Đang tải... (xem toàn văn)
HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định nấm Phytophthora infestans trên cây cà
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định nấm Phytophthora infestans cà chua Ngành học :CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực :NHĨM Nhóm :THỨ CA 1-2 Niên khóa :2021 - 2025 Thành phố Hồ Chí Minh, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định nấm Phytophthora infestans cà chua Hướng dẫn khoa học Sinh viên TS Huỳnh Văn Biết Nguyễn Thị Hồng – 21126352 ThS Trương Quang Toản Lê Ngọc Mai Xuân – 21126254 Nguyễn Thị Ngọc Huyền – 21126364 Thành phố Hồ Chí Minh, 10/2023 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii Chương Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích Chương Tổng quan 2.1 Giới thiệu giống nấm Phytophthora infestans 2.1.1 Nấm Phytophthora infestans 2.2 Bệnh mốc sương Phytophthora infestans gây cà chua 2.2.1 Bệnh mốc sương 2.2.2 Triệu chứng bệnh 2.3 Thiết bị kỹ thuật 2.3.1 Kỹ thuật PCR 2.3.1.1 Khái niệm 2.3.1.2 Nguyên tắc hoạt động 2.3.1.3 Cấu tạo máy PCR 2.3.2 Máy ly tâm (centrifuge) 2.3.2.1 Khái niệm 2.3.2.2 Cấu tạo máy ly tâm 2.3.3 Kính hiển vi Chương Vật liệu Phương pháp 10 3.1 Thu thập phân lập P infestans 10 3.2 Kiểm tra hình thái huyết học 10 3.3 Phân lập DNA gen 10 3.4 Xác nhận phân tử PCR 11 Chương Kết luận 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO 14 i DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách cặp mồi sử dụng để xác nhận phân tử Phytophthora infestans 12 ii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Hình dạng nấm Phytophthora infestans Hình 2.2: Chu kì sống Phytophthora infestans Hình 2.3: Bệnh mốc sương nấm Phytophthora infestans Hình 2.4: Máy PCR Hình 2.5: Máy ly tâm Hình 2.6: Cấu tạo kính hiển vi iii Chương Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề Tại Việt Nam, cà chua trồng tiêu thụ phổ biến với diện tích năm gần dao động khoảng 23 đến 25 ngàn Hiện nay, cà chua trọng đẩy mạnh ứng dụng công nghệ sinh học để nâng cao suất chất lượng sản phẩm, nghiên cứu chọn tạo giống cà chua lai suất cao chất lượng phù hợp với khu vực khác nhau, kháng loại sâu bệnh hại Trong đó, bệnh sương mai gây nấm Phytophthora xem tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho sức tàn phá mãnh liệt Nó gây bệnh như: bệnh thối rễ, thối lở cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá, thối trái đặc biệt nguy hiểm bệnh mốc sương cà chua Việc phân lập định danh nấm Phytophthora để tìm phương cách phịng trừ hữu hiệu nhu cầu cấp thiết Hiện nay, người ta định danh khoảng 60 lồi Phytophthora thức phân bố nhiều ký chủ nhiều vùng khí hậu khác giới Các lồi Phytophthora đặc biệt phát triển mạnh nước có khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới có Việt Nam Những nghiên cứu Phytophthora Việt Nam nhằm mục đích phát lây lan phát triển bệnh Mặt khác, đặc tính loài Phytophthora gần giống biến đổi kỹ thuật định danh trước (chẳng hạn kỹ thuật quan sát hình thái) khơng thể định danh số lồi Vì ngày nay, dựa tiến khoa học kỹ thuật, đặc biệt tiến kỹ thuật sinh học phân tử ta giải khó khăn Kỹ thuật sinh học phân tử đại với kỹ thuật như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật sử dụng enzyme cắt, kỹ thuật đọc trình tự, … tác động lên cấu trúc phân tử DNA lồi nấm từ cho phép việc định danh chúng cách xác 1.2 Mục đích Mục đích nghiên cứu kiểm tra bùng phát dịch bệnh P infestans phân lập xác định dựa đặc điểm hình thái, huyết học xác định PCR đặc hiệu loài Chương Tổng quan 2.1 Giới thiệu giống nấm Phytophthora infestans 2.1.1 Nấm Phytophthora infestans Nấm Phytophthora sợi nấm khơng màu, khơng vách ngăn, đơn bào, kích thước khơng đều, túi bào tử có hình trứng hình chanh, đầu có núm khơng có núm, khơng màu, suốt Nấm Phytophthora sống đất hình thức sợi nấm (mycelium) bào tử có vách dày gọi noãn bào tử (oospores), noãn bào tử tồn hàng năm đất Nấm tồn dạng sợi nấm lây lan nhờ gió nước Nấm P infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes), nấm sương mai (Peronosporales) lớp nấm thuộc giới (Kingdom) khác hẳn với nấm (true fungi), thực vật, động vật procaryote Một số tác giả cho lớp nấm trứng thuộc giới Protoctista số khác cho thuộc giới Chromista Nấm phát triển khoảng nhiệt độ từ 4-26°C tối ưu khoảng 16- 20°C, ẩm độ thích hợp từ 91-100% Bào tử nấm có kích thước trung bình khoảng 36 x 22 µm - 29 x 19 µm đường kính sợi nấm từ 3,5 - 4,0 µm, ni cấy mơi trường nhân tạo đạt kích thước tử 7,0 - 16 µm Trên mơ bệnh nấm hình thành bào tử phân sinh hình ơvan, elip hình chanh yên, bảo từ ngắn, đỉnh bào tử có núm nhỏ, kích thước bào tử khoảng 29 - 36 µm x 19 - 22 µm Hình 2.1: Hình dạng nấm Phytophthora infestans 2.1.2 Chu kì sống Phytophthora infestans Phytophthora infestans sinh sản vơ tính (thông qua bào tử động bào tử) Khi thời tiết ấm áp, bào tử bám vào mô vật chủ nhạy cảm trực tiếp nảy mầm để gây nhiễm trùng Tuy nhiên, thời tiết ẩm ướt mát mẻ, bào tử tạo bào tử di động lây nhiễm vào mô vật chủ Chỉ sau 4-5 ngày có đủ độ ẩm nhiệt độ vừa phải, giai đoạn bào tử xảy vị trí nhiễm trùng ban đầu Các bào tử sau gió mang bắn nước vào mô thực vật mới, tạo bệnh nhiễm trùng Và bệnh lây lan Sự lặp lại liên tục nhanh chóng chu kỳ bệnh vơ tính gây dịch bệnh mốc sương diện rộng tiến triển nhanh chóng Hình 2.2: Chu kì sống Phytophthora infestans 2.2 Bệnh mốc sương Phytophthora infestans gây cà chua 2.2.1 Bệnh mốc sương Bệnh mốc sương mối đe dọa lớn an ninh lương thực toàn cầu, gây thiệt hại lớn cho cà chua toàn giới Tác nhân gây bệnh Phytophthora infestans lưỡng bội, dị dưỡng sinh dưỡng Thông thường, bệnh mốc sương đặc trưng giai đoạn nhiễm trùng, sau giai đoạn hoại tử tế bào chủ bị chết 2.2.2 Triệu chứng bệnh Nấm gây hại cà chua tạo triệu chứng đa dạng tuỷ thuộc vào giống điều kiện thời tiết Trên bệnh lúc đầu điểm nhỏ màu xanh tái hình dạng khơng sau biến thành màu nâu xanh nhạt vết bệnh khơng có giới hạn rõ rệt Lúc đầu bệnh thường xuất mép lá, cuống sau lan rộng vào phiến tạo thành đám mô bị thổi nâu, trời ẩm ướt mặt chỗ có vết bệnh xuất lớp nấm trắng xốp sương muối đám cảnh bào tử phân sinh bào tử phân sinh nấm gây bệnh Còn thân, bị bệnh đoạn dài, vỏ ruột phần thân thổi ướt màu nâu đen Chỗ bị bệnh nhỏ tóp lại có phía thân bị thổi Khi ẩm ướt, vết bệnh có lớp nấm trắng sương muối bao phủ thời tiết khơ vết bệnh tóp lại Cành thân bị bệnh rễ gãy gục làm tán xơ xác Hình 2.3: Bệnh mốc sương nấm Phytophthora infestans 2.3 Thiết bị kỹ thuật 2.3.1 Kỹ thuật PCR 2.3.1.1 Khái niệm Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa vào base trình tự Kỹ thuật thường dùng để xác định mối quan hệ phát sinh loài loài kỹ thuật ứng dụng rộng rãi nghiên cứu sinh học PCR bao gồm enzyme khuếch đại trình tự DNA đặc hiệu Vùng thường sử dụng để khuếch đại vùng lập lại khơng mã hóa ITS (Internal Transcribed Spacer) RNA ribosome, vùng có giá trị thay đổi loài nấm xác định mối quan hệ lồi Kỹ thuật có giá trị tính tiến hóa mức độ cao lồi chủng so sánh PCR có giá trị việc xác định mức độ loài chủng Nó phù hợp để xác định nhóm, chủng đặc biệt Nguyên lý kỹ thuật PCR nhân lên gấp hàng triệu lần đoạn ADN chọn lọc thời gian ngắn môi trường in vitro giống trình phân bào 2.3.1.2 Nguyên tắc hoạt động Phản ứng PCR thường bao gồm bước thay đổi nhiệt độ bước lặp lại 25-50 lần Các chu trình bao gồm giai đoạn: Giai đoạn 1: Ở nhiệt độ vào khoảng 920C, cho phép axit nucleic dạng mạch đôi tách rời thành mạch đơn; Giai đoạn 2: Ở nhiệt độ từ 50-650C, cho phép gắn kết mồi huỳnh quang với khuôn ADN; Giai đoạn 3: Ở nhiệt độ từ 720C, tạo điều kiện cho phản ứng trùng hợp xúc tác enzyme ADN polymerase 2.3.1.3 Cấu tạo máy PCR Bộ phận điều khiển bao gồm: hình, phím bấm, vi mạch điều khiển, đóng vai trị phận giao tiếp với người dùng, giúp thiết lập chương trình điều khiển hoạt động thiết bị Nguồn điện gồm: biến áp, cầu chì, tụ điện, điện trở, diot, chuyển đổi đòng điện xoay chiều 220V thành dòng diện chiều với nhiều mức điện áp khác để cung cấp cho phận khác thiết bị Bộ phận điều khiển điện tử (các bo mạch điện tử) khối gia nhiệt (hay gọi Block) có lỗ để chứa ống đựng mẫu Để cho phản ứng PCR hoạt động đúng, block phải thay đổi nhiệt độ thời điểm cụ thể ổn định nhiệt độ khoảng thời gian cài đặt Các nhà khoa học (kỹ thuật viên) thiết lập chu trình nhiệt độ cho máy PCR máy tính bảng điều khiển (cảm ứng phím bấm) trước bắt đầu thực phản ứng nhân đôi Nắp nhiệt bao gồm phận điện trở, cảm biến nhiệt, có vai trị gia nhiệt cho phần nắp tube PCR giúp ngăn cản trình bay ngưng tụ gây hao hụt thể tích phản ứng Hình 2.4: Máy PCR 2.3.2 Máy ly tâm (centrifuge) 2.3.2.1 Khái niệm Dùng để phân tách thu nhận phần tử dung dịch dựa vào kích thước, hình dạng tỉ trọng, độ nhớt dung dịch tốc độ rotor Lực ly tâm có tác dụng làm tăng tốc độ lắng dung dịch ly tâm Qúa trình ly tâm q trình phân tách dựa kích thước hạt mật độ khác pha lỏng pha rắn Lực ly tâm thường tỉ lệ với tốc độ quay roto với khoảng cách tâm roto ống ly tâm Vì vậy, q trình thực ly tâm, nhiều roto với kích thước khác sử dụng 2.3.2.2 Cấu tạo máy ly tâm Cấu tạo máy li tâm gồm bốn phần bản: Phần quay bao gồm động có vận tốc cao, lực ly tâm lớn hệ thống giảm rung, roto adapter Phần điều khiển: Bao gồm mạch điều khiển giúp người sử dụng cài đặt tốc độ thời gian Hệ thống cảm biến: Bao gồm cảm biến đóng cửa, cảm biến bất đối xứng, cảm biến tải, tải dòng cảm biến roto Thùng máy: Là phận đảm bảo trình ly tâm an toàn Nguyên lý: Bản chất ly tâm phân tách hạt mật độ khác pha lỏng pha rắn dựa khối lượng riêng hạt trình ly tâm, phân thành lớp khác nhờ lực ly tâm Thành phần khối lượng riêng lớn xa tâm nhất, phần có khối lượng riêng nhỏ tập trung tâm roto Kết thúc trình ly tâm từ hỗn hợp ban đầu, thành phần riêng biệt tách Nguyên tắc: Sử dụng ống ly tâm có kích thước phù hợp với roto máy ly tâm Đặt ống cần ly tâm vị trí cân thể tích khối lượng Nếu mẫu bạn mâu lẻ sử dụng nước làm thêm ống cho cân Cần đậy nắp roto trước sử dụng máy ly tâm Kiểm tra lại thông số vận hành thời gian, tốc độ trước vận hành máy ly tâm Hình 2.5: Máy ly tâm 2.3.3 Kính hiển vi Là thiết bị phục vụ cho mục đích khoa học dùng để quan sát vật thể có kích thước nhỏ bé mà mắt thường khơng thể quan sát cách tạo hình ảnh phóng đại vật thể Kính hiển vi gấp độ phóng đại bình thường lên từ 40 - 3000 lần Kỹ thuật quan sát ghi nhận hình ảnh rõ nét vè xác Hình 2.6: Cấu tạo kính hiển vi Chương Vật liệu Phương pháp 3.1 Thu thập phân lập P infestans Lá cà chua bị nhiễm bệnh thu thập khảo sát bệnh mốc sương Các mẫu thu thập ủ 48 18°C Lá non chứa tổn thương đặt lộn ngược đĩa petri chứa môi trường chọn lọc (Rye Agar A) Các đĩa Petri ủ tuần 18°C Sợi nấm lên từ non sau đồng ni cấy mơi trường Rye Agar A chứa ampicillin 18°C 3.2 Kiểm tra hình thái huyết học Các đĩa chứa chất cấy cắt bỏ kiểm tra kính hiển vi để xác định P infestans Nhuộm màu xanh Lactophenol thực kiểm tra kính hiển vi Sàng lọc sơ loài Phytophthora thực cách sử dụng Phytophthora Immunostrip chuẩn bị sẵn (Agdia, Hoa Kỳ) Các mô thực vật bị nhiễm bệnh lấy chèn vào lớp lót lưới gần đáy túi chiết mẫu chứa dung dịch đệm SEB1 (Agdia, Mỹ) Các mẫu chiết cách ngâm kỹ chất đồng mô Agdia thu dung dịch đồng có màu xanh lục nâu nhạt Dải miễn dịch đưa vào mẫu phép lưu lại dịch chiết mẫu 30 phút Que thử lấy để giải thích kết 3.3 Phân lập DNA gen Để xác nhận phân tử, cho vào ống siêu ly tâm 1,5 mL chứa 750 µL dung dịch đệm ly giải (200 mM Tris-HCl, pH 8,0; 25 mM ethylene diamine tetra acetic acid, EDTA, pH 8,0; 250 mM NaCl, 0,5% natri dodecyl sulfate), nhỏ khối sợi nấm từ môi trường nuôi cấy non thu thập từ mẫu ruộng cà chua bị nhiễm bệnh thêm vào cách sử dụng tăm vơ trùng Mơ đồng hóa cách quay tốc độ 13.000 vòng/phút phút Phần phía chuyển sang ống ly tâm siêu nhỏ 1,5 mL khác ly tâm lại mơ tả Sau chuyển phần phía sang ống 10 siêu ly tâm 1,5 mL mới, 500 µl phenol:chloroform:alcohol (25:24:1) thêm vào ly tâm lại Lớp lấy thể tích tương đương isopropyl alcohol thêm vào Ống trộn cách đảo ngược thời gian ngắn Ống quay với tốc độ 13.000 vòng/phút 10 phút loại bỏ phần phía Hạt DNA thu được rửa 300 µL ethanol 70% Các viên DNA làm khơ khơng khí hịa tan 50 µL nước khử ion 3.4 Xác nhận phân tử PCR Các mẫu khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi mô tả (bảng 3.1) Phản ứng khuếch đại PCR thực 10 hỗn hợp phản ứng, chứa 100 ng DNA mẫu, 100pm mồi thuận mồi ngược, 2,5 mM dNTP, đệm PCR 1x, 0,2 U Taq polymerase nước nuclease để tạo nên thể tích Q trình khuếch đại thực máy luân nhiệt (Sure Cycler 8000, công nghệ Agilent) sau: chu kỳ 94°C 30 giây; 35 chu kỳ biến tính 94°C 30 giây ủ tính theo [2(A + T) + 4(G + C)] – °C 30 giây (Bảng 3.1) kéo dài 45 giây 72°C, chu kỳ kéo dài 72°C 10 phút Tất trình khuếch đại phân tách gel agarose 4%, với thang DNA 300 700 bp (MBI Fermentas) Gel nhuộm ethidium bromide (0,5 µg/ml) 30 phút 11 Bảng 3.1 Danh sách cặp mồi sử dụng để xác nhận phân tử Phytophthora infestans Primer ID Primer Sequence (5’-3’) AE-7-1 GCC GCC GAC ATA TTG AAT AE-7-2 CAA ATC TGC GAA CGA GAC AT O-8-1 AAG ATG ATG TTG GAT GAT TG O-8-2 TGC CTG ATT TCT ACC TTC T INF-F TGG GCG AGC CCT ATC AAA A INF-R CCG ATT CAA ATG CCA AGC TAA ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC Amplicon size (bp) Ta (°C) Reference 171 50 Judelson and Tooley 245 50 Judelson and Tooley 613 50 Hussain8 , et al 612 50 Hussain8 , et al Nguồn: doi: https://doi.org/10.14429/dlsj.3.11491 12 Chương Kết luận Sự xuất bào tử hình chanh dấu hiệu sớm P infestans Kiểm tra kính hiển vi kết hợp với đánh giá huyết học thử nghiệm xác nhận Việc lựa chọn mồi nghiên cứu để nhận dạng phân tử chứng minh quy trình rõ ràng để xác định P infestans sử dụng cách tin cậy để xác định mầm bệnh PCR kỹ thuật đáng tin cậy thử nghiệm theo thời gian, đảm bảo loại bỏ kết dương tính giả Việc xác định nấm Phytophthora infestans cà chua bước tiến quan quan trọng việc phòng chống bệnh sương mai diễn Nhờ kĩ thuật PCR mà ta nhanh chóng, tìm xác loại nấm gây bệnh Đây khởi đầu cho thành công để tạo sản phẩm giống có khả kháng nấm Phytophthora infestans gây hại cho trồng 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ivanov, A A., Ukladov, E O., & Golubeva, T S (2021) Phytophthora infestans: An Overview of Methods and Attempts to Combat Late Blight Journal of fungi (Basel, Switzerland), 7(12), 1071 https://doi.org/10.3390/jof7121071 Khalid, H., Grover, A., & Dwivedi, S (2017) PCR-based Methods for Identification and Detection of Phytophthora infestans in Infected Leaves of Tomato Defence Life Science Journal, 3(1), 41-44 https://doi.org/10.14429/dlsj.3.11491 Minh, Nguyễn Huỳnh Hoàng Định danh nấm Phytophthora spp kỹ thuật sinh học phân tử: Luận văn Kỹ sư Diss Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh,2017 Chi, Trần Yến Nghiên cứu nam phytophthora infestans gây bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tây vụ đông xuân năm 2008-2009 số tỉnh phía bắc việt nam: Luận văn ThS Diss Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2009 14