Thử nghiệm chuyển gen gfp trên gà gallus gallus domesticus sử dụng vector pt2 bh cvpf sb11 bằng phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp

Mục đích nghiên cứu

- Thiết lập quy trình chuyển vector pT2/BH-CVpf-SB11 vào phôi gà 0 giờ ấp.

- Đánh giá khả năng phát triển của phôi được tiêm vector pT2/BH- CVpf-SB11

- Ấp nở thành công trứng gà đã tiêm vector pT2/BH-CVpf-SB11

- Hoàn thiện phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà

- So sánh được hiệu quả chuyển gen của phương pháp vi tiêm vào phôi 0 giờ ấp và phương pháp chuyển gen qua tinh trùng gà.

- Đánh giá được sự biểu hiện của gen chuyển ở các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi gà và gà sau khi nở.

- Đánh giá được sự biểu hiện của gen chuyển ở các mô khác nhau của gà con ở các giai đoạn phát triển khác nhau.

Sự ra đời của công nghệ sinh học và kỹ thuật chuyển gen đã tạo ra một bước phát triển mới cho nền nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Chuyển gen là việc di chuyển các gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi là thể cho (donor) tới một cấu trúc di truyền khác có khả năng dung nạp gen gọi là thể nhận (recipient) thông qua một vector [9]. Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong ADN genome của nó Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau [2].

Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, đang và sẽ tạo ra các tiềm năng phát triển vô cùng to lớn trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội Trước các ứng dụng đa năng của sinh vật chuyển gen chung và động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia trên thế giới đã chú trọng đầu tư nghiên cứu và phát triển sinh vật chuyển gen

1.1.1 Quy trình tạo động vật chuyển gen Ở động vật, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tạo ra các thế hệ động vật mới cho năng suất cao, phẩm chất tốt, tăng khả năng chống chịu bệnh tật, có khả năng sản xuất được các loại protein quý hiếm rất cần trong trị liệu Quy trình tạo động vật chuyển gen thể hiện qua hình 1.1, gồm các bước sau:

Hình 1.1: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen [2]

- Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật

- Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân Ở giai đoạn này, tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của hợp tử và phân chia cho các tế bào con làm tăng khả năng mang gen của tế bào sinh dục

- Chuyển gen vào động vật

Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus, xung điện, chuyển gen qua tinh trùng, chuyển gen vào trứng mới thụ tinh (hình 1.2)

- Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm và chuyển vào tử cung cơ thể mẹ (đối với động vật bậc cao)

- Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen

- Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục [2].

Hình 1.2: Một số phương pháp chuyển gen ở động vật [2]

A: Chuyển gen nhờ retovirus; B: Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm

1.1.2 Ứng dụng của động vật chuyển gen a Trong nghiên cứu cơ bản

Chuyển gen là một công cụ lý tưởng cho việc nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực của y - sinh học Trong sinh học phân tử, động vật chuyển gen được sử dụng để phân tích sự điều hoà biểu hiện của gen để đánh giá một biến đổi di truyền đặc biệt ở mức độ toàn bộ cơ thể động vật Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng để nghiên cứu trong di truyền học phát triển ở động vật có vú [2]. b Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm

Công nghệ chuyển gen động vật ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại của phương pháp cải tạo giống cổ truyền để tạo ra các động vật biểu hiện các tính trạng mong muốn trong một thời gian ngắn hơn và chính xác hơn Mặt khác, nó cho các nhà chăn nuôi một phương pháp hiệu quả để tăng

A B sản lượng, tăng năng suất và khả năng chống chịu bệnh tật Các nhà khoa học đã tạo ra các vật nuôi chuyển gen có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất cao (nhiều thịt, nhiều sữa, nhiều trứng ), chất lượng sản phẩm tốt (nhiều nạc, ít mỡ, sữa chứa ít cholesterol ) và có khả năng kháng bệnh [24],[30] Năm 1985, giáo sư Zuoyan Zhu và nhóm nghiên cứu của ông đã chuyển được gen hormone sinh trưởng người vào cá Theo Zhu thì thế hệ F1 của cá đã được chuyển gen này lớn gấp hai lần so với cá đối chứng (hình 1.3) [2]

Hình 1.3: Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh trưởng [2] c Trong y học Động vật chuyển gen được sử dụng trong công nghệ cấy ghép cơ quan cho các bệnh nhân mắc các bệnh như tim, gan, thận… Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch [19]

Liệu pháp gen người bao gồm cả việc thêm một bản sao gen bình thường (gen chuyển) vào genome của một người mang các bản sao gen có thiếu sót để chữa các bệnh di truyền ở người

Trong kỹ nghệ dược phẩm, động vật chuyển gen được sử dụng để sản xuất protein dược phẩm, thuốc chữa bệnh (hình 1.4) [2],[24]

Hình 1.4: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen sản xuất protein thông qua tuyến sữa [2]

1.1.3 Khả năng ứng dụng tại Việt nam Động vật chuyển gen đã và đang trở thành một xu hướng nghiên cứu và phát triển Việc nghiên cứu và tạo động vật chuyển gen để tạo ra các dược phẩm, sản xuất các protein quý và các sản phẩm của chúng đang thực hiện ở nhiều nước trên thế giới Việc chuyển gen vào động vật hiện nay đang gặp những rào cản về pháp lý và đạo đức Nhiều người lo sợ rằng tạo động vật chuyển gen đe dọa phá vỡ sự cân bằng hệ sinh thái hoặc động vật chuyển gen có khả năng sinh sản thấp, nếu lai với động vật tự nhiên có thể làm giảm khả năng sinh sản, giảm số lượng, đe dọa sự tồn tại của loài Một số trường hợp động vật chuyển gen có khả năng kháng bệnh kém hoặc có biểu hiện bệnh lý Khả năng trôi dạt của những dòng gen có thể gây ra hiểm hoạ đối với môi trường sinh thái Bên cạnh đó, khi sử dụng retrovirus làm vector có thể sẽ nảy sinh những nguy cơ không thể lường trước được (loại virus thường chứa gen gây ung thư) Thêm vào đó, động vật chuyển gen sử dụng làm thực phẩm cũng không đạt được sự ủng hộ của công chúng [9],[19] Ở Việt Nam, những nghiên cứu về áp dụng công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ gen được phát triển khá mạnh mẽ trong những năm gần đây Nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở nhiều cơ sở nghiên cứu như Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ sinh học - Đại học quốc gia Hà Nội… Ở động vật, những nghiên cứu chuyển gen mới được bắt đầu và chủ yếu thực hiện ở cá chạch, cá vàng với tổ hợp gen hormone sinh trưởng bằng vi tiêm Ở Việt Nam, chưa có công trình nào công bố thực hiện thành công việc chuyển gen vào gia cầm và động vật có vú Tuy nhiên, các kỹ thuật liên quan đến việc tạo động vật chuyển gen thì đã được tiếp cận và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu Với điều kiện cơ sở vật chất và con người ở các cơ quan nghiên cứu ở nước ta, việc kết hợp nghiên cứu để tiến hành chuyển gen vào động vật có vú là hoàn toàn có thể thực hiện được [2],[19]

Công nghệ chuyển gen ở gà mới phát triển trong những năm gần đây,trong khi công nghệ chuyển gen ở động vật có vú đã phát triển từ trước đó một thời gian dài Chuyển gen ở gia cầm nói chung và gà nói riêng là vô cùng phức tạp và khó khăn Tuy nhiên, gà lại là đối tượng có nhiều tiềm năng cho công nghệ chuyển gen Tại sao các nhà khoa học lại chọn gà làm đối tượng chuyển gen? Để hiểu được những lợi thế của mô hình gà chuyển gen, chúng ta sẽ tìm hiểu sự phát triển của phôi gà và sinh lý sinh dục gà.

1.2.1 Sự phát triển của phôi gà

1.2.1.1 Sự phát triển phôi trước khi đẻ

Quá trình thụ tinh xảy ra ở phần trên của ống dẫn trứng Khi trứng rụng được hứng vào phễu của ống dẫn trứng Tại đây, tinh trùng đến và xâm nhập vào tế bào trứng

Hình 1.5 : Quá trình phân cắt trứng và tạo phôi nang ở gà [41]

Trứng gà thuộc loại đoạn noãn hoàng (teloleciathal) có nghĩa là noãn hoàng tập trung ở cực thực vật của trứng còn nhân và tế bào chất tinh khiết ở cực động vật Phân cắt ở phôi gà là dạng phân cắt đĩa (phân cắt không hoàn toàn) (hình 1.5) Noãn hoàng không phân cắt và không có cấu tạo tế bào, còn đĩa phôi phân chia tạo thành một cụm hình đĩa các tế bào nhỏ nằm bên trên khối noãn hoàng Sự phân cắt bắt đầu từ trung tâm của đĩa phôi và các rãnh phân cắt dần dần phân chia vùng này ra thành các tế bào [5],[26]

1.2.1.1.3 Giai đoạn tạo phôi nang

Vào lúc trứng được đẻ ra, ở đĩa phôi xuất hiện 2 vùng riêng biệt: Vùng sáng (area pellucida) chủ yếu là từ các tế bào trung tâm của đĩa phôi Vùng mờ (area opaca) tạo nên do các tế bào ở vùng rìa Ngay sau đó các tế bào vùng rìa phía đuôi của đĩa phôi di cư về phía đầu nhập với các tế bào di cư từ phía trên tạo thành lá dưới thứ cấp Xoang giữa lá trên và lá dưới gọi là xoang phôi nang[5].

1.2.1.2 Sự phát triển phôi gà sau khi đẻ và được ấp

1.2.1.2.1 Giai đoạn tạo phôi vị

CHUYỂN GEN Ở ĐỘNG VẬT

Sự ra đời của công nghệ sinh học và kỹ thuật chuyển gen đã tạo ra một bước phát triển mới cho nền nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Chuyển gen là việc di chuyển các gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi là thể cho (donor) tới một cấu trúc di truyền khác có khả năng dung nạp gen gọi là thể nhận (recipient) thông qua một vector [9]. Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong ADN genome của nó Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau [2].

Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã, đang và sẽ tạo ra các tiềm năng phát triển vô cùng to lớn trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội Trước các ứng dụng đa năng của sinh vật chuyển gen chung và động vật chuyển gen nói riêng, nhiều quốc gia trên thế giới đã chú trọng đầu tư nghiên cứu và phát triển sinh vật chuyển gen

1.1.1 Quy trình tạo động vật chuyển gen Ở động vật, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tạo ra các thế hệ động vật mới cho năng suất cao, phẩm chất tốt, tăng khả năng chống chịu bệnh tật, có khả năng sản xuất được các loại protein quý hiếm rất cần trong trị liệu Quy trình tạo động vật chuyển gen thể hiện qua hình 1.1, gồm các bước sau:

Hình 1.1: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen [2]

- Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật

- Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân Ở giai đoạn này, tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của hợp tử và phân chia cho các tế bào con làm tăng khả năng mang gen của tế bào sinh dục

- Chuyển gen vào động vật

Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus, xung điện, chuyển gen qua tinh trùng, chuyển gen vào trứng mới thụ tinh (hình 1.2)

- Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm và chuyển vào tử cung cơ thể mẹ (đối với động vật bậc cao)

- Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen

- Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục [2].

Hình 1.2: Một số phương pháp chuyển gen ở động vật [2]

A: Chuyển gen nhờ retovirus; B: Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm

1.1.2 Ứng dụng của động vật chuyển gen a Trong nghiên cứu cơ bản

Chuyển gen là một công cụ lý tưởng cho việc nghiên cứu thuộc nhiều lĩnh vực của y - sinh học Trong sinh học phân tử, động vật chuyển gen được sử dụng để phân tích sự điều hoà biểu hiện của gen để đánh giá một biến đổi di truyền đặc biệt ở mức độ toàn bộ cơ thể động vật Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng để nghiên cứu trong di truyền học phát triển ở động vật có vú [2]. b Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm

Công nghệ chuyển gen động vật ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại của phương pháp cải tạo giống cổ truyền để tạo ra các động vật biểu hiện các tính trạng mong muốn trong một thời gian ngắn hơn và chính xác hơn Mặt khác, nó cho các nhà chăn nuôi một phương pháp hiệu quả để tăng

A B sản lượng, tăng năng suất và khả năng chống chịu bệnh tật Các nhà khoa học đã tạo ra các vật nuôi chuyển gen có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất cao (nhiều thịt, nhiều sữa, nhiều trứng ), chất lượng sản phẩm tốt (nhiều nạc, ít mỡ, sữa chứa ít cholesterol ) và có khả năng kháng bệnh [24],[30] Năm 1985, giáo sư Zuoyan Zhu và nhóm nghiên cứu của ông đã chuyển được gen hormone sinh trưởng người vào cá Theo Zhu thì thế hệ F1 của cá đã được chuyển gen này lớn gấp hai lần so với cá đối chứng (hình 1.3) [2]

Hình 1.3: Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh trưởng [2] c Trong y học Động vật chuyển gen được sử dụng trong công nghệ cấy ghép cơ quan cho các bệnh nhân mắc các bệnh như tim, gan, thận… Ðộng vật chuyển gen còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch [19]

Liệu pháp gen người bao gồm cả việc thêm một bản sao gen bình thường (gen chuyển) vào genome của một người mang các bản sao gen có thiếu sót để chữa các bệnh di truyền ở người

Trong kỹ nghệ dược phẩm, động vật chuyển gen được sử dụng để sản xuất protein dược phẩm, thuốc chữa bệnh (hình 1.4) [2],[24]

Hình 1.4: Sơ đồ quy trình tạo động vật chuyển gen sản xuất protein thông qua tuyến sữa [2]

1.1.3 Khả năng ứng dụng tại Việt nam Động vật chuyển gen đã và đang trở thành một xu hướng nghiên cứu và phát triển Việc nghiên cứu và tạo động vật chuyển gen để tạo ra các dược phẩm, sản xuất các protein quý và các sản phẩm của chúng đang thực hiện ở nhiều nước trên thế giới Việc chuyển gen vào động vật hiện nay đang gặp những rào cản về pháp lý và đạo đức Nhiều người lo sợ rằng tạo động vật chuyển gen đe dọa phá vỡ sự cân bằng hệ sinh thái hoặc động vật chuyển gen có khả năng sinh sản thấp, nếu lai với động vật tự nhiên có thể làm giảm khả năng sinh sản, giảm số lượng, đe dọa sự tồn tại của loài Một số trường hợp động vật chuyển gen có khả năng kháng bệnh kém hoặc có biểu hiện bệnh lý Khả năng trôi dạt của những dòng gen có thể gây ra hiểm hoạ đối với môi trường sinh thái Bên cạnh đó, khi sử dụng retrovirus làm vector có thể sẽ nảy sinh những nguy cơ không thể lường trước được (loại virus thường chứa gen gây ung thư) Thêm vào đó, động vật chuyển gen sử dụng làm thực phẩm cũng không đạt được sự ủng hộ của công chúng [9],[19] Ở Việt Nam, những nghiên cứu về áp dụng công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ gen được phát triển khá mạnh mẽ trong những năm gần đây Nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở nhiều cơ sở nghiên cứu như Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ sinh học - Đại học quốc gia Hà Nội… Ở động vật, những nghiên cứu chuyển gen mới được bắt đầu và chủ yếu thực hiện ở cá chạch, cá vàng với tổ hợp gen hormone sinh trưởng bằng vi tiêm Ở Việt Nam, chưa có công trình nào công bố thực hiện thành công việc chuyển gen vào gia cầm và động vật có vú Tuy nhiên, các kỹ thuật liên quan đến việc tạo động vật chuyển gen thì đã được tiếp cận và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu Với điều kiện cơ sở vật chất và con người ở các cơ quan nghiên cứu ở nước ta, việc kết hợp nghiên cứu để tiến hành chuyển gen vào động vật có vú là hoàn toàn có thể thực hiện được [2],[19].

CHUYỂN GEN Ở GÀ

Công nghệ chuyển gen ở gà mới phát triển trong những năm gần đây,trong khi công nghệ chuyển gen ở động vật có vú đã phát triển từ trước đó một thời gian dài Chuyển gen ở gia cầm nói chung và gà nói riêng là vô cùng phức tạp và khó khăn Tuy nhiên, gà lại là đối tượng có nhiều tiềm năng cho công nghệ chuyển gen Tại sao các nhà khoa học lại chọn gà làm đối tượng chuyển gen? Để hiểu được những lợi thế của mô hình gà chuyển gen, chúng ta sẽ tìm hiểu sự phát triển của phôi gà và sinh lý sinh dục gà.

1.2.1 Sự phát triển của phôi gà

1.2.1.1 Sự phát triển phôi trước khi đẻ

Quá trình thụ tinh xảy ra ở phần trên của ống dẫn trứng Khi trứng rụng được hứng vào phễu của ống dẫn trứng Tại đây, tinh trùng đến và xâm nhập vào tế bào trứng

Hình 1.5 : Quá trình phân cắt trứng và tạo phôi nang ở gà [41]

Trứng gà thuộc loại đoạn noãn hoàng (teloleciathal) có nghĩa là noãn hoàng tập trung ở cực thực vật của trứng còn nhân và tế bào chất tinh khiết ở cực động vật Phân cắt ở phôi gà là dạng phân cắt đĩa (phân cắt không hoàn toàn) (hình 1.5) Noãn hoàng không phân cắt và không có cấu tạo tế bào, còn đĩa phôi phân chia tạo thành một cụm hình đĩa các tế bào nhỏ nằm bên trên khối noãn hoàng Sự phân cắt bắt đầu từ trung tâm của đĩa phôi và các rãnh phân cắt dần dần phân chia vùng này ra thành các tế bào [5],[26]

1.2.1.1.3 Giai đoạn tạo phôi nang

Vào lúc trứng được đẻ ra, ở đĩa phôi xuất hiện 2 vùng riêng biệt: Vùng sáng (area pellucida) chủ yếu là từ các tế bào trung tâm của đĩa phôi Vùng mờ (area opaca) tạo nên do các tế bào ở vùng rìa Ngay sau đó các tế bào vùng rìa phía đuôi của đĩa phôi di cư về phía đầu nhập với các tế bào di cư từ phía trên tạo thành lá dưới thứ cấp Xoang giữa lá trên và lá dưới gọi là xoang phôi nang[5].

1.2.1.2 Sự phát triển phôi gà sau khi đẻ và được ấp

1.2.1.2.1 Giai đoạn tạo phôi vị

Tạo phôi vị ở gà là quá trình di chuyển các cụm tế bào hoặc các khu vực lá trên để tạo phôi ba lá Các tế bào ở nửa sau của đĩa phôi mới đi vào trong và xuống dưới để tạo trung bì và nội bì, nửa trước di chuyển để phủ kín phần các tế bào đã xuống dưới và hình thành ngoại bì (trong đó có cả ngoại bì thần kinh) Các tế bào đi qua rãnh nguyên thuỷ đầu tiên là nguyên liệu nội bì, phần đi xa về phía trước sẽ tạo ra ruột trước, phần nguyên liệu dịch về phía sau sẽ tạo ruột giữa và ruột sau Tiếp sau nội bì, nguyên liệu trung bì đi qua hố nguyên thuỷ và phần trước của rãnh nguyên thuỷ vào xoang phôi nang, phần đi qua mép phía trước của hố nguyên thuỷ tạo nên trung bì trục, sau này sẽ hình thành đầu và dây sống [4],[5]

1.2.1.2.2 Giai đoạn hình thành mô – cơ quan

Hình 1.6: Phôi gà phát triển qua các giai đoạn [65]

Khi được ấp, phôi gà trải qua 1 loạt các biến đổi bao gồm sự tăng sinh tế bào kết hợp với sự xắp xếp lại cấu trúc phôi sau đó là các quá trình biệt hóa Bốn ngày ấp đầu tiên của sự phát triển phôi gà là sự hình thành các cấu trúc quan trọng Quá trình biệt hóa và hình thành cơ quan biểu hiện ở việc sự xuất hiện mầm các cơ quan có nguồn gốc từ nội bì, ngoài ngoại bì và trung bì (hình 1.6 và phụ lục 2) [4],[5]

1.2.2 Sinh lý sinh sản gà

1.2.2.1 Cơ quan sinh sản của gà mái

Sự hình thành buồng trứng và các tuyến sinh dục phụ xảy ra vào thời kỳ đầu của sự phát triển phôi Quá trình phát triển của tế bào trứng có ba thời kỳ: tăng sinh, sinh trưởng và chín Mặc dù trong giai đoạn phát triển phôi, phôi cái phát triển cả hai buồng trứng nhưng buồng trứng bên phải và ống dẫn trứng thoái hoá đi, do đó chỉ còn buồng trứng bên trái và ống dẫn trứng bên trái là trưởng thành và thực hiện chức năng Cơ quan sinh dục gà mái gồm một buồng trứng và một ống dẫn trứng:

Hình 1.7: Cấu tạo buồng trứng gà [52]

1: nang trứng chín; 2: nang trứng non

- Buồng trứng là một cụm các nang trứng Khi gà nở buồng trứng chứa vài ngàn trứng nhỏ, mỗi trứng trong nang riêng của mình

- Kích thước và hình dạng buồng trứng phụ thuộc vào tuổi gà, buồng trứng gà giống như một chùm nho với các nang trứng ở các giai đoạn phát triển khác nhau

Trứng gà là một tế bào khổng lồ chứa rất nhiều noãn hoàng, đó chính là khối lòng đỏ Lòng đỏ có cấu tạo phân lớp, một lớp noãn hoàng nhạt rồi đến một lớp noãn hoàng sẫm đồng tâm kế tiếp nhau Nhân của trứng nằm ở phần tế bào chất tinh khiết tạo thành một đĩa có tỉ lệ rất nhỏ so với khối noãn hoàng Bao quanh tế bào trứng có màng noãn hoàng (hình 1.8) [52].

Hình 1.8 : Trứng gà nhìn dọc (A) [60] và nhìn ngang (B)[52]

* Ống dẫn trứng: Ống dẫn trứng là một ống dài Khi thành thục sinh dục, ống dẫn trứng trơn, thẳng và có đường kính đồng nhất theo chiều dài ống dẫn (hình 1.9) [52].

Hình 1.9: Cấu tạo của ống dẫn trứng [52]

Mỗi phần của ống dẫn trứng có chiều dài và chức năng khác nhau, thể hiện như sau [51]:

Các phần của ống dẫn trứng

Thời gian trứng di chuyển tại đó

15 phút - Hứng trứng chín và thực hiện quá trình thụ tinh Đoạn lòng trắng 33 cm 3 giờ - Hình thành 40 -50 % albumin trong lòng trắng trứng Phần eo 10 cm

1,25 giờ - Hình thành 2 lớp màng vỏ

Tử cung 10,7 cm 20, 75 giờ - Hình thành 40% albumin, hình thành lớp vỏ đá vôi Âm đạo 10 cm - - Hình thành lớp phấn phủ lên trứng

- Trứng đi qua khi gà đẻ.

* Sự tạo trứng và tạo vỏ trứng: Sau khi giao phối, tinh trùng di chuyển trong ống dẫn trứng, tập trung tại phần phễu Khi trứng đi qua, một tinh trung xuyên thủng màng noãn hoàng, gặp tế bào trứng, hoàn thành quá trình thụ tinh Sau đó màng noãn hoàng dầy lên, ngăn cản sự xâm nhập của các tinh trùng khác Quá trình phân cắt trứng diễn ra khi trứng di chuyển dần xuống phía dưới Noãn bào ở trong đoạn phễu của ống dẫn trứng khoảng 15 phút, sau đó di chuyển xuống đoạn lòng trắng Tại đây, hợp tử được phủ bởi 1 lớp albumin Sau đó hợp tử di chuyển xuống phần eo rồi đến tử cung Khoảng 23

- 24h sau khi rụng, trứng được đẻ ra ngoài [52],[60]

1.2.2.2 Cơ quan sinh sản của gà trống và thành phần tinh dịch gà

1.2.2.2.1 Cơ quan sinh sản của gà trống

Cơ quan sinh sản gà trống gồm: tinh hoàn, hệ thống ống dẫn và cơ quan giao phối (hình 1.10):

* Tinh hoàn: có kích thước thay đổi tùy thời kỳ hoạt động sinh dục,với gà trống trưởng thành, thời kỳ đang hoạt động sinh dục, tinh hoàn dài khoảng 4,7 cm, rộng khoảng 2,7 cm và khối lượng khoảng 17 - 19 gram; khi thay lông, giảm còn 3 - 5 gram Khác với sự sắp xếp ở loài có vú, các ống sinh tinh trong tinh hoàn gia cầm không tập hợp thành các thùy rõ rệt được vây quanh bởi các mô liên kết, mà các ống sinh tinh nối lại với nhau thành nhánh nằm trong lớp vỏ màng liên kết trắng [1]

Hình 1.10: Cấu trúc hệ sinh dục gà trống [1]

1: Tinh hoàn; 2: ống dẫn tinh; 3: trực tràng; 4: huyệt

* Hệ thống ống dẫn: Tinh trùng từ các ống sinh tinh, đi qua mạng lưới tinh hoàn đến các ống dẫn ra Từ ống dẫn này, tinh trùng đi qua hàng loạt ống kết nối và được chuyển đến ống tinh hoàn phụ Ống tinh hoàn phụ đổ vào ống dẫn tinh ra Ống dẫn tinh ra là một ống có độ uốn lượn cao và ở đầu cuối thì duỗi thẳng và to hơn [1]

* Cơ quan giao phối: ở gà không phát triển, chỉ là một gai giao cấu để tiếp xúc với âm đạo và được lộn ra khi giao phối.

1.2.2.2.2 Đặc điểm cấu trúc của tinh trùng gà

Quá trình sản sinh tinh trùng ở gia cầm cũng tương tự như ở động vật có vú Tinh trùng gia cầm có dạng hình sợi, phân biệt rõ 2 phần: đầu, đuôi.Đầu tinh trùng gà dài, hơi cong, acrosome hình nón, được bọc bởi một màng acrosome liên tục, không có đoạn xích đạo hoặc một phiến đặc sau acrosome điển hình như ở tinh trùng động vật có vú mà có một khoảng trống dưới acrosome Đuôi tinh trùng gồm đoạn cổ (tương ứng với đoạn cổ của tinh trùng động vật có vú), đoạn giữa (tương ứng với phần thân) và đoạn chính(tương ứng với phần đuôi) [1]

1.2.2.2.3 Thành phần của tinh dịch gà

Tinh thanh gà là một dịch lỏng đặc biệt có chứa khoảng 50 - 60 chất gồm: muối, protein, một số axit amin [1]

Trong TTNT gà cần chú ý đến thành phần chất "dịch thể trong suốt" trong tinh thanh Chất "dịch thể trong suốt" (do mô cương cứng của lỗ huyệt tiết ra) được tiết vào trong tinh dịch là do khi lấy tinh, động tác ép và nặn lỗ huyệt quá mạnh làm cho một số tiểu thể của máu, bạch huyết, các urate trong mô cương cứng của lỗ huyệt được giải phóng ra Chất "dịch thể trong suốt" không gây nguy hại cho tinh trùng khi dẫn tinh bằng tinh dịch tươi, còn khi tinh dịch có lẫn "dịch thể trong suốt" và được bảo tồn 24 giờ rồi mới dẫn tinh thì tỉ lệ phôi sẽ giảm [1]

1.2.3 Thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng chuyển gen

Từ những đặc điểm trên, ta thấy gà có nhiều thuận lợi cho quá trình chuyển gen, nhưng bên cạnh đó cũng có một số khó khăn:

TRANSPOSON VÀ VECTOR TRANSPOSON SLEEPING BEAUTY 25 1 Transposon

Gene chuyển vị (transposon) là một đoạn ADN có khả năng tự tái bản một cách độc lập và xen vào một vị trí mới trong cùng nhiễm sắc thể hoặc một nhiễm sắc thể khác Transposon được phát hiện lần đầu tiên vào những năm 1940 bởi MC Clintock (1949) trong hệ gen của ngô; transposon là yếu tố cần thiết và thường gặp ở tất cả các loài sinh vật [45]

Transposon có cấu trúc gồm một hay nhiều đoạn gene nằm giữa hai yếu tố IS có chứa các trình tự lặp lại đảo ngược (inverted repeat sequence– IR) (hình 1.16) Một trong hai yếu tố IS chứa trình tự mã hóa cho enzyme transposase có chức năng nhận diện, cắt và nối ADN trong quá trình chuyển vị [2].

Hình 1.16: Cấu trúc của transposon [2]

Hai dạng chính của yếu tố transposon được phân chia dựa vào cách thức vận động trong hệ gen của transposon Retrotransposon di chuyển qua trung gian ARN theo kiểu copy - dán Theo kiểu này, transposon được sao chép và một bản sao của nó được gắn vào vị trí mới, còn bản gốc vẫn duy trì ở vị trí cũ mà không mất đi Kiểu vận động thứ 2 của transposon là kiểu cắt- dán Cách thức vận động này đi liền với sự đứt ra của trình tự gốc và gắn vào một vị trí khác trong hệ gen Sự cắt - dán của transposon luôn được xúc tác bởi enzyme đặc biệt là transposase Một số transposon có chứa trình tự mã hoá cho enzyme transposase [45].

Kích thước của transposon nói chung là không dài hơn 2kb. Transposon được phiên mã thành RNA, RNA được phiên mã ngược thành ADN sợi kép ADN sợi kép này hợp nhất vào genome với hiệu quả cao Sự hợp nhất được điều khiển bởi gen transposase mã hóa transposon và các trình tự lặp lại đảo ngược ITR Các trình tự lặp lại đảo ngược có mặt ở cả hai đầu của transposon Transposon là vector có tiềm năng đối với sự hợp nhất gen ngoại lai vào genome Ðể làm được điều này, một phần lớn vùng phiên mã của transposon bị mất đi, tạo ra khoảng trống đối với gen ngoại lai ADN tái tổ hợp chứa gen ngoại lai không có khả năng đặc biệt để tự hợp nhất vào genome Sự có mặt của gen transposase là cần thiết đối với mục đích này. Một số transposon có chứa trình tự mã hoá cho enzyme transposase [2].

Trong quá trình vận động, các transposase gắn vào vị trí đầu hoặc gần đầu của trình tự vận động, đồng thời cắt mạch ADN sợi kép tại vị trí gốc Việc cắt phân tử ADN sợi kép ở vị trí này làm tách trình tự vận động khỏi nhiễm sắc thể hoặc plasmid, nhờ đó chúng có thể vận động tới một vị trí khác trong hệ gen Khi yếu tố vận động gắn vào một vị trí mới trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid, nó sẽ gây ra sự nhân đôi một trình tự ngắn ở hai đầu tại vị trí nó gắn vào Vì vậy, vector transposon cho phép tạo ra các động vật chuyển gen đối với các loài mà vi tiêm ADN thông thường không thành công [2]

Tuy nhiên, transposon chỉ có thể mang các đoạn ADN ngoại lai với chiều dài giới hạn Ngoài ra, các cơ chế tế bào phá hủy transposon có thể ức chế sự biểu hiện của gen chuyển trong một số trường hợp [16],[22],[25]

Vector transposon Sleeping Beauty (SB) là một thành viên của họ Tc1/ marine Đây là họ các yếu tố di truyền vận động có tính chất cổ xưa và có mức độ phổ biến cao, được tìm thấy ở rất nhiều các loài động vật có xương sống bao gồm cả con người Hệ thống transposon SB chứa một gen đơn mã hoá cho enzyme transposase và một transposon chứa đầu tận cùng lặp lại tại vị trí liên kết với transposase (hình 1.17) [45].

Hình 1.17: Cấu trúc và hoạt động của transposon Sleeping beauty

(theo Perry et al., 2004 và B.-W Kong, 2008 ) Đặc điểm này cho phép transposase vận chuyển transposon theo kiểu trans khi chúng được sử dụng như một hệ thống gen chuyển Sau khi liên kết đặc hiệu enzyme transposase sẽ cắt mạch đơn của phân tử ADN đích

(transposon SB) tại vị trí lặp lại ngược chiều IR/DR chứa khoảng 15-20 bp ở đầu tận cùng của mỗi IR, và dài khoảng 200-250 bp Transposon SB sau đó sẽ cài một cách ngẫu nhiên vào bất cứ vị trí nào có 2 nu TA trên toàn hệ gen (hình 1.17) [22].

Vector Transposon Sleeping Beauty (SB) được sử dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng, từ cá tới người như một công cụ chuyển gen Nó đã được sử dụng thành công để chuyển gen biểu hiện lâu dài trên chuột và cá ngựa vằn. Thêm vào đó, chuyển gen qua vector transposon SB cũng cho thấy hiệu quả chuyển gen tăng gần 10 lần so với khi sử dụng các hệ thống transposon ADN khác Mới đây nhất, năm 2008, Kong và các cộng sự đã đồng vận chuyển đoạn ADN chứa gen kháng puromycin với vector transposon Sleeping

Beauty vào tế bào nguyên bào sợi phôi gà “bất tử” (immortal chicken embryo fibroblast) bằng phương pháp chuyển gen nhờ calcium phosphate. Sau đó các tế bào được nuôi cấy trong môi trường chứa kháng sinh puromycin Dựa vào số lượng các quần lạc tế bào có khả năng kháng puromycin, họ đã đánh giá được hiệu quả chuyển gen có sự hỗ trợ của vector

SB Kết quả cho thấy hiệu quả chuyển gen đã tăng từ 15 tới 35 lần khi transposon mã hóa cho gen kháng puromycin được đồng vận chuyển với một cấu trúc mã hóa cho SB Khi phân tích trình tự ADN genome gà, người ta biết được transposon đã cài vào 18 vị trí trên 11 nhiễm sắc thể của hệ gen.Điều này cho thấy đối với hệ gen gia cầm, sự vận động transposon thông qua trung gian transposase là sự bổ sung rất tiềm năng cho các công cụ di truyền khác [22],[45].

GFP - eGFP VÀ VAI TRÒ CỦA GEN BÁO CÁO

GFP là từ viết tắt của Green Fluorescent protein - một loại protein gồm

238 axit amin (26.9 kDa), lần đầu tiên được phân lập từ loài sứa Aequorea victoria sống ở ven biển Tây Bắc Thái Bình Dương Ở phía dưới chiếc dù xoè rộng của nó có những mấu cơ phát ra một thứ ánh sáng xanh mờ mờ Đó là một loại protein có khả năng phát ánh sáng màu xanh lục khi chiếu ánh sáng cực tím GFP của A victoria có đỉnh phát sáng ở bước sóng 509 nm tương ứng với vùng ánh sáng xanh trong phổ ánh sáng nhìn thấy [48]

Năm 1992, Martin Chalfie công bố thành tựu cài những đoạn mã hoá của GFP vào tế bào khác loài Từ đó, tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới người ta đã tạo ra các loại cây toả sáng, những con vật như chuột, thỏ, lợn… phát ra ánh sáng xanh lục khi đặt chúng vào dưới ánh sáng cực tím (hình 1.18)

Hình 1 18 : Elba, thỏ chuyển gen protein huỳnh quang màu xanh lá cây[2]

Người ta đã lợi dụng tính phát quang của GFP dùng như một chất đánh dấu rất đặc trưng Gen mã hoá cho GFP vì thế được sử dụng như một gen chỉ thị (gen báo cáo) trong công nghệ chuyển gen Các dạng dẫn xuất của GFP (phát ánh sáng có màu khác) thu được khi gây đột biến GFP Năm

1995, Robert Y Tsien tại Trường Đại học California đã nâng cao được đặc trưng quang phổ của GFP, với cường độ phát quang cao và bền hơn hàng chục lần, đó chính là eGFP eGFP - enhanced Green Flourescent Protein là một protein tái tổ hợp gồm 265 axit amin 2 axit amin ở vị trí 64 và 65 củaGFP là Phenyl và Serin được thay thế lần lượt là Lơzin và Threonin ở eGFP.Protein này được biểu hiện và tinh sạch từ vi khuẩn E coli, nó có đặc điểm cho khả năng phát huỳnh quang tối đa và bền vững hơn GFP [59],[65].

PUROMYCIN VÀ ỨNG DỤNG SÀNG LỌC TẾ BÀO CHUYỂN GEN

Puromycin là một loại kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu sinh học tế bào với mục đích chọn lọc tế bào đã biến đổi nhờ kĩ thuật di truyền.

Hình 1 19 : Cấu tạo hóa học của Puromycin và cơ chế tác động của nó tới quá trình dịch mã: A So sánh cấu trúc của puromycin với phức hệ tysosyl- tARN

B Mô hình hoạt động của puromycin [59]

Puromycin kìm hãm sự sinh trưởng của rất nhiều tế bào Prokaryote và Eukaryote bằng cách can thiệp vào quá trình tổng hợp protein Sự có mặt của Puromycin sẽ gây kết thúc sớm chuỗi polipeptide khi quá trình dịch mã đang diễn ra trên ribosome Một thành phần của Puromycin giống với đầu tận cùng 3’ của tARN vận chuyển axit amin vì thế nó có khả năng liên kết vào vị trí A của ribosome và làm ngừng quá trình dịch mã, giải phóng chuỗi polypeptide ngắn hơn bình thường (hình 1.19) Cơ chế chính xác của quá trình này cho đến nay vẫn chưa biết rõ nhưng vị trí 3’ chứa một liên kết amide thay cho liên kết este bình thường của tARN Liên kết amide này làm cho phân tử khó bị thuỷ phân, từ đó khiến cho ribosome dừng hoạt động [54].

Trong sinh học tế bào, puromycin là nhân tố chọn lọc trong hệ thống nuôi cấy tế bào, cho phép chọn lọc và duy trì những tế bào biểu hiện gen kháng Puromycin Liều lượng thích hợp để chọn lọc trong nuôi cấy tế bào là trong khoảng từ 10 - 100 g/ml Mặc dù ở nồng độ thấp như 1 g/ml nó đã có thể gây chết tới 99% tế bào không có khả năng kháng puromycin chỉ sau

THỤ TINH NHÂN TẠO Ở GÀ

Thụ tinh nhân tạo (artificial insermination) là một tiến bộ kỹ thuật trong ngành chăn nuôi được áp dụng ở nước ta từ những năm 1960 TTNT là một phương pháp truyền giống tiên tiến do con người tiến hành để bộ phận sinh dục cái tiếp nhận được tinh dịch của con đực không thông qua giao phối trực tiếp [1].

1.6.1 Lợi ích và khó khăn của TTNT

* Cải thiện di truyền: Cho phép sử dụng rộng rãi những đực giống năng suất cao, từ đó cải thiện được năng suất các thế hệ đời sau Cho phép sử dụng tinh dịch đông lạnh của những đực giống cao sản (thậm chí khi chúng đã chết). Bằng kỹ thuật TTNT có thể làm dễ dàng hơn việc kiểm tra năng suất qua đời sau trong những điều kiện về môi trường và quản lý khác biệt nhau.

* An toàn dịch bệnh: Không du nhập bệnh mới, khống chế được lây lan dịch bệnh thông qua giao cấu hoặc do tiếp xúc giữa đực và cái [1].

* Hạn chế những khó khăn hoặc nguy hiểm trong giao phối tự nhiên mà nguyên nhân thường từ phía con đực Như: Ðực giống có thể trọng quá lớn so với con cái; đực giống hung dữ gây tổn thương cho con cái; đực giống bị què, đau chân không nhảy ôm được con cái [1].

- Công tác TTNT đòi hỏi trình độ quản lý cao

- TTNT đòi hỏi xác định đúng thời điểm dẫn tinh để nâng cao tỉ lệ đẻ và số con sinh ra trong ổ Ðể dẫn tinh đạt hiệu quả cao, cần phát hiện động dục 2 lần mỗi ngày.

- Nếu tinh dịch không pha loãng, chỉ nên sử dụng trong vòng vài giờ sau khi lấy tinh Nếu dùng tinh dịch đông lạnh, tỉ lệ thụ thai và số con sinh ra thường thấp hơn nhiều so với sử dụng tinh dịch tươi hoặc giao phối tự nhiên

- Việc vệ sinh vô trùng và những phương tiện, thiết bị dùng trong TTNT cũng đòi hỏi những chí phí nhất định [1].

TTNT ở gà phát triển muộn hơn so với ở gia súc Đến năm 1986, người ta mới bắt đầu nghiên cứu TTNT ở gà.

TTNT giúp gia tăng tỉ lệ phối và sử dụng gà tốt trong thời gian dài hơn so với phối tự nhiên Ngoài ra, việc TTNT giúp kiểm soát được tình hình chính xác gia phả của gà con thế hệ sau từ những quả trúng gà giống đã được đánh dấu và cho ấp nở cá thể.

Trước khi TTNT khoảng 3 tuần cần nuôi tách riêng con mái do tinh trùng gà có thể sống trong ống dẫn trứng khoảng 17 – 20 ngày.

Quy trình TTNT trên gà được thực hiện bởi chế độ lấy tinh và gieo tinh 2 lần/tuần Việc lấy tinh gà 2lần/tuần tuy có ảnh hưởng đến thể tích tinh dịch nhưng lại không ảnh hưởng tới hoạt lực và nồng độ tinh dịch Tuy nhiên, sau khi lấy tinh trùng của gà cần phải tiến hành gieo ngay để không làm giảm hoạt lực của tinh dịch Thời gian gieo tinh được tính bắt đầu sau khi gà đẻ hết trứng trong ngày để trứng không ngăn cản đường đi của tinh trùng (sau 14h) Dụng cụ gieo tinh phải được vệ sinh hàng ngày và dùng riêng cho từng con giống TTNT nên tiến hành liên tiếp trong 2 ngày của tuần đầu tiên và sau đó 3 ngày 1 lần [1].

KHÁI QUÁT VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Từ những năm cuối thế kỷ XIX các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu đưa ra những phương pháp bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng vào dung dịch muối để có thể duy trì sự sống cho những tế bào bên ngoài cơ thể. Đó chính là những bước thí nghiệm đầu tiên cho nghiên cứu nuôi cấy tế bào.Trong gần 40 năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy tế bào đã ghi nhận những bước tiến nhảy vọt [6]

Nuôi cấy tế bào là công cụ để nghiên cứu chức năng và cấu trúc của gen, lập bản đồ gen của các loài sinh vật, nghiên cứu hoạt động của các tế bào ung thư Bên cạnh đó, trong những năm gần đây công nghệ chuyển gen động vật đã trở thành một hướng nghiên cứu đầy triển vọng cho công nghệ sinh học và nó hứa hẹn sẽ mang lại những ứng dụng to lớn cho đời sống [6]

Môi trường nuôi cấy tế bào gồm các thành phần sau: muối vô cơ,carbohydrate, acid béo, amino acid, vitamin, yếu tố vi lượng, các chất điều hòa sinh trưởng Đối với tế bào động vật trong môi trường còn phải bổ sung thêm huyết thanh Mỗi thành phần có chức năng khác nhau [8],[65].

ĐẠI CƯƠNG VỀ NGUYÊN BÀO SỢI

Nguyên bào sợi có nguồn gốc từ những tế bào trung mô trong phôi thai và những tế bào nguyên bào sợi phân chia trong cơ thể trưởng thành. Nguyên bào sợi là loại tế bào thường gặp nhất trong các mô liên kết Ngoài ra nguyên bào sợi có thể xuất phát từ những tế bào trung mô tiền thân được duy trì trong các mô liên kết trưởng thành [5],[65].

Dưới kính hiển vi điện tử thì nguyên bào sợi là những tế bào chưa trưởng thành, ít biệt hóa Nguyên bào sợi thường có dạng hình thoi, ít nhánh ngắn, kích thước không quá 20 - 25 μm, nhân bầu dục hoặc có hình cầu, có một hoặc vài nhân Nhân của nguyên bào sợi cô đặc được kéo dài theo trục tế bào Bào tương ưa bazơ nhạt, lưới nội bào, ti thể phát triển và có ranh giới với chất ngoại bào không rõ rệt Nguyên bào sợi có khả năng phân chia mạnh, tế bào có thể di động yếu do yếu tố vi sợi actin và myozin ở ngoại vi bào tương Tế bào có những nhánh là chân giả dạng sợi (hình 1.20) [6],[65].

Hình 1.20: Hình dạng của một nguyên bào sợi gà điển hình [65]

Nguyên bào sợi gà hình thoi, ít tua ngắn, nhân hình elip và chứa rất nhiều vi sợi actin và myozin ở bào tương

Nguyên bào sợi phân tán khắp nơi trong mô liên kết của cơ nơi chúng tiết ra chất nền ngoại bào một cách linh động giàu collagen

Khi mô liên kết bị hủy hoại chúng gần như di chuyển vào trong vết thương, tăng sinh và tiết ra một lượng chất nền collagen rất lớn giúp cô lập đồng thời sửa chữa vết thương Khả năng phát triển nhanh trên bề mặt của mô bị thương cũng như sự phát triển độc lập của chúng là lí do khiến chúng là loại tế bào dễ phát triển nhất trong môi trường nuôi cấy Nguyên bào sợi là loại tế bào linh hoạt nhất trong mô liên kết bởi chúng khả năng có thể biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau của họ mô này Các tế bào này tổng hợp collagen, lưới, sợi elastic và glycosaminoglycan và glycoprotein của chất nền nội bào vô định hình Các nguyên bào sợi như là những giá thể để cho các tế bào gốc bám vào để tăng trưởng [8],[65].

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chúng tôi sử dụng giống gà Lơgo (Leghorn) được cung cấp bởi trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương, Viện Chăn nuôi Quốc Gia

Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay, có ảnh hưởng lớn đến toàn bộ ngành gà công nghiệp thế giới Đây là giồng gà nuôi công nghiệp, nguồn gốc từ Italia, phát triển ở vịnh Địa Trung Hải, hiện nay được nuôi rộng rãi ở hầu khắp các nước, ở các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới Giống gà này đã nhập vào nuôi ở Việt Nam từ rất sớm (khoảng những năm 50 - 60 của thế kỷ XX). Đây là giống gà chuyên trứng, sức đẻ năm đầu là 280 - 300 trứng, sản lượng trứng một năm khoảng 250 - 270 quả/1 con mái Trứng to, nặng 60- 65g, tỉ lệ lòng trắng so với lòng đỏ cao hơn các loại trứng gà khác, vỏ trứng màu trắng, dễ kiểm tra phôi trong quả trứng ấp. Đặc điểm hình thái: Gà leghorn có lông màu trắng, đầu nhỏ, mào và tích phát triển Trọng lượng cơ thể lúc trưởng thành khoảng 1,8 - 2 kg/con ở gà trống; 1,4 - 1,8 kg/con ở gà mái Bộ lông dày, sít, xếp sát vào thân Cấu trúc cơ thể chắc chắn, bộ xương khoẻ chắc Mào đơn có 5 khía răng cưa nhỏ, gà mái khi đã đẻ gà thường ngả về một phía Cổ dài trung bình, ngực phát triển và hơi thẳng Bụng và đuôi phát triển, với lông dài, mỏ, da, chân màu vàng [12,13,59,64]

Với những đặc điểm trên, trứng gà Leghorn là đối tượng rất thuận lợi cho các nghiên cứu chuyển gen ở gia cầm với mục đích sản xuất protein dược liệu trong lòng trắng trứng

Hình 2.1: Gà Leghorn (A: Gà trống; B: Gà mái) 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Dụng cụ cần thiết để làm các TN trong đề tài gồm:

Bảng 2.1: Các dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong đề tài

STT Tên dụng cụ Hãng sản xuất

1 Bộ vi phẫu Dumont Thuỵ Sĩ

2 Buồng đếm hồng cầu Neubaoer Trung Quốc

3 Giếng nuôi cấy, đĩa nuôi cấy 24 giếng Corning Mỹ

4 Đĩa thủy tinh, bình tam giác, đèn cồn, lamen; giấy thấm Trung Quốc

5 Màng lọc vi khuẩn Sartorius Đức

6 Ống Eppendorf, ống PCR Corning Mỹ

7 Ống Fancol 15, 50 ml Corning Mỹ

8 Pipet thủy tinh 2, 5, 10 ml Trung Quốc

10 Xy lanh chuyên dụng để TTNT Trung Quốc

11 Xy lanh y tế 1 ml Việt Nam

Các thiết bị nghiên cứu cần thiết cho đề tài như sau:

Bảng 2.2: Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất

1 Buồng cấy vô trùng Microflow Anh

2 Kính hiển vi Olympus Nhật Bản

3 Kính hiển vi soi ngược Zeiss Đức

4 Kính hiển vi soi nổi Zeiss Đức

5 Kính soi trứng Việt Nam

6 Máy ấp trứng Hà Lan

7 Máy điện di Bio- rad Mỹ

9 Máy khoan mini Hàn Quốc

11 Máy ly tâm Hettich Mỹ

12 Máy PCR Bio- rad Mỹ

14 Máy soi gel Bio – rad Mỹ

15 Nồi khử trùng Vietronics Việt Nam

16 Tủ ấm CO2 Sanyo Nhật Bản

17 Tủ lạnh (4, -20, -80 độ C) Revco Mỹ

19 Tủ xông khử trùng trứng Việt Nam

Các hoá chất sử dụng trong đề tài bao gồm:

Bảng 2.3: Các hóa chất sử dụng trong đề tài

STT Hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất

3 Buffer 10X for Taq SBS Trung Quốc

6 Dung dịch sinh lý (NaCl 0,9%) Việt Nam

12 Kit tách plasmid Invitrogen Mỹ

15 Môi trường DMEM Stem cells Mỹ

19 Taq – polymerase SBS Trung Quốc

Vector transposon Sleeping Beauty (SB) là quà tặng của GS CarmelAlvarez thuộc bộ môn di truyền, đại học Tổng hợp Malaga, Tây Ban Nha dành tặng phòng công nghệ tế bào động vật, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

Hình 2.2 : Cấu trúc vector Transposon Sleeping Beauty (vector pT2/BH-

Vector transposon Sleeping Beauty chúng tôi sử dụng là một plasmid có kích thước 8230 bp, là tổ hợp của 3 plasmid pCVpf, pT2 - BH và spUb - SB11, trong đó plasmid pCVpf có mang đoạn gen kháng puromycin và đoạn gen mã hoá cho eGFP, plasmid pT2 - BH mang transposon SB và plasmid spUb - SB11 chứa đoạn gen mã hóa cho enzyme transposase có liên quan đến sự di chuyển của transposon Vector này được thiết kế sao cho gen kháng Puromycin và gen eGFP nằm giữa 2 đầu lặp lại ngược chiều IR/DR của transposon, do đó cho phép enzyme transposase cắt transposon (chứa gen kháng Puromycin và gen eGFP) từ vector này vào genome tế bào nhận

Ban đầu vector pT2/BH-CVpf-SB11 được biến nạp vào vi khuẩn

Escherichia coli Vector được tách từ vi khuẩn bằng bộ kit Quick Plasmid

2.2.5 Mồi sử dụng cho PCR

Hai cặp mồi chúng tôi sử dụng trong phản ứng PCR là cặp mồi eFGP và cặp mồi 18S Các cặp mồi được cung cấp bởi BIONEER, Hàn Quốc Hai cặp mồi đều có kích thước 18 bp (bảng 2.4 và 2.5).

Bảng 2.4: Trình tự mồi xuôi và ngược sử dụng để khuếch đại đoạn

ADN có kích thước 418 bp của gen eGFP

Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ bắt cặp

GFPFor 5’ – ACA AGT TCA GCG TGT CCG – 3’ 55,3 0 C GFPRev 5’ – TTC ACC TTG ATG CCG TTC – 3’ 55,2 O C

Bảng 2.5: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược của đoạn gen có kích thước 318 bp của gen 18S ribosome

Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ bắt cặp

18Sfor 5’ – GTC GGC GTC CAA CTT CTT – 3’ 55,4 0 C 18Srev 5’ – CGA TCC GAG GAC CTC ACT – 3’ 55,7 O C

2.2.6 Môi trường nuôi cấy và đệm

- Thành phần môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi: DMEM + 15% FBS + 1% streptomycin/penicillin (100U/ml penicillin, 100 àg/ml streptomycin) hoặc optimen + 5% FBS + 1% streptomycin/penicillin

- Đệm TBE (Tris base, Boric acide, EDTA)

- Đệm TE (Tris- EDTA) (pH=8)

Chúng tôi tiến hành song song hai phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp

2.3.1.1 Phương pháp chuyển gen qua tinh trùng

Tinh trùng mang gen pT2/BH-CVpf-SB11

Lấy tinh trùng Ủ với vector pT2/BH-CVpf-SB11

Nuôi cấy nguyên bào sợi, sàng lọc Puromycin

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR Ấp

Kiểm tra bằng phản ứng PCR

Hình 2.3 : Sơ đồ quy trình chuyển gen qua tinh trùng

Quy trình thí nghiệm đối với phương pháp SMGT được thể hiện qua hình 2.3:

Chúng tôi tiến hành thu tinh dịch của các gà trống thí nghiệm, rồi ủ với vector pT2/BH-CVpf-SB11 sau đó thụ tinh nhân tạo cho gà mái Tiến hành ấp trứng thu được sau thụ tinh; sau 5 ngày kiểm tra tỉ lệ phôi rồi chia làm hai lô để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển:

Kiểm tra bằng phản ứng PCR

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR

+ Lô 1: tách phôi 7 ngày ấp, nuôi cấy nguyên bào sợi và sàng lọc bằng puromycin

+ Lô 2: Ấp nở thành gà con, sau đó kiểm tra bằng phương pháp PCR.

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình phương pháp vi tiêm

Quy trình thí nghiệm đối với phương pháp vi tiêm thể hiện qua hình 2.4 Chúng tôi tiến hành vi tiêm vector pT2/BH-CVpf-SB11 vào trứng gà 0 giờ ấp Sau đó đem ấp trứng và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển tương tự như đối với phương pháp SMGT.

2.3.2.1 Các phương pháp sử dụng trong quy trình chuyển gen qua tinh trùng

Vi tiêm Vector pT2/BH-CVpf-SB11

Trứng gà mang gen pT2/BH-CVpf-SB11

Nuôi cấy nguyên bào sợi, sàng lọc Puromycin

Gà conTrứng gà 7 ngày ấp

2.3.2.1.1 Phương pháp mát-xa tạo phản xạ xuất tinh ở gà trống

Trước khi huấn luyện 3 - 5 ngày, chọn 5 con trống khỏe mạnh, không có dị tật, không có tính hăng, đang trong thời kỳ thành thục nuôi tách khỏi gà mái, nhốt trên lồng tầng hoặc nuôi trên nền, nhốt chung hoặc nhốt cá thể tùy điều kiện chuồng trại nhưng với yêu cầu là không cho gà đá nhau Gà trống nên được làm quen với người lấy tinh qua màu áo quần và thái độ tiếp xúc ôn hòa, nhẹ nhàng Đồng thời cắt bỏ bớt phần lông che phủ lỗ huyệt Đúng 14h chiều mỗi ngày sẽ tiến hành mát xa tạo phản xạ xuất tinh cho những con gà trống đó

Nhẹ nhàng bắt gà trống và kẹp vào nách trái (nếu thuận tay phải), cho đuôi gà hướng ra phía trước Luồn bàn tay trái dưới lườn gà và cố định 2 đùi gà (gà không quẫy nhưng vẫn thoải mái và 2 chân gà được thả lỏng) Dùng bàn tay phải vuốt lên lưng gà xuôi về phía phao câu nhằm kích thích phản xạ xuất tinh Thực hiện động tác này trong khoảng 5 phút/con ở lần đầu huấn luyện đầu tiên

Trong các lần tiếp theo, động tác đó được giảm thời gian và khi đuôi gà cong lên chứng tỏ gà trống đã có phản xạ xuất tinh.

Cần thực hiện liên tục hàng ngày cho tới khi các con gà trống có phản xạ xuất tinh (khoảng 7 ngày) thì tiến hành lấy tinh trùng và TTNT.

2.3.2.1.2 Phương pháp lấy tinh trùng gà

Phương pháp lấy tinh cần hai người thực hiện phối hợp với nhau:

- Người thứ nhất: thực hiện thao tác gây xuất tinh ở gà trống Khi gà trống cong đuôi lên, chứng tỏ gà đáp ứng sự kích thích và chuẩn bị xuất tinh. Lúc đó dùng ngón cái và ngón trỏ (tay phải) bóp nhẹ vào vùng lỗ huyệt và hơi ấn vào bụng dưới lỗ huyệt để tăng thêm kích thích.

- Người thứ hai: dùng một tay vén ngược đuôi gà lên để lộ vùng huyệt và đỡ vướng bàn tay phải của người thứ nhất Vào thời điểm này, gà trống sẽ phóng tinh dịch màu trắng ra ngoài, người thứ 2 kịp thời dùng dụng cụ để hứng tinh dịch (hình 2.5).

Hình 2.5: Phương pháp lấy tinh trùng gà

Sự phối hợp giữa hai người phải nhịp nhàng và ăn khớp nhau, nếu không sẽ làm gà bị ức chế phản xạ xuất tinh hoặc tinh dịch phóng ra ngoài dụng cụ hứng tinh Cũng cần chú ý một số gà thải phân cùng lúc với tinh dịch (nhất là những gà được ăn trước khi lấy tinh), vì vậy cần cẩn thận tránh việc hứng phân vào dụng cụ đựng tinh dịch.

2.3.2.1.3 Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng

- Pha loãng tinh dịch: Dùng ống trộn hồng cầu hút tinh dịch nguyên đến vạch 0.5, sau đó hút tiếp dung dịch NaCl 3% (để giết chết tinh trùng) đến vạch 101 Trong quá trình hút tinh dịch và dung dịch NaCl chú ý không để hiện tượng sủi bọt trong ống.

- Dùng ngón tay cái và ngón giữa bịt hai đầu ống trộn, lắc nhẹ, đều trong

2 - 3 phút để trộn đều dung dịch

- Bỏ 3 - 4 giọt đầu, rồi nhỏ 1 giọt lên buồng đếm hồng cầu (hình 2.6), đậy lamen.

Hình 2.6: Buồng đếm hồng cầu Neubauer

(Gồm 15 hàng và 15 cột, tạo thành 225 ô vuông lớn, trong đó có 25 ô vuông lớn ở trung tâm lại được chia nhỏ, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ; mỗi ô vuông nhỏ có chiều sâu 1/10 mm; rộng 1/20mm) [64]

- Đếm số lượng tinh trùng: Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, quan sát ở vật kính 10X để thấy được ô buồng đếm, sau đó chuyển sang vật kính lên 40X và tiến hành đếm Đếm theo quy tắc (hình 2.7):

+ Đếm 5 ô vuông lớn (4 ô ở 4 góc và ô ở giữa)

+ Đếm từ trái sang phải và từ trên xuống dưới.

KẾT QUẢ KIỂM TRA NỒNG ĐỘ TINH TRÙNG

Nồng độ tinh trùng là số tinh trùng trong 1 ml tinh dịch Việc xác định chính xác nồng độ tinh trùng là rất quan trọng, từ đó có thể tính được số liều tinh dịch có thể sản xuất mỗi lần xuất tinh, số lượng tinh trùng cần thiết cho mỗi lần TTNT.

Chúng tôi tiến hành kiểm tra lượng tinh dịch sau mỗi lần xuất tinh (V) và nồng độ tinh trùng (C) của 5 gà trống thí nghiệm (TN) thu được kết quả sau:

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra số lượng tinh dịch (V) và nồng độ tinh trùng (C)

Số hiệu gà V (ml) C (tinh trùng/ml)

5 0,25 ± 0,008 8,7.10 8 ± 0,4.10 8 Qua bảng số liệu trên ta thấy 5 gà trống có lượng tinh dịch sau mỗi lần xuất tinh và nồng độ tinh trùng tương đối đồng đều Lượng tinh dịch cao nhất ở gà số 3 (0,30 ml), thấp nhất ở gà số 1 và số 5 (0,25 ml) Tất cả các giá trị này đều phù hợp với lượng xuất tinh trung bình của gà theo Bahr và Bakst là 0,25 [11].

Nồng độ tinh trùng của 5 gà trống TN cũng tương đối cao, dao động trong khoảng từ 8.10 8 đến 9.10 8 tinh trùng/ml.

Từ 2 kết quả trên, chúng tôi thấy rằng cả 5 gà trống TN đều đảm bảo về số lượng và chất lượng tinh dịch theo tiêu chuẩn của loài, đáp ứng yêu cầu của TTNT [1]

Dựa trên số liệu này, chúng tôi có thể tính toán số lần pha loãng tinh dịch cho quá trình TTNT.

KẾT QUẢ KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN GFP TRONG

3.2.1 Kết quả kiểm tra tỉ lệ phôi

Tỉ lệ phôi sau khi tiến hành chuyển gen là yếu tố quan trọng để đánh giá hiệu quả chuyển gen Chúng tôi tiến hành đồng thời hai phương pháp chuyển gen qua tinh trùng và vi tiêm vào trứng gà 0 giờ ấp Sau 5 ngày ấp ở điều kiện nhiệt độ từ 37 o - 37,8 o C, chúng tôi kiểm tra trứng xem có phôi phát triển hay không Kết quả thu được có sự khác nhau rõ rệt giữa 2 phương pháp, thể hiện ở bảng sau:

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra tỉ lệ phôi

Phươn g pháp Đợt TN Số trứng thu được

Vi tiêm Đợt 1 30 16 53,33 Đợt 2 28 24 85,71 Đợt 3 29 26 89,66

Như vậy chúng ta thấy rằng, tỉ lệ phôi của phương pháp SMGT cao hơn rất nhiều so với phương pháp vi tiêm Tỉ lệ phôi trung bình của phương pháp SMGT là xấp xỉ 95,76% , trong khi đó tỉ lệ này ở phương pháp vi tiêm là 76,23% Do đợt đầu tiến hành TN chúng tôi lấy tinh dịch của 5 gà trốngTTNT cho 15 gà mái, tiến hành TTNT 3 lần/tuần, thu trứng từ ngày thứ 2 đến thứ 7 sau thụ tinh nên số trứng thu được là rất lớn, hai đợt SMGT sau,chúng tôi lấy tinh dịch của 2 gà trống, tiến hành TTNT cho 7 gà mái nên số trứng thu được giảm đi Trong khi đó, mỗi đợt tiến hành vi tiêm chúng tôi chỉ thu được từ 28 - 30 trứng, do mỗi đợt vi tiêm trên trứng phải tiến hành đồng thời rất nhiều thao tác đòi hỏi sự tỉ mỉ và chính xác cao Do vậy, trong đợt đầu tiến hành, tỉ lệ phôi thu được chiếm 53,55%; những lần sau do có kinh nghiệm hơn nên tỉ lệ phôi đạt 85,71% ở lần tiến hành TN thứ hai; 89,66% ở đợt TN thứ ba (kết quả này cao hơn so với kết quả mở cửa sổ có vi tiêm (60%) đã được nghiên cứu trong luận văn cao học của ThS Thân Thị Trang Uyên) Tuy nhiên, tỉ lệ này vẫn thấp hơn nhiều so với phương pháp SMGT, với tỉ lệ phôi ở các lần TN khá đồng đều và đạt lần lượt là 97,60%; 96,66%; 93,67%, tỉ lệ này tương đương với kết quả nghiên cứu của ThS Lê Thị Tuyết năm 2007 [13].

Như vậy, chúng ta thấy rằng tỉ lệ phôi khi sử dụng phương pháp SMGT cao hơn so với phương pháp vi tiêm.

Số trứng thu được của cả hai phương pháp chúng tôi chia làm hai lô: + Lô 1: tiến hành TN tách phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy in vitro

+ Lô 2: tiếp tục ấp đến khi trứng nở.

3.2.2 Kết quả nuôi cấy in vitro tế bào phân lập từ phôi gà 7 ngày ấp

Nguyên bào sợi sau khi phân lập từ phôi 7 ngày ấp được chuyển vào các giếng nuôi cấy với lượng tế bào ban đầu được cấy vào mỗi giếng khoảng 0,3x10 6 tế bào/giếng Môi trường được dùng để nuôi cấy dòng nguyên bào sợi phụi gà: DMEM + 10% FBS + 100U/ml Penicillin, 100 àg/ml streptomycin hoặc Optimen + 5% FBS + 100U/ml Penicillin, 100 àg/ml streptomycin Sau 24h nuôi cấy, nguyên bào sợi bám xuống đáy giếng và có hình dạng đặc trưng: tế bào có hình thuôn nhọn hai đầu, phân nhánh 24h sau nuôi cấy in vitro, tế bào được kiểm tra dưới kính hiển vi và thay môi trường. Sau 24h,mật độ tế bào chiếm trên 70% bề mặt giếng Sau 72h nuôi cấy (tế bào chiếm khoảng 90 % bề mặt giếng nuôi cấy), tiến hành cấy chuyển với tỉ lệ 1:2 Sau lần cấy chuyển đầu tiên nguyên bào sợi gà vẫn tăng sinh nhanh chóng, tế bào vẫn giữ được hình dạng ổn định Số lượng tế bào trong mỗi giếng nuôi cấy trước khi cấy chuyển đều được kiểm tra bằng buồng đếm hồng cầu Mỗi giếng nuôi cấy của cả lô TN và ĐC đều được cấy số lượng tế bào tương tự nhau, khoảng 0,3x10 6 tế bào/giếng.

Sau 48 giờ sau khi cấy chuyển, tế bào bắt đầu được xử lý bằng puromycin (lúc này, mỗi giếng nuôi cấy có mật độ khoảng 0,3x10 6 - 0,5x10 6 tế bào/giếng) (hình 3.1).

Hình 3.1: Tế bào phôi gà 7 ngày ấp trước khi sàng lọc bằng puromycin

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết)

Mỗi đợt thí nghiệm được tiến hành trên 6 phôi gồm 1 phôi đối chứng (ĐC) và 5 phôi TN, mỗi phôi có 4 giếng gồm 1 giếng không bổ sung puromycin, và 3 giếng còn lại có nồng độ puromycin là: 1μg/ml, 2 μg/ml, 3 μg/ml Lần lượt tế bào trong từng giếng của các lô được quan sát dưới kính hiển vi và đếm số lượng tế bào sau 24h Bằng mắt thường ta cũng nhận thấy sự khác nhau về màu sắc của môi trường ở các giếng có nồng độ puromycin khác nhau Ở các giếng không bổ sung puromycin, môi trường bị mất màu do trong môi trường có chất chỉ thị màu hồng phenol khi tế bào tăng sinh mạnh đã làm thay đổi độ pH môi trường sang axit khiến môi trường đổi màu. Ở các giếng bổ sung các nồng độ puromycin khác nhau có sự khác nhau.

3.2.2.1 Kết quả sau 24 giờ sàng lọc bằng puromycin a Kết quả quan sát dưới kính hiển vi của cả 2 phương pháp SMGT và vi tiêm

1 Ở cả hai phương pháp SMGT và vi tiêm, sau 24h sàng lọc, chúng tôi quan sát thấy có sự khác biệt giữa các giếng của lô ĐC và lô TN, giữa các giếng được bổ sung nồng độ puromycin khác nhau Quan sát dưới kính hiển vi chúng tôi thấy như sau:

- Ở các giếng không bổ sung puromycin ở cả lô TN và lô ĐC, tế bào vẫn tăng trưởng tốt (hình 3.2):

Hình 3.2: Tế bào lô ĐC và TN sau 24h sàng lọc không bổ sung puromycin

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết)

- Ở nồng độ puromycin 1 àg/ml:

+ Ở lô ĐC, tế bào chết khá nhiều, các tế sống sót chỉ còn khoảng 1/3 so với giếng không bổ sung puromycin (hình 3.3).

Hỡnh 3.3: Tế bào lụ ĐC sau 24h sàng lọc bổ sung puromycin nồng độ 1 àg/ml

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết)

+ Ở lô TN, quan sát dưới kính hiển vi chúng tôi thấy, có sự khác nhau giữa các phôi: một số phôi có một số tế bào chết tuy nhiên mật độ tế bào không thay đổi; một số phôi số lượng tế bào chết rất nhiều (hình 3.4):

Hỡnh 3.4: Tế bào lụ TN sau 24h sàng lọc cú bổ sung puromycin nồng độ 1 àg/ml

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: một số phôi, tế bào chết ít, vẫn tăng sinh bình thường

B: Một số phôi, tế bào chết nhiều

- Ở nồng độ puromycin nồng độ 2àg/ml:

+ Ở các giếng ĐC tế bào chết rất nhiều, số lượng tế bào giảm nhiều lần so với trước khi bổ sung puromycin, chỉ còn một vài tế bào sống sót (hình 3.5).

Hình 3.5: Tế bào lô ĐC sau 24h sàng lọc có bổ sung puromycin nồng độ 2 àg/ml

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết)

+ Ở các giếng TN: một số phôi tế bào có chết nhưng không nhiều như ở giếng ĐC và vẫn còn nhiều tế bào bám dưới đáy giếng nuôi cấy; một số phôi tế bào chết rất nhiều tương tự như lô ĐC (hình 3.6).

Hỡnh 3.6: Tế bào lụ TN sau 24h sàng lọc cú bổ sung puromycin nồng độ 2 àg/ml

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: một số phôi, tế bào chết không nhiều B: Một số phôi chỉ còn lác đác một vài tế bào

- Ở nồng độ puromycin 3àg/ml:

+ Tế bào trong các giếng của lô ĐC chết hết (hình 3.7).

Hình 3.7: Tế bào lô ĐC sau 24h sàng lọc có bổ sung puromycin nồng độ 3 àg/ml

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết)

+ Tuy nhiên ở lô TN, một số phôi vẫn còn khá nhiều tế bào bám ở đáy giếng nuôi cấy, một số phôi cũng không còn tế bào nào sống sót.

Hỡnh 3.8: Tế bào lụ TN sau 24h sàng lọc cú bổ sung puromycin nồng độ 3 àg/ml

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: một số phôi, vẫn còn khá nhiều tế bào sống sót B: Một số phôi hầu như không còn tế bào nào sống sót

Như vậy khi quan sát dưới kính hiển vi, ta đã thấy rõ sự khác biệt giữa các giếng lô ĐC và các giếng lô TN Nồng độ puromycin càng cao, tế bào chết càng nhiều Tuy nhiên, ở đa số các phôi lô TN, tế bào vẫn có khả năng sinh trưởng ở nồng độ puromycin 1 àg/ml, một số tế bào vẫn cú khả năng sống sút ở nồng độ puromycin 2 àg/ml, thậm chớ 3 àg/ml Cũn một số phụi

TN khỏc, tế bào chết nhiều ngay ở nồng độ puromycin 1 àg/ml. b Kết quả đếm số lượng tế bào

Chúng tôi tiến hành đếm số lượng tế bào (đối với 3 đợt TN) và thu được kết quả như sau:

* Đối với phương pháp SMGT

Bảng 3.3: Số lượng tế bào sau 24h sàng lọc bằng puromycin đối với phương pháp SMGT (tế bào/giếng)

Lô TN ĐC TN1 TN 2 TN 3 TN 4 TN 5 Đợt

Qua bảng số liêu trên ta thấy, số lượng tế bào có sự biến động lớn sau 24h nuôi cấy Nếu coi tỉ lệ sống sót của lô không bổ sung puromycin là 100% thì tỉ lệ sống sót các lô bổ sung puromycin với các nồng độ khác nhau là khác nhau (bảng 1 - phụ lục 1) Có thể biểu diễn qua hình 3.9:

Tỉ lệ sống sót (%) ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5

0 μg/mlg/ml 1 μg/mlg/ml 2 μg/mlg/ml 3 μg/mlg/ml

Hình 3.9: Biểu đồ tỉ lệ sống sót của tế bào sau 24h sàng lọc bằng puromycin đối với phương pháp SMGT (đợt TN 1)

Qua hình 3.9 ta thấy: lô ĐC và lô TN3 có tỉ lệ sống sót của tế bào sau24h sàng lọc bằng puromycin là tương tự nhau, tỉ lệ sống sót thấp ngay ở nồng độ puromycin 1 μg/ml Ở nồng độ 2 μg/ml và 3 μg/ml, hầu như không còn tế bào nào sống sót Lô TN1, TN2, TN4, TN5, tế bào vẫn sinh trưởng bình thường ở nồng độ puromycin 1 μg/ml, tỉ lệ sống sót của tế bào rất cao,dao động từ 90 - 100% Ở nồng độ puromycin 2 μg/ml và 3 μg/ml, tỉ lệ sống sót của tế bào lần lượt khoảng 30% và 10% (bảng 1 - phụ lục 1)

* Đối với phương pháp vi tiêm

Bảng 3.4: Số lượng tế bào sau 24h sàng lọc bằng puromycin đối với phương pháp vi tiêm (tế bào/giếng)

Lô thí nghiệm ĐC TN 1 TN 2 TN 3 TN 4 TN 5 Đợt

Tương tự như đối với phương pháp SMGT, chúng ta có thể biểu diễn tỉ lệ sống sót của tế bào sau 24h sàng lọc bằng puromycin qua hình 3.10

Tỉ lệ sống sót (%) ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5

Hình 3.10: Biểu đồ tỉ lệ sống sót của tế bào sau 24h sàng lọc puromycin đối với phương pháp vi tiêm (đợt TN 1)

Qua hình 3.10 ta thấy: lô ĐC, lô TN 3, lô TN 4, có tỉ lệ sống sót của tế bào sau 24h sàng lọc là tương tự nhau, tỉ lệ sống sót của tế bào còn rất thấp ngay ở nồng độ puromycin 1 μg/ml , ở nồng độ 2 μg/ml và 3 μg/ml, hầu như không còn tế bào nào sống sót Lô TN 1, TN 2, TN 5, tế bào vẫn sinh trưởng bình thường ở nồng độ puromycin 1 μg/ml; ở nồng độ puromycin 2 μg/ml và 3 μg/ml, tỉ lệ sống sót của tế bào vẫn khá cao (bảng 2 – phụ lục 1).

Qua bảng số liệu và 2 biểu đồ trên, ta thấy sự biến động số lượng tế bào sau 24h sàng lọc với các nồng độ puromycin khác nhau ở phương pháp SMGT và vi tiêm diễn ra theo một quy luật tương tự nhau Có sự khác biệt rõ ràng về số lượng tế bào còn khả năng bám ở đáy giếng nuôi cấy giữa lô ĐC và lô TN sau 24 giờ sàng lọc

- Tế bào trong các giếng không bổ sung puromycin ở cả lô ĐC và lô TN vẫn sống và tăng sinh bình thường Số lượng tế bào tăng khoảng 0,02x10 6 tế bào/ giếng nuôi cấy

- Trong khi đú ở cỏc giếng cú bổ sung puromycin nồng độ 1 àg/ml:

+ Tế bào trong các giếng nuôi cấy ở lô ĐC chết nhiều và số lượng tế bào giảm xuống còn trung bình khoảng 0,1x10 6 tế bào/giếng nuôi.

+ Tế bào trong các giếng nuôi cấy ở lô TN có hai trường hợp khác nhau: Một số phôi, ở các giếng chỉ xuất hiện một số tế bào chết và số lượng tế bào gần như là không thay đổi so với lúc trước khi bổ sung puromycin (0,3-0,5x10 6 tế bào/giếng) Một số phôi, số lượng tế bào lại giảm hẳn đi, tương tự như ở lô ĐC.

- Trong cỏc giếng cú bổ sung puromycin với nồng độ 2 àg/ml:

àg/ml

lô TN Những tế bào lô TN sống sót ngay trong điều kiện môi trường có puromycin chứng tỏ chúng có khả năng kháng puromycin Những lô TN mà tế bào chết ngay ở nồng độ puromycin 1 àg/ml, cho thấy những phụi này không có khả năng kháng puromycin Điều đó phần nào chứng tỏ rằng một số phôi lô TN đã có khả năng kháng puromycin.

3.2.2.2 Kết quả sau 120 giờ xử lý puromycin a Kết quả quan sát dưới kính hiển vi của cả 2 phương pháp SMGT và vi tiêm

Sau khi bổ sung puromycin sau 24h, chúng tôi đã loại bỏ được những tế bào không có khả năng kháng puromycin Chúng tôi tiến hành thay môi trường, bổ sung puromycin và tiếp tục nuôi cấy.

Sau 120 giờ, chúng tôi quan sát dưới kính hiển vi và thấy rằng:

- Ở lô ĐC: giếng không bổ sung puromycin vẫn sinh trưởng bình thường, những giếng có bổ sung puromycin đều không còn tế bào nào sống sót (hình 3.11).

Hình 3.11: Tế bào lô ĐC sau 120 giờ sàng lọc

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: Không bổ sung puromycin B: Có bổ sung puromycin với các nồng độ khác nhau

+ Ở những giếng không bổ sung puromycin, tế bào tăng trưởng rất tốt (hình 3.12).

Hình 3.12: Tế bào lô TN sau 120 giờ sàng lọc không bổ sung puromycin

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết)

+ Đối với những phôi sau 24h sàng lọc đã không có khả năng kháng puromycin, sau 120 giờ nuôi cấy, không còn tế bào nào sống sót ở cả ba nồng độ puromycin 1, 2, 3 àg/ml (hỡnh 3.13).

Hình 3.13: Tế bào lô TN không có khả năng kháng puromycin sau 120 giờ sàng lọc bổ sung puromycin nồng độ 1, 2, 3 àg/ml

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết)

+ Những phụi cũn lại, ở nồng độ puromycin 1àg/ml, tế bào chết ớt, nhưng tốc độ tăng trưởng chậm (hình 3.14A) Ở nồng độ puromycin

2 àg/ml, số lượng tế bào chết nhiều, chỉ cũn thấy lỏc đỏc vài tế bào sống bám dưới đáy giếng nuôi cấy (hình 3.14B).

Hình 3.14: Tế bào lô TN sau 120 giờ sàng lọc

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết) A: bổ sung puromycin nồng độ 1 àg/ml B: lọc bổ sung puromycin nồng độ 2 àg/ml

- Ở giếng nuụi cấy cú bổ sung puromycin nồng độ 3 àg/ml, trong giếng nuôi cấy không còn tế bào nào sống sót:

Hỡnh 3.15: Tế bào lụ TN sau 120 giờ sàng lọc bổ sung puromycin nồng độ 3 àg/ml

(1: tế bào sống; 2: tế bào chết)

Kết quả quan sát dưới kính hiển vi cho chúng ta thấy rõ hơn khả năng kháng puromycin ở các lô ĐC và TN Ngay trong lô TN, các phôi cũng thể hiện khả năng kháng puromycin khác nhau Những phôi nào sau 24h đã không thể hiện khả năng kháng puromycin, thì sẽ không còn tế bào nào sống sút ở cả 3 nồng độ puromycin 1, 2 và 3 àg/ml Những phụi cú khả năng khỏng puromycin, tế bào tiếp tục tăng trưởng ở nồng độ 1 àg/ml Cũn ở nồng độ puromycin cao hơn, hầu như không còn tế bào nào sống sót b Kết quả đếm số lượng tế bào

* Đối với phương pháp SMGT:

Bảng 3.5: Số lượng tế bào sau 120 giờ sàng lọc puromycin đối với phương pháp SMGT (tế bào/giếng)

Lô TN ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 Đợt

* Đối với phương pháp vi tiêm

Bảng 3.6: Số lượng tế bào sau 120 giờ sàng lọc puromycin đối với phương pháp vi tiêm (tế bào/giếng)

Lô TN ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 Đợt

Qua bảng 3.5 và 3.6, chúng ta thấy rằng sau 120h sàng lọc bằng puromycin, tỉ lệ sống sót của tế bào giảm đáng kể (bảng 3, bảng 4 - phụ lục

1) Có thể biểu diễn tỉ lệ sống sót của tế bào qua hình 3.16 và 3.17 dưới đây:

Tỉ lệ sống sót (%) ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5

Hình 3.16: Biểu đồ tỉ lệ sống sót của tế bào sau 120h sàng lọc bằng puromycin đối với phương pháp SMGT (đợt TN 1)

Tỉ lệ sống sót (%) ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5

Hình 3.17: Biểu đồ tỉ lệ sống sót của tế bào sau 120h sàng lọc bằng puromycin đối với phương pháp vi tiêm (đợt TN 1)

Như vậy, qua bảng 3.5; 3.6 và hình 3.15; 3.16, ta thấy:

- Tế bào vẫn tăng trưởng bình thường ở các giếng không bổ sung puromycn

- Ở các giếng có bổ sung puromycin 3 μg/ml đều không còn tế bào nào sống sót ở cả lô ĐC và lô TN.

- Ở nồng độ puromycin 2 μg/ml, có một vài giếng lác đác vài tế bào sống sót, khoảng 2 – 8 tế bào/giếng, do mật độ tế bào quá thưa nên chúng không thể tăng sinh được

- Ở nồng độ puromycin 1 μg/ml, ở giếng ĐC và khoảng 30% các giếng lô

TN cũng không còn tế bào nào sống sót Tuy nhiên, các giếng TN còn lại, tế bào vẫn sống, vẫn tăng trưởng nhưng tốc độ tăng trưởng chậm, chỉ tăng thêm khoảng 0,1-0,2x10 6 tế bào/giếng so với sau 24h nuôi cấy. Sau 120 giờ nuôi cấy, sự biến động số lượng tế bào được biểu diễn qua hình 3.17, 3.18 và 3.19.

Hình 3.18: Đồ thị biến động số lượng TB lô ĐC sau 120 giờ nuôi cấy

(phương pháp SMGT – đợt TN 1)

Qua hình 3.17 ta thấy, các tế bào lô ĐC, ở nồng độ puromycin 0 μg/ml, tế bào tăng trưởng bình thường, sau 24h nuôi cấy, tăng lên khoảng0,03.10 6 tế bào/giếng, sau 120 giờ nuôi cấy, số lượng tế bào tiếp tục tăng, lên đến 0,5.10 6 tế bào Tuy nhiên, ở nồng độ puromycin 1 μg/ml, số lượng tế bào giảm nhanh chóng, sau 24h, từ 3,8.10 6 tế bào xuống còn 0,12.10 6 tế bào, sau

120 giờ đều không còn tế nào nào sống sót Ở nồng độ puromycin 2 μg/ml, sau 24h chỉ còn lại khoảng 98 tế bào nằm rải rác, sau 120 giờ nuôi cấy, các tế bào đều chết hết Ở nồng độ puromycin 3 μg/ml, sau 24h đã không còn tế bào nào sống sót.

Hình 3.19: Đồ thị biến động số lượng TB lô TN1 sau 120 giờ nuôi cấy

(phương pháp SMGT – đợt TN 1)

Các tế bào lô TN1, ở nồng độ puromycin 0 μg/ml, tế bào tăng sinh tốt,sau 120 giờ nuôi cấy, đạt khoảng 0,53.10 6 tế bào/giếng Ở nồng độ puromycin 1 μg/ml, tế bào sinh trưởng chậm, sau 24h nuôi cấy, hầu như không tăng, sau 120 giờ nuôi cấy, tăng từ 0,39.10 6 lên 0,41.10 6 tế bào Ở nồng độ puromycin 2 μg/ml, sau 24h nuôi cấy, tế bào bị chết nhiều, còn0,13.10 6 tế bào, sau 120h không còn tế bào nào sống sót, ở một số giếng còn lác đác một vài tế bào Ở nồng độ puromycin 3 μg/ml, sau 24h, tế bào chết gần hết chỉ còn 0,05.10 6 tế bào, sau 120 giờ cũng không còn tế bào nào sống sót (hình 3.18).

Hình 3.20: Đồ thị biến động số lượng TB lô TN3 sau 120 giờ nuôi cấy

(phương pháp SMGT – đợt TN1) Ở một số lô TN, số lượng tế bào biến động tượng tự như ở lô ĐC Khi không bổ sung puromycin, tế bào vẫn tăng trưởng tốt; khi bổ sung puromycin ở các nồng độ khác nhau, tế bào đều chết rất nhiều, sau 120 giờ nuôi cấy đều không còn tế bào nào sống sót (hình 3.19).

Như vậy, sau 120 giờ nuôi cấy, sàng lọc bằng puromycin, phần nào đã chứng tỏ sự có mặt của gen kháng puromycin trong một số phôi TN Những phôi tế bào chết nhiều giống như ở lô ĐC, chứng tỏ các tế bào không mang gen kháng puromycin Ở những đợt TN khác nhau, số lượng phôi có khả năng kháng puromycin puromycin là khác nhau, ở phương pháp SMGT và phương pháp vi tiêm là khác nhau, thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.7: Tỉ lệ phôi có các tế bào mang gen kháng puromycin

Số phôi có khả năng kháng

Qua đây, phần nào ta có thể đánh giá được hiệu quả của 2 phương pháp chuyển gen ở gà Mặc dù số phôi mỗi lần tiến hành TN là nhỏ, nhưng phần nào ta có thể thấy rằng tỉ lệ thành công ở phương pháp SMGT cao hơn so với phương pháp vi tiêm. c Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR

Chúng tôi tiến hành thu những tế bào còn sống ở lô TN sau khi đã sàng lọc bằng puromycin và tiến hành phản ứng PCR Do số lượng tế bào ở mỗi giếng còn lại không nhiều nên chúng tôi gom số tế bào sống ở tất cả các giếng lô TN có bổ sung puromycin thành mẫu TN; tế bào ở tất cả các giếng không bổ sung puromycin thành mẫu ĐC Ở cả phương pháp SMGT và vi tiêm đều thu được kết quả như sau:

Hình 3.21: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR kiểm tra sự có mặt của gen eGFP trong nguyên bào sợi gà

Giếng 2: ĐC (+):vector transposon Sleeping Beauty có mang gen eGFP

Giếng 4: ADN thu từ tế bào lô TN

Giếng 5: ADN thu từ tế bào lô ĐC

Sự có mặt của gen eGFP trong ADN genome gà với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen eGFP kích thước 418 bp được tìm thấy trong các tế bào tách từ phôi gà 7 ngày ấp được chuyển gen bằng phương pháp SMGT hoặc có vi tiêm phức hệ AND-liposome Cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen có kích thước của gen Ribosome 18S được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của ADN tế bào gà Những mẫu tế bào được kiểm tra đều xuất hiện băng có kích thước 321 bp chứng tỏ ADN gà trong mẫu đạt tiêu chuẩn cho việc kiểm tra bằng PCR.

Như vậy, trong mẫu tế bào sau khi sàng lọc puromycin và được kiểm tra bằng PCR đã xuất hiện băng có kích thước 418 bp của đoạn gen eGFP,

418 bp đó là mẫu của lô TN thu được sau khi đã sàng lọc bằng puromycin Điều này chứng tỏ gen mã hoá cho eGFP đã được chuyển vào genome của tế bào gà. Khi vector transposon đi vào trong tế bào chất, promotor T7 hoạt động tạo ra transposase, protein kháng puromycin và eGFP nhưng hoạt động đó nhanh chóng bị chấm dứt vì khi transposase hoạt động, nó sẽ tác động lên 2 đầu lặp lại ngược chiều và cắt chúng ra khỏi vector Đoạn ADN mang gen eGFP và gen kháng puromycin nằm giữa 2 đầu lặp lại ngược chiều đó sẽ được cài ngẫu nhiên vào tất cả các vị trí có 2 nucleotit TA trên toàn hệ gen và gây tổng hợp thêm 2 nucleotide TA sau khi cài vào ADN genome tế bào theo cơ chế cắt dán điển hình của transposon Đoạn trình tự bị cắt ra nằm giữa 2 đầu IR/DR có chứa promoter T7 nên đoạn gen mã hóa cho transposase không thể hoạt động thêm được nữa Thêm vào đó, phần còn lại của vector sau khi bị cắt sẽ ở dạng mạch thẳng và bị phân hủy nhanh chóng trong tế bào chất [45].