Thử nghiệm chuyển gen gfp trên gà gallus gallus domesticus sử dụng vector pt2 bh cvpf sb11 bằng phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp 1

PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việc nâng cao suất, cải tiến tiềm di truyền vấn đề hàng đầu phát triển nông nghiệp nói chung chăn ni nói riêng Tuy nhiên, cơng tác cải tạo giống cổ truyền cịn tồn nhiều hạn chế (con lai thu qua lai tạo chọn lọc cịn mang gen khơng mong muốn…) Vậy, câu hỏi đặt để tạo giống vật ni có suất cao, phẩm chất tốt giống vật nuôi mang gen mong muốn [2],[9]? Gần đây, nhờ thành tựu lĩnh vực ADN tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen đời cho phép khắc phục trở ngại nói Nó cho phép đưa gen mong muốn vào vi sinh vật, thực vật động vật để tạo giống sinh vật có đặc tính Việc chuyển gen khơng dừng lại việc sử dụng nguồn gen loài mà cịn đưa gen lồi vào lồi khác Ở động vật, trình chuyển gen tương đối phức tạp năm gần thu nhiều thành tựu đáng kể Với ưu điểm bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, tạo tiềm phát triển vô to lớn nhiều lĩnh vực đời sống xã hội Trong hướng nhà nghiên cứu tập trung vào mục tiêu: tạo động vật chuyên sản xuất protein quý phục vụ y học; tạo động vật có sức chống chịu tốt, có tốc độ lớn nhanh, cho suất cao chất lượng sản phẩm tốt Ðộng vật chuyển gen sử dụng làm mơ hình thí nghiệm nghiên cứu bệnh người để nhanh chóng tìm giải pháp chẩn đoán điều trị bệnh hiểm nghèo [2],[11] Quá trình chuyển gen động vật tiến hành thành công nhiều đối tượng khác chuột, cá, thỏ, lợn, cừu, bò Đặc biệt, gà, cấu tạo sinh lý có nhiều ưu để tiến hành chuyển gen nên có nhiều thí nghiệm chuyển gen thành cơng với tỉ lệ cao Đây đối tượng tuyệt vời để sản xuất protein tái tổ hợp trứng [32] Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu lĩnh vực tạo động vật chuyển gen bắt đầu đạt thành cơng đáng khích lệ Tuy nhiên, nghiên cứu bước đầu, cần có nghiên cứu với quy mơ sâu rộng để đưa động vật chuyển gen vào sản xuất Hiện nay, Việt Nam chưa có cơng trình cơng bố chuyển gen thành cơng tạo gia cầm chuyển gen Chính lí trên, chúng tơi chọn đề tài “Thử nghiệm chuyển gen GFP gà (Gallus gallus domesticus) sử dụng vector pT2/BHCVpf-SB11 phương pháp chuyển gen qua tinh trùng vi tiêm vào phôi gà ấp” làm đề tài nghiên cứu Mục đích nghiên cứu - Thiết lập quy trình chuyển vector pT2/BH-CVpf-SB11 vào phôi gà ấp - Đánh giá khả phát triển phôi tiêm vector pT2/BHCVpf-SB11 - Ấp nở thành công trứng gà tiêm vector pT2/BH-CVpf-SB11 - Hoàn thiện phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà - So sánh hiệu chuyển gen phương pháp vi tiêm vào phôi ấp phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà - Đánh giá biểu gen chuyển giai đoạn phát triển khác phôi gà gà sau nở - Đánh giá biểu gen chuyển mô khác gà giai đoạn phát triển khác PHẦN NỘI DUNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Đối tượng nghiên cứu Chúng sử dụng giống gà Lơgo (Leghorn) cung cấp trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương, Viện Chăn nuôi Quốc Gia Gà leghorn có lơng màu trắng, đầu nhỏ, mào tích phát triển Trọng lượng thể lúc trưởng thành khoảng 1,8 - kg/con gà trống; 1,4 - 1,8 kg/con gà mái Gà Leghorn giống chuyên trứng cao sản giới nay, sức đẻ năm đầu 280 - 300 trứng, sản lượng trứng năm khoảng 250 270 quả/1 mái Trứng to, nặng 60-65g, tỉ lệ lòng trắng so với lòng đỏ cao loại trứng gà khác, vỏ trứng màu trắng, dễ kiểm tra phôi trứng ấp Với đặc điểm trên, trứng gà Leghorn đối tượng thuận lợi cho nghiên cứu chuyển gen gia cầm với mục đích sản xuất protein dược liệu lịng trắng trứng B A Hình 2.1: Gà Leghorn (A: Gà trống; B: Gà mái) 1.2 Vector transposon Sleeping Beauty Vector transposon Sleeping Beauty sử dụng plasmid có kích thước 8230 bp, tổ hợp plasmid pCVpf, pT2 - BH spUb SB11, plasmid pCVpf có mang đoạn gen kháng puromycin đoạn gen mã hoá cho eGFP, plasmid pT2 - BH mang transposon SB plasmid spUb - SB11 chứa đoạn gen mã hóa cho enzyme transposase có liên quan đến di chuyển transposon Hình 2.2: Cấu trúc vector Transposon Sleeping Beauty (vector pT2/BH-CVpf-SB11) 1.3 Phương pháp nghiên cứu Chúng tiến hành song song hai phương pháp chuyển gen qua tinh trùng vi tiêm vào phôi gà ấp 3.1 Phương pháp chuyển gen qua tinh trùng Quy trình thí nghiệm phương pháp SMGT thể qua hình 2.3: Chúng tiến hành thu tinh dịch gà trống thí nghiệm, ủ với vector pT2/BH-CVpf-SB11 sau thụ tinh nhân tạo cho gà mái Tiến hành ấp trứng thu sau thụ tinh; sau ngày kiểm tra tỉ lệ phôi chia làm hai lô để kiểm tra có mặt gen chuyển: + Lơ 1: Tách phôi ngày ấp, nuôi cấy nguyên bào sợi sàng lọc puromycin + Lô 2: Ấp nở thành gà con, sau kiểm tra phương pháp PCR Gà mái Gà trống Lấy tinh trùng Tinh trùng Ủ với vector pT2/BH-CVpf-SB11 Thụ tinh nhân tạo Tinh trùng mang vector pT2/BH-CVpf-SB11 Trứng gà ấp Ấp Trứng gà ngày ấp Gà Tách phôi Nuôi cấy nguyên bào sợi, sàng lọc Puromycin Kiểm tra có mặt gen chuyển phản ứng PCR Kiểm tra có mặt gen chuyển phản ứng PCR Hình 2.3: Sơ đồ quy trình chuyển gen qua tinh trùng 1.3.2 Phương pháp vi tiêm Quy trình thí nghiệm phương pháp vi tiêm thể qua hình 2.4 Chúng tơi tiến hành vi tiêm vector pT2/BH-CVpf-SB11 vào trứng gà ấp Sau đem ấp trứng kiểm tra có mặt gen chuyển tương tự phương pháp SMGT Trứng gà ấp Vi tiêm Vector pT2/BH-CVpf-SB11 Trứng gà mang vector pT2/BH-CVpf-SB11 Ấp Trứng gà ngày ấp Gà Tách phôi Nuôi cấy nguyên bào sợi, Kiểm tra có mặt gen chuyển phản ứng PCR sàng lọc Puromycin Kiểm tra có mặt gen chuyển phản ứng PCR Hình 2.4: Sơ đồ quy trình phương pháp vi tiêm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 2.1 Kết kiểm tra nồng độ tinh trùng Chúng tiến hành kiểm tra lượng tinh dịch sau lần xuất tinh (V) nồng độ tinh trùng (C) gà trống thí nghiệm (TN) thu kết quả: Bảng 3.1: Kết kiểm tra số lượng tinh dịch (V) nồng độ tinh trùng (C) Số hiệu gà V (ml) C (tinh trùng/ml) 0,25 ± 0,008 9,0.108 ± 0,4.108 0,27 ± 0,009 8,0.108 ± 0,3.108 0,30 ± 0,009 8,5.108 ± 0,3.108 0,28 ± 0,008 8,0.108 ± 0,2.108 0,25 ± 0,008 8,7.108 ± 0,4.108 Qua bảng số liệu ta thấy gà trống có lượng tinh dịch sau lần xuất tinh nồng độ tinh trùng tương đối đồng Lượng tinh dịch cao gà số (0,30 ml), thấp gà số số (0,25 ml) Tất giá trị phù hợp với lượng xuất tinh trung bình gà theo Bahr Bakst 0,25 [11] Nồng độ tinh trùng gà trống TN tương đối cao, dao động khoảng từ 8.108 đến 9.108 tinh trùng/ml Từ kết trên, thấy gà trống TN đảm bảo số lượng chất lượng tinh dịch theo tiêu chuẩn loài, đáp ứng yêu cầu TTNT [1] Dựa số liệu này, chúng tơi tính tốn số lần pha lỗng tinh dịch cho q trình TTNT 2.2 Kết kiểm tra có mặt gen GFP genom giai đoạn phôi 2.2.1 Kết kiểm tra tỉ lệ trứng có phơi Chúng tơi tiến hành đồng thời hai phương pháp chuyển gen qua tinh trùng vi tiêm vào trứng gà ấp Sau ngày ấp, kiểm tra trứng xem có phơi phát triển hay khơng Kết thu có khác rõ rệt phương pháp, thể bảng sau: Bảng 3.2: Kết kiểm tra tỉ lệ trứng có phơi Phươn g pháp SMGT Vi tiêm Đợt TN Số trứng thu Số trứng có phơi Tỉ lệ trứng (quả) 125 75 79 30 28 29 phát triển (quả) 122 72 74 16 24 26 có phơi (%) 97,60 96,00 93,67 53,33 85,71 89,66 Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Đợt Như thấy rằng, tỉ lệ trứng phôi phương pháp SMGT cao nhiều so với phương pháp vi tiêm Tỉ lệ trứng có phơi trung bình phương pháp SMGT xấp xỉ 95,76% , tỉ lệ phương pháp vi tiêm 76,23% 2.2.2 Kết nuôi cấy in vitro tế bào phân lập từ phôi gà ngày ấp Sau phân lập từ phôi ngày ấp, tế bào chuyển vào giếng nuôi cấy đĩa 24 giếng với lượng tế bào ban đầu cấy vào giếng khoảng 0,3x106 tế bào/giếng Mơi trường dùng để ni cấy dịng ngun bào sợi phôi gà là: DMEM + 10% FBS + 100U/ml Penicillin, 100 µg/ml streptomycin Optimen + 5% FBS + 100U/ml Penicillin, 100 µg/ ml streptomycin Sau 24h ni cấy, nguyên bào sợi bám xuống đáy giếng có hình dạng đặc trưng: tế bào có hình thn nhọn hai đầu, phân nhánh Sau đó, tế bào bắt đầu xử lý puromycin (lúc này, giếng nuôi cấy có mật độ khoảng 0,3x106 - 0,5x106 tế bào/giếng) (hình 3.1) Hình 3.1: Tế bào phơi gà ngày ấp trước sàng lọc puromycin (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) Mỗi đợt thí nghiệm tiến hành phôi gồm phôi đối chứng (ĐC) phơi TN, phơi có giếng gồm giếng không bổ sung puromycin, giếng cịn lại có nồng độ puromycin là: 1μg/ml, μg/ml, 3g/ml, μg/ml, μg/ml, 3g/ml, μg/ml, μg/ml, 3g/ml Lần lượt tế bào giếng lơ quan sát kính hiển vi đếm số lượng tế bào sau 24h 2.2.2.1 Kết sau 24 sàng lọc puromycin a Kết quan sát kính hiển vi Ở hai phương pháp SMGT vi tiêm, sau 24h sàng lọc, chúng tơi quan sát thấy có khác biệt giếng lô ĐC lô TN, giếng bổ sung nồng độ puromycin khác Quan sát kính hiển vi chúng tơi thấy sau: - Ở giếng không bổ sung puromycin lô TN lô ĐC, tế bào tăng trưởng tốt (hình 3.2): Hình 3.2: Tế bào lô ĐC TN sau 24h sàng lọc không bổ sung puromycin (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) - Ở nồng độ puromycin µg/ml: + Ở lơ ĐC, tế bào chết nhiều, tế sống sót cịn khoảng 1/3 so với giếng khơng bổ sung puromycin (hình 3.3) Hình 3.3: Tế bào lơ ĐC sau 24h sàng lọc bổ sung puromycin nồng độ µg/ml (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) + Ở lơ TN, quan sát kính hiển vi chúng tơi thấy, có khác phơi: số phơi có số tế bào chết nhiên mật độ tế bào không thay đổi; số phơi số lượng tế bào chết nhiều (hình 3.4): 1 B A 2 Hình 3.4: Tế bào lô TN sau 24h sàng lọc bổ sung puromycin nồng độ µg/ml (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: Tế bào tăng sinh bình thường, số tế bào chết B: Tế bào chết nhiều - Ở nồng độ puromycin nồng độ 2µg/ml: + Ở giếng ĐC tế bào chết nhiều, số lượng tế bào giảm nhiều lần so với trước bổ sung puromycin, cịn vài tế bào sống sót (hình 3.5) Hình 3.5: Tế bào lơ ĐC sau 24h sàng lọc bổ sung puromycin nồng độ µg/ml (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) + Ở giếng TN: số phơi tế bào có chết không nhiều giếng ĐC cịn nhiều tế bào bám đáy giếng ni cấy; số phôi tế bào chết nhiều tương tự lơ ĐC (hình 3.6) 1 2 B A Hình 3.6: Tế bào lơ TN sau 24h sàng lọc bổ sung puromycin nồng độ µg/ml (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: Tế bào chết khơng nhiều B: Lượng tế bào sống cịn - Ở nồng độ puromycin 3µg/ml: + Tế bào giếng lô ĐC chết hết + Tuy nhiên lơ TN, số phơi cịn nhiều tế bào bám đáy giếng nuôi cấy, số phơi khơng cịn tế bào sống sót 2 A B Hình 3.8: Tế bào lô TN sau 24h sàng lọc bổ sung puromycin nồng độ µg/ml (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: Giếng ni cấy cịn nhiều tế bào sống sót B: Giếng ni cấy khơng cịn tế bào sống sót Như vậy, quan sát kính hiển vi, ta thấy rõ khác biệt giếng lô ĐC giếng lô TN Nồng độ puromycin cao, tế bào chết nhiều Tuy nhiên, đa số phôi lô TN, tế bào có khả sinh trưởng nồng độ puromycin µg/ml, số tế bào có khả sống sót nồng độ puromycin µg/ml, chí µg/ml Cịn số phơi TN khác, tế bào chết nhiều nồng độ puromycin µg/ml b Kết đếm số lượng tế bào Chúng tiến hành đếm số lượng tế bào (đối với đợt TN) thấy số lượng tế bào có biến động lớn sau 24h ni cấy Nếu coi tỉ lệ sống sót lơ khơng bổ sung puromycin 100% tỉ lệ sống sót lơ 1 bổ sung puromycin với nồng độ khác khác (bảng 1,2 - phụ lục 1) Có thể biểu diễn qua hình 3.9 3.10: Tỉ lệ sống sót (%) 100 80 60 μg/mlg/ml μg/mlg/ml μg/mlg/ml μg/mlg/ml 40 20 ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 Lơ TN Tỉ lệ sống sót (%) Hình 3.9: Biểu đồ tỉ lệ sống sót tế bào sau 24h sàng lọc puromycin phương pháp SMGT (đợt TN 1) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 μg/mlg/ml μg/mlg/ml μg/mlg/ml μg/mlg/ml ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 Lơ TN Hình 3.10: Biểu đồ tỉ lệ sống sót tế bào sau 24h sàng lọc puromycin phương pháp vi tiêm (đợt TN 1) Qua bảng biểu đồ trên, ta thấy biến động số lượng tế bào sau 24h sàng lọc với nồng độ puromycin khác phương pháp SMGT vi tiêm diễn theo quy luật tương tự Có khác biệt rõ ràng số lượng tế bào cịn khả bám đáy giếng ni cấy lô ĐC lô TN sau 24h sàng lọc Như thấy rằng, sau 24h sàng lọc có khác biệt lơ TN lô ĐC khả kháng puromycin: + Ở lô ĐC, tế bào chết nhiều nồng độ puromycin thấp (1 µg/ml) + Ở lơ TN, có hai trường hợp: Đa số phơi, tế bào cịn khả sống sót tiếp tục tăng sinh nồng độ puromycin µg/ml Ở nồng độ puromycin µg/ml µg/ml, tế bào bị chết nhiều cao nhiều so với lơ ĐC Bên cạnh đó, số phơi lô TN, tế bào chết nhiều nồng độ puromycin µg/ml Qua phần ta thấy khả kháng puromycin số phôi lô TN Những tế bào lơ TN sống sót điều kiện mơi trường có puromycin chứng tỏ chúng có khả kháng puromycin Những lô TN mà tế bào chết nồng độ puromycin µg/ml, cho thấy phơi khơng có khả kháng puromycin Điều phần chứng tỏ số phôi lô TN có khả kháng puromycin 2.2.2.2 Kết sau 120 xử lý puromycin a Kết quan sát kính hiển vi Sau bổ sung puromycin sau 24h, loại bỏ tế bào khả kháng puromycin Chúng tơi tiến hành thay môi trường, bổ sung puromycin tiếp tục nuôi cấy Sau 120 giờ, chúng tơi quan sát kính hiển vi thấy rằng: - Ở lô ĐC: giếng không bổ sung puromycin sinh trưởng bình thường, giếng có bổ sung puromycin khơng cịn tế bào sống sót (hình 3.11) B A Hình 3.11: Tế bào lơ ĐC sau 120 sàng lọc (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: Khơng bổ sung puromycin B: Có bổ sung puromycin với nồng độ khác - Ở lô TN: + Ở giếng không bổ sung puromycin, tế bào tăng trưởng tốt (hình 3.12) Hình 3.12: Tế bào lô TN sau 120 sàng lọc không bổ sung puromycin (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) + Đối với phôi sau 24h sàng lọc khơng có khả kháng puromycin, sau 120 ni cấy, khơng cịn tế bào sống sót ba nồng độ puromycin 1, 2, µg/ml (hình 3.13) Hình 3.13: Tế bào lơ TN khơng có khả kháng puromycin sau 120 sàng lọc bổ sung puromycin nồng độ 1, 2, µg/ml (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) + Những phơi cịn lại, nồng độ puromycin 1µg/ml, tế bào chết ít, tốc độ tăng trưởng chậm (hình 3.14A) Ở nồng độ puromycin µg/ml, số lượng tế bào chết nhiều, thấy lác đác vài tế bào sống bám đáy giếng ni cấy (hình 3.14B) 2 1 A B Hình 3.14: Tế bào lơ TN sau 120 sàng lọc (1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: bổ sung puromycin nồng độ µg/ml B: lọc bổ sung puromycin nồng độ µg/ml - Ở giếng ni cấy có bổ sung puromycin nồng độ µg/ml, giếng ni cấy khơng cịn tế bào sống sót Kết quan sát kính hiển vi cho thấy rõ khả kháng puromycin lô ĐC TN Ngay lô TN, phôi thể khả kháng puromycin khác Những phôi sau 24h khơng thể khả kháng puromycin, khơng cịn tế bào sống sót nồng độ puromycin 1, µg/ml Những phơi có khả kháng puromycin, tế bào tiếp tục tăng trưởng nồng độ µg/ml Cịn nồng độ puromycin cao hơn, khơng cịn tế bào sống sót Sau 120 ni cấy, biến động số lượng tế bào biểu diễn qua hình 3.17, 3.18 3.19 Số TB (x 1000000) 0.6 0.53 0.5 0.4 0.39 0.42 0.39 μg/ml, μg/ml, g/ml 0.41 μg/ml, μg/ml, g/ml 0.3 μg/ml, μg/ml, g/ml 0.2 μg/ml, μg/ml, g/ml 0.13 0.1 0.05 0h 0.000008 120h 24h Thời gian Hình 3.18: Đồ thị biến động số lượng TB lô TN1 sau 120 nuôi cấy (phương pháp SMGT – đợt thí nghiệm 1) Các tế bào lô TN1, nồng độ puromycin μg/ml, μg/ml, 3g/ml, tế bào tăng sinh tốt, sau 120 nuôi cấy, đạt khoảng 0,53.106 tế bào/giếng Ở nồng độ puromycin μg/ml, μg/ml, 3g/ml, tế bào sinh trưởng chậm, sau 24h nuôi cấy, không tăng, sau 120 nuôi cấy, tăng từ 0,39.106 lên 0,41.106 tế bào Ở nồng độ puromycin μg/ml, μg/ml, 3g/ml, sau 24h ni cấy, tế bào bị chết nhiều, cịn 0,13.106 tế bào, sau 120h khơng cịn tế bào sống sót, số giếng cịn lác đác vài tế bào Ở nồng độ puromycin μg/ml, μg/ml, 3g/ml, sau 24h, tế bào chết gần hết 0,05.106 tế bào, sau 120 khơng cịn tế bào sống sót (hình 3.18) Số TB (x 1000000) 0.6 0.51 0.5 0.4 μg/ml, μg/ml, 3g/ml 0.4 0.38 0.38 μg/ml, μg/ml, 3g/ml 0.3 μg/ml, μg/ml, 3g/ml 0.2 μg/ml, μg/ml, 3g/ml 0.13 0.1 00.000102 0h 24h Thời gian 120h Hình 3.19: Đồ thị biến động số lượng TB lô TN3 sau 120 nuôi cấy (phương pháp SMGT – đợt thí nghiệm 1) Ở số lơ TN, số lượng tế bào biến động tượng tự lô ĐC Khi không bổ sung puromycin, tế bào tăng trưởng tốt; bổ sung puromycin nồng độ khác nhau, tế bào chết nhiều, sau 120 ni cấy khơng cịn tế bào sống sót (hình 3.19) Như vậy, sau 120 ni cấy, sàng lọc puromycin, phần chứng tỏ có mặt gen kháng puromycin số phôi TN Những phôi tế bào chết nhiều giống lô ĐC, chứng tỏ tế bào không mang gen kháng puromycin Ở đợt TN khác nhau, số lượng phơi có khả kháng puromycin puromycin khác nhau, phương pháp SMGT phương pháp vi tiêm khác nhau, thể bảng sau: Bảng 3.7: Tỉ lệ phơi có tế bào mang gen kháng puromycin Phươn g pháp Đợt TN Đợt SMGT Đợt Đợt Đợt Vi tiêm Đợt Đợt Số phơi có khả kháng (phơi) 4 3 Tổng số phôi (phôi) 5 5 5 Tỉ lệ thành công (%) 80 80 60 60 80 60 Tỉ lệ trung bình (%) 73,33 66,67 Qua đây, phần ta đánh giá hiệu phương pháp chuyển gen gà Mặc dù số phôi lần tiến hành TN nhỏ, phần ta thấy tỉ lệ thành công phương pháp SMGT cao so với phương pháp vi tiêm c Kết kiểm tra có mặt gen chuyển phản ứng PCR Chúng tiến hành thu tế bào cịn sống lơ TN sau sàng lọc puromycin tiến hành phản ứng PCR Do số lượng tế bào giếng lại không nhiều nên gom số tế bào sống tất giếng lơ TN có bổ sung puromycin thành mẫu TN; tế bào tất giếng không bổ sung puromycin thành mẫu ĐC Ở phương pháp SMGT vi tiêm thu kết sau: 800 bp 600 bp 418 bp 200 bp 321 bp Hình 3.20: Kết điện di sản phẩm multiplex PCR kiểm tra có mặt gen eGFP nguyên bào sợi gà Giếng 1: ĐC (-): nước Giếng 2: ĐC (+):vector transposon Sleeping Beauty có mang gen eGFP Giếng 3: Marker kb Giếng 4: ADN thu từ tế bào lô TN Giếng 5: ADN thu từ tế bào lô ĐC Cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen có kích thước gen Ribosome 18S sử dụng để kiểm tra có mặt ADN tế bào gà Những mẫu tế bào kiểm tra xuất băng có kích thước 321 bp chứng tỏ ADN gà mẫu đạt tiêu chuẩn cho việc kiểm tra PCR Như vậy, mẫu tế bào sau sàng lọc puromycin kiểm tra PCR xuất băng có kích thước 418 bp đoạn gen eGFP, mẫu lô TN thu sau sàng lọc puromycin Điều chứng tỏ gen mã hoá cho eGFP chuyển vào genome tế bào gà Kết sàng lọc tế bào puromycin kết PCR chứng tỏ có mặt đoạn gen chuyển mẫu ADN genome gà Điều cho thấy bước đầu thành công việc chuyển gen vào phôi gà ấp phương pháp vi tiêm SMGT 2.3 Kết kiểm tra có mặt gen chuyển giai đoạn gà 2.3.1 Kết kiểm tra giai đoạn tuần tuổi Chúng tiến hành ấp trứng thu sau tiến hành thí nghiệm SMGT đến nở, thu 10 gà Các gà đánh số theo dõi phát triển qua giai đoạn khác Sau đó, chúng tơi tiến hành lấy máu kiểm tra có mặt gen chuyển phản ứng PCR Kết thu thể hình 3.22 3.24: Hình 3.22: Kết điện di sản phẩm multiplex PCR ADN thu từ máu gà chuyển gen phương pháp SGMT Hình 3.24: Kết điện di sản phẩm multiplex PCR ADN thu từ máu gà chuyển gen phương pháp vi tiêm Giếng 1: ĐC (-): nước Giếng 2: ĐC (+):vector transposon Sleeping Beauty có mang gen eGFP Giếng 3: Marker kb Giếng 4: ĐC sinh học (ĐCSH): ADN từ phôi gà không chuyển gen Giếng 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14: Mẫu máu ADN từ gà chuyển gen Tất mẫu máu gà xuất băng 321bp nhờ cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen ribosome 18S, chứng tỏ ADN thu đảm bảo chất lượng Sự có mặt gen eGFP ADN genom gà với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen eGFP có kích thước 418 bp tìm thấy mẫu máu số gà Điều chứng tỏ rằng, gen chuyển ổn định genom gà đến giai đoạn tuần tuổi Tỉ lệ