để khăng cao với nhiệt độ và phần lớn các hóa chất sát trùng

Rickettsia, Chlamydia và Mycoplasma là những vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc

(trước đây xếp loại chúng vào nhóm vi sinh vật trung gian giữa vi khuẩn và virus) Rickettsia là những vi sinh vật bé hơn vi khuẩn nhưng lớn hơn virus Chúng cũng ký sinh nội bào bắt buộc như virus, nhưng chúng có nhiều đặc điểm của vi khuẩn hơn (có cấu trúc tế bào, có hai loại acid nucleic, nhưng thiếu một số enzym hô hấp năng lượng), có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học (kích thước trung bình 0, 25 x1

𝜇𝑚) Chlamydia có những đặc điểm như Rickettsia nhưng bé hơn (khoảng 150 nm),

là một tác nhân gây bệnh quan trọng (mắt hột và nhiễm trùng đường sinh dục tiết

niệu) Mycoplasma chỉ khác Rickettsia là không có vách, nên cùng được xếp vào các

vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc

1.1 Vi khuẩn:

Vi khuẩn là những sinh vật nhân sơ đơn bào có kích thước cực kỳ nhỏ (0,2 – 10 𝜇𝑚) , một số chúng còn thuộc loại ký sinh trùng Có bộ khung tế bào và các bào quan như ty thể và lục lạp Là nhóm hiện diện đông đảo nhất trong sinh giới Vi

1 Theo Sách Vi sinh vật Y học _ Chủ biên GS.TS Lê Huy Chính _ Nhà xuất bản Y học

4

khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, nước, chất thải phóng xạ và cả bên trong những sinh vật khác

Vi khuẩn là những vi sinh vật có chuỗi ADN xoắn kép (ngoại trừ Mycoplasma)

và vách tế bào Hầu hết vi khuẩn sống ngoại bào, nhưng một số lại ưu tiên cư trú và nhân lên trong nội bào Các mầm bệnh nội bào bắt buộc chỉ có thể phát triển, sinh sản và gây bệnh trong các tế bào của vật chủ Ví dụ về các mầm bệnh này bao gồm

Chlamydia, các loài Chlamydophila và Rickettsia Các mầm bệnh nội bào nuôi cấy

có thể sống và sinh sản bên trong hoặc bên ngoài tế bào vật chủ Ví dụ về các mầm

bệnh này bao gồm Salmonella typhi, loài Brucella, Francisella tularensis, N

gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Legionella và loài Listeria, Mycobacterium tuberculosis

Nhiều vi khuẩn hiện diện ở người dưới dạng hệ vi sinh vật bình thường, thường

có số lượng lớn và ở nhiều khu vực (ví dụ, trong đường tiêu hóa và da) Chỉ có một vài loài vi khuẩn là mầm bệnh của con người

a) Cấu tạo của vi khuẩn:

Vách tế bào

Tạo nên hình dạng của vi khuẩn và nằm bên ngoài màng sinh chất, được làm bằng polymer gọi là peptidoglycan Sự hiện diện của thành tế bào ở vi khuẩn được phát hiện bằng hiện tượng ly tương, bằng cách nhuộm và bằng phân lập trực tiếp

5

Thành tế bào vi khuẩn gram dương: Thành phần chủ yếu là mucopeptit gọi là murein, một chất trùng hợp mà những đơn vị hoá học là những đường amin N-acetyl glucosamin và axit N-acetyl muramic và những chuỗi peptit ngắn chứa alanin, axít glutamic và axit diaminopimelic hoặc lysin Ngoài ra vách tế bào của một số vi khuẩn gram dương còn chứa axit teichoic Ở một vài loại vi khuẩn, axit teichoic chiếm tới 30% trọng lượng khô của vách tế bào

Thành tế bào vi khuẩn Gram âm: Lớp mucopeptit mỏng hơn và hai lớp lipoprotein

và lipopolysaccharide ở bên ngoài, lớp lipoprotein chứa tất cả những axit amin thông thường Không có axit teichoic, thành tế bào vi khuẩn gram âm chứa một lượng lipit đáng kể, khoảng 20% trọng lượng khô của vách tế bào

Chức năng của thành tế bào là duy trì hình dáng của vi khuẩn, quyết định tính bắt màu Gram của vi khuẩn (do tính thẩm thấu khác nhau của vi khuẩn Gram âm và Gram dương) Tạo nên kháng nguyên thân O của vi khuẩn đường ruột: Để điều chế kháng nguyên 0 của vi khuẩn đường ruột xử lý vi khuẩn không di động bằng nhiệt

và cồn Tạo nên nội độc tố của vi khuẩn đường ruột Nội độc tố chỉ được giải tỏa lúc

vi khuẩn bị ly giải Ở vi khuẩn đường ruột, nội độc tố là những phức hợp saccarit dẫn xuất từ vách tế bào

lipopoly-Vỏ bao

Là một cấu trúc nhầy bọc quanh vách tế bào của một số vi khuẩn, thường là

polysaccharide, chỉ có vỏ của B.anthracis là một polypeptide acid D-glutamic Vỏ

có thể phát hiện dễ dàng ở huyền dịch mực tàu, ở đó nó hiện ra như một vùng sáng giữa môi trường mờ đục và tế bào vi khuẩn trông rõ hơn

Cũng có thể phát hiện bằng phản ứng phình vỏ hoặc bằng kỹ thuật nhuộm đặc biệt Sự đột biến tạo thành vỏ rất dễ nhận biết vì tế bào có vỏ tạo nên khuẩn lạc bóng láng hoặc nhầy M trong khi tế bào không vỏ tạo nên khuẩn lạc xù xì R Nhiệm vụ duy nhất được biết của vỏ là bảo vệ vi khuẩn chống thực bào và chống virus muốn gắn vào vách tế bào

Màng tế bào chất (màng nguyên tương)

Là màng bán thấm dày khoảng 10 nm nằm sát vách tế bào Người ta có thể chứng minh sự hiện diện của nó bằng hiện tượng ly tương hoặc nhuộm với xanh Victoria 4R Nó chứa 60 – 70% lipit, 20 – 30% protein và một lượng nhỏ hydrat cacbon

6

Màng nguyên tương có chức năng rào cản thẩm thấu của tế bào, ngăn cản không cho nhiều phẩm vật vào bên trong tế bào nhưng lại xúc tác việc chuyên chở hoạt động của nhiều phẩm vật khác vào bên trong tế bào

Hơn nữa màng tế bào chứa nhiều hệ thống enzyme và vì vậy có chức năng giống như ti lạp thể của động vật và thực vật Màng nguyên tương cho thấy những chỗ lõm vào gọi là mạc thể Ở vi khuẩn Gram dương mạc thể khá phát triển cho thấy hình ảnh nhiều lá đồng tâm Ở vi khuẩn Gram âm mạc thể chỉ là vết nhăn đơn giản

Tế bào chất (nguyên tương)

Là cấu trúc được bao bọc bên ngoài bởi màng nguyên tương, ở trạng thái gel, cấu trúc này gồm 80% nước, các protein có tính chất enzyme, cacbohydrat, lipid và các ion vô cơ ở nồng độ cao, và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp Nguyên tương chứa dày đặc những hạt hình cầu đường kính 18 nm gọi là ribosome Ngoài ra còn

có thể tìm thấy những hạt dự trữ glycogen, granulosa hoặc polymetaphotphat

V Khảo sát ở kính hiển vi điện tử nhân không có màng nhân và bộ máy phân bào

Nó là một sợi DNA trọng lượng phân tử 3×109 dallon và chứa một nhiễm sắc thể duy nhất dài khoảng 1mm nếu không xoắn

Nhân nối liền ở một đầu với thể mạc Sự nối liền này giữ một vai trò chủ yếu trong sự tách rời 2 nhiễm sắc thể con sau khi sợi nhiễm sắc thể mẹ tách đôi Trong

sự phân chia nhân hai mạc thể qua chổ nối liền với màng nguyên tương di chuyển theo những hướng đối nghịch theo hai nhóm con nối liền với chúng Như thế màng nguyên tương tự động như một bộ máy thô sơ của sự gián phân với mạc thể đảm nhận vai trò thai vô sắc

Tiêu mao, nhung mao

Chịu trách nhiệm về tính di động của vi khuẩn Người ta quan sát sự di động của

vi khuẩn dưới kính hiển vi đặt một giọt huyền dịch vi khuẩn ở lam kính và phủ một

lá kính mỏng Lông dài 3 – 12 mm hình sợi gợn sóng, mảnh 10 – 20 nm) nên phải nhuộm với axit tannic để tạo thành một lớp kết tủa làm dày lông dễ phát hiện Lông phát xuất từ thể đáy ngay bên dưới màng nguyên tương và có chuyển động xoay tròn

7

Bản chất protein nó tạo nên do sự tập hợp những đơn vị phụ gọi là flagellin tạo thành một cấu trúc hình trụ rỗng Cách thức mọc lông là một đặc tính di truyền Ở một số loại nhiều lông mọc quanh thân, ở một số loại một lông mọc ở cực và ở một

số loại khác một chùm lông ở một cực Nếu lông bị làm mất đi bằng cơ học thì lông mới được tạo thành nhanh chóng Lông đóng vai trò kháng nguyên như kháng nguyên H ở vi khuẩn đường ruột

Pili

Là những phụ bộ hình sợi, mềm mại hơn lông, mảnh hơn nhiều và có xu hướng thẳng đường kính 2 – 3nm và dài từ 0,3 – 1nm, tìm thấy từ một đến hàng trăm ở mặt ngoài vi khuẩn, bản chất protein

Pili phát xuất ở trong màng nguyên tương và xuyên qua vách tế bào Pili được tìm thấy ở vi khuẩn gram âm nhưng cũng có thể tìm thấy ở một số vi khuẩn gram dương Pili F có nhiệm vụ trong sự tiếp hợp Những pili khác giúp cho vi khuẩn bám vào niêm mạc hoặc bề mặt khác của tế bào

Nha bào

Những thành viên của Bacillus, Clostridium và Sporosarcina tạo thành nội nha

bào dưới ảnh hưởng của môi trường bên ngoài không thuận lợi, mỗi tế bào làm phát sinh một nha bào Nha bào có thể nằm ở giữa, ở đầu nút hoặc gần đầu nút tùy theo loài, vách nha bào chứa những thành phần mucopeptide và axit dipicolinic Sự đề kháng của nha bào với hóa chất độc là do tính không thẩm thấu của vách nha bào,

sự đề kháng với nhiệt liên hệ đến trạng thái mất nước cao

Vì chịu đựng với điều kiện không thuận lợi bên ngoài nha bào góp phần quan trọng trong khả năng lây bệnh của trực khuẩn hiếu khí tạo nha bào như trực khuẩn than hoặc trực khuẩn kỵ khí tạo nha bào như Clostridia, nhất là trực khuẩn uốn ván, hoại thư, sinh hơi, ngộ độc thịt.2

b) Các loại vi khuẩn ngày nay

Có vô số các loại vi khuẩn khác nhau Cách phân loại vi khuẩn là theo hình dạng của chúng như hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy (phẩy khuẩn) hay hình sợi

Cầu khuẩn là những vi khuẩn có hình cầu nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc hình ngọn nến, cầu khuẩn còn có cách gọi khác là cocci, có đường kính trung bình

2 Vi khuẩn là gì? Cấu tạo, môi trường sinh sống thế nào? Lợi hay hại? – BV Đa khoa Tâm Anh

1.2 Virus:

Virus là một đơn vị sinh học nhỏ bé (kích thước từ 20 - 300 nm), có khả năng biểu hiện những tính chất cơ bản của sự sống: gây nhiễm cho tế bào, duy trì được nòi giống qua các thế hệ mà vẫn giữ tính ổn định về mọi đặc điểm sinh học của nó trong tế bào cảm thụ thích hợp

Đặc điểm cơ bản nhất để phân biệt virus với vi khuẩn là virus chỉ chứa một trong hai loại acid nucleic (ADN hoặc ARN), virus sinh sản tăng lên theo cấp số nhân, còn

vi khuẩn sinh sản theo kiểu phân đôi

a) Cấu trúc của virus:

Virus có cấu trúc rất đơn giản,

không có enzym hô hấp và

enzym chuyển hóa, vì vậy virus

bắt buộc phải ký sinh trong tế

bào cảm thụ

Virus có nhiều hình thể khác

nhau: hình cầu, hình khối, hình

sợi, hình que, hình chùy, hình

khối phức tạp Hình thể mỗi loại

rất khác nhau nhưng luôn ổn định

đối với từng loại Tùy theo cách

sắp xếp của acid nucleic và

capsid chia làm hai loại đối

xứng:

Đối xứng hình xoắn ốc: acid

nucleic và các capsomer được

sắp xếp dọc theo hình lò xo đều hay không đều

Acid nucleic (AN):

Mỗi loại virus đều phải có một trong hai acid nucleic: ARN (acid ribonucleic) hoặc ADN (acid deoxyribonucleic) Những loại có cấu trúc ADN phần lớn đều mang ADN sợi kép Ngược lại, loại mang ARN thì chủ yếu ở dạng sợi đơn

Các acid nucleic (AN) chỉ chiếm từ 1% tới 2% trọng lượng của hạt virus nhưng

có chức năng đặc biệt quan trọng:

AN mang mọi mật mã di truyền đặc trưng cho từng loài

AN quyết định khả năng gây nhiễm trùng trong tế bào cảm thụ

AN quyết định chu kỳ nhân lên trong tế bào cảm thụ

AN mang tính bán kháng nguyên đặc hiệu

Thành phần capsid:

Capsid là cấu trúc bao quanh acid nucleic Bản chất hóa học của capsid là protein Capsid được tạo bởi nhiều đơn vị capsid bao gồm các phân tử protein có sắp xếp đặc trưng cho từng loài Các đơn vị capsid đó được gọi là các capsomer

Cùng với phần “lõi” AN, phần “vỏ” capsid của virus có thể sắp xếp đối xứng xoắn, đối xứng khối hoặc đối xứng phức hợp Cấu trúc capsid có chức năng quan trọng:

Bao quanh AN để bảo vệ không cho enzym nuclease và các yếu tố phá hủy AN khác

Protein capsid tham gia vào sự bám vào những vị trí đặc hiệu của tế bào cảm thụ (với các loại không có bao envelop)

Protein capsid mang tính kháng nguyên đặc hiệu Capsid giữ cho hình thái và kích thước luôn được ổn định

có thêm gai nhú (spike) thì đó là glycoprotein

Trên bao ngoài của một số loài có những núm lồi lên, mang những chức năng riêng biệt

Chức năng riêng của envelop: Tham gia vào sự bám trên các vị trí thích hợp của

tế bào cảm thụ Ví dụ: gpl20 của HIV hoặc hemagglutinin cúm Tham gia vào giai đoạn lắp ráp và giải phóng virus ra khỏi tế bào sau chu kỳ nhân lên

Envelop tham gia vào hình thành tính ổn định kích thưốc và hình thái Tạo nên các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt virus Một số kháng nguyên này có khả năng thay đổi cấu trúc

Enzyme:

Trong thành phần cấu trúc có một số enzym, đó là những enzym cấu trúc, chúng gắn với cấu trúc của hạt virus hoàn chỉnh Các enzym cấu trúc có thể gặp: Neuraminidase, ADN hoặc ARN polymerase, men sao chép ngược (Reverse transcriptase) Mỗi enzym cấu trúc có những chức năng riêng trong chu kỳ nhân lên trong tế bào cảm thụ và chúng cũng mang tính kháng nguyên riêng, đặc hiệu ở mỗi loài

2 Kỹ thuật PCR và Real-time PCR:

2.1 Kỹ thuật PCR:

Cụm từ PCR được viết tắt từ Polymerase Chain Reaction nghĩa là chuỗi phản ứng polymerase hay phản ứng khuếch đại gene Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, không cần sự hiện diện của tế bào PCR là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA hoặc sản xuất

và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó từ một mẫu nhỏ ban đầu hoặc là một bản sao duy nhất

Nó được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình xử lý DNA để giải trình tự PCR giúp phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của một gen để xác định các tác nhân gây bệnh trong quá trình nhiễm trùng và khi tạo ra các cấu hình DNA pháp y từ các mẫu DNA nhỏ

Kéo dài (Extend

primer): Nhiệt độ tối ưu để enzyme tổng hợp DNA mạch mới hoạt động (70 – 72°C) – Giai đoạn tối ưu để tổng hợp DNA mạch mới hoạt động

b) Nguyên tắc cơ bản

Dựa trên sự hoạt động của emzyme

Sự hiện diện của mồi chuyên biệt

Khả năng nối dài mồi của taq polymerase

Các nu tự do trong môi trường

5 Cation 𝑀𝑔2+ (𝑀𝑔𝐶𝑙2) đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt động hiệu quả

6 Dung dịch đệm Tris-KCI (PCR Buffer): Cung cấp môi trường thuận lợi cho phản ứng nhân bản diễn ra

d) Nguyên tắc hoạt động PCR:

Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

13

Giai đoạn biến tính: Nhiệt

độ sẽ được đưa lên 94 – 96°C,

từ 2 – 5 phút các liên kết

hydro sẽ bị phá vỡ khiến

DNA bị biến tính trở thành

dạng mạch đơn

Giai đoạn bắt cặp (hoặc

giai đoạn gắn mồi): Nhiệt độ

được hạ xuống 50 – 65°C, 20

giây – 2 phút, các đoạn mồi sẽ

bắt cặp bổ sung vào 2 đầu

trình tự mục tiêu

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt

độ được đưa lên 68 – 72°C,

20 giây – 5 phút, Taq

polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung

Giai đoạn biến tính:

Trong giai đoạn này, dung dịch chứa DNA mẫu và tất cả các thành phần cốt lõi khác được đun nóng đến 94 – 95°C

Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mỗi bắt cặp với sợi DNA, nhưng cũng

đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn

Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gần không đặc hiệu

Nếu quá cao, mồi có thể không gắn được

Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3 – 5°C so với Tm của mồi dùng trong phản ứng Polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi – khuôn và bắt đầu tổng hợp DNA

Các đoạn mồi được thiết kế để bổ sung theo thứ tự các đoạn ngắn của DNA trên mỗi đầu của chuỗi được sao chép

Đoạn mới được xem là tác nhân đầu tiên trong quá trình tổng hợp DNA Enzyme polymerase chi có thể thêm các base DNA vào một chuỗi DNA kép Chỉ một khi đoạn mỗi được kể nói thì enzyme polymerase có thể gắn và bắt đầu tạo ra chuỗi DNA bổ sung mới từ các cơ sở DNA có liên kết rời rạc lúc đầu

Hai dải DNA tách rời được bổ sung và chạy theo các hướng ngược

Bước này thường mất khoảng 10 – 30 giây

Giai đoạn mở rộng:

Trong bước cuối cùng này, nhiệt được tăng lên 72°C để cho phép DNA mới được tạo ra bởi một enzyme enzyme Taq DNA polymerase đặc biệt bổ sung thêm các base DNA

Các chuỗi ADN mới được tạo ra bằng cách sử dụng các sợi gốc làm mẫu Một enzyme DNA polymerase kết hợp các nucleotide DNA tự do với nhau Enzyme này

15

thường là Taq polymerase, một enzyme ban đầu được phân lập từ một vi khuẩn ưa nhiệt gọi là Thermus aquaticus

Thứ tự mà trong đó các nucleotide tự do được thêm vào được xác định bởi trình

tự nucleotide trong sợi DNA gốc (mẫu)

Kết quả của một chu kỳ PCR là hai chuỗi chuỗi DNA mục tiêu, mỗi chuỗi chứa một sợi mới được tạo ra và một sợi ban đầu

Chu trình nhiệt của 1 quy trình PCR:

Như vậy, cứ qua một

chu kỳ nhiệt, số mạch

DNA sẽ được nhân đôi

Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại

liên tục 30 – 40 lần thì số

bản sao sẽ là 230 ~ 240

bản sao

Số lượng bản sao DNA

khổng lồ này khi được

gắn các phân tử phát tín

hiệu (ví dụ Ethidium

Bromide) có thể nhìn thấy

bằng mắt thường trên gel

điện di dưới ánh đèn UV

e) Phát hiện sản phẩm PCR:

Điện di trên gel agarose

Phân loại DNA dựa vào kích thước

1 Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương, đoạn DNA

có kích thước ngắn di chuyển nhanh hơn so với đoạn có kích thước lớn

2 Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan sát dưới đèn UV

f) Ứng dụng:

Phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan

B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1 ), các

vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum )

16

Phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường tình dục (Neisseria gonorrhoeae,

Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum )

Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó (ví dụ: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu )

Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như Staphylococcus aureus – MRSA,

các vi khuẩn sinh ESBL hoặc betalactamase, carbapenemase )

Xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt

của Escherichia coli

Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN

Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết

Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA1 - BRCA2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin ) Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)

Phải có phòng lab hiện đại, chuẩn mực; đòi hỏi kỹ thuật viên, bác sĩ phải có trình

độ chuyên môn cao

Giá thành xét nghiệm PCR còn khá cao

để tiên lượng tốt và ít biển, di chứng Dù PCR lao cho dịch não tủy có độ đặc hiệu

Sp cao gần tuyệt đối 98%, nhưng độ nhạy Se lạ rất thấp 56% Vì thế, các bác sĩ lâm sàng thường phải: Làm PCR lao thêm trên các mẫu khác như máu, nước tiểu, đờm, dịch màn phối, màng bụng và làm thêm các xét nghiệm khác như IDR, soi đàm, chụp phối

2.2 Kỹ thuật Real-time PCR:

Kỹ thuật Real-time Polymerase Chain Reaction (real-time PCR) là một phương pháp phân tích DNA hoặc RNA một cách chính xác và độ nhạy cao Nó còn được gọi là quantitative PCR (qPCR) vì nó cung cấp thông tin về lượng mục tiêu ban đầu trong mẫu một cách số lượng

Kỹ thuật này gần tương tự như kỹ thuật PCR, tuy nhiên ở đây có thêm một thiết

bị ghi tín hiệu khi xả ra phản ứng tổng hợp PCR Dựa trên việc so sánh số vòng mẫu thử và số vòng của mẫu chuẩn đạt được trong cũng một khoảng thời gian xảy ra phản ứng, từ đó sẽ tính được số vòng mẫu thử gấp bao nhiêu lần số vòng mẫu chuẩn, rồi dựa vào đó người ta tính được nồng độ DNA của mẫu thử

Lưu ý: khi làm PCR thông thường thì ta có thể dùng nắp ống tube PCR màu, còn khi làm Real-Time PCR thì khuyến cáo dùng loại nắp trong ở ống tube Real-Time PCR

Thành phần: tương tự như PCR, nhưng có thêm TaqMan probe hoặc EvaGreen (mẫu dò)

Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan, trong kỹ thuật realtime PCR, có nhiều cách khác nhau để tạo ra tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kỳ Cách dựa trên mẫu

dò TaqMan là một loại mẫu dò (probe) được sử dụng khá phổ biến trong kỹ thuật realtime PCR Thành phần trong một phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu

Sơ đồ nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan

19

Mồi trong phản ứng realtime PCR thường có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55 –

60oC và thấp hơn mẫu dò TaqMan khoảng 5 – 10oC để đảm bảo mẫu dò luôn bắt cặp trước Trình tự đích lựa chọn cũng không nên dài quá 150bp để phản ứng diễn ra tối

ưu nhất

Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan cũng chỉ có

2 giai đoạn:

1 Biến tính ở 94 – 95oC trong 15 – 30 giây

2 Bắt cặp và kéo dài ở 60oC trong 30 – 60 giây

Real-time PCR thường được sử dụng để định lượng mức độ gen cụ thể

Nó cũng được sử dụng trong việc phát hiện, định lượng vi khuẩn, virus, và giảm

sự thất bại của quy trình so với PCR truyền thống

20

3 Ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật:

Việc định lượng vi khuẩn và virus có ý nghĩa quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và ứng dụng, bao gồm y học, nông nghiệp, môi trường, và nghiên cứu cơ bản Dưới đây là một số lý do chính tại sao cần phải định lượng chúng:

 Y học và Sức khỏe Cộng đồng:

Chẩn đoán bệnh: Vi khuẩn và virus thường liên quan đến nhiều bệnh truyền nhiễm Việc định lượng chúng giúp trong quá trình chẩn đoán, điều trị và theo dõi

sự tiến triển của bệnh nhân

Kiểm soát dịch bệnh: Định lượng vi khuẩn và virus là quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh và đưa ra các biện pháp phòng ngừa

Nghiên cứu Sinh học và Động lực học Tế bào: Hiểu về sự phát triển và chuyển hóa của tế bào: Vi khuẩn và virus thường được sử dụng trong nghiên cứu cơ bản để hiểu rõ hơn về quá trình sinh học, động lực học tế bào, và tương tác tế bào

Phát triển và Kiểm thử Thuốc: Nghiên cứu và phát triển thuốc: Đối với vi khuẩn

và virus gây bệnh, việc định lượng chúng là quan trọng trong quá trình phát triển và kiểm thử các loại thuốc và vắc xin

Để định lượng vi sinh vật có nhiều phương pháp tùy thuộc vào mục tiêu cụ thể, loại vi sinh vật, và môi trường mẫu Một số phương pháp:

- Phương pháp nuôi cấy và đếm (Plate Count):

Nuôi cấy vi sinh vật trên agar: Mẫu được trải lên bề mặt của một môi trường nuôi cấy, và sau đó được ủ để vi sinh vật phát triển thành các đám

Đếm số lượng đám vi sinh vật: Sau một khoảng thời gian ủ, số lượng đám được đếm để ước tính số lượng vi sinh vật ban đầu

Phương pháp này dễ thực hiện và việc định lượng vi sinh vật được thực hiện thủ công hoặc có sự hỗ trợ của máy đếm vi sinh vật nhưng có nhược điểm khi gặp cái vi khuẩn chậm mọc, khó mọc, virus và vi nấm mọc chậm; tạp nhiễm/

21

- Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction):

PCR (Polymerase Chain Reaction): Được sử dụng để nhân bản và định lượng DNA hoặc RNA của vi sinh vật

Real-time PCR (qPCR): Cho phép định lượng theo thời gian thực, cung cấp kết quả ngay sau khi PCR hoàn thành

Việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong định lượng vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích, như độ chính xác cao, độ nhạy, và khả năng xử lý mẫu nhanh chóng, làm tăng khả năng hiểu rõ về sinh học và y học Kỹ thuật sinh học phân tử, bao gồm các phương pháp như PCR (Polymerase Chain Reaction), qPCR (quantitative PCR),

và các phương pháp phân tích DNA hoặc RNA khác, được sử dụng rộng rãi trong định lượng vi sinh vật

Định lượng vi khuẩn: Đánh giá tình trạng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp PCR và qPCR Điều này giúp theo dõi sự thay đổi trong số lượng vi khuẩn và theo dõi, tiên lượng bệnh

Đánh giá nhiễm trùng: Kiểm tra nhiễm trùng virus trong mẫu sinh phẩm để xác định sự hiện diện và định lượng virus trong các loại mẫu như máu, dịch tiết, hoặc mẫu dịch nhầy

Đánh giá sự khử khuẩn: Kiểm tra hiệu quả khử khuẩn: Khi áp dụng các biện pháp tiệt trùng, khử khuẩn như sử dụng chất khử trùng, PCR có thể được sử dụng để đánh giá hiệu suất của quá trình này bằng cách định lượng vi khuẩn còn lại

Đánh giá microbiota ruột: Xác định thành phần vi sinh vật trong hệ thống ruột, PCR và qPCR được sử dụng để đánh giá thành phần của microbiota ruột, giúp hiểu

rõ hơn về vai trò của các vi khuẩn trong sức khỏe và bệnh tật

Định lượng MicroRNA (miRNA): Kiểm tra biểu hiện gen và điều chỉnh gen, PCR

có thể được sử dụng để định lượng microRNA, loại RNA nhỏ thường liên quan đến

sự điều chỉnh gen Điều này có ứng dụng trong nghiên cứu về bệnh lý và phát triển

22

II BỆNH LÝ COVID–19

COVID-19 là một bệnh do virus xuất hiện vào năm 2019 liên quan đến virus SARS-CoV-2 thuộc họ coronavirus (MERS-CoV, SARS-CoV và SARS-CoV-2) Hầu như tất cả các thể bệnh nặng liên quan đến COVID-19 được đặc trưng bởi viêm phổi lan tỏa gây suy hô hấp có thể dẫn đến hội chứng hô hấp cấp (ARDS) Xem xét các nghiên cứu trước đây về Hội chứng nguy ngập hô hấp cấp (SARS) và những gì chúng ta biết về sinh lý bệnh học của COVID-19, virus mới cũng cùng họ coronavirus ở thế kỷ 21 này, gây lo ngại vì một tỷ lệ lớn (lên đến 25%) bệnh nhân mắc COVID-19 có thể có di chứng hô hấp dài hạn như hội chứng hạn chế liên quan đến rối loạn trao đổi khí

Phòng ngừa bằng cách tiêm phòng và các biện pháp phòng ngừa kiểm soát lây nhiễm (ví dụ: đeo khẩu trang, rửa tay, giãn cách xã hội, cách ly y tế những người bị nhiễm bệnh) Chẩn đoán bằng xét nghiệm kháng nguyên hoặc PCR (phản ứng chuỗi polymerase) đối với chất tiết đường hô hấp trên hoặc dưới Điều trị bằng chăm sóc

hỗ trợ, thuốc kháng virus hoặc corticosteroid

Nhiễm SARS-CoV-2 gây ra nhiều mức độ nặng của bệnh, từ không triệu chứng đến suy hô hấp cấp tính và tử vong Các yếu tố nguy cơ bị bệnh nặng bao gồm tuổi già, suy giảm miễn dịch, bệnh lý đi kèm (ví dụ: tiểu đường, bệnh thận mạn tính) và mang thai Vaccine đã cho thấy phần nào hiệu quả trong việc ngăn ngừa lây truyền

và rất hiệu quả trong việc ngăn ngừa bệnh nặng và tử vong

1 Mức độ lan truyền của COVID-19:

Virus SARS-CoV-2 lây lan khi tiếp xúc gần người với người, chủ yếu qua các giọt bắn ở đường hô hấp được tạo ra khi người bệnh ho, hắt hơi, hát, tập thể dục hoặc nói chuyện Sự lây lan xảy ra thông qua các giọt bắn ở đường hô hấp lớn có thể di chuyển với khoảng cách ngắn và hạ trực tiếp trên bề mặt niêm mạc hoặc qua các hạt sol khí hô hấp nhỏ có thể tồn tại trong không khí vài giờ và di chuyển với khoảng cách xa hơn (> 6 feet) trước khi bị hít vào Sự lây lan của virus cũng có thể xảy ra khi tiếp xúc với các bề mặt bị ô nhiễm (bọt khí) do dịch tiết đường hô hấp, nếu một người chạm vào bề mặt bị ô nhiễm và sau đó chạm vào niêm trên mặt (mắt, mũi, miệng)

Virus SARS-CoV-2 dễ lây lan giữa người với người Nguy cơ lây truyền liên quan trực tiếp đến số lượng virus mà một người phơi nhiễm Cả những bệnh nhân

số dòng dõi Pango của virus này Một đột biến di truyền mang lại lợi thế về thể chất,

cụ thể là tăng khả năng lây truyền, có thể nhanh chóng thay thế các biến thể đã lưu hành trước đó Sự phát triển của các biến thể thống trị ở Hoa Kỳ và phần lớn thế giới bao gồm Alpha, Beta, Delta và Omicron Biến thể Omicron đã chiếm ưu thế trên toàn thế giới kể từ tháng 3 năm 2022, với các biến thể con Omicron mới hơn và dễ lây truyền hơn (ví dụ: BA.4 và BA.5) thay thế Omicron ban đầu (B.1.1.529)

Các tình huống có nguy cơ lây truyền cao bao gồm các cơ sở sinh hoạt tập trung, kém thông thoáng, chẳng hạn như các dịch vụ tôn giáo trong nhà, phòng tập thể dục, quán bar, câu lạc bộ đêm , nhà hàng trong nhà

Các yếu tố xã hội quyết định đến sức khỏe (điều kiện ở nơi mọi người sinh ra, sống, học tập, làm việc và vui chơi) tác động đến một loạt các nguy cơ và kết quả về sức khỏe, chẳng hạn như phơi nhiễm với nhiễm trùng SARS-CoV-2, COVID-19 nặng và tử vong, cũng như tiếp cận với xét nghiệm, tiêm vaccine và điều trị

2 Triệu chứng của COVID-19:

Mức độ nặng và nhóm các triệu chứng khác nhau ở những người bị COVID-19 Một số có ít hoặc không có triệu chứng, và một số bị bệnh nặng và tử vong Các triệu chứng phổ biến có thể bao gồm:

- Ớn lạnh hoặc run rẩy kèm theo rùng mình nhiều lần

- Không ngửi thấy mùi hoặc không nếm thấy vị mới xuất hiện

- Mệt mỏi

- Đau cơ

- Đau đầu

3 Cơ chế gây bệnh 3 :

Mặc dù SARS-CoV-2 có thể ảnh hưởng đến các cơ quan khác ngoài phổi, nhưng

ở hầu hết các thể nặng của COVID-19, tổn thương hô hấp rất hay gặp Một số lý do

có thể giải thích tổn thương phổi trong COVID-19 Đầu tiên, biểu mô hô hấp đặc biệt tiếp xúc với virus SARS-CoV-2 Thật vậy, như các trường hợp nhiễm virus khác,

có liên quan đến SARS- CoV-2 bắt đầu bằng việc gắn protein trên vỏ virus với thụ thể trên màng tế bào người bệnh Protein S (protein gai) của virus SARS-CoV-2, giống như SARS-

có di chứng lâu dài vì 415 bệnh nhân vẫn có X quang phổi bất thường sau khi xuất hiện bệnh

4 Phương pháp định lượng virus Sar CoV-2:

4.1 Kỹ thuật Real-time PCR:

Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt với tín hiệu khuếch đại được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt, nhờ đó người thực hiện có thể theo dõi được kết quả PCR

One-step RT-PCR là phản ứng kết hợp phiên mã ngược và PCR trong cùng một tube xét nghiệm

Giá trị chu kỳ

ngưỡng Ct (Threshold

cycle value): số chu kỳ

nơi đường biểu diễn tín

hiệu huỳnh quang vượt

26

Hai phần ba đầu tiên của bộ gen mã hóa cho các protein phi cấu trúc từ 2 khung

mở đọc ORF1a và ORF1b Một phần ba cuối của bộ gen mã hóa cho các protein cấu trúc là protein (S), protein màng (M), protein vỏ (E) và nucleocapsid (N) protein

- Dịch phế nang, dịch nội khí quản, dịch màng phổi

- Tổ chức phổi, phế quản, phế nang (khi có chỉ định)

Mẫu máu: 3-5 ml máu tĩnh mạch có hoặc không có chất chống đông

b) Xử lý mẫu:

Xử lý mẫu: Mỗi loại mẫu sẽ có phương pháp xử lý khác nhau

- Loại bỏ chất ức chế

- Tăng nồng độ mục tiêu cần phát hiện (nuôi cấy tăng sinh, cô đặc)

- Tăng độ đồng nhất của mẫu

Ví dụ: Mẫu dịch phết tăm bông (đồng nhất mẫu)

Xử lý mẫu và tách chiếc DNA/RNA

- Trang thiết bị trạng thái SS

27

- Chuẩn bị vật tư, hóa chất, dụng cụ đầy đủ

- Nhận mẫu kiểm tra đối chiếu thông tin BN

An toàn: sử dụng PPE, thực hiện thao tác trong tủ ATSH cấp II, sử dụng đầu tip

có lọc, khử nhiễm bằng cồn 70 độ hoặc khử amplicons bằng clo 0.5%