Kỹ thuật sinh học phân tử và bệnh viêm não xốp ở bò

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****** BÀI TIỂU LUẬN KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ BỆNH VIÊM NÃO XỐP Ở BÒ (BOVINE SPONGIFORM ENCEPHOLOPATHY) GVHD: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Trịnh Thị Huyền Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC I/ ĐẶT VẤN ĐỀ II, TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bệnh viêm não xốp 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Sự lưu hành 2.1.3 Tác nhân gây bệnh 2.2 Các đặc điểm dịch tễ 12 2.2.1 Ổ chứa mầm bệnh 12 2.2.2 Bệnh lý 12 2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định bệnh viêm não xốp bò 15 III/ KẾT LUẬN 20 IV/ TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I/ ĐẶT VẤN ĐỀ Thời gian gần bệnh bò điên gây tổn thất lớn nông nghiệp nước gây nên xáo trộn đời sống người Những bò bị điên, húc đầu vào tường, không tự chủ thao tác hoạt động thân chết Trên hình giải phẫu bệnh não có lỗ thủng lỗ chỗ (nên tả não thể xốp).Vì người ta gọi bệnh xốp não bò (Bovine Spongiform Encephalopathy - BSE) hay gọi bệnh bò điên (Mad Cow desease) Thể bệnh giống với nhiều bệnh khác có triệu chứng cách truyền bệnh, bao gồm : bệnh gãi cừu, bệnh xốp não chồn, bệnh kuru người (xốp não tìm thấy tộc Papua New guine), bệnh CJD (Creutzfeldt- Jakob Disease) người Những động vật bị bệnh có biểu khả phối hợp động tác, điều khiển chân, run, sợ hãi ngứa với cường độ mạnh Đôi bệnh thể triệu chứng ngủ gà triệu chứng kích động Thời gian ủ bệnh kể từ nhiễm đến phát bệnh thường lâu, nhiều năm Nhưng bệnh phát vật chết sau tháng Có nhiều chứng khả bệnh bò điên lây sang người, gây bệnh tiến triển chậm tác hại đến hệ thần kinh, làm xốp não dẫn đến chết Điều khiến dư luận giới lo ngại nhiều nước cấm việc nhập bò sống sản phẩm bị có xuất xứ từ nước Anh Còn nhiều điểm bệnh chưa biết rõ, trình nghiên cứu Nước Anh nhiều nước khác áp dụng biện pháp chống dịch nghiêm ngặt nên bệnh khống chế Hiện Việt Nam chưa phát thấy bệnh này, phủ Bộ NN &PTNT có nhiều văn quy định hạn chế việc nhập bò sản phẩm bị từ nước có bệnh Tuy nhiên, vận động sôi động kinh tế thị trường người cần cảnh giác để đề phịng bệnh bị điên khơng xảy Việt Nam LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II, TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bệnh viêm não xốp 2.1.1 Nguồn gốc Năm 1732, nhà khoa học thú y nước Anh quan sát thấy dạng bệnh bí hiểm xảy với cừu Tên bệnh - Scrapie - tiếng Anh có nghĩa ngứa, gãi, xuất phát từ đặc điểm vật lâm bệnh ngứa ngáy dụi mõm xuống đất Kết khám nghiệm tử thi cho thấy, toàn não bị biến dạng đến mức nhận – nhìn giống nắm bọt biển Cừu đứng khơng vững, co rụt thân thể, sau gầy dần chết sau vài tuần.Bệnh chưa quan tâm ngăn ngừa tận năm 1936, nhà nghiên cứu Pháp cho thấy bệnh truyền từ ốm sang khoẻ tiêm dịch nghiền não cừu bệnh vào cừu khoẻ Từ nhà khoa học tập trung nghiên cứu bệnh Sau tháng tiêm , cừu mắc bệnh trang trại cừu lớn năm tuổi biểu bệnh Con vật trạng thái bị kích thích, hưng phấn khơng nghỉ, ln ln muốn gãi, đánh nhau, cọ sát làm rụng lông (do có tên bệnh gãi cừu); giảm thể trọng, ốm yếu, cân giác quan, cuối chết Chỉ có số đàn có biểu gãi thường khoảng 10 đàn cách lây lan bệnh tự nhiên đến chưa rõ Họ chứng minh bệnh truyền nhiễm qua mắc bệnh trực tiếp gây tác nhân mà trước bệnh xem di truyền Năm 1920: bệnh CJD (Creutzfeldt – Jakob) mơ tả lần Anh, có bệnh nhân chết với triệu chứng tâm thần nên người ta gọi dạng bệnh bò điên người Bệnh thường xảy người cao tuổi nên ý Tuổi biểu trung bình 56 tuổi có trường hợp người bệnh nằm lứa tuổi 1829 Những biểu bệnh thay đổi giấc ngủ ăn Sau vài tuần xuất biểu thần kinh Cơn bệnh thần kinh xuất số 20% trường hợp bệnh Phần lớn người bị bệnh rung co cứng cơ, chức não tập tính bình thường Tiến triển bệnh phá hoại đại LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com não chức đại não, giảm hoạt động thần kinh, cảm giác dần chức nhìn, bệnh nhân chết, 90% bệnh nhân chết sau năm, 5% sau năm 5% kéo dài đến 10 năm Nhưng từ năm 1990, bệnh xảy người trẻ tuổi ngày nhiều Đến cuối năm 2000 có tới 80 người Anh người Pháp chết ăn phải thịt bò điên hệ thống thần kinh trung ương bị thối hóa kéo dài từ tuần đến tháng với triệu chứng trạng thái cân , trí nhớ, dẫn đến liệt chân tay.CJD dễ nhầm với bệnh Alzheimer, bệnh lú lẫn người cao tuổi Trí nhớ người bệnh bị giảm sút nhanh chóng, khả nhận biết ngày kém, tiến tới quên hết chuyện khả nhận biết Bệnh Alzheimer xảy người cao tuổi, diễn biến kéo dài nhiều năm bệnh CJD thời gian bộc lộ triệu chứng kéo dài vài tháng Thời gian ủ bệnh CJD dài, 15- 25 năm, bệnh phát, 4- 10 tháng sau bệnh nhân chết khơng có thuốc chữa Năm 1947, phát bệnh xốp não chồn TME với chết khơng bình thường chồn Wiscosin (Mỹ), Canada, Phần lan Phần lớn chồn bị chết sau có dấu hiệu thần kinh ngắn Thời gian nung bệnh thường tháng, chúng sống tách biệt tách biệt động vật khác nên đường truyền bệnh thức ăn Đánh ăn thịt non nguyên nhân truyền lây Năm 1956 phát bệnh Kuru người Kuru bệnh xuất tộc Fore New Guinea Ở tập tục ăn thịt người chết tiến hành tận khoảng năm 1956 Bệnh xảy phần lớn phụ nữ trẻ em hai giới ăn phải mơ bệnh óc người chết tộc Đàn ơng bị nhiễm bệnh họ ăn phần thịt Căn bệnh gây khả điều vận tiểu não dẫn tới khơng có khả phối hợp động tác vận động, suy giảm trí nhớ, run rẩy chân tay, dần chức dẫn truyền vỏ não Phần lớn bệnh nhân kuru chết khơng có dấu hiệu điên LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com dấu hiệu bệnh kuru CJD Bệnh nhân với thời gian ủ bệnh dài xuất triệu chứng chậm thường chết tác động đột ngột bên não liên quan đến tuỷ sống sau thay với triệu trứng bệnh lý vòng 12 tháng Năm 1986, Jeffrey Wells phát loại bệnh bò hoang Anh Năm 1987, Wells cộng phát mô tả loại bệnh tương tự bò sữa, gọi bệnh bò điên (Mad cow) Về sau đặc điểm tổ chức tế bào bệnh, tác giả đặt tên cho bệnh “ Bệnh viêm não thể xốp bò ( Bovine Spongiform Encephalopathy - BSE) Cũng bệnh tương tự cừu gây bệnh ngứa gãi, chồn gây bệnh viêm não tủy truyền nhiễm TME, người gây bệnh Creutfeldf Jacob Kuru người ta chưa hiểu biết rõ ràng đầy đủ bệnh Tuy nhiên bệnh kể trên, kể BSE, theo Frazen (1988) chứng minh dùng mô não động vật bị bệnh tiêm truyền cho vật khỏe mạnh gây bệnh 2.1.2 Sự lưu hành Bệnh bò điên bắt nguồn từ nước Anh vào năm 80 kỷ 20 Bệnh phát nhiều nơi kéo dài sang năm 90 với 160.000 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ca mắc bệnh khoảng 30.000 đàn bò Hầu hết trường hợp bệnh giống bị sữa Holstein/ Friesian Sau số nước thơng báo có bệnh: Thụy Sỹ 205 trường hợp, Ailen 12 con, Bồ Đào Nha 30 Các trường hợp có bệnh lẻ tẻ Pháp, Đức, Italia, Đan Mạch, Canada, Oman quần đảo Falkland Trong số nước có bệnh, nhiều trường hợp nhập bị có bệnh từ nước Anh 2.1.3 Tác nhân gây bệnh Trong trình nhận diện tác nhân gây bệnh, cách để làm biến đổi acid nucleic không ảnh hưởng đến mức độ nhiễm , ngược lại q trình làm biến tính protein làm giảm mức nhiễm Điều chứng tỏ tác nhân gây bệnh thành phần protein Giả thuyết “chỉ protein” đặt Griffith (1967) sau phát triển Prusiner cộng ( 1982, 1999) sau 15 năm Stomley Prusimerr dùng chất chiết xuất từ não cừu bị bệnh, phá huỷ axit nucleic (đồng thời AND ARN) mà không làm khả gây bệnh chất chiết tiêm chất chiết sang não động vật khác Ngược lại phá LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com huỷ Protein chất chiết khả gây bệnh khơng cịn S.Prusiner cho tác nhân gây bệnh có chất Protein ơng đặt tên Prion (proteinaceous infection particle) Xác định chuỗi protein gây bệnh cho thấy giống hệt cấu trúc protein PrPc, đặt tên PrPsc Normal and diseased prions PrPc protein với cấu trúc khoảng 253 ạcid amin người 250 acid amin lồi hữu nhũ khác Nó kiểm soát gene nhiễm sắc thể số chuột nhiễm sắc thể số 20 người Gene chứa exon, exon thứ mã hóa tồn trình tự protein Nó bảo tồn loài vật Ở vật khoẻ phần glucide prion protein gắn vào màng tế bào liên kết cộng hoá trị với chuỗi phospholipid Ở bệnh gãi cừu protein prion nằm màng tế bào có hình dạng cáu trúc khác hẳn Sự thay đổi làm protein chịu nhiệt, kháng với loại enzim phân huỷ protein, tia tử ngoại, 135OC 18 phút, dùng proteinase K (1 loại enzyme phân huỷ protein cực mạnh) bị cắt làm tiểu phần 27-30 KĐ (Kilodalton- đơn vị đo khối lượng protein =1 đơn vị oxy) Protein Prion người mắc bệnh GSS (Gerstmann - Strauxler Scheinker) axit amin proline thay Leucine vị trí 102 Nghiên cứu cấu trúc prion, người ta chia phần, phần 100 acid amin đầu carboxyl gắp lại gồm chuỗi xoắn anpha chuỗi đối song gấp nếp beta , 100 acid amin đầu amino có cấu trúc tổ chức ngẫu nhiên Nghiên cứu quang phổ cho thấy PrPc chủ yếu có cấu trúc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com xoắn alpha PrPsc có chủ yếu cấu trúc xoắn beta giảm cấu trúc alpha Như có chuyển đổi từ cấu trúc alpha sang cấu trúc beta tạo PrPsc Đầu kỵ nước PrPc có lẽ tham gia vào việc chuyển đổi từ alpha sang beta Gen cấu trúc protein prion giống hệt người, khỉ, chuột nhắt, chuột cống, chuột hang, chồn, bò gà Vùng khởi đầu, giải mã gen bao gồm 253 codon người 257 codon chồn Vai trò PrPc chưa hiểu rõ Cắt bỏ gene mã hóa PrPc chuột (gen Prnp) không ảnh hưởng tăng trưởng thú, ngoại trừ có trí nhớ có vấn đề giấc ngủ Chuột thiếu PrP0/0 ( chuột thiếu PrPc) đề kháng với prion không thấy dấu vết nhiễm prion não chúng Điều PrPc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thụ thể tiếp nhận prion Một prion bệnh nhuộm màu (đỏ) đưa vào qua đường tiêu hóa tự phát Một prion nội sinh thể (màu xanh) vào tương tác với prion bệnh, chúng ép sát vào để thay đổi hình dạng chúng thành prion bị bệnh Cuối prion bệnh ngày tăng chuyển đổi từ prion bình thường sang prion bệnh, gây thiệt hại cho mơ Về vị trí, PrPc thường có tế bào thần kinh Protein diện bề mặt tế bào thần kinh PrPsc tế bào chất Prion protein bệnh tích luỹ tế bào tạo thành túi gọi Lysosome Trong não tế bào đầy Lysosome dẫn đến phá vỡ làm chết tế bào Khi tế bào chết tạo hố não Các prion bệnh giải phóng xâm nhập vào tế bào khác Như thế, PrPsc biến thành PrPsc PrPc vào tế bào chất trình tạo PrPc 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Những tế bào liên quan đến bệnh prion Nhiều loại tế bào liên quan đến trình vận chuyển prion (tế bào lympho B T, tế bào thần kinh, tế bào M) trình mã tác nhân lây lan (các neuron, tế bào follocular dendritic) khoảng trống prion (vi tế bào thần kinh, tế bào đơn nhân lớn) Vì thế, để dẫn truyền tới não, tác nhân lây nhiễm phải qua hàng rào không thấm, hàng rào ruột máu não Chuỗi cấu trúc prion rào cản loài PrPc ký chủ gần cấu trúc với prion dễ nhiễm Khi phân tích trình tự gen Prnp loài người ta thấy prion protein loài giống bệnh dễ lây truyền Cừu bị khác vị trí, người bị khác 30 vị trí có lẽ khả truyền bệnh từ bò sang người lâu Người ta quan sát thấy chuyển prion protein người sang Prnp bệnh với có mặt prion protein bị phịng thí nghiệm 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2 Các đặc điểm dịch tễ 2.2.1 Ổ chứa mầm bệnh Ổ chứa lịm mắc bệnh bò điên bột thịt bột xương lị Ngồi cịn thịt óc cừu mắc bệnh gãi ngứa 2.2.2 Bệnh lý Các chứng dịch tễ cho thấy bệnh bị điên khơng phải truyền từ bò sang bò khác mà có nhiều khả thức ăn đậm đặc chứa protein động vật có mầm bệnh Trong trại bị, ăn lơ thức ăn có bột thịt, bột xương lồi nhai lại có số mắc bệnh Có giả thuyết cho mầm bệnh phân phối khơng thức ăn, tính mẫn cảm khác cá thể bị Sự nhân lên mầm bệnh xảy tế bào lympho ruột tế bào hệ lưới nội mô trước bệnh xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương Về đường truyền bệnh, thời gian gần đây, người ta chứng minh bệnh truyền qua đường tiêu hóa Neen Singh nhóm nghiên cứu ĐH Case Western Reserve mô q trình ăn tiêu hóa thịt bị nhiễm bệnh Họ nghiền mô não chứa prion bệnh nhân mắc dạng bệnh bị điên Sau đó, mơ tiếp xúc với loạt enzym tiêu hoá mạnh miệng, dày ruột, có tác dụng phân huỷ protein thành mẩu nhỏ Kết cho thấy: Prion loại protein thứ hai tên ferritin nguyên vẹn Ferritin chứa sắt có nhiều thịt Hai protein dường bám vào Tiếp theo, nhóm nghiên cứu bổ sung màng tế bào lót thành ruột vào mơ hình ruột người Bằng cách gắn nhãn phát sáng cho prion ferritin, họ 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hai protein ''dắt tay nhau'' qua tế bào lót nói Singh cho lượng lớn prion thịt bò nhiễm bệnh xâm nhập vào thể đường Một nghiên cứu tiến hành năm 2001 cho thấy prion qua thành ruột Nghiên cứu Singh giải thích cách prion vượt qua rào cản lồi động vật Nhiều lồi động vật có protein ferritin gần giống hệt nhau, cho phép ferritin bám vào vận chuyển prion lạ từ bò Singh cho ferritin vận chuyển prion động vật hoang dã mắc bệnh xốp não, chẳng hạn hươu, nai, vào thể người Theo Singh, chặn đứng q trình vận chuyển ferritin ngăn prion xâm nhập vào thể người Tuy nhiên, điều khó thực người phải điều trị vào thời điểm bị phơi nhiễm Thời kì ủ bệnh: nhiều bệnh virus chậm, bệnh bị điên có thời kì ủ bệnh dài, thường 18 tháng.Trong gây bệnh thực nghiệm, thời gian ủ bệnh cừu dê ngắn 440 ngày dài 1720 ngày Thời gian ủ bệnh nhân tạo bò tương tự Tính cảm nhiễm sức đề kháng Có khác đáng kể tuổi bị cảm nhiễm bệnh Bê non bò năm tuổi bị cảm thụ với bệnh bò trưởng thành Tỷ lệ mắc bệnh cao bò từ năm tuổi trở lên Tuy nhiên đàn bị tỷ lệ mắc bệnh thấp Đó điều đặc biệt khác với bệnh truyền nhiễm khác Chính mà thời gian đầu, bệnh phát hiện, người ta không cho bệnh truyền nhiễm Chỉ đến gây bệnh thực nghiệm cho bò tính truyền nhiễm bệnh khẳng định Có thực tế đàn bị có số lượng lớn tỷ lệ mắc bệnh cao đàn bị có số lượng Bệnh xảy khơng phụ thuộc vào tháng năm Bò đực hay bị khơng có khác biệt với tỷ lệ mắc bệnh Bò khai thác sữa hay có thai khơng khác với bị khơng thời kỳ sản xuất tỷ lệ bệnh Riêng 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com giống bò người ta thấy hầu hết ca bệnh giống bị sữa Holstein F.Friesian Đó giống bị phổ biến ni nước Anh Bệnh tích Triệu chứng lâm sàng khác thuộc loại: - Thay đổi hành vi - Thay đổi tư thế, dáng đi, vận động khác - Tăng nhạy cảm Khi bệnh bắt đầu, thay đổi tính tình hành vi vận động khó nhận thấy Các triệu chứng ban đầu không rõ ràng bao gồm nhút nhát, sợ sệt, lơ đễnh, nghễnh ngãng, run nhẹ vùng cổ, vai hông, nghiến thường xuyên, cử động khơng mục đích đầu chân Bị lắc lư chân sau, hay đá chân vắt sữa, hụt bước, nhịp nhàng vận động, không tuân theo điều khiển chủ ni Bị bệnh cảnh giác có người đến gần thường dự khơng vào khoang vắt sữa, đơi công người bị bắt buộc phải vào Khi đi, đầu nghiêng sang phía, kêu rống Bị hay tỳ móng vào thành chuồng, uể oải, cử động phối hợp, loạng choạng Lúc nằm nghỉ bò bệnh thận trọng thường chọn chỗ riêng Bò bệnh đứng cúi đầu, cổ vươn thẳng, tai chĩa phía sau, cử bất thường, phần sau không phối hợp, đặc biệt dễ quan sát bò ăn cỏ bãi chăn Triệu chứng tiến triển đơi làm bị ngã, nằm nghiêng Một tiếng động bất ngờ làm vật co giật Đa số bò bị bệnh bị giết chết giai đoạn sản lượng sữa giảm thấp, giảm trọng lượng tính tình trở nên khơng kiểm sốt Diến biến bệnh kéo dài khoảng 2- tuần lễ hàng tháng, cuối bò bị bại liệt dần Thường bệnh xuất gần thời điểm cai sữa diễn biến nhanh Các triệu chứng tiến triển theo chiều hướng khác vật trở nên dữ, chạy loạn lên, lao đầu vào tường, run rẫy, ngã, bại liệt chết Các biến đổi bệnh lý học thấy kính hiển vi giới hạn não Chúng bao gồm thối hóa đối xứng bên não, có thối hóa khơng bào tế bào chất phần chất xám Khi quan sát kính hiển vi miếng cắt từ não, có cảm 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com giác nhìn mặt cắt miếng bọt biển ( đệm mút), có tên gọi bệnh viêm não dạng xốp Vị trí bệnh tích thường gặp hành tủy, chiếm 99% trường hợp Các bệnh tích BSE cho thấy phản ứng viêm mơ liên kết thần kinh Một đặc điểm bật bệnh BSE quan sát kính hiển vi điện tử, chất chiết từ não có sợi fibrin có kích thước từ 100 – 500nm chiều dài, gọi SAF ( scrapie associated fibrils) Các sợi gồm đến sợi kết với nhau, có bề ngang 4-6 nm, xếp theo hình xoắn ốc 2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định bệnh viêm não xốp bò Bệnh prion xảy thay đổi cấu hình protein khơng độc (PrPc) thành protein độc ( PrPsc) Điều cho thấy không ổn định cấu trúc PrPc.Người ta dùng acid nucleic diện (Circulating nucleic acids (CNA)) để phát yếu tố SINEs (cell stress-related short interspersed nucleotide elements) đoạn ngắn nucleotide có tính ổn định diện vùng trung tâm bảo toàn PrPc huyết gia súc liên quan đến bệnh BSE Acid nucleic ly trích, khuếch đại, tạo dịng, xếp theo trình tự huyết protein prion kháng protease Trình tự 80bp từ vùng 3’ Bov-tA SINE Kỹ thuật PCR sử dụng để phân tích huyết từ trường hợp liên quan bệnh BSE, 137 động vật họ biểu bệnh BSE kết hợp với trường hợp liên quan đến bệnh BSE, bò đối chứng âm PrPres kiểm tra QUY TRÌNH THỰC HIỆN Thu nhận huyết : Máu từ tĩnh mạch đuôi động mạch thu vào tube nhựa 18ml giữ nhiệt độ phòng 30 phút để đảm bảo đơng máu thích hợp Những ống cất giữ tới 8°C không 24h để thực thí nghiệm khác Ly tâm làm tới 8°C với 1000g 15 phút Huyết 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mặt chuyển vào chén ly tâm nhỏ 1.5ml vào phân chia thành 0.5ml bảo quản lạnh 20°C 80°C sử dụng Chuẩn bị phần nhỏ huyết Huyết đông lạnh xả 4°C nước đá 250μL chuyển thành ống ly tâm nhỏ 1,5ml Ống ly tâm 4000 vịng 25 phút 4°C mơ hình đầu máy ly tâm 5.214 ghế (Eppendorf, Hamburg, Đức) để loại bỏ mảnh vụn tế bào Phần mặt chuyển vào ống ly tâm 2000 vòng 35 phút Phần mặt lấy cẩn thận viên kết sử dụng để phân tích xa Tách chiết Nucleic acid Sử dụng 20.000 × g bột viên với silica chuẩn dựa chiết xuất axit nucleic theo hướng dẫn nhà sản xuất Các axit nucleic sử dụng đông lạnh -80 ° C tiếp tục sử dụng Primers Mồi sử dụng nghiên cứu bắt nguồn từ trước điều tra Một thời gian ngắn, hai súc vật bị bệnh BSE bốn đối chứng bình thường sử dụng; dùng mồi CHX-1F CHX-1R 1F CHX-CHX-1R CHX-1F tương đồng với cDNA bị tương tự calmodulin CHX-1R tương đồng với đơn vị monomer Bov-tA Giải trình tự Mồi CHX-1F CHX-1R sử dụng chiết xuất axit nucleic 20μl PCR với 30-35 chu kỳ 48-55°C bắt cặp (60 seconds), 68°C kéo dài (2 min), and 94°C biến tính (1 min) Mẫu lấy từ trường hợp bị bệnh BSE , bò khỏe mạnh làm đối chứng phủ lên gel polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) phân tích mơ tả Band cắt khỏi gel, tách rửa , phải chịu reamplification Các sản phẩm kết thúc với polymerase T7 DNA phosphoryl hóa với polynucleotide kinase ATP Hỗn hợp phản ứng sử dụng cho việc thắt đầu vào enzyme tiêu hóa SmaI, vector pGEM16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4Z khử gốc phospho Ủ qua đêm ° C cách sử dụng U T7 DNA ligase, μg vector, sản phẩm PCR Sản phẩm chuyển vào Escherichia coli c phủ TAXI LB-agar có chứa tetracyclin, ampicillin, 5-bromo-4cloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside (X-Gal), isopropylthiogalactopyranoside (IPTG) Sau ủ qua đêm 37°C, dịng dương tính chọn ni cấy mơi trường LB 1,5ml với ampicillin Vi khuẩn thu hoạch, plasmid phân lập theo quy trình chuẩn hoàn nguyên 50μl Trisborat-EDTA đệm Các plasmid trình tự sử dụng mơ hình LICOR 4200 trình tự DNA với IRD700-M13 có nhãn phía trước mồi ngược M13 hay với mơ 3.100 trình tự mao quản nhỏ ABI sử dụng mồi khơng nhãn với vùng kết thúc Big-Dye Trình tự xử lý cách sử dụng Sequencher (Mac OSX) Sau thời gian ngắn thiết kế vector tạo dòng sử dụng , contig tự động thực cách sử dụng thông số mặc định nghiêm ngặt Từ contigs kết quả, dịng từ hai mẫu khác chọn Homologs sau định nghĩa phần chuỗi contig bao phủ 50% dịng cá thể Các trình tự homologous cuối kiểm tra cho diện mồi sử dụng tất homologs có trình tự mồi; 18 homologs có trình tự mồi diện BLAST phân tích Phân tích di truyền áp dụng cho chuỗi cách sử dụng chương trình BLAST Advance 3μl dịch chiết nucleic acid từ huyết sử dụng mà không cần tiền xử lý Dnase tổng số 20μl Mồi CHX-1F CHX-1R sử dụng 1μm sử dụng hệ thống polymerase proofreading (Advantage-2 PCR kit, BDClontech, Heidelberg , Đức) Sau 30 chu kỳ / 95 °C 30 giây, 55oC 45 giây, 68°C phút, SybrGreen cđược ghi lại MX4000 PCR hệ thống (cửa hàng số 401.260) Diện tích đường cong (AUC) chức nóng chảy bắt nguồn-d (F) / dT 87°C 90°C sử dụng để phân tích sử dụng cách khơng bị ảnh hưởng sản phẩm không đặc 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hiệu: mồi-dimers, mà thường xuyên có mặt việc sử dụng SybrGreen PCR Các mẫu phản ứng cá thể tính tốn sở AUC giới hạn phát hiện, ( +5 độ lệch chuẩn) Tất mẫu ban đầu phản ứng lặp lại Mẫu hiển thị phản ứng retesting định nghĩa nhiều lần Phân tích thống kê Tỷ lệ phản ứng lặp lặp lại nhóm lân cận nhóm đối chứng khỏe tính toán dùng thử nghiệm chi –square Để so sánh tổng số nhóm thực bậc tự , so sánh hai nhóm nhóm với mức độ tự hạ xuống đến Điện di Tám μl hỗn hợp PCR trộn lẫn với đệm cho vào gel polyacrylamide đúc sẵn 12-20% đệm Tris-borat-EDTA (45mM Tris, 45mM acid boric, 1mM EDTA) (4 đến 20% Tris - borat-EDTA gel; Điện di nhiệt độ môi trường xung quanh 45 phút 180V Các gel nhuộm màu cho 20 phút giải pháp chụp ảnh tia UV Trình tự sản phẩm PCR từ BSE BSE-tiếp xúc với bò dựa mồi CHX-1F CHX-1R gửi cho sở liệu EMBL (nhập số AJ780924 để AJ780929) 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình phía cho thấy băng điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi nhóm Tương tự mơ hình nhiều băng quan sát cho huyết BSE huyết cohort phản ứng khơng nhìn thấy động vật đối chứng bình thường Hình bên cho thấy kết phân tích đường cong nóng chảy (28) mẫu Kết Một mồi bắt nguồn từ vùng sine '(CHX-1R) đánh giá PCR tách từ huyết gia súc khỏe mạnh bệnh Mẫu bò bị bệnh BSE, động vật thân cận có nguy mắc BSE, động vật khỏe sử dụng Một cặp mồi (CHX-1F/CHX-1R) cho thấy khơng có phản ứng với nhóm đối chứng động vật khỏe mạnh, khuếch đại, phù hợp với BSE-tiếp xúc với gia súc CHX1F/CHX-1R sử dụng để khuyếch đại CNA từ hai mẫu có bệnh BSE, huyết chứa đối chứng âm PrPre , bò đối chứng khỏe mạnh 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hiện người ta sử dụng phương pháp immuno-polymerase chain reaction sc (IPCR) để phát diện PrP IPCR kỹ thuật nhờ mà khả khuếch đại PCR đôi với phát protein kháng thể định dạng ELISA Khả phát nhạy cảm gấp 1.000.000 lần so với mức phát western blot ELISA Cách tiến hành Sơ đồ kỹ thuật IPCR Bắt giữ kháng kháng thể PrP , hấp phụ lên microwell, sử dụng để nắm bắt kháng nguyên PRP Các cầu nối Streptavidin-HRP máy dò -kháng thể kháng PRP phóng 500bp biotinylated Reporter DNA khuếch đại PCR sử dụng probe huỳnh quang để phân tích thời gian thực III/ KẾT LUẬN Bệnh viêm não xốp bò bệnh truyền nhiễm đặc biệt phát Anh vào nửa cuối thập kỷ 80.Tác nhân gây bệnh nhỏ virus gọi prion tiểu phần protein có khả gây nhiễm Bệnh phát nhiều trại ni bị nước Anh Sau có lẽ việc xuất bị sống sản phẩm 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bò, bệnh phát nhiều nước Châu Âu lục địa khác số lượng không nhiều Người ta sử dụng nhiều kỹ thuật khác để phát bệnh viêm não xốp bò Kỹ thuật PCR dùng dùng để phát yếu tố SINEs (cell stressrelated short interspersed nucleotide elements) đoạn ngắn nucleotide có tính ổn định diện vùng trung tâm bảo toàn PrPc huyết gia súc liên quan đến bệnh BSE Sử dụng cặp mồi (CHX-1F/CHX-1R) cho thấy khơng có phản ứng với nhóm đối chứng động vật khỏe mạnh có phản ứng với nhóm mang bệnh BSE Ngồi người ta sử dụng kỹ thuật IPCR kỹ thuật nhờ mà khả khuếch đại PCR đôi với phát protein bệnh cho kháng thể định dạng ELISA IV/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Thị Dân, ,2005,công nghệ sinh học chăn nuôi gia súc, NXB Nông nghiệp 1.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18657541?ordinalpos=1&itool=Ent rezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_SingleItemSu pl.Pubmed_Discovery_RA&linkpos=3&log$=rela www.jbc.org/content/early/2009/08/19/jbc.M109.031559.abstrac http://www.hpj.com/archives/2005/jul05/jul4/AfterBSEpositiveconfirmati.cfm http://scienceblogs.com/retrospectacle/2007/02/basic_concepts_prions.php 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... bệnh bò hoang Anh Năm 1987, Wells cộng phát mô tả loại bệnh tương tự bò sữa, gọi bệnh bò điên (Mad cow) Về sau đặc điểm tổ chức tế bào bệnh, tác giả đặt tên cho bệnh “ Bệnh viêm não thể xốp bò. .. 12 2.2.1 Ổ chứa mầm bệnh 12 2.2.2 Bệnh lý 12 2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định bệnh viêm não xốp bò 15 III/ KẾT LUẬN 20 IV/ TÀI LIỆU THAM... sợi kết với nhau, có bề ngang 4-6 nm, xếp theo hình xoắn ốc 2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định bệnh viêm não xốp bò Bệnh prion xảy thay đổi cấu hình protein khơng độc (PrPc) thành protein