Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô cây cà chua phục vụ cho chuyển gen

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀĐỊNHTÊN CHỦNG NẤM MỤC TRẮNG CÓ KHẢ NĂNG PHÂNHỦYLIGNIN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ RỪNG MIỀNBẮC VIỆTNAM Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Hồng Liên Sinh viên thực : Vũ Duy Thành Lớp : 1203 Hà Nội - 2016 Khóa luận tốt nghiệp Cơng nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Được phân công Khoa công nghệ sinh học, Viện đại học mở Hà Nội, đồng ý giáo viên hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Hồng Liên, em thực đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học định tên chủng nấm mục trắng có khả phân hủy Lignin phân lập từ rừng miền bắc Việt Nam” Để hồn thành khóa luận này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Phan Thị Hồng Thảo, TS Nguyễn Văn Hiếu, ThS Nguyễn Thị Hồng Liên toàn thể cán phịng Vi sinh vật đất – Viện cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ em suốt q trình thực tập phịng Trên thực tế khơng có thành cơng mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt thời gian từ bắt đầu thực tập phòng đến nay, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý Thầy Cơ, gia đình bạn bè Với lịng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Viện Đại học Mở Hà Nội với tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian học tập trường Và đặc biệt, học kỳ Nếu khơng có lời hướng dẫn, dạy bảo thầy cô, em nghĩ thu hoạch em khó hồn thiện Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Mặc dù có nhiều cố gắng để thực đề tài cách hoàn thiện nhất, song buổi đầu làm quen với công tác nghiện cứu khoa học, tiếp cận với thực tế sản xuất hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên tránh khỏi thiếu sót định mà thân chưa thấy Em mong góp ý quý Thầy, Cô giáo bạn đồng mơn để khóa luận hồn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2016 Sinh viên Vũ Duy Thành VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Cơng nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sản xuất bột giấy sinh học 1.1.1 Khái niệm bột giấy sinh học 1.1.2 Vai trò nấm mục trắng trình sản xuất bột giấy sinh học 1.2 Nấm mục trắng 1.2.1 Đặc điểm sinh học nấm mục trắng 1.2.2 Hệ Enzyme phân hủy Lignin nấm mục trắng 13 1.3 Một số đặc điểm vùng phiên mã nấm mục trắng 17 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Các mẫu nấm 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 20 2.1.4 Môi trường 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp phân lập sàng lọc [1, 2] 21 2.2.2 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào 22 2.2.3 Khả sinh tổng hợp enzym ngoại bào 22 2.2.4 Phương pháp nuôi cấy thu enzym [16] 23 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzym phân hủy lignin 23 2.2.6 Phân tích trình tự gen vùng phiên mã ITS – RDNA 26 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng nấm mục trắng từ rừng miền Bắc Việt Nam có khả phân hủy Lignin cao 28 3.1.1 Phân lập nấm mục trắng từ rừng miền Bắc Việt Nam 28 3.2 Định tên chủng nấm mục trắng tuyển chọn dựa vào số đặc điểm sinh học trình tự gen vùng ITS – rDNA 33 3.2.1 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng nấm tuyển chọn 33 VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Cơng nghệ sinh học 3.3 Hoạt tính enzym phân hủy lignin chủng nấm nuôi rơm 40 3.3.1 Phân tích trình tự vùng gen phiên mã ITS – RDNA – rDNA chủng nấm mục trắng tuyển chọn 42 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Tỷ lệ thành phần xác định hoạt tính lignin peroxidase 23 Bảng 2.2 Tỷ lệ thành phần xác định hoạt tính mangan peroxidase 24 Bảng 2.3 Tỷ lệ thành phần xác định hoạt tính laccase 25 Bảng 3.1 Hoạt tính phân huỷ guaiacol đặc điểm thể số mẫu nấm 29 Bảng 3.2 Hình thái khuẩn lạc mơi trường thạch sau ngày 33 Bảng 3.3 Hoạt tính enzym phân hủy lignin từ rơm chủng nấm 41 Bảng 3.4 Độ tương đồng trình tự gen vùng ITS – rDNA – rDNA chủng 53 với chủng nấm Genbank 43 Bảng 3.5 Độ tương đồng trình tự gen vùng ITS – rDNA – rDNA chủng 59 với chủng nấm Genbank 45 VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 Khóa luận tốt nghiệp Cơng nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu tạo nấm Basidiomycetes (a) bào tử đảm (b) Hình 1.2 Chu trình sống nấm đảm (Copyright Pearson Education, Inc., Publishing as Benjamin Cummings) 13 Hình 1.3 Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ β–O-4 tiểu phần polymer lignin 15 Hình 1.4.Cơ chế phân cắt mối liên kết Cα-Cβ tạo thành gốc aryl 15 Hình 1.5 Cơ chế xúc tác laccase 16 Hình 1.6 Sơ đồ vùng ITS – RDNA – rDNA nấm 18 Hình 3.1 Ni cấy chủng nấm mục trắng môi trường dịch thể 36 Hình 3.2 Hình ảnh vi sợi khố (được khoanh trịn) chủng nấm 37 Hình 3.3 Khả sinh enzym ngoại bào chủng nấm 38 Hình 3.4 Khả sinh trưởng chủng nấm mục trắng nhiệt độ nuôi cấy sau ngày 40 Hình 3.5 Hệ sợi chủng nấm sinh trưởng rơm 41 Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại gen ITS – rDNA chủng 53 (a) chủng 59 (b) 42 Hình 3.7.Trình tự hoàn chỉnh vùng gen ITS – rDNA – rDNAcủa chủng 53 .43 Hình 3.8 Trình tự hồn chỉnh vùng gen ITS – rDNA – rDNA chủng 59 .45 VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, ngành cơng nghiệp giấy cịn phát triển chậm so với giới trình độ quy mơ sản xuất Cả nước có khoảng 300 doanh nghiệp, chủ yếu doanh nghiệp vừa nhỏ, trình độ công nghệ lạc hậu Tuy nhiên Việt Nam có phương pháp sản xuất bột giấy phương pháp sử dụng hóa chất, phương pháp lý, phương pháp tái chế giấy loại, phương pháp sử dụng nhiều hóa chất, lượng để tạo sản phẩm gây lãng phí ảnh hưởng không tốt đến môi trường, làm giảm lực cạnh tranh ngành giấy thời kì cơng nghiệp hóa, đại hóa đất nước q trình hội nhập quốc tế sâu rộng Sản xuất bột giấy sinh học xem giải pháp nhằm khắc phục nhược điểm phương pháp sản xuất bột giấy truyền thống Bột giấy sinh học bột giấy tạo nguyên liệu tiền xử lý nấm mục trắng có khả phân huỷ lignin Bên cạnh đó, sản xuất giấy vốn sử dụng nhiều nguyên liệu gỗ Hiện nay, diện tích rừng nước ta ngày thu hẹp nạn chặt phá khai thác bừa bãi, ảnh hưởng đến nguồn nguyên liệu sản xuất giấy Nhiều nước giới Trung Quốc, Ấn Độ, Ai Cập hướng đến sản xuất giấy sử dụng nguyên liệu phi gỗ phế phụ phẩm nông nghiệp rơm rạ, rơm, thân đay, thân ngô Việt Nam nước nông nghiệp nên lượng phế phụ phẩm nông nghiệp vô lớn Trong thực tế nguồn nguyên liệu chưa khai thác sử dụng có hiệu quả, khơng lãng phí mà cịn gây nhiễm mơi trường Ở nước ta, chưa có nhiều cơng bố phân loại nấm mục trắng dựa việc phân tích trình tự vùng gen phiên mã trongITS – RDNA ứng dụng nấm mục trắng sản xuất bột giấy sinh học Phần lớn nghiên cứu dừng việc phân loại nấm mục trắng theo đặc điểm hình thái đa dạng sinh học nấm mục trắng VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 Nhằm mục đích tạo chủng nấm mục trắng có khả phân huỷ lignin cao để sử dụng sản xuất bột giấy sinh học từ rơm rạ, thực đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học định tên chủng nấm mục trắng có khả phân hủy Lignin phân lập từ rừng miền bắc Việt Nam” Đề tài tạiphòng Vi sinh vật đất – Viện công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sản xuất bột giấy sinh học 1.1.1 Khái niệm bột giấy sinh học Bột giấy loại vật liệu dạng xơ, sợi chế biến từ nguyên liệu sợi cellulose từ thực vật gỗ cứng (cây hạt kín, rộng) gỗ mềm (cây hạt trần, kim), loại ngắn ngày, loại phụ phẩm nơng nghiệp Q trình sản xuất bột giấy phổ biến sử dụng phương pháp học hóa học Bột giấy sản xuất theo phương pháp hóa học có độ bền lý cao, hiệu suất thấp (khoảng 50%) đặc biệt phát thải lượng lớn chất gây ô nhiễm môi trường Bột giấy sản xuất theo phương pháp học cho hiệu suất thu hồi bột giấy cao, lượng tiêu hao lớn, bột giấy có độ bền học khơng cao [9] Giải pháp nhà khoa học giới quan tâm tập trung vào nghiên cứu sản xuất bột giấy sinh học Bột giấy sinh học bột giấy sản xuất theo phương pháp sử dụng loại chế phẩm sinh học phá vỡ liên kết lignin (delignification) để thu xơ sợi bột giấy Sản lượng nguyên liệu gỗ cho sản xuất giấyngày suy giảm diện tích rừng bị thu hẹp tốc độ tái sinh rừng lại chậm so với nhu cầu sử dụng Tại số quốc gia có nơng nghiệp phát triển (như Trung Quốc, Ấn Độ…), để tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp rơm rạ, bã mía, thân ngơ vô phong phú, lượng lớn bột giấy sản xuất từ phế phụ phẩm nông nghiệp để thay cho nguyên liêu gỗ Vì vậy, tăng cường sử dụng nguyên liệu phi gỗ, đặc biệt phế thải nông nghiệp… hướng phát triển nguồn nguyên liệu xơ sợi, phục vụ phát triển bền vững, nước phát triển Sản xuất bột giấy sinh học nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu từ lâu Quan điểm sử dụng nấm tiến hành tiền xử lý gỗ năm 50 kỷ trước Cơ sở trình sản xuất bột giấy sinh học khả phát triển gỗ nấm mục trắng phân VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 hủy lignin mà không tác động tới cellulose Bột giấy thu chủ yếu tác động tác nhân sinh học, q trình xử lý hóa học học có tính phụ trợ Loại hình cơng nghệ đặc biệt thích hợp ngun liệu ngắn ngày, thân thảo [9] Một số nghiên cứu sử dụng đồng thời số chủng nấm xử lý xử lý hai bước với hai loài nấm khác với nguyên liệu khác rơm rạ, bã mía, gỗ bạch đàn, gỗ dương Một số loài nấm thường sử dụng sản xuất bột giấy sinh học như: Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Ceriporiopsis subvermispora, Trametes versicolor, Pycnoporus sanguineus, Pleurotus sp., (trong phần lớn lồi nấm đảm), số loài khác [30] Phương pháp sử dụng chủng nấm mục trắng có khả phân giải lignin để sản xuất bột giấy từ phụ phẩm nông nghiệp cho kết khả quan Herpoel cộng (2002) phát triển quy trình công nghệ sinh học sử dụng xylanase laccase từ nấm Pycnoporus cinnabarinus để loại bỏ lignin từ rơm rạ sản xuất bột giấy [13] Bột giấy sản xuất hồn tồn theo phương pháp sinh học thường có độ trùng hợp thấp, dẫn tới hình thành tờ giấy có độ bền khơng cao Do nhà khoa học áp dụng trình xử lý ngắn với mục đích loại bỏ phần lignin Các trình xử lý giúp thúc đẩy trình xử lý theo phương pháp hóa học học Nếu tiếp tục xử lý theo phương pháp hóa học giảm lượng kiềm thủy phân tiếp lượng Cl2 tiêu tốntrong trình tẩy trắng, tiền xử lý sinh học giúp tiết kiệm lượng nghiền trình xử lý học Các số bột giấy tạo độ chịu bục, độ bền kéo, độ bền xé hay độ trắng tăng 25 – 45% Sản phẩm bột giấy sản xuất đảm bảo chất lượng mà phương pháp sản xuất bột giấy giúp giảm chi phí sản xuất, giảm phát thải nhiễm mơi trường hạn chế sử dụng hóa chất lượng [30] VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 Chủn g 53 Chủn g 59 Hình 3.2 Hình ảnh vi sợi khố (được khoanh trịn) chủng nấm Nhiều sợi nấm hệ sợi chủng nấm 53 59 có hình thành khóa (clamp connection) Theo Sharma (1998), khóa cấu trúc hình thành suốt phân chia tế bào khuẩn ty bậc hai hầu hết dòng nấm thuộc ngành phụ nấm đảm Basidiomycotina[28] Như vậy, chủng nấm 53 59 thuộc ngành phụ nấm đảm Basidiomycotina 3.2.1.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh lý, sinh hóa a Khả sinh enzym ngoại bào Cả chủng nấm có khả sinh tổng hợp enzym ngoại bào cao Bên cạnh khả phân hủy hợp chất có cấu trúc tương tự lignin guaiacol, RBBR, chủng nấm mục trắng 53 59 phân hủy tốt chất CMC, tinh bột casein VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 37 Các nguồn chất Chủng nấm Guaiacol RBBR CMC Tinh bột Casein 53 59 Hình 3.3 Khả sinh enzym ngoại bào chủng nấm VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 38 b Dải nhiệt độ pH phát triển Các chủng nấm mục trắng nuôi cấy nhiệt độ khác Qua bảng hình 3.4 thấy nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến khả sinh trưởng chủng 53 v 59 Chúng sinh trưởng phát triển tốt 25 30°C, nhiệt độ nuôi cấy cao hơn, 37 42°C, nấm sinh trưởng Chủng nâm mục trắng Nhiệt độ sinh trưởng 53 59 25°C 30°C VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 39 37°C 42°C Không sinh trưởng Không sinh trưởng Hình 3.4 Khả sinh trưởng chủng nấm mục trắng nhiệt độ nuôi cấy sau ngày Khi nuôi cấy môi trường pH ban đầu điều chỉnh từ pH – pH 9, chủng nấm mục trắng có khả sinh trưởng dải pH rộng pH – Tuy nhiên pH tối ưu cho chủng nấm 53 sinh trưởng phát triển môi trường dịch thể pH – 6, chủng 59 sinh trưởng tốt pH trung tính đến kiềm pH – 3.3 Hoạt tính enzym phân hủy lignin chủng nấm nuôi rơm Các chủng nấm nuôi cấy phế phẩm nông nghiệp rơm Phương pháp nuôi cấy thu hồi enzym thực theo mục 2.2.4 (Phần Vật liệu phương pháp) VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 40 Chủng 53 Chủng 59 Hình 3.5 Hệ sợi chủng nấm sinh trưởng rơm Cả chủng nấm mục trắng 53 59 có khả sinh trưởng phát triển tốt chất rắn rơm Hoạt tính enzym phân hủy lignin chủng nấm kiểm tra suốt trình ni cấy Kết thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Hoạt tính enzym phân hủy lignin từ rơm chủng nấm Enzym Chủng nấm Thời gian nuôi cấy (ngày) phân hủy lignin 10 15 20 LiP 775,8 874,2 1791,3 1676,1 Lac 893,2 1934,7 1669,5 948,4 LiP 980,8 1437,4 2529,7 1043,9 Lac 1026,5 1198,6 861,8 (nkat/L) 53 59 Trên chất rơm, chủng 53 59 sinh lignin peroxidase laccase Hoạt tính LiP chủng đạt cao sau 15 ngày nuôi cấy VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 41 rơm Chủng 53 sinh tổng hợ ợp laccase tốt sau 10 ngày vớ ới chủng 59 phải cần đếnn 15 ngày để đ hoạt tính laccase đạt cao 3.3.1 Phân tích trình tự vùng gen phiên mã ITS – RDNA – rDNA chủng nấm mục trắng ng tuyển chọn DNA tổng số nấm m mục m trắng tách chiết theo phương ương pháp c Sambrook vàRussell Russell (2011) DNA tổng số chủng 53 59 đãã tách chiết thành công đượcc bảo b quản 4oC để sử dụng ng cho thí nghi nghiệm Thực phản ứng ng PCR khuếch khu đại gen ITS – rDNA - rDNA từ DNA tổng số chủng nấm m mục m trắng, sử dụng cặp mồi đặc hiệuu BF BR cho băngsáng nhấtt có kích th thước khoảng 800 bp (hình 3.6) ) K Kết cho thấy phản ứng ng PCR thí nghi nghiệm đặc hiệu a b Hình 3.6 Điện di kiểm m tra sản s phẩm phản ứng PCR khuếch đạii gen ITS – rDNA c chủng 53 (a) chủng 59 (b) Đường chạy M:: thang DNA chu chuẩn; đường chạy 53 59: gen ITS – rDNA chủng 53 59 VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 42 GAAAAAAGGTTTCGTAGGTGACCTGCGGAGGATCATTATCGAGTTCT TGAAACGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCACGCCCTGCTC AATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTAGGTTTCTTGGTCGCGTTG GGTTCCGTTACTGGGGCTCGACAAAGCCGAGGGGCTTATGTTTTACT ACAAACTATAAAGTAACTGAATGTATACCGCGTCTAACGCATCTATA TACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAAC GCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCA TGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATTCTCAACCTACAAGCCTTTTCGGA GGCCTTTGTACGGCTTGGACTTGGAGGATCATTGTCGGCAGCGATGT CGGCTCCTCTTAAACGCATTAGCTAGTTCTCGCGGAACGGCTCTCGG TGTGATAATTGTCTACGCCGTGGTCGTGCCGGGTACATGGACAAGCT TCTAAACCGGTCACTCCTTGTGAGAGACACATATCTTGACATCTGAC CTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC GGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACTGCGAGTGAA GCGGGAAAAGCTCAAATTTAAAATCTGGCGGTCTTTGGCCGTCCGAG TTGTAGTCTGGAGAAGTGCTTTCCGCGCTGGACCGTGAAAATTTTCC CCGGAATTTCCTTCCATT Hình 3.7.Trình tự hoàn chỉnh vùng gen ITS – rDNA – rDNAcủa chủng 53 Bảng 3.4.Độ tương đồng trình tự gen vùng ITS – rDNA – rDNA chủng 53 với chủng nấm Genbank Chủng nấm Microporus xanthopus BPSM Microporus xanthopus Microporus vernicipes D16 Microporus sp BAB4083 Microporus xanthopus Microporus affinis VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 Độ tương Mã số truy cập đồng (%) 98 98 98 98 97 97 Genbank KM985667 JX290074 KP715551 KJ670302 LC149595 KP013022 43 Trình tự gen vùngITS – rDNA – rDNA chủng nấm 53 có kích thước 816 nucleotide, trình bày hình 3.7 Khi so sánh trình tự gen nhận nghiên cứu với trình tự gen tương ứng ngân hàng liệu sở GenBank công cụ BLAST (NCBI) cho thấy: gen vùngITS – rDNA – rDNA chủng 53 có độ tương đồng cao (98%) so với gen tương ứng chủng Microporus xanthopus BPSM 30(KM98566), Microporus vernicipes D16 (KP715551), Microporus affinis MEL2382659(KP013022) (Bảng 3.4) Kết hợp với đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa, tạm xếp chủng TĐ53 thuộc chi Microporus đặt tên chủng 53 làMicroporus sp TĐ53 Trong danh mục loài nấm phân huỷ gỗ Samoa (Mỹ) theo nghiên cứu McKenzie (1996) [20] Brooks (2004) [8] có mặt lồi nấm thuộc chi Microporus M affinis, M vernicipes Microporus sp Microporus xanthopus bốn loài nấm nhóm nghiên cứu Ashiglar (2014) định danh kỹ thuật phân tích trình tự vùng gen ITS – rDNA – rDNA [4] Chưa có nhiều cơng bố khả phân huỷ lignin Microporus Năm 2013, Shri cộng kiểm tra khả sinh tổng hợp enzym phân huỷ lignin loài M xanthopus M affinis chất bã mía [29] CGATTTTGGCCTGTCGTATGAGCGCCTGCGGATGCGATCAGTAACGA GTTTTGACATGGGTTGTAGCTGGCCTCACGAGGCATGTGCACGCCCT GCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTAGGTTTGGCGTGGGCT TTCGGGGCCTTCACGGGCTTTGAGAGCATTCTGCCTGCCTATGTATC ACTATAAACACTACGAAGTAACAGAATGTAATCGCGTCTAACGCATC TTAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAA GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTG AATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGG AGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGTATTCTCAACCCACACATCCTTGT GATGCTTGTGAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGCTGGCCCATCGCGGTC GGCTCCTCTTGAATGCATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTCTCAG VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 44 TGTGATAATTGTCTACGCTGTGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCT AACCGTCCTGCTAGGGACAACTTACTTGACATCTGACCTCAAATCAG GTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAA GAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACTGCGAGTGAAGCGGGAAAA GCTCAAATTTAAAATCTGGCGGTCTTTGGCCGTCCGAGTTGTAGTCT GGAGAAGCGTCTTCCGCGCTGGACCGTGTACAAGTTCTCCTGGA Hình 3.8.Trình tự hồn chỉnh vùng gen ITS – rDNA – rDNA chủng 59 Bảng 3.5.Độ tương đồng trình tự gen vùng ITS – rDNA – rDNA chủng 59 với chủng nấm Genbank Chủng nấm Leiotrametes lactinea Trametes cubensis S26 Leiotrametes lactinea Trametes elegans UMT170-T Trametes lactinea 9V7/2 Trametes lactinea Độ tương đồng (%) 99 99 99 99 99 99 Mã số truy cập Genbank KP01295 GQ85179 JN04876 KM4380122 GQ982888 HM756191 Trình tự gen vùngITS – rDNA – rDNA chủng nấm 59có kích thước 796 nucleotide, trình bày hình 3.8 Khi so sánh trình tự gen nhận nghiên cứu với trình tự gen tương ứng ngân hàng liệu sở GenBank công cụ BLAST (NCBI) cho thấy: gen vùngITS – rDNA chủng 59 có độ tương đồng cao (99%) so với gen tương ứng chủng Leiotrametes lactinea MEL2382767 (KP012950), Leiotrametes lactinea Cui7084 (JN048769), Trametes lactinea 9V7/2(GQ982888) (Bảng 3.5) Kết hợp với đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa, tạm xếp chủng VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 45 TĐ59thuộc loài Leiotrametes lactinea đặt tên chủng TĐ59 Leiotrametes lactinea sp TĐ59 Leiotrametes chi nấm Welti phân loại xếp thành chi riêng, trước đây, chi nấm xếp lồng vào với chi Trametes [33] Vào năm 2012, Berrin cộng công bố phân lập chủng nấm Leiotrametes lactinea (Mã số truy cập Genbank JX082368) từ rừng nhiệt đới đảo Guiana (Pháp) [6] Các nghiên cứu phân lập phân loại nấm mục trắng phân huỷ lignin cịn hạn chế Nhóm nghiên cứu Metuku (2011) chọn chủng nấm có khả phân giải lignin cao định tên Pycnoporus sp DIS 343f [22] Ortiz cộng năm 2013 nghiên cứu đa dạng sinh học nấm mục trắng công viên quốc gia Chile định danh 12 loài nấm khác thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes [23] VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 46 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, đưa kết luận sau: T 35 mẫu nấm thân gỗ mục từ vườn quốc gia Tam Đảo, phân lập tuyển chọn 12 chủng nấm mục trắng có khả phân giải lignin Đã lựa chọn chủng nấm 53 59 để phân loại, định danh dựa số đặc điểm sinh học phân tích trình tự vùng gen ITS – rDNA nấm; Đã nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng nấm mục trắng 53 59 Chúng phát triển tốt mơi trường cao malt, Hansen, khoai tây khống có bổ sung rơm Hai chủng thuộc ngành phụ nấm đảm Basidiomycotina Chúng có khả sinh tổng hợp enzym ngoại bào ligninase, cellulase, amylase protease Nhiệt độ ni cấy thích hợp từ 25 30°C có khả sinh trưởng dải pH – 9; Đã đánh giá khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzym phân hủy lignin hai chủng nấm mục trắng 53 59 chất rơm rạ theo thời gian nuôi cấy; Đã khuếch đại phân tích trình tự vùng gen ITS – rDNA – rDNA chủng nấm 53 59 Dựa vào kết nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tích trình tự vùng gen ITS – rDNA , tạm xếp chủng 53 thuộc chi Microporus chủng 59 thuộc loài Leiotrametes lactinea VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Bá Dũng (2003) Nấm lớn Tây Nguyên, NXB Khoa học Kỹ thuật Trịnh Tam Kiệt (2011) Nấm lớn Việt Nam, Tập (tái lần thứ 2), NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ Akhtar M., Kirk TK and Blanchette RA (1999), Biopulping: An overview of consortia research, Proc of the 6th ICBPPI.187-192 Ashiglar S.M., Brooks F., Cannon P.G and Klopfenstein N.B (2014), Preliminary Survey Of Wood-Associated Fungi In Southeast O'ahu Of Hawai'i Using DNA-Based Identification, In: Murray, M & P Palacios (Comps) Proceedings of the 62nd Annual Western International Forest Disease Work Conference, 67-69 Atalla RH, Reiner RS, Houtman CJ (2004) New technology in pulping and bleaching Encyclopedia of forest sciences Oxford, UK,Elservier Academic Press, 2, 918-924 Berrin G., Navarro D., Couturier M., Olivé C., M.Haon GS., Taussac S., Lechat C., Courtecuisse R., Favel A., Coutinho M., and Lesage L (2012), Exploring the Natural Fungal Biodiversity of Tropical and Temperate Forests toward Improvement of Biomass Conversion, Appl Environ Microbiol., 78(18): 6483–6490 Bonnarme P., Perez J., and Jeffries TW (1991), Regulation of ligninase productionin white-rot fungi, ACS Symp Ser, 460:200-206 Brooks, FE (2004) Tech Paper 41 ASCC Land Grant, Malaeimi, AS Chen HZ (2014) Biotechnology of Lignocellulose: Theory and Practice, Chemical Industry Press 10 Cho NS., Pashenova N., Hop PTB., Leonowicz A (2003), Purification and characterization of a laccase from Cerrena unicolor, Cheongju, Korea,19-40 VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 48 11 Diehl SV., McElroy C and Prewitt ML (2004), Development and imple mentation of a DNARFLP database for wood decay and wood associated fungi The International Research Group on Wood Preservation; 35: 1-18 12 Gardes M and Bruns TD (1993) ITS – RDNA primers with enhanced specificity for basidiomycetes – application to the identification of mycorrhizae and rusts Mol Eco., 2:113-118 13 Herpoel I., Jeller H., Fang G., Petit-Conil M., Bourbonnais R., Robert J., Asther M and Sigoillot, J (2002), Efficient enzymatic delignification of wheat straw pulp by a sequential xylanase-laccase treatment J Pulp Paper Sci 28: 67–71 14 Highley TL., Dashek WV (1998), Biotechnology in the Study of Brown and White-Rot Decay, Forest products biotechnology, 15-36 15 Husaini A, Fisol FA,Yun LC, Hussain MH, Sepiah Muid S, Roslan HA (2011) Lignocellulolytic enzymes produced by tropical white rot fungi during biopulping of Acacia mangium wood chips J Biochem Tech 3(2): 245-250 16 Iqbal HMN., Asgher M., and Bhatti HN (2011), Optimization of physical and nutritional factors for synthesis of lignin degrading enzymes by a novel strain of Trametes versicolor, Bio.Res., 6: 1273-1278 17 Jebapriya GR And Gnanadoss JJ (2014), Screening and molecular ch aracterization of white rot fungi c apable of laccase production and dye decolourization, International Journal of life science & pharma research, 4(2): L12-20 18 Kirk TK And Farrell RL (1987), Enzymatic “Combustion”: The microbial degradation of lignin, Ann Rev Microbiol., 41:465-505 19 Kobe steel (1988) Lignin degrading microorganisms having high activity and selectivity (for lignin) Japanese Patent EP295063 VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 49 20 Mc Kenzie, EHC 1996 Tech Paper 206 SPC, Noumea, New Caledonia 21 Mercer D., Iqbal H., Miller P., and McCarthy A (1996), Screening Actinomycetes for Extracellular Peroxidase Activity, Appl Environ Microb., 62: 2186-2190 22 Metuku P., Burra S., Nidadavolu H., Pabba S., and Singaracharya M (2011),Selection of highest lignolytic white rot fungus and ITS – rDNA molecular identification Cell Tissue Res., 11(1): 2557-2562 23 Ortiz R., Navarrete J., Oviedo C., Párraga M., Carrasco I., Vega E., Ortiz M., and Blanchette R (2013), White rot B asidiomycetes isolated from Chiloé National park in Los Lagos region, Chile A van Leeuw J Microb, 104: 1193-1203 24 Priyadarsini RI, BhuvaneswariV (2011), Isolation, identification and phylogenetic analysis of white rot fungus and heterologous expression of gene encoding laccase, Journal of Applied Sciences in Environmental Sanitation, (1): 69-83 25 Sambrook J and Russell D W 2001 Molecular cloning A laboratory manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 26 Schwantes H.O., Salttler P.W.(1971) Methoden zur Messung der Wachstumsgeschwindigkeit von Pilzmycelien Oberhess Naturwiss ZeITS – rDNA chr., 38: 5-18 27 Setliff EC, Marton R, Granzow SG, Eriksson K-EL (1990) Biomechanical pulping with white-rot fungi TAPPIJ, 73(8): 141-147 28 Sharma O.P (1998) Textbook of Fungi, 5thedition Tata McGraw-Hill Publishing Company Limited, New Delhi 29 Shri T.A., Deepa P., Nithya T (2013), Screening, optimization and separation of ligninolytic enzyme by polyporaceae group fungi, VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 50 International Journal of Science Innovations and Discoveries, (4): 434445 30 Singh P., Sulaiman O., Hashim R., Rupani P., and Peng L (2010), Biopulping of lignocellulosic material using different fungal species: A review, Rev Environ Sci Biotechnol., 9: 141-151 31 Singhalet A, Jaiswal PK, Jha PK, Alka Thapliyal, and Thakur IS (2013) Assessment of Cryptococcus albidus for biopulping of Eucalyptus,Prep Biochem Biotechnol, 43(8): 735-49 32 Tuomela M., Vikman M., Hatakka A., Itӓvaara A (2000), Biodegradation of lignin in a compost environment: a review Biores Technol 72: 169183 33 Welti S., Moreau P., Favel A., Courtecuisse R., Haon M., Navarro D., Taussac S., and Meessen L (2012), Molecular phylogeny of Trametes and related and description of a new genusLeiotrametes Fungal Diversity 55: 47-64 34 White TJ., Bruns T., Lee S., Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds) PCR Protocols: a Guide to methods and Applications, Academic Press, New York, USA 315–322 VŨ DUY THÀNH – CNSH 1203 51