Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định nấm phytophthora infestans trên cây cà chua

HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định nấm Phytophthora infestans trên cây cà

Thành phố Hồ Chí Minh, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC





BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định nấm

Phytophthora infestans trên cây cà chua

Thành phố Hồ Chí Minh, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định nấm

Phytophthora infestans trên cây cà chua

Hướng dẫn khoa học

TS Huỳnh Văn Biết

ThS Trương Quang Toản

Sinh viên Nguyễn Thị Hồng – 21126352

Lê Ngọc Mai Xuân – 21126254 Nguyễn Thị Ngọc Huyền – 21126364

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

Chương 1 Giới thiệu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 1

Chương 2 Tổng quan 2

2.1 Giới thiệu về giống nấm Phytophthora infestans 2

2.1.1 Nấm Phytophthora infestans 2

2.2 Bệnh mốc sương do Phytophthora infestans gây ra ở cây cà chua 4

2.2.1 Bệnh mốc sương 4

2.2.2 Triệu chứng bệnh 4

2.3 Thiết bị và kỹ thuật 5

2.3.1 Kỹ thuật PCR 5

2.3.1.1 Khái niệm 5

2.3.1.2 Nguyên tắc hoạt động 6

2.3.1.3 Cấu tạo máy PCR 6

2.3.2 Máy ly tâm (centrifuge) 7

2.3.2.1 Khái niệm 7

2.3.2.2 Cấu tạo máy ly tâm 8

2.3.3 Kính hiển vi 9

Chương 3 Vật liệu và Phương pháp 10

3.1 Thu thập và phân lập P infestans 10

3.2 Kiểm tra hình thái và huyết thanh học 10

3.3 Phân lập DNA bộ gen 10

3.4 Xác nhận phân tử bằng PCR 11

Chương 4 Kết luận 13

TÀI LIỆU THAM KHẢO 14

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách các cặp mồi được sử dụng để xác nhận phân tử Phytophthora infestans 12

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Hình dạng nấm Phytophthora infestans 2

Hình 2.2: Chu kì sống của Phytophthora infestans 4

Hình 2.3: Bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans 5

Hình 2.4: Máy PCR 7

Hình 2.5: Máy ly tâm 9

Hình 2.6: Cấu tạo kính hiển vi 9

Chương 1 Giới thiệu

1.1 Đặt vấn đề

Tại Việt Nam, cây cà chua được trồng và tiêu thụ phổ biến với diện tích trong những năm gần đây dao động khoảng 23 đến 25 ngàn ha Hiện nay, cây cà chua đang được chú trọng đẩy mạnh ứng dụng công nghệ sinh học để nâng cao năng suất chất lượng sản phẩm, như nghiên cứu chọn tạo giống cà chua lai năng suất cao và chất lượng phù hợp với từng khu vực khác nhau, kháng được các loại sâu bệnh hại Trong đó, bệnh

sương mai gây ra bởi nấm Phytophthora được xem là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm

cho cây do sức tàn phá mãnh liệt của nó Nó gây ra những căn bệnh như: bệnh thối rễ, thối lở cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá, thối trái và đặc biệt nguy hiểm là bệnh mốc sương trên

cà chua Việc phân lập và định danh nấm Phytophthora để tìm ra các phương cách

phòng trừ hữu hiệu là một nhu cầu cấp thiết Hiện nay, người ta chỉ định danh được

khoảng 60 loài Phytophthora chính thức được phân bố trên nhiều ký chủ ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên thế giới Các loài Phytophthora này đặc biệt phát triển mạnh ở

các nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt Nam

Những nghiên cứu về Phytophthora ở Việt Nam chỉ nhằm mục đích phát hiện sự lây lan và phát triển bệnh Mặt khác, do đặc tính của các loài Phytophthora gần giống nhau

và rất biến đổi cho nên các kỹ thuật định danh trước đây (chẳng hạn như kỹ thuật quan sát hình thái) không thể định danh được một số loài Vì thế ngày nay, dựa trên những tiến bộ khoa học kỹ thuật, đặc biệt là những tiến bộ về các kỹ thuật sinh học phân tử ta có thể giải quyết những khó khăn trên Kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với các kỹ thuật như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật sử dụng enzyme cắt, kỹ thuật đọc trình tự, … tác động lên cấu trúc phân tử DNA của các loài nấm từ đó cho phép việc định danh chúng một cách chính xác hơn

1.2 Mục đích

Mục đích của nghiên cứu này là kiểm tra sự bùng phát dịch bệnh P infestans được

phân lập và xác định dựa trên các đặc điểm hình thái, huyết thanh học và xác định PCR đặc hiệu loài

Chương 2 Tổng quan

2.1 Giới thiệu về giống nấm Phytophthora infestans

2.1.1 Nấm Phytophthora infestans

Nấm Phytophthora là sợi nấm không màu, không vách ngăn, đơn bào, kích thước

không đều, túi bào tử có hình trứng và hình quả chanh, trên đầu có núm hoặc không có

núm, không màu, trong suốt Nấm Phytophthora sống trong đất dưới hình thức các sợi

nấm (mycelium) hoặc các bào tử có vách dày gọi là noãn bào tử (oospores), các noãn bào tử tồn tại hàng năm trong đất Nấm tồn tại dưới dạng sợi nấm và lây lan nhờ gió và nước

Nấm P infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes), bộ nấm sương mai

(Peronosporales) lớp nấm này thuộc một giới (Kingdom) khác hẳn với nấm (true fungi), thực vật, động vật và procaryote Một số tác giả cho rằng lớp nấm trứng thuộc về giới Protoctista một số khác thì cho rằng nó thuộc giới Chromista

Nấm có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 4-26°C nhưng tối ưu ở khoảng 16- 20°C,

ẩm độ thích hợp là từ 91-100% Bào tử nấm có kích thước trung bình khoảng 36 x 22

µm - 29 x 19 µm đường kính sợi nấm từ 3,5 - 4,0 µm, khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo có thể đạt kích thước tử 7,0 - 16 µm Trên mô bệnh nấm hình thành các bào tử phân sinh hình ôvan, elip hoặc hình quả chanh yên, bảo từ ngắn, đỉnh bào tử có núm nhỏ, kích thước bào tử khoảng 29 - 36 µm x 19 - 22 µm

Hình 2.1: Hình dạng nấm Phytophthora infestans

2.1.2 Chu kì sống của Phytophthora infestans

Phytophthora infestans sinh sản vô tính (thông qua bào tử và động bào tử) Khi

thời tiết ấm áp, bào tử bám vào mô vật chủ nhạy cảm và trực tiếp nảy mầm để gây nhiễm trùng Tuy nhiên, trong thời tiết ẩm ướt mát mẻ, bào tử tạo ra các bào tử di động có thể lây nhiễm vào các mô của vật chủ Chỉ sau 4-5 ngày có đủ độ ẩm và nhiệt độ vừa phải, một giai đoạn bào tử mới có thể xảy ra tại vị trí nhiễm trùng ban đầu Các bào tử mới sau đó được gió mang đi và bắn nước vào mô thực vật mới, tạo ra các bệnh nhiễm trùng mới Và bệnh lây lan Sự lặp lại liên tục và nhanh chóng của chu kỳ bệnh vô tính này gây ra dịch bệnh mốc sương trên diện rộng và tiến triển nhanh chóng

Hình 2.2: Chu kì sống của Phytophthora infestans

2.2 Bệnh mốc sương do Phytophthora infestans gây ra ở cây cà chua

2.2.1 Bệnh mốc sương

Bệnh mốc sương là mối đe dọa lớn đối với an ninh lương thực toàn cầu, gây thiệt

hại lớn cho cà chua trên toàn thế giới Tác nhân gây bệnh Phytophthora infestans là

lưỡng bội, dị dưỡng và sinh dưỡng Thông thường, bệnh mốc sương được đặc trưng bởi một giai đoạn nhiễm trùng, sau đó là giai đoạn hoại tử trong đó tế bào chủ bị chết

2.2.2 Triệu chứng bệnh

Nấm gây hại trên cà chua tạo ra các triệu chứng đa dạng tuỷ thuộc vào giống và điều kiện thời tiết Trên lá bệnh lúc đầu chỉ là những điểm nhỏ màu xanh tái hình dạng

không đều sau biến thành màu nâu và xanh nhạt vết bệnh không có giới hạn rõ rệt Lúc đầu bệnh thường xuất hiện ở mép lá, cuống lá sau đó lan rộng vào phiến lá tạo thành những đám mô bị thổi nâu, khi trời ẩm ướt mặt dưới lá chỗ có vết bệnh xuất hiện lớp nấm trắng xốp như sương muối đó là đám cảnh bào tử phân sinh và bào tử phân sinh của nấm gây bệnh Còn ở trên thân, bị bệnh từng đoạn dài, vỏ và ruột phần thân thổi ướt màu nâu đen Chỗ bị bệnh nhỏ tóp lại có khi chỉ một phía thân bị thổi Khi ẩm ướt, trên vết bệnh có lớp nấm trắng như sương muối bao phủ khi thời tiết khô vết bệnh tóp lại Cành thân bị bệnh rễ gãy gục làm tán cây xơ xác

Hình 2.3: Bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans

2.3 Thiết bị và kỹ thuật

2.3.1 Kỹ thuật PCR

2.3.1.1 Khái niệm

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa vào các base trình tự Kỹ thuật này thường dùng để xác định mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học PCR bao gồm enzyme khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu Vùng thường được sử dụng để khuếch đại là vùng lập lại không mã hóa ITS (Internal Transcribed Spacer) trong RNA

ribosome, vùng này có giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó có thể xác định mối quan hệ giữa các loài Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao của các loài và các chủng có thể được so sánh PCR rất có giá trị trong việc xác định ở mức độ loài và chủng Nó phù hợp để xác định các nhóm, các chủng đặc biệt

Nguyên lý của kỹ thuật PCR là nhân lên gấp hàng triệu lần một đoạn ADN chọn lọc trong thời gian ngắn trong môi trường in vitro giống như quá trình phân bào

2.3.1.2 Nguyên tắc hoạt động

Phản ứng PCR thường bao gồm các bước thay đổi nhiệt độ và các bước này được lặp lại 25-50 lần Các chu trình này bao gồm 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Ở nhiệt độ vào khoảng 920C, cho phép các axit nucleic ở dạng mạch đôi tách rời nhau thành các mạch đơn;

 Giai đoạn 2: Ở nhiệt độ từ 50-650C, cho phép sự gắn kết của các mồi huỳnh quang với khuôn ADN;

 Giai đoạn 3: Ở nhiệt độ từ 720C, tạo điều kiện cho phản ứng trùng hợp được xúc tác bởi enzyme ADN polymerase

2.3.1.3 Cấu tạo máy PCR

Bộ phận điều khiển bao gồm: màn hình, phím bấm, vi mạch điều khiển, đóng vai trò là bộ phận giao tiếp với người dùng, giúp thiết lập chương trình và điều khiển hoạt động của thiết bị

Nguồn điện gồm: biến áp, cầu chì, tụ điện, điện trở, diot, có thể chuyển đổi đòng điện xoay chiều 220V thành dòng diện một chiều với nhiều mức điện áp khác nhau để cung cấp cho các bộ phận khác nhau của thiết bị

Bộ phận điều khiển điện tử (các bo mạch điện tử) và khối gia nhiệt (hay gọi là Block)

có các lỗ để chứa các ống đựng mẫu Để cho các phản ứng PCR hoạt động đúng, block phải thay đổi nhiệt độ tại thời điểm cụ thể và ổn định nhiệt độ đó trong một khoảng thời gian đã cài đặt Các nhà khoa học (kỹ thuật viên) sẽ thiết lập chu trình nhiệt độ cho máy

PCR bằng máy tính hoặc bảng điều khiển (cảm ứng hoặc phím bấm) trước khi bắt đầu thực hiện phản ứng nhân đôi

Nắp nhiệt bao gồm các bộ phận như điện trở, cảm biến nhiệt, có vai trò gia nhiệt cho phần nắp của tube PCR giúp ngăn cản quá trình bay hơi và ngưng tụ gây hao hụt thể tích phản ứng

Hình 2.4: Máy PCR 2.3.2 Máy ly tâm (centrifuge)

2.3.2.1 Khái niệm

Dùng để phân tách và thu nhận các phần tử trong một dung dịch dựa vào kích thước, hình dạng và tỉ trọng, độ nhớt của dung dịch và tốc độ rotor

Lực ly tâm có tác dụng làm tăng tốc độ lắng của dung dịch khi ly tâm Qúa trình ly tâm

là quá trình phân tách dựa trên kích thước các hạt và mật độ khác nhau giữa pha lỏng

và pha rắn

Lực ly tâm thường tỉ lệ với tốc độ quay của roto với khoảng cách giữa tâm của roto và ống ly tâm Vì vậy, trong một quá trình thực hiện ly tâm, nhiều roto với kích thước khác nhau có thể được sử dụng

2.3.2.2 Cấu tạo máy ly tâm

Cấu tạo máy li tâm gồm bốn phần cơ bản:

 Phần quay bao gồm một động cơ có vận tốc cao, lực ly tâm lớn và hệ thống giảm rung, roto và adapter

 Phần điều khiển: Bao gồm mạch điều khiển giúp người sử dụng cài đặt được tốc độ và thời gian

 Hệ thống cảm biến: Bao gồm cảm biến đóng cửa, cảm biến bất đối xứng, cảm biến quá tải, quá tải dòng và cảm biến roto

 Thùng máy: Là bộ phận đảm bảo quá trình ly tâm được an toàn

Nguyên lý: Bản chất của ly tâm là phân tách các hạt và mật độ khác nhau giữa pha lỏng

và pha rắn dựa trên khối lượng riêng của các hạt trong quá trình ly tâm, phân thành lớp khác nhau nhờ lực ly tâm Thành phần khối lượng riêng lớn nhất sẽ ở xa tâm nhất, còn phần có khối lượng riêng nhỏ sẽ tập trung ở tâm của roto Kết thúc quá trình ly tâm từ một hỗn hợp ban đầu, từng thành phần riêng biệt sẽ được tách ra

Nguyên tắc:

 Sử dụng ống ly tâm có kích thước phù hợp với roto của máy ly tâm

 Đặt các ống cần ly tâm ở vị trí cân bằng về thể tích khối lượng Nếu mẫu của bạn là mâu lẻ thì sử dụng nước làm thêm một ống sao cho đều và cân bằng

 Cần đậy nắp roto trước khi sử dụng máy ly tâm

 Kiểm tra lại các thông số vận hành về thời gian, tốc độ trước khi vận hành máy ly tâm

Hình 2.5: Máy ly tâm 2.3.3 Kính hiển vi

Là một thiết bị phục vụ cho mục đích khoa học dùng để quan sát các vật thể có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không thể quan sát được bằng cách tạo ra các hình ảnh phóng đại của vật thể đó Kính hiển vi có thể gấp độ phóng đại bình thường lên từ

40 - 3000 lần Kỹ thuật quan sát và ghi nhận hình ảnh rõ nét vè chính xác nhất

Hình 2.6: Cấu tạo kính hiển vi

Chương 3 Vật liệu và Phương pháp

3.1 Thu thập và phân lập P infestans

Lá cây cà chua bị nhiễm bệnh được thu thập trong một cuộc khảo sát bệnh mốc sương Các mẫu thu thập được ủ trong 48 giờ ở 18°C Lá non chứa tổn thương được đặt lộn ngược trong đĩa petri chứa môi trường chọn lọc (Rye Agar A) Các đĩa Petri được ủ trong một tuần ở 18°C

Sợi nấm nổi lên từ các lá non sau đó được đồng nuôi cấy trong môi trường Rye Agar A chứa ampicillin ở 18°C

3.2 Kiểm tra hình thái và huyết thanh học

Các đĩa lá chứa chất cấy được cắt bỏ và kiểm tra bằng kính hiển vi để xác định P

infestans

Nhuộm màu xanh Lactophenol được thực hiện và kiểm tra dưới kính hiển vi Sàng lọc

sơ bộ các loài Phytophthora được thực hiện bằng cách sử dụng Phytophthora

Immunostrip đã được chuẩn bị sẵn (Agdia, Hoa Kỳ) Các mô thực vật bị nhiễm bệnh được lấy và chèn vào giữa các lớp lót lưới gần đáy túi chiết mẫu chứa dung dịch đệm SEB1 (Agdia, Mỹ) Các mẫu được chiết bằng cách ngâm kỹ bằng chất đồng nhất mô Agdia cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất có màu xanh lục hoặc nâu nhạt Dải miễn dịch được đưa vào từng mẫu và được phép lưu lại trong dịch chiết mẫu trong 30 phút Que thử được lấy ra để giải thích kết quả

3.3 Phân lập DNA bộ gen

Để xác nhận phân tử, cho vào ống siêu ly tâm 1,5 mL chứa 750 µL dung dịch đệm

ly giải (200 mM Tris-HCl, pH 8,0; 25 mM ethylene diamine tetra acetic acid, EDTA,

pH 8,0; 250 mM NaCl, 0,5% natri dodecyl sulfate), nhỏ khối sợi nấm từ môi trường nuôi cấy non thu thập từ các mẫu ruộng cà chua bị nhiễm bệnh được thêm vào bằng cách sử dụng tăm vô trùng Mô được đồng nhất hóa đúng cách và quay ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút Phần nổi phía trên được chuyển sang một ống ly tâm siêu nhỏ 1,5 mL khác và ly tâm lại như mô tả ở trên Sau khi chuyển phần nổi phía trên sang ống

siêu ly tâm 1,5 mL mới, 500 µl phenol:chloroform:alcohol (25:24:1) được thêm vào và

ly tâm lại Lớp trên được lấy và một thể tích tương đương của isopropyl alcohol được thêm vào

Ống được trộn bằng cách đảo ngược một thời gian ngắn Ống được quay với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút và loại bỏ phần nổi phía trên Hạt DNA thu được được rửa trong 300 µL ethanol 70% Các viên DNA được làm khô trong không khí và hòa tan trong 50 µL nước khử ion

3.4 Xác nhận phân tử bằng PCR

Các mẫu được khuếch đại bằng PCR sử dụng các cặp mồi được mô tả trong (bảng 3.1) Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện trong 10 hỗn hợp phản ứng, chứa 100

ng DNA mẫu, 100pm mỗi mồi thuận và mồi ngược, 2,5 mM dNTP, bộ đệm PCR 1x, 0,2 U Taq polymerase và nước không có nuclease để tạo nên thể tích Quá trình khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt (Sure Cycler 8000, công nghệ Agilent) như sau: một chu kỳ ở 94°C trong 30 giây; 35 chu kỳ biến tính ở 94°C trong 30 giây ủ được tính theo [2(A + T) + 4(G + C)] – 5 °C trong 30 giây (Bảng 3.1) và kéo dài 45 giây ở 72°C, tiếp theo là một chu kỳ kéo dài ở 72°C trong 10 phút Tất cả các quá trình khuếch đại được phân tách trên gel agarose 4%, cùng với thang DNA 300 và 700 bp (MBI Fermentas) Gel được nhuộm trong ethidium bromide (0,5 µg/ml) trong 30 phút