Thử nghiệm chuyển gen gfp trên gà gallus gallus domesticus sử dụng vector pt2 bh cvpf sb11 bằng phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp

Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học Chuyên ngành: Sinh häc thùc nghiÖm PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việc nâng cao suất, cải tiến tiềm di truyền vấn đề hàng đầu phát triển nơng nghiệp nói chung chăn ni nói riêng Tuy nhiên, công tác cải tạo giống cổ truyền chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo chọn lọc để cải tạo nguồn gen vật nuôi nên tồn nhiều hạn chế (con lai thu qua lai tạo chọn lọc mang gen không mong muốn…) Vậy, câu hỏi đặt để tạo giống vật ni có suất cao, phẩm chất tốt giống vật nuôi mang gen mong muốn (gen mã hóa protein dược liệu quý, gen có khả chống chịu tốt ) [2],[9]? Gần đây, nhờ thành tựu lĩnh vực ADN tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen đời cho phép khắc phục trở ngại nói Nó cho phép đưa gen mong muốn vào vi sinh vật, thực vật động vật để tạo giống sinh vật có đặc tính Việc chuyển gen khơng dừng lại việc sử dụng nguồn gen loài mà cịn đưa gen lồi vào lồi khác Kể từ năm 1970, nhà khoa học chuyển gen lạ vào vi khuẩn bắt biểu Ở động vật, q trình chuyển gen tương đối phức tạp năm gần thu nhiều thành tựu đáng kể Trong hướng nhà nghiên cứu tập trung vào mục tiêu: tạo động vật chuyên sản xuất protein quý phục vụ y học; tạo động vật có sức chống chịu tốt, có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho suất cao chất lượng sản phẩm tốt Ðộng vật chuyển gen cịn sử dụng làm mơ hình thí nghiệm nghiên cứu bệnh người để nhanh chóng tìm giải pháp chẩn đốn điều trị bệnh hiểm nghèo ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch Việc tạo động vật chuyn Nguyễn Thị Hồng Hạnh học Cao học K17 Sinh Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học Chuyên ngµnh: Sinh häc thùc nghiƯm gen trở thành khía cạnh nghiên cứu trung tâm lĩnh vực sinh sản động vật tạo giống vật nuôi [2],[11] Với ưu điểm bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, tạo tiềm phát triển vô to lớn nhiều lĩnh vực đời sống xã hội Trước ứng dụng đa sinh vật chuyển gen nói chung động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia giới trọng đầu tư nghiên cứu phát triển sinh vật chuyển gen Trên sở công nghệ ADN tái tổ hợp, ngành chăn nuôi đứng trước hội thay đổi có tính cách mạng Ngày người ta tạo động vật mang đặc tính kỳ diệu mà phương pháp lai tạo bình thường khơng thể thực Quá trình chuyển gen động vật tiến hành thành công nhiều đối tượng khác chuột, cá, thỏ, lợn, cừu, bò Đặc biệt, gà, cấu tạo sinh lý có nhiều ưu để tiến hành chuyển gen nên có nhiều thí nghiệm chuyển gen thành cơng với tỉ lệ cao, thuận lợi cho việc cải thiện tính hiệu hệ thống chuyển gen cách trực tiếp Đây đối tượng tuyệt vời để sản xuất protein tái tổ hợp trứng Ðây bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà mái đẻ “quả trứng vàng” mang protein dược phẩm [32] Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu lĩnh vực tạo động vật chuyển gen bắt đầu đạt thành cơng đáng khích lệ Tuy nhiên, nước ta, việc tạo động vật chuyển gen vấn đề chưa nghiên cứu sâu Việc nghiên cứu bắt đầu vài năm gần thực đối tượng cá Đó nghiên cứu bước đầu, cần có nghiên cứu với quy mơ sâu rộng để đưa động vật chuyển gen vào sản xuất Hiện nay, Việt Nam chưa có cơng trình cơng bố chuyển gen thành công tạo gia cầm chuyển gen Nguyễn Thị Hồng Hạnh học Cao học K17 Sinh Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học Chuyên ngành: Sinh häc thùc nghiƯm Chính lí trên, chọn đề tài “Thử nghiệm chuyển gen GFP gà (Gallus Gallus Domesticus) sử dụng vector pT2/BHCVpf-SB11 phương pháp chuyển gen qua tinh trùng vi tiêm vào phôi gà ấp” làm đề tài nghiên cứu Mục đích nghiên cứu - Thiết lập quy trình chuyển vector pT2/BH-CVpf-SB11 vào phơi gà ấp - Đánh giá khả phát triển phôi tiêm vector pT2/BHCVpf-SB11 - Ấp nở thành công trứng gà tiêm vector pT2/BH-CVpf-SB11 - Hoàn thiện phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà - So sánh hiệu chuyển gen phương pháp vi tiêm vào phôi ấp phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà - Đánh giá biểu gen chuyển giai đoạn phát triển khác phôi gà gà sau nở - Đánh giá biểu gen chuyển mô khác gà giai on phỏt trin khỏc Nguyễn Thị Hồng Hạnh học Cao học K17 Sinh Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm PHẦN NỘI DUNG Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHUYỂN GEN Ở ĐỘNG VẬT Sự đời công nghệ sinh học kỹ thuật chuyển gen tạo bước phát triển cho nông nghiệp giới nói chung Việt Nam nói riêng Chuyển gen việc di chuyển gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi thể cho (donor) tới cấu trúc di truyền khác có khả dung nạp gen gọi thể nhận (recipient) thông qua vector [9] Ðộng vật chuyển gen động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào ADN genome Gen ngoại lai phải truyền lại cho tất tế bào, kể tế bào mầm Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật thành công gen di truyền lại cho hệ sau [2] Với ưu điểm bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, tạo tiềm phát triển vô to lớn nhiều lĩnh vực đời sống xã hội Trước ứng dụng đa sinh vật chuyển gen chung động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia giới trọng đầu tư nghiên cứu phát triển sinh vật chuyển gen 1.1.1 Quy trình tạo động vật chuyển gen Ở động vật, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tạo hệ động vật cho suất cao, phẩm chất tốt, tăng khả chống chịu bệnh tật, có khả sản xuất loại protein quý cần trị liệu Quy trình tạo động vật chuyển gen thể qua hỡnh 1.1, gm cỏc bc sau: Nguyễn Thị Hồng Hạnh học Cao học K17 Sinh Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Hình 1.1: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen [2] - Tách chiết, phân lập gen mong muốn tạo tổ hợp gen biểu tế bào động vật - Tạo sở vật liệu biến nạp gen Ở động vật có vú giai đoạn biến nạp gen thích hợp trứng giai đoạn tiền nhân Ở giai đoạn này, tổ hợp gen lạ có hội xâm nhập vào genome hợp tử phân chia cho tế bào làm tăng khả mang gen tế bào sinh dục - Chuyển gen vào động vật Hiện có nhiều phương pháp khác chuyển gen sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen cách sử dụng tế bào gốc phôi, chuyển gen cách sử dụng vector virus, xung điện, chuyển gen qua tinh trùng, chuyển gen vào trứng thụ tinh (hình 1.2) - Ni cấy phơi ống nghiệm chuyển vào tử cung thể mẹ (đối với động vật bậc cao) - Kiểm tra động vật sinh từ phôi chuyển gen - Tạo nguồn động vật chuyển gen cách liên tục [2] Ngun ThÞ Hồng Hạnh học Cao học K17 Sinh Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học A Chuyên ngành: Sinh häc thùc nghiƯm B Hình 1.2: Một số phương pháp chuyển gen động vật [2] A: Chuyển gen nhờ retovirus; B: Chuyển gen phương pháp vi tiêm 1.1.2 Ứng dụng động vật chuyển gen a Trong nghiên cứu Chuyển gen công cụ lý tưởng cho việc nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực y - sinh học Trong sinh học phân tử, động vật chuyển gen sử dụng để phân tích điều hoà biểu gen để đánh giá biến đổi di truyền đặc biệt mức độ toàn thể động vật Ðộng vật chuyển gen sử dụng để nghiên cứu di truyền học phát triển động vật có vú [2] b Trong nông nghiệp công nghiệp thực phẩm Công nghệ chuyển gen động vật đời cho phép khắc phục trở ngại phương pháp cải tạo giống cổ truyền để tạo động vật biểu tính trạng mong muốn thời gian ngắn xác Mặt khác, cho nhà chăn ni phương pháp hiệu để tăng Ngun Thị Hồng Hạnh học Cao học K17 Sinh Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học Chuyên ngành: Sinh häc thùc nghiÖm sản lượng, tăng suất khả chống chịu bệnh tật Các nhà khoa học tạo vật ni chuyển gen có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho suất cao (nhiều thịt, nhiều sữa, nhiều trứng ), chất lượng sản phẩm tốt (nhiều nạc, mỡ, sữa chứa cholesterol ) có khả kháng bệnh [24],[30] Năm 1985, giáo sư Zuoyan Zhu nhóm nghiên cứu ông chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá Theo Zhu hệ F1 cá chuyển gen lớn gấp hai lần so với cá đối chứng (hình 1.3) [2] Hình 1.3: Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh trưởng [2] c Trong y học Động vật chuyển gen sử dụng công nghệ cấy ghép quan cho bệnh nhân mắc bệnh tim, gan, thận… Ðộng vật chuyển gen cịn sử dụng làm mơ hình thí nghiệm nghiên cứu bệnh người để nhanh chóng tìm giải pháp chẩn đốn điều trị bệnh hiểm nghèo ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch [19] Liệu pháp gen người bao gồm việc thêm gen bình thường (gen chuyển) vào genome người mang gen có thiếu sót để chữa bệnh di truyền người Trong kỹ nghệ dược phẩm, động vật chuyển gen sử dụng để sản xuất protein dược phẩm, thuốc chữa bệnh (hình 1.4) [2],[24] Ngun ThÞ Hång Hạnh học Cao học K17 Sinh Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiƯm Hình 1.4: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen sản xuất protein thông qua tuyến sữa [2] 1.1.3 Khả ứng dụng Việt nam Động vật chuyển gen trở thành xu hướng nghiên cứu phát triển Việc nghiên cứu tạo động vật chuyển gen để tạo dược phẩm, sản xuất protein quý sản phẩm chúng thực nhiều nước giới Việc chuyển gen vào động vật gặp rào cản pháp lý đạo đức Nhiều người lo sợ tạo động vật chuyển gen đe dọa phá vỡ cân hệ sinh thái động vật chuyển gen có khả sinh sản thấp, lai với động vật tự nhiên làm giảm khả sinh sản, giảm số lượng, đe dọa tồn loài Một số trường hợp động vật chuyển gen có khả kháng bệnh có biểu bệnh lý Khả trơi dạt dịng gen gây hiểm hoạ mơi trường sinh thái Bên cạnh đó, sử dng retrovirus lm vector cú Nguyễn Thị Hồng Hạnh học Cao học K17 Sinh Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm th nảy sinh nguy lường trước (loại virus thường chứa gen gây ung thư) Thêm vào đó, động vật chuyển gen sử dụng làm thực phẩm không đạt ủng hộ công chúng [9],[19] Ở Việt Nam, nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học đặc biệt công nghệ gen phát triển mạnh mẽ năm gần Nghiên cứu chuyển gen tiến hành nhiều sở nghiên cứu Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ sinh học - Đại học quốc gia Hà Nội… Ở động vật, nghiên cứu chuyển gen bắt đầu chủ yếu thực cá chạch, cá vàng với tổ hợp gen hormone sinh trưởng vi tiêm Ở Việt Nam, chưa có cơng trình cơng bố thực thành cơng việc chuyển gen vào gia cầm động vật có vú Tuy nhiên, kỹ thuật liên quan đến việc tạo động vật chuyển gen tiếp cận thực số sở nghiên cứu Với điều kiện sở vật chất người quan nghiên cứu nước ta, việc kết hợp nghiên cứu để tiến hành chuyển gen vào động vật có vú hồn tồn thực [2],[19] 1.2 CHUYỂN GEN Ở GÀ Công nghệ chuyển gen gà phát triển năm gần đây, cơng nghệ chuyển gen động vật có vú phát triển từ trước thời gian dài Chuyển gen gia cầm nói chung gà nói riêng vơ phức tạp khó khăn Tuy nhiên, gà lại đối tượng có nhiều tiềm cho công nghệ chuyển gen Tại nhà khoa học lại chọn gà làm đối tượng chuyển gen? Để hiểu lợi mơ hình gà chuyển gen, tìm hiểu phát triển phơi gà sinh lý sinh dục gà Ngun Thị Hồng Hạnh học Cao học K17 Sinh Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học Chuyên ngành: Sinh häc thùc nghiƯm 1.2.1 Sự phát triển phơi gà 1.2.1.1 Sự phát triển phôi trước đẻ 1.2.1.1.1 Thụ tinh Quá trình thụ tinh xảy phần ống dẫn trứng Khi trứng rụng hứng vào phễu ống dẫn trứng Tại đây, tinh trùng đến xâm nhập vào tế bào trứng 1.2.1.1.2 Sự phân cắt Hình 1.5: Quá trình phân cắt trứng tạo phôi nang gà [41] Trứng gà thuộc loại đoạn nỗn hồng (teloleciathal) có nghĩa nỗn hồng tập trung cực thực vật trứng nhân tế bào chất tinh khiết cực động vật Phân cắt phôi gà dạng phân cắt đĩa (phân cắt khơng hồn tồn) (hình 1.5) Nỗn hồng khơng phân cắt khơng có cấu tạo tế bào, cịn đĩa phơi phân chia tạo thành cụm hình đĩa tế bào nhỏ nằm bên khối nỗn hồng Sự phân cắt trung tâm đĩa phôi rãnh phân cắt phân chia vùng thnh cỏc t bo [5],[26] Nguyễn Thị Hồng Hạnh häc Cao häc K17 – Sinh