Kỹ thuật sinh học phân tử

Sinh học phân tử_Nhóm 11 Bài 9: KỸ THUẬT PHÂN TỬ Các phương pháp tách chiết nucleic acid: 1.1 Tách chiết DNA: • Để thu nhận DNA tinh cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng protein • Sự tách chiết DNA dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/nước) • Mục đích: thu phân tử nucleic acid trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy tác nhân học hay hóa học • Các nucleic acid cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào (DNase RNase) • Sau cơng đoạn tách chiết, nucleic acid tinh nằm thể tích dung dịch lớn Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dạng cặn tủa dễ bảo quản cần hịa lại nước theo nồng độ mong muốn - Quy trình: Bước Phá màng tế bào màng nhân, giải phóng DNA phân hủy protein liên kết với DNA Tế bào, mô nghiền hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl) proteinase (proteinase K, lysozyme) • Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô hỗn hợp chất tẩy (SDS) proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA mơi trường đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA • Chất tẩy phân tử lưỡng cực, kết hợp với protein màng phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng • Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy khơng ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ Bước Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu (protein, polysaccharide, lipid, RNA) Sử dụng phenol:chloroform làm biến tính protein Loại protein: lắc mẫu dung dịch phenol:chloroform để biến tính protein đồng thời khơng hịa tan nucleic acid Protein bị biến tính khơng hịa tan pha nước có chứa nucleic acid sau ly tâm tủa thành lớp nằm pha nước pha phenol:chloroform Thu hồi nucleic acid pha nước Bước Nucleic acid kết tủa ethanol (tỉ lệ 2:1) hay isopropanol (tỉ lệ 1:1) kết hợp nồng độ muối cao, sau thu nhận cách ly tâm Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi phân hủy enzyme cần hịa lại nước theo nồng độ mong muốn Có thể tủa ethanol isopropanol Sau li tâm để thu nhận lại nucleic acid Cặn tủa rửa ethanol 70% để loại bỏ muối dấu vết isopropanol Sinh học phân tử_Nhóm 11 1.2 Tách chiết RNA: Phương pháp tách chiết RNA toàn phần gồm bước phương pháp tách chiết DNA • Tế bào, mô nghiền dung dịch gồm chất tẩy mạnh, tác nhân gây biến tính protein mạnh (guanidinium thiocyanate), chất khử (β-mercapto ethanol) • Các protein loại bỏ khỏi mẫu qua xử lí phenol:chloroform li tâm • RNA hịa tan nước tủa ethanol thu nhận thông qua li tâm PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT mRNA • mRNA chiếm 1-5% RNA tổng số tế bào với điểm chung cấu trúc polyA • Dựa vào liên kết bổ sung T-A, cột oligo dT-cellulose sử dụng để tách mRNA khỏi mẫu RNA tổng số (hình bên) • mRNA tinh kỹ thuật siêu li tâm, sắc kí hay điện di Sinh học phân tử_Nhóm 11 Sinh học phân tử_Nhóm 11 Các phương pháp phân tích định tính định lượng thơ nucleic acid: 2.2 Phương pháp định lượng quang phổ (Spectrophotometer) - Phương pháp cho phép ước lượng tương đối nồng độ acid nucleic, protein, tế bào dung dịch - Nguyên tắc phương pháp dựa hấp thu ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm (OD260) phân tử acid nucleic - Một dung dịch acid nucleic tinh thường có tỉ số OD260/OD280 khoảng 1,8-2 - đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ DNA sợi đôi 50μg/ml dung dịch RNA hayg/ml dung dịch RNA hay DNA sợi đơn 40μg/ml dung dịch RNA hayg/ml 2.2 Phương pháp điện di - Được sử dụng phân tích định tính thu nhận mẫu acid nucleic - Nguyên tắc phương pháp dựa vào đặc tính cấu trúc tích điện phân tử Dưới tác động điện trường, phân tử tích điện âm di chuyển cực dương - Tính linh động phân tử phụ thuộc vào khối lượng phân tử chất điện di nồng độ chất cấu thành gel - Việc lựa chọn gel, nồng độ gel phụ thuộc vào kích thước phân tử cần phân tách - Nồng độ gel điện di phương nằm ngang Sinh học phân tử_Nhóm 11 2.3 Điện di với gel agarose - Gel agarose loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tách nucleic acid có kích thước từ 0,5 – 20 kb - Gel chuẩn bị giá thể nằm ngang điện di thực theo phương nằm ngang - Sự di chuyển nucleic acid gel đánh dấu chất nhuộm mẫu (sample loading dye) - Kết điện di quan sát tia UV sau nhuộm gel với ethidium bromide (EtBr) Kích thước mẫu điện di xác định dựa vào “thang chuẩn” hay “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (Molecular weight marker) Sinh học phân tử_Nhóm 11 A Điện di thực theo phương nằm ngang B Gel sau điện di nhuộm EtBr quan sát tia UV; phân tử EtBr xen vào base khiến phân tử DNA phát quang chiếu tia UV 2.4 Điện di với gel polyacrylamide: Sinh học phân tử_Nhóm 11 - Gel polyacrylamide dùng để tách đoạn acid nucleic có kích thước 100bp protein - Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp nhiều so với gel agarose - Điện di thực theo phương đứng - Các ứng dụng chủ yếu: + Tinh oligonucleotide tổng hợp + Xác định trình tự đoạn DNA + Tách đoạn DNA nhỏ, có chiều dài 500 bp Sinh học phân tử_Nhóm 11 Điện di gel polyacrylamide (PAGE) A Gel chuẩn bị hai kính hay nhựa theo phương thẳng đứng B Mẫu phân tách dựa vào kích thước nhuộm để quan sát Sinh học phân tử_Nhóm 11 Kỹ thuật PCR: Kỹ thuật PCR (viết tắt Polymerase chain reaction) phương pháp sử dụng rộng rãi xét nghiệm DNA sinh học phân tử để tạo nhiều trình tự DNA cụ thể Thông qua PCR, đoạn DNA với lượng nhỏ (chỉ vài nanogram) khuếch đại theo cấp số nhận để tạo hàng triệu đoạn trình tự DNA PCR kỹ thuật quan trọng thường thiếu quy trình nghiên cứu phịng thí nghiệm sinh học phân tử, y sinh, khoa học hình sự, pháp y xét nghiệm DNA PCR phát minh TS Kary Mullis vào năm 1983 Vào thời điểm đó, ơng làm việc Cetus Corporation, công ty công nghệ sinh học Cơng trình Kary Mullis vinh dự nhận giải Nobel Hóa học vào năm 1993 với Michael Smith 3.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR PCR dựa việc sử dụng khả enzyme DNA polymerase để tổng hợp chuỗi ADN từ chuỗi ADN ban đầu cung cấp Bởi DNA polymerase thêm nucleotide vào nhóm ′-OH có từ trước, nên-OH có từ trước, nên enzyme cần đoạn ADN mồi để thêm nucleotide Sinh học phân tử_Nhóm 11 Yêu cầu cho phép phân định vùng cụ thể chuỗi mẫu mà nhà nghiên cứu muốn khuếch đại Khi kết thúc phản ứng PCR, trình tự cụ thể tích lũy thành hàng tỷ đoạn trình tự ADN ban đầu 3.2 Thành phần phản ứng PCR thường bao gồm: (1) Dung dịch ADN mẫu (DNA template) chứa đoạn ADN cụ thể tinh để nhân (2) Primers: đoạn ADN mồi, thường có độ dài vài chục Kb, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu điểm kết thục đoạn ADN mẫu (3) DNA polymerase: enzyme có nhiệm vụ tổng hợp đoạn ADN trình tự ADN ban đầu Enzyme có khả chịu nhiệt cao thường sử dụng PCR Taq polymerase (4) Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm loại (A, T, G, C) –> thành phần bản, xem “viên gạch” cấu tạo nên cấu trúc ADN –> DNA polymerase sử dụng dNTPs để tổng hợp nên trình tự ADN (5) Dung dịch đệm (buffer solution): cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase (6) Ống PCR (PCR tube): dụng cụ plastic chuyên dụng dùng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước cho vào thiết bị thực PCR (Thermal cycler) 3.3 Phản ứng PCR thực chu kỳ nhiệt gồm bước chính: Sinh học phân tử_Nhóm 11 (1) Initialization: hỗn hợp dung dịch PCR gia nhiệt lên đến 94–98°C thời gian 1-10 phút để làm nóng (2) Denaturation: đoạn trình tự ADN sợi đơi làm nóng phân tách thành sợi ADN đơn, tạo khn cho q trình nhân (3) Annealing: đoạn mồi bám vào sợi ADN khuôn vị trí khởi đầu để bắt đầu q trình tổng hợp sợi ADN (4) Extension/elongation: enzyme Taq polymerase tham gia hoạt động tổng hợp cách sử dụng dNTPs để gắn lại với tạo thành chuỗi bổ sung (5) Final elongation: sau trải qua vòng lặp chu trình nhiệt (25-40 vịng tùy theo thí nghiệm), phản ứng PCR tiếp tục trì nhiệt độ 70–74 °C thời gian 5-10 phút để đảm bảo toàn sợi ADN đơn kéo dài hoàn toàn Ở thời điểm này, số lượng ADN trình tự ADN ban đầu đạt đến số 230, or 1073741824 (6) Final hold: toàn khay phản ứng PCR làm mát nhiệt độ 4–15 °C khoảng thời gian khơng xác định xem giai đoạn lưu trữ ngắn hạn sản phẩm phản ứng PCR Quy trình kỹ thuật PCR thường sử dụng thành phần trải qua bước nêu Mặc dù vậy, thực tế triển khai không đơn lấy thành phần trộn với ống PCR cho vào máy chạy có hàng triệu đoạn trình tự ADN ban đầu mong muốn Trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử, đặc biệt phòng xét nghiệm ADN, phản ứng PCR cần tối ưu hóa theo tiêu chí cơng việc để nhân trình tự ADN mong muốn với độ tin cậy cao 3.4 Kỹ thuật PCR ứng dụng Trong quãng thời gian 30 năm kể từ PCR sử dụng lần đầu tiên, kỹ thuật tác động mạnh mẽ đến lĩnh vực chuyên ngành liên quan đến Khoa học sống Y Sinh học Kỹ thuật PCR giúp làm thay đổi cách thức nghiên cứu nâng cao suất làm việc chuyên ngành từ pháp y, an tồn thực phẩm, chẩn đốn lâm sàng nghiên cứu hệ gen (genomics) Trên thực tế, kỹ thuật PCR trở nên phổ biến, tưởng tượng mà nghĩ Thuật ngữ “PCR” từ Từ điển đại học Merriam-Webster Trong lĩnh vực xét nghiệm ADN, kỹ thuật PCR sử dụng để nhân đoạn ADN tách từ đứa trẻ người cha nghi vấn Ở bước tiếp theo, sản phẩm PCR dùng để phân tích hệ thống giải trình tự gene hệ Sinh học phân tử_Nhóm 11 Sinh học phân tử_Nhóm 11 Các phương pháp xác định trình tự nucleic acid: 4.1 Ngun tắc chung: • Hình thành tập hợp nhiều oligonucleotide với chiều dài khác • Các trình tự phân tách dựa vào kích thước phương pháp điện di gel polyacrylamide • Kết đọc phóng xạ tự ghi máy dò tự động 4.2 Phương pháp Maxam – Gilbert Lịch sử • Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học Lần cơng bố vào năm 1977 • Nguyên tắc phương pháp dựa phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác • Trước hết, phân tử DNA đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’ mạch đơn, tạo đoạn đánh dấu phát hình phóng xạ • Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng loại nucleotide mạch DNA đánh dấu phóng xạ, tạo đoạn oligonucleotide có chiều dài nucleotide phát điện di Kết phản ứng hóa học xử lí mạch DNA phát điện di gel polyacriamide xác định trình tự mạch đơn Dựa vào thuỷ giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự phương pháp hố học • Phân tử DNA đánh dấu 32P đầu chia thành phân đoạn • Mỗi phân đoạn xử lý hoá học chuyên biệt, làm biến đổi loại nucleotide đặc trưng cắt phân tử DNA nucleotide • Năm nhóm nucleotide bị tác động là: G, A, C, G+A, T+C • Các phân đoạn phân tách gel polyacrylamide • Vị trí kích thước oligonucleotide gel xác định nhờ đầu đánh dấu phóng xạ • Kết đọc phóng xạ tự ghi Mạch đơn đánh dấu phóng xạ xử lí theo nhóm phản ứng - Nhóm phản ứng thứ xử lý mạch đơn DNA dimethyl sulphate làm đứt mạch G - Nhóm phản ứng thứ hai xử lý mạch đơn DNA axit (pH=2) gây đứt mạch đơn A G - Nhóm phản ứng thứ ba xử lý mạch đơn DNA hydrazine gây đứt mạch đơn T C - Nhóm phản ứng thứ xử lý mạch đơn DNA hydrazine với nồng độ muối (NaCl) cao làm đứt mạch đơn C Vị trí kích thước oligonucleotide gel xác định nhờ đầu đánh dấu phóng xạ (32P) Sinh học phân tử_Nhóm 11 Sinh học phân tử_Nhóm 11 Oligonucleotides phân tử DNA RNA ngắn, tạo thành từ kết nối nhiều tiểu phân tử nucleotide Ví dụ, oligonucleotide chứa nucleotide gọi hexamer 32P phosphate đầu 5’ DNA loại bỏ akaline phosphatese enzyme sau dùng enzyme polinucleotide kinase radiolabeled [γ-γ-32P] ATP sau radio label 32P chuyển vào đầu 5’ 4.3 Phương pháp dideoxynucleotide Sanger Sinh học phân tử_Nhóm 11 Ngun lý: Sanger, Smith Coulson cơng bố vào năm 1977, dựa theo chế tổng hợp DNA Đã giải trình tự hồn chỉnh gen thực khuẩn thể ΦX 174X 174 Trong trình tổng hợp mạch đơn DNA bổ sung hàm lượng nhỏ dideoxynucleotide (ddNTP) Do ddNTP nhóm OH (carbon số 3) ngẫu nhiên làm cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại Dựa vào tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự DNA cần xác định trình tự nhờ enzyme DNA polymerase • Sử dụng loại nucleotide thơng thường loại dideoxynucleotide (ddNTP) có nhóm 3’OH thay H • Trình tự DNA cần xác định phải tạo dòng vector mạch đơn (phage M13) • Thành phần phản ứng gồm: DNA pol, mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt phage M13, loại nucleotide (1 loại đánh dấu đồng vị phóng xạ 35S) loại ddNTP • Khi dNTP sử dụng phản ứng tổng hợp, phản ứng dừng lại Giải trình tự máy tự động (Sequencer) • Theo ngun tắc sử dụng dNTP Sanger cộng phát minh • Trong q trình tổng hợp DNA sử dụng mồi dNTP đánh dấu huỳnh quang, loại dNTP có màu khác • Máy tổng hợp mạch đơn mạch khuôn, dùng phần mềm để xử lý kết Sinh học phân tử_Nhóm 11 Các phương pháp lai phân tử: 5.1 Nhiệt độ nóng chảy (Tm) DNA Các nhân tố ảnh hưởng đến Tm - Thành phần base - Độ dài - Ảnh hưởng điểm bắt cặp sai lệch - Ảnh hưởng môi trường phản ứng (nồng độ muối formamide) Tm = 16,6 log[γ-M] + 0,41 (%GC) + 81,5 - % mismatch – 675/chiều dài (cặp base) – 0,65 (% formamide) 5.2 Khái niệm lai phân tử Hai mạch đơn phân tử DNA tách thành sợi đơn tác động nhiệt độ Nếu nhiệt độ phản ứng giảm từ từ điều kiện thích hợp, hai mạch bắt cặp trở lại Hiện tượng gọi lai phân tử 5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử • Nồng độ DNA thời gian phản ứng Sinh học phân tử_Nhóm 11 Được xem xét đồng thời, tích số nồng độ (concentration) thời gian gọi Cot Cot1/2 giá trị có 50% số phân tử lai • Nhiệt độ Tốc độ phản ứng lai cực đại nhiệt độ thấp Tm phân tử khoảng 25% • Độ dài trình tự Tốc độ lai tỉ lệ thuận với bình phương độ dài trình tự bổ sung • Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ – 10 lần Sinh học phân tử_Nhóm 11 https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.bio-active.co.th%2Fproduct %2Faccuprep-plant-genomic-dna-extraction-kit-100-extractions%2F%3Flang %3Den&psig=AOvVaw0BcSKlZDJuMcSoMcKQn9pt&ust=1683553722799000&source=images &cd=vfe&ved=0CBMQjhxqFwoTCICvzL-s4_4CFQAAAAAdAAAAABAF https://www2.hcmuaf.edu.vn/data/nhtri/Chuong%208%20Cac%20ky%20thuat%20phan %20tich%20trong%20sinh%20hoc%20phan%20tu(3).pdf https://r.search.yahoo.com/ _ylt=Awrx.2enO1dki4I9pJBrUwx.;_ylu=Y29sbwNzZzMEcG9zAzMEdnRpZAMEc2VjA3Ny/RV=2/ RE=1683467304/RO=10/RU=https%3a%2f%2fwww.xetnghiemadnchacon.com%2fky-thuatpcr%2f/RK=2/RS=0pKsce2ruDLVl_7iUHU0DWgEW9ohttp://ibsgacademic.com/oligonucleotides-07-2017/ https://drive.google.com/drive/u/0/folders/1v-g2KG0vkDyxL7ikltD0Fc2YgzlwCmXZ https://www.youtube.com/watch?v=lRMeiVbOgiA https://www.youtube.com/watch?v=cl2s-ZMmcbc