Đang tải... (xem toàn văn)
Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ XÁC ĐỊNH NẤM PHYTOPHTHORA INFESTANS TRÊN CÂY CÀ CHUAGVBM: TS.. infestans thu
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ XÁC ĐỊNH NẤM PHYTOPHTHORA INFESTANS TRÊN CÂY CÀ CHUA Môn : Thiết bị kỹ thuật công nghệ sinh học GVBM: TS Huỳnh Văn Biết GVHD: Ths.Trương Quang Toản Nhóm thực hiện: Nhóm TP Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 10 năm 2023 Tên thành viên Nguyễn Thị Hồng – 21126352 Lê Ngọc Mai Xuân – 21126254 Nguyễn Thị Ngọc Huyền – 21126364 Nội dung Đặt vấn đề Tổng quan Vật liệu & Phương pháp Kết luận ĐẶT VẤN ĐỀ Hình Cây cà chua bình thường Hình Bệnh sương mai cà chua nấm Phytophthora infestans gây Mục đích Đặc điểm hình thái Huyết học Kỹ thuật PCR đặc hiệu loài Hình Cây cà chua bị bệnh mốc sương mai TỔNG QUAN A Nấm Phytophthora infestans B Bệnh sương mai cà chua C Kỹ thuật thiết bị A Nấm Phytophthora infestans Nấm P infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes), nấm sương mai (Peronosporales), lớp nấm thuộc giới (Kingdom) khác hẳn với nấm (true fungi), thực vật, động vật prokaryote Nấm phát triển nhiệt độ từ 426°C tối ưu 16-20°C Hình Nấm Phytophthora infestans kính hiển vi B Bệnh mốc sương mai cà chua Tác nhân gây bệnh Phytophthora infestans lưỡng bội, dị dưỡng sinh dưỡng Bệnh mốc sương đặc trưng giai đoạn nhiễm trùng, sau giai đoạn hoại tử tế bào chủ bị chết Hình Bệnh mốc sương mai cà chua Triệu chứng Nấm gây hại cà chua tạo triệu chứng đa dạng tùy thuộc vào giống điều kiện thời tiết Trên bệnh lúc đầu điểm nhỏ màu xanh tái, hình dạng khơng sau biến thành màu nâu xanh nhạt, vết bệnh khơng có giới hạn rõ rệt Hình Các dấu hiệu bệnh cà chua C Kỹ thuật & thiết bị a Kỹ thuật PCR PCR kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa vào base trình tự * Nguyên lý: nhân lên gấp hàng triệu lần đoạn DNA chọn lọc thời gian ngắn in vitro * Nguyên tắc: biến tính, bắt cặp kéo dài 10 Hình Thành phần chu trình thực phản ứng PCR C Kỹ thuật & thiết bị b Máy ly tâm * Nguyên lý: phân tách hạt mật độ khác pha lỏng pha rắn dựa khối lượng riêng, phân thành lớp riêng biệt nhờ lực ly tâm Hình Cấu tạo máy ly tâm quy trình thực 11 C Kỹ thuật & thiết bị c Kính hiển vi Nguyên tắc khúc xạ ánh sáng qua hệ thấu kính thủy tinh Ảnh tạo qua thấu kính ảnh thật, ngược chiều so với vật mẫu ban đầu Hình Cấu tạo kính hiển vi 12 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP A Thu thập & phân lập B Kiểm tra hình thái huyết học C Phân lập DNA gen D Xác nhận phân tử PCR 13 A Thu thập & phân lập Ủ 48 18ºC Đặt lộn ngược đĩa petri chứa môi trường chọn lọc (Rye Agar A) Ủ tuần 18°C Lá bị nhiễm bệnh mốc sương mai Các chủng phân lập tinh chế xử lý Nuôi cấy môi trường Rye Agar A chứa ampicillin 18°C 14 Sợi nấm lên từ non B Kiểm tra hình thái huyết học Các đĩa chứa chất cấy Cắt bỏ Nhuộm màu xanh Lactophenol Kiểm tra Sau đó, thực bước huyết học thông qua que thử 15 C Phân lập DNA gen Chứa 750 µL dung dịch điện ly giải, mẫu nấm môi trường nuôi cấy x2 Chứa 500 µl phenol: chloroform: alcohol (25:24:1) Lấy lớp thể tích tương đương isopropyl alcohol thêm vào Lấy phần 13.000 vòng/phút phút Lắc nhẹ Phơi khơ kết tủa DNA thu hịa tan 50µl nước ion Bỏ lượng chất lỏng phía Rửa phần kết tủa DNA 300µl ethanol 70% 13.000 vòng/phút phút 16 D Xác nhận phân tử PCR Chuẩn bị template primer - Các cặp mồi: 100 pm mồi xuôi ngược - 100 ng DNA mẫu - 2,5 mM dNTPs - Bộ đệm PCR 1X - 0,2 U Taq polymerase - Nước khơng có nuclease để tạo thể tích Cài đặt chương trình PCR Một chu kỳ 94°C 30 giây; 35 chu kỳ biến tính 94°C 30 giây Giai đoạn bắt cặp phụ thuộc vào đoạn mồi sử dụng Chu kỳ kéo dài 45 giây 72 °C Tiếp theo chu kỳ kéo dài 72°C 10 phút 17 Phân tích sản phẩm PCR Tất mẫu PCR sau tách gel agarose 4%, với DNA ladders 300 bp 700 bp (MBI Fermentas) Bảng Danh sách cặp mồi sử dụng để xác nhận phân tử Phytophthora infestans Primer ID Primer Sequence (5’-3’) AE-7-1 GCC GCC GAC ATA TTG AAT Amplicon (bp) 171 AE-7-2 O-8-1 CAA ATC TGC GAA CGA GAC AT AAG ATG ATG TTG GAT GAT TG O-8-2 TGC CTG ATT TCT ACC TTC T INF-F TGG GCG AGC CCT ATC AAA A INF-R CCG ATT CAA ATG CCA AGC TAA ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 18 size Ta (°C) Reference 50 Judelson Tooley and 245 50 Judelson Tooley and 613 50 Hussain8 , et al 612 50 Hussain8 , et al 4 KẾT LUẬN Việc xác định sớm diện bào tử hình chanh quan trọng việc đối phó với P infestans Kết hợp kỹ thuật kiểm tra kính hiển vi đánh giá huyết học giúp xác nhận bệnh cách xác Sử dụng PCR kiểm chứng phương pháp hiệu để loại bỏ kết dương tính giả, mở hội quan trọng việc phòng chống bệnh sương mai tạo giống kháng nấm hiệu 19 Tài liệu tham khảo Ivanov, A A., Ukladov, E O., & Golubeva, T S (2021) Phytophthora infestans: An Overview of Methods and Attempts to Combat Late Blight Journal of fungi (Basel, Switzerland), 7(12), 1071 https://doi.org/10.3390/jof7121071 Khalid, H., Grover, A., & Dwivedi, S (2017) PCR-based Methods for Identification and Detection of Phytophthora infestans in Infected Leaves of Tomato Defence Life Science Journal, 3(1), 41-44 https://doi.org/10.14429/dlsj.3.11491 Minh, Nguyễn Huỳnh Hoàng Định danh nấm Phytophthora spp kỹ thuật sinh học phân tử: Luận văn Kỹ sư Diss Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh,2017 Chi, Trần Yến Nghiên cứu nấm phytophthora infestans gây bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tây vụ đông xuân năm 20082009 số tỉnh phía bắc Việt Nam: Luận văn ThS Diss Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2009 20