Ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật

Virus khơng có cấu trúc tế bào dưới tế bào, genome chỉ chứa một trong hai loại acid nucleic, ký sinh bắt buộc trong tế bào cảm thụ, sinh sản theo cấp số nhân và di truyền được nòi giống;

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC TẾ HỒNG BÀNG Chuyên đề: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT GVHD: TS Nguyễn Tuấn Anh Học viên: PGS.TS Nguyễn Thị Nga Học phần: Hồ Cao Quốc Thịnh – 2326080032 Nguyễn Đoàn Tường Uyên - 2326080046 Thực hành Y sinh học di truyền Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024 MỤC LỤC I TỔNG QUAN 3 1 Định nghĩa vi sinh vật: 3 2 Kỹ thuật PCR và Real-time PCR: .10 3 Ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật: 20 II BỆNH LÝ COVID–19 22 1 Mức độ lan truyền của COVID-19: 22 2 Triệu chứng của COVID-19: 23 3 Cơ chế sinh bệnh: 24 4 Phương pháp định lượng virus Sar CoV-2: 25 III VIÊM GAN SIÊU VI B 34 1 Phân loại viêm gan siêu vi B: 35 2 Triệu chứng của bệnh viêm gan B: .36 3 Các đường lây nhiễm của bệnh Viêm gan siêu vi B: 37 4 Cấu trúc Virus Viêm gan B: 38 5 Cơ chế gây bệnh: .39 6 Một số chỉ số trong xét nghiệm quan trọng trong viêm gan siêu vi B: 40 7 Phương pháp định lượng Hepatitis B virus (HBV): 40 III VIÊM GAN SIÊU VI C 46 1 Tổng quan: 46 2 Khả năng gây bệnh: 48 3 Dịch tễ học Viêm Gan C: 48 4 Đường lây truyền: .49 5 Một số xét nghiệm quan trọng trong viêm gan siêu vi C: 50 7 Phương pháp định lượng Hepatitis C virus (HCV): 51 2 TỔNG QUAN 1 Định nghĩa vi sinh vật: Theo GS.TS Lê Huy Chính1 định nghĩa vi sinh vật là những vi sinh vật nhỏ bé chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi - đó là những sinh vật đơn bào (protist), bao gồm: vi khuẩn, động vật nguyên sinh và vi nấm (bacteria, protozoa, fungi) Vi khuẩn là những đơn bào không có màng nhân (procaryote) và cùng với virus hợp thành môn Vi sinh vật học, tiếng Anh gọi là Microbiology Vi khuẩn có đầy đủ các đặc điểm của một sinh vật, nhưng virus thì không hoàn toàn Virus không có cấu trúc tế bào (dưới tế bào), genome chỉ chứa một trong hai loại acid nucleic, ký sinh bắt buộc trong tế bào cảm thụ, sinh sản theo cấp số nhân và di truyền được nòi giống; kích thước rất bé (từ 10 nm đến 300 nm) và chỉ nhìn được dưới kính hiển vi điện tử, vị trí phân loại của virus chưa rõ ràng, chúng được nghiên cứu trong môn Vi sinh vật học Prion, một loại mầm bệnh mới đơn giản hơn virus (Virus-like agents: Prions) Vào những năm 90 của thế kỷ XX, một tác nhân gây bệnh mới đã được phát hiện là prion Prion là những protein không bình thường, nó để khăng cao với nhiệt độ và phần lớn các hóa chất sát trùng Rickettsia, Chlamydia và Mycoplasma là những vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc (trước đây xếp loại chúng vào nhóm vi sinh vật trung gian giữa vi khuẩn và virus) Rickettsia là những vi sinh vật bé hơn vi khuẩn nhưng lớn hơn virus Chúng cũng ký sinh nội bào bắt buộc như virus, nhưng chúng có nhiều đặc điểm của vi khuẩn hơn (có cấu trúc tế bào, có hai loại acid nucleic, nhưng thiếu một số enzym hô hấp năng lượng), có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học (kích thước trung bình 0, 25 x1 𝜇𝑚) Chlamydia có những đặc điểm như Rickettsia nhưng bé hơn (khoảng 150 nm), là một tác nhân gây bệnh quan trọng (mắt hột và nhiễm trùng đường sinh dục tiết niệu) Mycoplasma chỉ khác Rickettsia là không có vách, nên cùng được xếp vào các vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc 1.1 Vi khuẩn: Vi khuẩn là những sinh vật nhân sơ đơn bào có kích thước cực kỳ nhỏ (0,2 – 10 𝜇𝑚) , một số chúng còn thuộc loại ký sinh trùng Có bộ khung tế bào và các bào quan như ty thể và lục lạp Là nhóm hiện diện đông đảo nhất trong sinh giới Vi 1 Theo Sách Vi sinh vật Y học _ Chủ biên GS.TS Lê Huy Chính _ Nhà xuất bản Y học 3 khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, nước, chất thải phóng xạ và cả bên trong những sinh vật khác Vi khuẩn là những vi sinh vật có chuỗi ADN xoắn kép (ngoại trừ Mycoplasma) và vách tế bào Hầu hết vi khuẩn sống ngoại bào, nhưng một số lại ưu tiên cư trú và nhân lên trong nội bào Các mầm bệnh nội bào bắt buộc chỉ có thể phát triển, sinh sản và gây bệnh trong các tế bào của vật chủ Ví dụ về các mầm bệnh này bao gồm Chlamydia, các loài Chlamydophila và Rickettsia Các mầm bệnh nội bào nuôi cấy có thể sống và sinh sản bên trong hoặc bên ngoài tế bào vật chủ Ví dụ về các mầm bệnh này bao gồm Salmonella typhi, loài Brucella, Francisella tularensis, N gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Legionella và loài Listeria, Mycobacterium tuberculosis Nhiều vi khuẩn hiện diện ở người dưới dạng hệ vi sinh vật bình thường, thường có số lượng lớn và ở nhiều khu vực (ví dụ, trong đường tiêu hóa và da) Chỉ có một vài loài vi khuẩn là mầm bệnh của con người a) Cấu tạo của vi khuẩn: Vách tế bào Tạo nên hình dạng của vi khuẩn và nằm bên ngoài màng sinh chất, được làm bằng polymer gọi là peptidoglycan Sự hiện diện của thành tế bào ở vi khuẩn được phát hiện bằng hiện tượng ly tương, bằng cách nhuộm và bằng phân lập trực tiếp 4 Thành tế bào vi khuẩn gram dương: Thành phần chủ yếu là mucopeptit gọi là murein, một chất trùng hợp mà những đơn vị hoá học là những đường amin N-acetyl glucosamin và axit N-acetyl muramic và những chuỗi peptit ngắn chứa alanin, axít glutamic và axit diaminopimelic hoặc lysin Ngoài ra vách tế bào của một số vi khuẩn gram dương còn chứa axit teichoic Ở một vài loại vi khuẩn, axit teichoic chiếm tới 30% trọng lượng khô của vách tế bào Thành tế bào vi khuẩn Gram âm: Lớp mucopeptit mỏng hơn và hai lớp lipoprotein và lipopolysaccharide ở bên ngoài, lớp lipoprotein chứa tất cả những axit amin thông thường Không có axit teichoic, thành tế bào vi khuẩn gram âm chứa một lượng lipit đáng kể, khoảng 20% trọng lượng khô của vách tế bào Chức năng của thành tế bào là duy trì hình dáng của vi khuẩn, quyết định tính bắt màu Gram của vi khuẩn (do tính thẩm thấu khác nhau của vi khuẩn Gram âm và Gram dương) Tạo nên kháng nguyên thân O của vi khuẩn đường ruột: Để điều chế kháng nguyên 0 của vi khuẩn đường ruột xử lý vi khuẩn không di động bằng nhiệt và cồn Tạo nên nội độc tố của vi khuẩn đường ruột Nội độc tố chỉ được giải tỏa lúc vi khuẩn bị ly giải Ở vi khuẩn đường ruột, nội độc tố là những phức hợp lipopoly- saccarit dẫn xuất từ vách tế bào Vỏ bao Là một cấu trúc nhầy bọc quanh vách tế bào của một số vi khuẩn, thường là polysaccharide, chỉ có vỏ của B.anthracis là một polypeptide acid D-glutamic Vỏ có thể phát hiện dễ dàng ở huyền dịch mực tàu, ở đó nó hiện ra như một vùng sáng giữa môi trường mờ đục và tế bào vi khuẩn trông rõ hơn Cũng có thể phát hiện bằng phản ứng phình vỏ hoặc bằng kỹ thuật nhuộm đặc biệt Sự đột biến tạo thành vỏ rất dễ nhận biết vì tế bào có vỏ tạo nên khuẩn lạc bóng láng hoặc nhầy M trong khi tế bào không vỏ tạo nên khuẩn lạc xù xì R Nhiệm vụ duy nhất được biết của vỏ là bảo vệ vi khuẩn chống thực bào và chống virus muốn gắn vào vách tế bào Màng tế bào chất (màng nguyên tương) Là màng bán thấm dày khoảng 10 nm nằm sát vách tế bào Người ta có thể chứng minh sự hiện diện của nó bằng hiện tượng ly tương hoặc nhuộm với xanh Victoria 4R Nó chứa 60 – 70% lipit, 20 – 30% protein và một lượng nhỏ hydrat cacbon 5 Màng nguyên tương có chức năng rào cản thẩm thấu của tế bào, ngăn cản không cho nhiều phẩm vật vào bên trong tế bào nhưng lại xúc tác việc chuyên chở hoạt động của nhiều phẩm vật khác vào bên trong tế bào Hơn nữa màng tế bào chứa nhiều hệ thống enzyme và vì vậy có chức năng giống như ti lạp thể của động vật và thực vật Màng nguyên tương cho thấy những chỗ lõm vào gọi là mạc thể Ở vi khuẩn Gram dương mạc thể khá phát triển cho thấy hình ảnh nhiều lá đồng tâm Ở vi khuẩn Gram âm mạc thể chỉ là vết nhăn đơn giản Tế bào chất (nguyên tương) Là cấu trúc được bao bọc bên ngoài bởi màng nguyên tương, ở trạng thái gel, cấu trúc này gồm 80% nước, các protein có tính chất enzyme, cacbohydrat, lipid và các ion vô cơ ở nồng độ cao, và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp Nguyên tương chứa dày đặc những hạt hình cầu đường kính 18 nm gọi là ribosome Ngoài ra còn có thể tìm thấy những hạt dự trữ glycogen, granulosa hoặc polymetaphotphat Ribosome Là nơi tạo ra hoặc tổng hợp protein, được tạo thành từ các hạt giàu RNA Thể nhân Có thể thấy với kính hiển vi ánh sáng sau khi nhuộm hoặc soi trực tiếp ở kính hiển vi pha tương phản Nhân có thể hình cầu, hình que, hình quả tạ hoặc hình chữ V Khảo sát ở kính hiển vi điện tử nhân không có màng nhân và bộ máy phân bào Nó là một sợi DNA trọng lượng phân tử 3×109 dallon và chứa một nhiễm sắc thể duy nhất dài khoảng 1mm nếu không xoắn Nhân nối liền ở một đầu với thể mạc Sự nối liền này giữ một vai trò chủ yếu trong sự tách rời 2 nhiễm sắc thể con sau khi sợi nhiễm sắc thể mẹ tách đôi Trong sự phân chia nhân hai mạc thể qua chổ nối liền với màng nguyên tương di chuyển theo những hướng đối nghịch theo hai nhóm con nối liền với chúng Như thế màng nguyên tương tự động như một bộ máy thô sơ của sự gián phân với mạc thể đảm nhận vai trò thai vô sắc Tiêu mao, nhung mao Chịu trách nhiệm về tính di động của vi khuẩn Người ta quan sát sự di động của vi khuẩn dưới kính hiển vi đặt một giọt huyền dịch vi khuẩn ở lam kính và phủ một lá kính mỏng Lông dài 3 – 12 mm hình sợi gợn sóng, mảnh 10 – 20 nm) nên phải nhuộm với axit tannic để tạo thành một lớp kết tủa làm dày lông dễ phát hiện Lông phát xuất từ thể đáy ngay bên dưới màng nguyên tương và có chuyển động xoay tròn 6 Bản chất protein nó tạo nên do sự tập hợp những đơn vị phụ gọi là flagellin tạo thành một cấu trúc hình trụ rỗng Cách thức mọc lông là một đặc tính di truyền Ở một số loại nhiều lông mọc quanh thân, ở một số loại một lông mọc ở cực và ở một số loại khác một chùm lông ở một cực Nếu lông bị làm mất đi bằng cơ học thì lông mới được tạo thành nhanh chóng Lông đóng vai trò kháng nguyên như kháng nguyên H ở vi khuẩn đường ruột Pili Là những phụ bộ hình sợi, mềm mại hơn lông, mảnh hơn nhiều và có xu hướng thẳng đường kính 2 – 3nm và dài từ 0,3 – 1nm, tìm thấy từ một đến hàng trăm ở mặt ngoài vi khuẩn, bản chất protein Pili phát xuất ở trong màng nguyên tương và xuyên qua vách tế bào Pili được tìm thấy ở vi khuẩn gram âm nhưng cũng có thể tìm thấy ở một số vi khuẩn gram dương Pili F có nhiệm vụ trong sự tiếp hợp Những pili khác giúp cho vi khuẩn bám vào niêm mạc hoặc bề mặt khác của tế bào Nha bào Những thành viên của Bacillus, Clostridium và Sporosarcina tạo thành nội nha bào dưới ảnh hưởng của môi trường bên ngoài không thuận lợi, mỗi tế bào làm phát sinh một nha bào Nha bào có thể nằm ở giữa, ở đầu nút hoặc gần đầu nút tùy theo loài, vách nha bào chứa những thành phần mucopeptide và axit dipicolinic Sự đề kháng của nha bào với hóa chất độc là do tính không thẩm thấu của vách nha bào, sự đề kháng với nhiệt liên hệ đến trạng thái mất nước cao Vì chịu đựng với điều kiện không thuận lợi bên ngoài nha bào góp phần quan trọng trong khả năng lây bệnh của trực khuẩn hiếu khí tạo nha bào như trực khuẩn than hoặc trực khuẩn kỵ khí tạo nha bào như Clostridia, nhất là trực khuẩn uốn ván, hoại thư, sinh hơi, ngộ độc thịt.2 b) Các loại vi khuẩn ngày nay Có vô số các loại vi khuẩn khác nhau Cách phân loại vi khuẩn là theo hình dạng của chúng như hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy (phẩy khuẩn) hay hình sợi Cầu khuẩn là những vi khuẩn có hình cầu nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc hình ngọn nến, cầu khuẩn còn có cách gọi khác là cocci, có đường kính trung bình 2 Vi khuẩn là gì? Cấu tạo, môi trường sinh sống thế nào? Lợi hay hại? – BV Đa khoa Tâm Anh 7 khoảng 1 μm Cầu khuẩn được chia thành: Song cầu, liên cầu khuẩn, tụ cầu, trực khuẩn và xoắn khuẩn Trực khuẩn: Đây là tên chung của những vi khuẩn có hình que Có kích thước của từ 0,5 - 1 - 4μm Xoắn khuẩn: Tên gọi của những vi khuẩn có từ hai vòng xoắn trở lên, kích thước thay đổi 0,5 - 3 - 5 - 40μm Xoắn khuẩn phần lớn thuộc loại hoại sinh, rất ít có khả năng gây bệnh 1.2 Virus: Virus là một đơn vị sinh học nhỏ bé (kích thước từ 20 - 300 nm), có khả năng biểu hiện những tính chất cơ bản của sự sống: gây nhiễm cho tế bào, duy trì được nòi giống qua các thế hệ mà vẫn giữ tính ổn định về mọi đặc điểm sinh học của nó trong tế bào cảm thụ thích hợp Đặc điểm cơ bản nhất để phân biệt virus với vi khuẩn là virus chỉ chứa một trong hai loại acid nucleic (ADN hoặc ARN), virus sinh sản tăng lên theo cấp số nhân, còn vi khuẩn sinh sản theo kiểu phân đôi a) Cấu trúc của virus: Virus có cấu trúc rất đơn giản, không có enzym hô hấp và enzym chuyển hóa, vì vậy virus bắt buộc phải ký sinh trong tế bào cảm thụ Virus có nhiều hình thể khác nhau: hình cầu, hình khối, hình sợi, hình que, hình chùy, hình khối phức tạp Hình thể mỗi loại rất khác nhau nhưng luôn ổn định đối với từng loại Tùy theo cách sắp xếp của acid nucleic và capsid chia làm hai loại đối xứng: Đối xứng hình xoắn ốc: acid nucleic và các capsomer được sắp xếp dọc theo hình lò xo đều hay không đều 8 Đối xứng hình khối: khi các capsomer được sắp xếp thành các hình khối cầu đa diện Một số loài có thể sắp xếp đối xứng khối và đối xứng xoắn trên từng phần Cách đối xứng này là đối xứng phức tạp Cấu trúc cơ bản còn được gọi là cấu trúc chung Cấu trúc cơ bản bao gồm hai thành phần chính mà mỗi virus đều phải có: Acid nucleic (AN): Mỗi loại virus đều phải có một trong hai acid nucleic: ARN (acid ribonucleic) hoặc ADN (acid deoxyribonucleic) Những loại có cấu trúc ADN phần lớn đều mang ADN sợi kép Ngược lại, loại mang ARN thì chủ yếu ở dạng sợi đơn Các acid nucleic (AN) chỉ chiếm từ 1% tới 2% trọng lượng của hạt virus nhưng có chức năng đặc biệt quan trọng: AN mang mọi mật mã di truyền đặc trưng cho từng loài AN quyết định khả năng gây nhiễm trùng trong tế bào cảm thụ AN quyết định chu kỳ nhân lên trong tế bào cảm thụ AN mang tính bán kháng nguyên đặc hiệu Thành phần capsid: Capsid là cấu trúc bao quanh acid nucleic Bản chất hóa học của capsid là protein Capsid được tạo bởi nhiều đơn vị capsid bao gồm các phân tử protein có sắp xếp đặc trưng cho từng loài Các đơn vị capsid đó được gọi là các capsomer Cùng với phần “lõi” AN, phần “vỏ” capsid của virus có thể sắp xếp đối xứng xoắn, đối xứng khối hoặc đối xứng phức hợp Cấu trúc capsid có chức năng quan trọng: Bao quanh AN để bảo vệ không cho enzym nuclease và các yếu tố phá hủy AN khác Protein capsid tham gia vào sự bám vào những vị trí đặc hiệu của tế bào cảm thụ (với các loại không có bao envelop) Protein capsid mang tính kháng nguyên đặc hiệu Capsid giữ cho hình thái và kích thước luôn được ổn định b) Cấu trúc riêng: Cấu trúc riêng còn được gọi là cấu trúc đặc biệt, chỉ có ở một số loài nhất định để thực hiện những chức năng đặc trưng cho loại đó Cấu trúc bao ngoài (envelop): 9 Một số loài bên ngoài lớp capsid còn bao phủ một lớp bao ngoài, được gọi là envelop Bản chất hóa học của envelop là một phức hợp: protein, lipid, carbohydrate, nói chung là lipoprotein hoặc glycoprotein Nếu chỉ có màng thì đó là lớp dilipid Nếu có thêm gai nhú (spike) thì đó là glycoprotein Trên bao ngoài của một số loài có những núm lồi lên, mang những chức năng riêng biệt Chức năng riêng của envelop: Tham gia vào sự bám trên các vị trí thích hợp của tế bào cảm thụ Ví dụ: gpl20 của HIV hoặc hemagglutinin cúm Tham gia vào giai đoạn lắp ráp và giải phóng virus ra khỏi tế bào sau chu kỳ nhân lên Envelop tham gia vào hình thành tính ổn định kích thưốc và hình thái Tạo nên các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt virus Một số kháng nguyên này có khả năng thay đổi cấu trúc Enzyme: Trong thành phần cấu trúc có một số enzym, đó là những enzym cấu trúc, chúng gắn với cấu trúc của hạt virus hoàn chỉnh Các enzym cấu trúc có thể gặp: Neuraminidase, ADN hoặc ARN polymerase, men sao chép ngược (Reverse transcriptase) Mỗi enzym cấu trúc có những chức năng riêng trong chu kỳ nhân lên trong tế bào cảm thụ và chúng cũng mang tính kháng nguyên riêng, đặc hiệu ở mỗi loài 2 Kỹ thuật PCR và Real-time PCR: 2.1 Kỹ thuật PCR: Cụm từ PCR được viết tắt từ Polymerase Chain Reaction nghĩa là chuỗi phản ứng polymerase hay phản ứng khuếch đại gene Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, không cần sự hiện diện của tế bào PCR là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA hoặc sản xuất và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó từ một mẫu nhỏ ban đầu hoặc là một bản sao duy nhất Nó được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình xử lý DNA để giải trình tự PCR giúp phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của một gen để xác định các tác nhân gây bệnh trong quá trình nhiễm trùng và khi tạo ra các cấu hình DNA pháp y từ các mẫu DNA nhỏ 10