Định danh nấm phytophthora spp bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******* NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***** ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN NGUYỄN HUỲNH HỒNG MINH KS TRỊNH THỊ PHƢƠNG VY KHĨA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***** IDENTIFYING Phytophthora spp BY MOLECULAR TECHNOLOGIES GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD LE DINH DON NGUYEN HUYNH HOANG MINH Bs TRINH THI PHUONG VY TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN - Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cán giáo viên Trường Đại Học Nông Lâm, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện cho em thực đề tài - Em biết ơn hướng dẫn thầy Tiến sĩ Lê Đình Đơn, Kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy, Kỹ sư Nguyễn Văn Lẫm tận tình hướng dẫn em suốt thời gian thợc đề tài - Cảm ơn thầy cơ, anh chị giảng viên Phịng Cơng Nghệ Sinh Học – Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài - Xin gửi lời cảm ơn đến bạn thực tập đề tài Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, đặc biệt bạn nhóm Bảo Vệ Thực Vật thời gian qua tận tình giúp đỡ - Cảm ơn tập thể lớp Cơng nghệ sinh học khóa 28 chia kỉ niệm buồn vui suốt thời gian bốn năm học vừa qua Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Sinh viên Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT Nguyễn Huỳnh Hồng Minh, Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh “ ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ” Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Đình Đôn KS Trịnh Thị Phương Vy Nấm Phytophthora xem tác nhân nguy hiểm hàng đầu cho kinh tế nông nghiệp nước ta Dựa số kết đạt từ nghiên cứu trước hình thái sinh thái giống nấm này, đề nghị qui trình định danh giống nấm sở cấu trúc di truyền chúng Mục đích đề tài bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR, kỹ thuật giải trình tự nhằm khuếch đại xác định vùng trình tự đặc trưng ITS1- 5,8S- ITS2 Kết đề tài tạo sở cho nghiên cứu điều tra kiểm soát mầm bệnh Phytophthora nước ta Sau thực tồn qui trình, chúng tơi thu số kết sau: - Sản phẩm khuếch đại vùng ITS1- 5,8S- ITS2 hai mẫu nấm tiêu Bà Rịa sầu riêng Đồng Nai 900 bp Trong sản phẩm khuếch đại hai mẫu nấm địa lan cho band 800 bp 900 bp hai band - Kết giải trình tự hai mẫu nấm địa lan cho thấy trình tự tồn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 khoảng 800 bp Trong vùng ITS1 khoảng 225 bp; vùng 5,8S 160 bp vùng ITS2 420 bp v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC .o0o Trang Lời cảm ơn iv Tóm tắt v Mục lục vi Danh mục hình ix Danh mục bảng x Danh sách chữ viết tắt xi Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.2.3 Giới hạn đề tài 1.2.4 Đối tượng đề tài 2 Tổng quan 2.1 Giới thiệu giống Phytophthora 2.1.1 Cây tiến hoá Phytophthora 2.1.2 Chu kì sống Phytophthora 2.1.3 Phân lập Phytophthora từ bôl phận nhiễm bệnh 2.1.4 Một số môi trường phân lập Phytophthora từ mô bệnh 2.1.5 Đặc điểm hình thái giống Phytophthora 2.1.6 Phân biệt nấm Pythium nấm Phytophthora 2.2 Một số bệnh Phytophthora nghiên cứu Việt Nam 2.2.1 Cà chua khoai tây 2.2.2 Khoai sọ 2.2.3 Dứa 2.2.4 Họ cam chanh 2.2.5 Sầu riêng vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.6 Mận 2.2.7 Cao su 10 2.3 Các kỹ thuật phát định danh Phytophthora 11 2.3.1 Kỹ thuật quan sát hình thái môi trường nuôi cấy 11 2.3.2 So sánh tương xứng sinh sản sinh dưỡng 12 2.3.3 Kỹ thuật protein profile 12 2.3.4 Isozyme 13 2.3.5 Huyết học kit chuẩn đoán 13 2.3.6 Kỹ thuật RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) 14 2.3.7 Kỹ thuật probe acid nucleic, DNA fingerprinting 14 2.3.8 Sự lai DNA-DNA 15 2.3.9 Kỹ thuật PCR RAPD 15 2.4 Một số cơng trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora 15 2.4.1 Một số cơng trình nghiên cứu ngồi nước 15 2.4.2 Công trình nghiên cứu nước 17 2.5 Một số lưu ý trước thực thí nghiệm 18 2.5.1 Sơ lược trình tự ITS 18 2.5.2 Danh mục lồi Phytophthora tìm thấy Việt Nam 19 Vật Liệu phương pháp 21 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 21 3.1.1 Thời gian thực 21 3.1.2 Địa điểm thực 21 3.2 Vật liệu hoá chất 21 3.2.1 Tăng sinh nhân sinh khối 21 3.2.2 Ly trích DNA 22 3.2.3 Điện di 22 3.2.4 Kỹ thuật PCR 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Tăng sinh nhân sinh khối 23 3.3.2 Ly trích DNA 24 3.3.3 Kỹ thuật PCR 26 3.3.4 Kỹ thuật giải trình tự 28 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.3.5 Xử lý kết giải trình tự 29 Kết thảo luận 30 4.1 Quá trình tăng sinh nhân sinh khối 30 4.2 Quá trình ly trích 30 4.3 Quá trình PCR 31 4.4 Kết tinh sản phẩm PCR 35 4.5 Xử lý kết giải trình tự 36 Kết luận đề nghị 44 Tài liệu tham khảo 45 Phụ lục 47 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Danh sách hình Hình 2.1 Chu kì sống Phytophthora Hình 2.2 Một số bệnh Phytophthora gây số trồng 10 Hình 2.3 Vùng trình tự ITS DNA ribosome 18 Hình 4.1 Sản phẩm qui trình 31 Hình 4.2 Sản phẩm qui trình ly trích 31 Hình 4.3 Thang nồng độ DNA chuẩn 32 Hình 4.4 Kết qủa phản ứng PCR 33 Hình 4.5 Sản phẩm PCR lần thứ hai 34 Hình 4.6 Mẫu tinh dùng cho phản ứng giải trình tự 36 Hình 4.7 Cây phát sinh loài hai mẫu địa lan 40 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Danh sách bảng Bảng 2.1 Cây tiến hoá nấm Phytophthora………………………………… Bảng 2.2 Danh mục lồi nấm Phytophthora tìm thấy Việt Nam 19 Bảng 3.1 Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l 26 Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l 27 Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR 27 Bảng 4.1 Các nguồn nấm ngân hàng gen dùng để so sánh 37 Bảng 4.2 So sánh trình tự nucleotide vùng ITS hai mẫu DL1, DL2 38 Bảng 4.3 Kết so sánh vùng đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 40 Bảng 4.4 Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) mẫu Phytophthora địa lan 42 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 Hình 4.7 Cây phát sinh lồi hai mẫu địa lan Theo hình 4.7 hai mẫu nấm có chung nguồn gốc thuộc lồi P.multivesiculata ( dịng CBS545.96) Chúng tơi thực thêm số so sánh nhằm xác định tiểu phần gen vùng (ITS1-5,8S-ITS2) dựa trình tự tương đồng vùng ITS dòng nấm P.multivesiculata chủng CBS545.96 Bảng 4.3 Kết so sánh vùng đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 Độ tương đồng Số lượng Nucleotide P.multi CBS545.96 DL1 DL2 DL1 DL2 ITS1 100% 100% 225 225 5,8S 100% 100% 160 160 ITS2 99,99% 99,99% 420 420 Tỉ lệ tương đồng vùng ITS1 mẫu 100%; vùng ITS2 99,5%; vùng 5,8S 100% Dựa trình tự ITS1, trình tự ITS2 trình tự vùng 5.8S thu bảng kết sau LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 Bảng 4.4 Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) mẫu Phytophthora địa lan #18S NAAGCTGGAGAGAGACTTCCCC #ITS1 CCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCTT GGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCATG GCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGTTTTAAACCCATTCTTTAATAC TGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAG #5_8S AACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATA CGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCC GGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTA #ITS2 GTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAA GTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACT CTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCG GCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTG GCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTG AACCGTAGCTGTGTTNTGGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGG CGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCA TCTCAA #28S ATATCAGGCAAGATTA Theo kết bảng 4.4, đến số điều cần thảo luận như: - Kết BLAST đoạn trình tự ngân hàng gen cho thấy sản phẩm hai mẫu nấm thuộc giống Phytophthora ( phù hợp với kết định danh quan sát hình thái kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy) - Vùng ITS1- 5,8S- ITS2 hai mẫu nấm có 850 nucleotide Điều phù hợp kết PCR hai mẫu nấm cho sản phẩm khoảng 800 bp - Kết so sánh phần mềm ClustalX toàn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 vẽ phát sinh loài phần mềm Treeview cho thấy hai mẫu nấm có quan hệ gần với loài P multivesiculata, đặc biệt dòng P multivesiculata CBS545.96 - Để khẳng định lại kết tiến hành so sánh trình tự tiểu phần nhỏ ITS1; ITS2; 5,8S Tỉ lệ tương đồng phép so sánh đạt gần 100% Chúng kết luận hai mẫu thuộc lồi P multivesiculata dịng CBS545.96 - Đối chiếu với bảng danh mục lồi Phytophthora có mặt Việt Nam ( A Drenth I Guest, 2004) chứng minh loài xuất Việt Nam kể từ năm 2004 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết giải trình tự cho ta số kết luận như: - Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hai mẫu nấm tiêu Bà Rịa sầu riêng Đồng Nai thuộc giống Phytophthora chưa xác định rõ hai mẫu nấm địa lan - Kết giải trình tự hai mẫu nấm địa lan có cấu trúc trình tự gần giống -Trình tự hai mẫu nấm sau so sánh ngân hàng gen cho kết gần với ba dòng nấm bao gồm P.multivesiculata, P multivesiculata CBS545.96 P syringae Kết thu phát sinh loài cho thấy hai mẫu nấm có trình tự tương đồng với dòng P multivesiculata CBS545.96 - So với bảng danh mục loài Phytophthora xuất Việt Nam A Drenth I Guest điều tra năm 2004 cho thấy lồi nấm khơng có mặt bảng danh mục loài nấm Phytophthora gây bệnh Việt Nam 5.2 Đề nghị - Giải trình tự trực tiếp hai nấm Phytophthora tiêu Bà Rịa sầu riêng Đồng Nai - Tăng số lượng mẫu phân tích nhằm phát mức độ đa dạng loài nấm đối tượng - Áp dụng qui trình định danh cho nghiên cứu loài nấm loại lan Lâm Đồng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 Phần TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trịnh Thị Phương Vy, 2005 Định danh nấm Phytopthora spp kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction) kết hợp mơ tả hình thái học Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử, giới thiệu phương pháp ứng dụng, NXB Nơng Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh André Drenth David I Guest, 2004 Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra James C Correll Genetic, Biochemical, Molecular Techniques for the Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi Alex A Appiad, Isaac Y Opoku Andrews Y Akrofi, 2004 Natural occurrence and distribution of stem cankers caused by Phytophthora palmivora on cocoa S.E Zitko L.W Timmer,1994 Competitive Parasitc Abilities of Phytophthora parasitica and P palmivora on Fibrous Roots of Citrus D Cooke, N Williams J M Duncan, The uses of ITS regions in Phytophthora species C Silvar, J M Duncan, D.E.L Cooke, N.A Williams, J Diaz F Merino, 2004 Development of specific PCR primers for identification and detection of Phytophthora capsici Leon T Wangsomboondee J.B Ristaino, 2002 Optimization of Sample Size and DNA Extraction Methods to Improve PCR Detection of Different Propagules of Phytophthora infestans 10 A Drenth J.A.G Irwin, 2001 Routine DNA based Diagnostic Test for Phytophthora 11 F Yamak, T.L Peever, G.G Grove, R.J Boal, 2002 Occurrence and Identification of Phtophthora spp Pathogenic to Pear Fruit in Irrigation Water in the Wenatchee River Valley of Washington State LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 12 Frank N Martin Paul W Tooley, 2004 Identification of Phtophthora to Species Level Using Restriction Fragment Length Polymophism Analysis of a Polymerase chain Reaction-Amplified Region of Mitochondrial DNA 13 P Chowdappa, D Brayford, J Smith J Flood, 2003 Molecular discrimination of Phytophthora isolates on cocoa and their relationship with coconut, black pepper and bell pepper isolates based on rDNA repeat and AFLP fingerprints, CURRENT SCIENCE, VOL 84, NO 14 C.M Brasier, D.E.L Cooke J.M Duncan, 1999 Origin of a new Phytophthora pathogen through interspecific hydridization LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 52 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... sinh học phân tử ta giải khó khăn Các kỹ thuật sinh học phân tử đại với kỹ thuật như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật sử dụng enzyme cắt, kỹ thuật đọc trình tự,… tác động lên cấu trúc phân tử DNA lồi nấm. .. Chúng thực đề tài ” ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ” nhằm hoàn thiện qui trình định danh nấm Phytophthora kỹ thuật sinh học phân tử LUAN VAN CHAT LUONG download... ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***** ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên