Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định nấm phytophthora infestans trên cây cà chua

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ XÁC ĐỊNH NẤM PHYTOPHTHORA INFESTANS TRÊN CÂY CÀ CHUAGVBM: TS.. infestans thu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

XÁC ĐỊNH NẤM PHYTOPHTHORA INFESTANS

TRÊN CÂY CÀ CHUA

GVBM: TS Huỳnh Văn Biết GVHD: Ths.Trương Quang Toản Nhóm thực hiện: Nhóm 3

Môn : Thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh học

Tên thành viên

Nguyễn Thị Hồng – 21126352

Lê Ngọc Mai Xuân – 21126254

Nguyễn Thị Ngọc Huyền – 21126364

Nội dung

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

do nấm Phytophthora infestans gây ra

Mục đích

Kỹ thuật PCR đặc hiệu loài

Đặc điểm hình tháiHuyết thanh học

Hình 3 Cây cà chua bị bệnh

mốc sương mai

2 TỔNG QUAN

A Nấm Phytophthora infestans

B Bệnh sương mai trên cây cà chua

C Kỹ thuật và thiết bị

A Nấm Phytophthora infestans

Nấm P infestans thuộc lớp nấm

trứng (Oomycetes), bộ nấm sương

mai (Peronosporales), lớp nấm này

thuộc một giới (Kingdom) khác hẳn

với nấm (true fungi), thực vật, động

vật và prokaryote

Nấm phát triển trong nhiệt độ từ

4-26°C nhưng tối ưu ở 16-20°C

Hình 4 Nấm Phytophthora

infestans dưới kính hiển vi

B Bệnh mốc sương mai trên cây cà chua

Tác nhân gây bệnh Phytophthora

infestans là lưỡng bội, dị dưỡng và

sinh dưỡng

Bệnh mốc sương được đặc trưng bởi

một giai đoạn nhiễm trùng, sau đó là

giai đoạn hoại tử trong đó tế bào chủ

bị chết Hình 5 Bệnh mốc sương mai trên cây cà chua

Triệu chứng

Nấm gây hại trên cà chua tạo ra

các triệu chứng đa dạng tùy thuộc

vào giống và điều kiện thời tiết

Trên lá bệnh lúc đầu chỉ là những

điểm nhỏ màu xanh tái, hình dạng

không đều sau đó biến thành màu

nâu và xanh nhạt, vết bệnh không

có giới hạn rõ rệt

Hình 6 Các dấu hiệu của bệnh

trên cây cà chua

C Kỹ thuật & thiết bị

a Kỹ thuật PCR

PCR là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa

vào các base trình tự

* Nguyên lý: nhân lên gấp hàng triệu

lần một đoạn DNA chọn lọc trong

thời gian ngắn trong in vitro

* Nguyên tắc: biến tính, bắt cặp và

C Kỹ thuật & thiết bị

* Nguyên lý: phân tách các hạt

và mật độ khác nhau giữa pha

lỏng và pha rắn dựa trên khối

lượng riêng, phân thành lớp

riêng biệt nhờ lực ly tâm.

b Máy ly tâm

Hình 8 Cấu tạo của máy ly tâm và quy trình thực hiện

C Kỹ thuật & thiết bị

c Kính hiển vi

Nguyên tắc khúc xạ ánh sáng

qua hệ các thấu kính thủy tinh

Ảnh tạo ra qua thấu kính này

là ảnh thật, và ngược chiều so

với vật mẫu ban đầu.

3 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

A Thu thập & phân lập

B Kiểm tra hình thái và huyết thanh học

C Phân lập DNA bộ gen

D Xác nhận phân tử bằng PCR

A Thu thập & phân lập

Ủ 48 giờ ở 18ºC Đặt lá lộn ngược

trong đĩa petri chứa môi trường chọn lọc (Rye Agar A)

Ủ một tuần ở 18°C Sợi

nấm nổi lên

từ các

lá non

Nuôi cấy trong môi trường Rye Agar A chứa ampicillin ở 18°C

Các chủng phân lập

được tinh chế và xử lý

Lá bị nhiễm bệnh mốc

sương mai

B Kiểm tra hình thái và

C Phân lập DNA bộ gen

Chứa 750 µL dung

dịch điện ly giải,

mẫu nấm trong môi

trường nuôi cấy

Lấy phần nổi

Chứa 500 µl phenol: chloroform:

alcohol (25:24:1)

Lấy lớp trên và một thể tích tương đương của

isopropyl alcohol

thêm vào.

Bỏ đi lượng chất lỏng phía trên

Rửa phần kết tủa DNA bằng 300µl ethanol 70%

Phơi khô kết tủa DNA

thu được và hòa tan

trong 50µl nước ion

x2

13.000 vòng/phút trong 5 phút

13.000 vòng/phút trong 5 phút

Lắc nhẹ

Giai đoạn bắt cặp sẽ phụ thuộc vào đoạn mồi sử dụng.

Chu kỳ kéo dài trong 45 giây ở 72 °C.

Tiếp theo là một chu kỳ kéo dài ở 72°C trong 10 phút.

bp (MBI Fermentas).

Primer ID Primer Sequence (5’-3’) Amplicon size

(bp)

Ta (°C) Reference AE-7-1

4 KẾT LUẬN

Việc xác định sớm sự hiện diện của bào tử hình quả chanh là

quan trọng trong việc đối phó với P infestans Kết hợp kỹ thuật

kiểm tra bằng kính hiển vi và đánh giá huyết thanh học giúp xác nhận bệnh một cách chính xác

Sử dụng PCR đã được kiểm chứng là phương pháp hiệu quả để loại bỏ kết quả dương tính giả, mở ra cơ hội quan trọng trong việc phòng chống bệnh sương mai và tạo ra các giống cây kháng nấm hiệu quả

Tài liệu tham khảo

Ivanov, A A., Ukladov, E O., & Golubeva, T S (2021) Phytophthora infestans: An Overview of Methods and Attempts to Combat Late Blight Journal of fungi (Basel, Switzerland), 7(12), 1071

https://doi.org/10.3390/jof7121071

Khalid, H., Grover, A., & Dwivedi, S (2017) PCR-based Methods for Identification and Detection of

Phytophthora infestans in Infected Leaves of Tomato Defence Life Science Journal, 3(1), 41-44

https://doi.org/10.14429/dlsj.3.11491

Minh, Nguyễn Huỳnh Hoàng Định danh nấm Phytophthora spp bằng các kỹ thuật sinh học phân tử:

Luận văn Kỹ sư Diss Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh,2017 Chi, Trần Yến Nghiên cứu nấm phytophthora infestans gây bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tây vụ đông xuân năm 2008-

2009 tại một số tỉnh phía bắc Việt Nam: Luận văn ThS Diss Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội,

2009.

THANKS!