Chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm bằng kỹ thuật sinh học phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI TIỂU LUẬN MÔN CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ ĐỀ : CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT CÁC TYPE PRRS Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực : Nguyễn Thị Thanh Nga MSSV : 06126084 Lớp : DH06SH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Phần I : Đặt vấn đề……………………………………………………3 Phần II : Tổng quan……………………………………………………4 II.1 : Giới thiệu virus PRRS…………………………………… II.2 : Giới thiệu phương pháp phát hiện…………………………5 II.3 : Vật liệu phương pháp………………………………………6 3.1 : Dịng tế bào ni cấy virus……………………………….6 3.2 : Thiết kế primer probe…………………………………….6 3.3 : Ly trích RNA mẫu định lượng……………………….7 3.4 : RT-PCR định lượng…………………………………………7 3.5 : Tính chuyên biệt tính nhạy TaqMan® RT-PCR…… 3.6 : Các yếu tố cản trở……………………………………………9 II.4 Kết quả………………………………………………………… 10 Phần III : Kết luận…………………………………………………………16 Phần IV : Tài liệu tham khảo LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I ĐẶT VẤN ĐỀ PRRS : hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome).Bệnh xảy với biểu rối loạn sinh sản heo nái hô hấp heo thịt, gây thiệt hại đáng kể cho nhà chăn nuôi Bệnh xuất Bắc mỹ vào đầu năm 1980, sau bệnh xuất Châu Âu Châu Á.Và Việt Nam bệnh phát vào năm 1997 đàn lợn nhập từ Mỹ Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo nhiều lần bùng phát thành dịch nhiều nơi giới Khi phân tích mặt di truyền người ta xác định dòng virus PRRS : dòng châu Âu (chủ yếu Lelystad) , dòng châu Mỹ (chủ yếu VR-2332).Và năm gần cịn phát thêm dịng virus có nguồn gốc từ Trung Quốc với mức độ gây bệnh nguy hiểm Vì viêc chuẩn đoán phân biệt type điều cần thiết ta áp dụng việc sử dụng nguồn vaccine có hiệu quả, sử dụng phương pháp phịng chống bệnh thích hợp Phát kháng thể, phân lập virus môi trường nuôi cấy tế bào, RT-PCR phương pháp phổ biến sử dụng để chuẩn đoán PRRS Tùy thuộc vào thời gian nhiễm bệnh mẫu thí nghiệm có sẵn mà lựa chọn phương pháp chuẩn đốn thích hợp Để chẩn đoán phân biệt type virus PRRS ta dùng kỹ thuật RTPCR , nested PCR , cắt phân đoạn đa hình (RFLP), ELISA Với kỹ thuật trên, kỹ thuật RT-PCR định lượng với thuốc nhuộm TaqMan xem thành công cho việc nghiên cứu chuẩn đoán bệnh Kỹ thuật phát cho thấy khác dòng PRRSV EU US LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II TỔNG QUAN II.1 Giới thiệu virus PRRS Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo xác định loại virus ARN sợi dương có vỏ envelope thuộc họ Arteriviridae Bộ gen virus gây hội chứng PRRS gồm có khung đọc mở (ORF : Open Reading Frame ) mã hóa cho thành phần khác virus.Tuy nhiên có khung ORF có ý nghĩa quan trọng định danh virus ORF 7, quy định tổng hợp protein tương ứng : nucleocapsid (N) 15-kda , matrix (M) 19-kda glycoprotein envelope (E) 25-kda Các ORF ORF có tính ổn định cao dòng khác biệt ORF dòng châu Âu châu Mỹ rõ rệt Giữa dòng virus xét mức độ nucleotide có tương đồng khoảng 55%- 80% , khác chủ yếu yếu tố kháng nguyên Hình 1: Các Protein cấu trúc PRRSV LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.2 Giới thiệu phương pháp phát Trong phương pháp dùng để phát PRRSV phương pháp thành cơng để phát acid nucleic đặc trưng PRRSV RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase chain reaction) Một số phương pháp RT-PCR thiết lập để phát PRRSV, có vài số khơng thể phân biệt dịng virus PRRS EU US Và có RT-PCR định lượng phát RT-PCR thơng thường tốn thời gian TaqMan® RT-PCR (định lượng) dễ bị nhiễm DNA từ lần PCR trước.Hơn nữa, địi hỏi số bước trước sau khuếch đại Sự phát triển công nghệ TaqMan cải tiến đáng kể phương pháp phát cách cho phép phân tích định lượng Nguyên tắc hoạt động TaqMan® cắt probe (sợi đơi) đánh dấu huỳnh quang đầu 5’ chất hấp phụ huỳnh quang đầu 3’ nhờ hoạt động 5’- 3’ exonuclease Taq DNA polymerase (chịu nhiệt) Không primer mà probe gắn đặc hiệu với trình tự đích, đó, sản phẩm khuếch đại khơng đặc hiệu tạo khơng thu tín hiệu TaqMan dương tính probe không gắn vào phân tử DNA Khi primer chọn để khuếch đại đoạn DNA ngắn có chứa probe có vị trí gắn kết hiệu khuếch đại nâng cao.Nhiều thí nghiệm phát triển dễ dàng đánh dấu probe với thuốc nhuộm huỳnh quang khác Do khác biệt lớn chiều dài bước sóng để phát tín hiệu thuốc nhuộm huỳnh quang VIC FAM , Sequence Detector SDS 7700 phân biệt đồng thời tín hiệu probe đánh dấu VIC –FAM ống LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Thử nghiệm TaqMan RT- PCR định lượng để phát phân biệt dịng EU US dựa vào cặp mồi bổ sung cho ORF7 type virus sử dụng probe nhuộm huỳnh quang đặc trưng cho type Bằng cách ống phản ứng đóng kín cho bước sau khuếch đại nhờ khuếch đại DNA không bị nhiễm từ môi trường xung quanh II.3 Vật liệu phương pháp 3.1 Dòng tế bào virus : Tế bào Marc-145 thích hợp cho PRRSV sử dụng để phát triển dòng vaccine US PRRSV VR 2332 với liều 105.9 TCID50 /ml ,được phát miễn dịch huỳnh quang gián tiếp sử dụng hyperimmune polyclonal.Mẫu đem sử dụng huyết từ heo bị bệnh PAM, tập hợp từ tế bào đại thực bào túi phổi từ lợn có mầm bệnh đặc trưng PAM dùng cho việc ni cấy dịng EU PRRSV Lelystad M 96262 với liều 107,3 TCID50/ml Sử dụng mẫu mô phổi Nếu mẫu quan (100-200 mg) đồng 1ml phosphate buffered saline (PBS), làm nhờ máy ly tâm cất giữ -700C trước đem ly trích RNA 3.2 Thiết kế primer probe Trình tự dịng Lelystad M 96262 ATCC VR 2332 aligned dùng phần mềm Gene Works 2.5.1 (Oxford Molecular Group , Oxford, UK) Với ổn định khung ORF gen type virus mồi ngược USalignEU-R (5’ AAATGIGGCTTCTCIGGITTTT 3’) mồi xuôi USalignEUF (5’ TCAICTGTGCCAGITGCTGG 3’) chọn TaqMan® RT-PCR khuếch đại tạo đoạn DNA có kích thước 105pb (type US) với 96 pb (type EU) Các primer probe đặc hiệu thiết kế phần mềm Primer ExpressTM (Applied Biosystems, Foster City, USA) tổng hợp PE Biosystem, LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Weiterstadt, Germany (probes) Microsynth, Balgach, Switzerland (primers) Hai probe TaqMan® thiết kế đặc trưng cho type PRRSV Probe đặc trưng cho type EU-PRRSV :VIC–EU (5’ CCCAGCGCCAGCAACCTAGGG 3’, định hướng antisense ) đánh dấu với VIC điểm cuối đầu 5’ TAMRA điểm kết thúc đầu 3’ Nhưng trái lại Probe đặc trưng cho type US-PRRSV : FAM–US–rev (5’TCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA 3’, định hướng sense ), đầu 5’ đánh dấu với FAM đầu 3’ TAMRA 3.3 Ly trích RNA mẫu định lượng Mẫu RNA cho type chuẩn bị, sau ly trích RNA cách sử dụng TRIZOL® Reagent (Life Technologies, Rockville, USA), phần RNA hòa tan với dung dịch nước không chứa enzym RNAse khoảng 20μl RNA để lạnh -700C sử dụng làm mẫu định lượng Trước lần chạy, 1µl rã đơng pha loãng thành tỷ lệ 1:10, 1:100, 1:1000 để cung cấp mẫu cho type virus với tỷ lệ tương ứng 1000, 100, 10, với liều TCID50 cho ống phản ứng riêng biệt 3.4 RT-PCR định lượng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PRRSV RT-PCR thơng thường có tên ORF RT-PCR phát RNA virus toàn ORF type PRRSV bị biến đổi cách sử dụng ExpandTM Reverse Transcriptase (Roche Molecular Biochemicals, Rotkreuz, Switzerland) 420C 1h, PCR (950C phút, 40 chu kỳ với chu kỳ : 940C : 20s ; 600C : 20s ; 720C : 20s ) với Taq DNA polymerase ( Promega, Madison, USA ) Các phản ứng phân tích điện di với gel agarose, kết có xuất băng đặc trưng 637 bp (EU) v 660 bp (US) Hn hp (25àl) ca TaqManđ RT-PCR gồm có : 5.5 mM MgCl2 and x Buffer A [bao gồm 60 nM thuốc nhuộm ROX (6-carboxy-N,N,N_,N_tetramethylrhodamine), 50mM KCl, 0.01 mM acid ethylenediamine tetraacetic (EDTA) 10mM Tris-HCl, pH 8,3) từ Kit TaqMan® Gold RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, USA), 300µM dATP, dGTP, dCTP dTTP (Promega), 400 nM cho primer, 100 nM cho probe, 0.625 units Ampli Taq GoldR DNA Polymerase (Applied Biosystems), 12.5 units MultiScribeTM Reverse Transcriptase (Applied Biosystems), 10 units Recombinant Rnasinđ (Promega) Cui cựng l 2àl RNA ớch c thêm vào hỗn hợp Nồng độ probe primer xem xét để phản ứng đạt ngưỡng : số chu kỳ (CT) thấp tín hiệu huỳnh quang tăng lên sau chu kỳ ( ∆Rn ) Thực RT 480C 30 phút biến tính 950C vịng 10 phút, 40 chu kỳ PCR thực ( 950C 15s ; 600C phút) RT PCR thực ống đơn với Sequence Detector ABI Prism® 7700 (Applied Biosystems) khơng cần mở ống bước RT PCR bước sau khuếch đại Để ngăn chặn phản ứng bị nhiễm hỗn hợp TaqMan® chuẩn bị tủ cấy vơ trùng Mỗi lần chạy phản ứng gồm : mẫu đối chứng âm (chỉ chứa nước thay chứa RNA), mẫu RNA type EU PRRSV mẫu RNA type US PRRSV LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tương ứng 1000, 100, 10, 1, với liều TCID50 ống riêng biệt Những mẫu quan tâm chạy lần Khi mẫu đối chứng âm (-) cho type mẫu virus type (+) kết dương tính mẫu có ý nghĩa, điều có nghĩa mẫu chưa biết xác định 3.5 Tính chuyên biệt tính nhạy TaqMan® RT-PCR Tính chun biệt sản phẩm TaqMan kiểm tra việc giải trình tự nucleotide Tính chun biệt probe kiểm tra việc phân tích mẫu RNA type virus EU US, mẫu mô huyết chứa số lượng RNA PRRSV EU US khác Ngoài probe kiểm tra riêng biệt việc thêm số lượng lớn RNA PRRSV khác loài Phân lập virus tế bào nuôi cấy, RT-PCR thông thường TaqMan RT-PCR so sánh tính nhạy việc kiểm tra dịch tế bào nuôi cấy pha loãng liên tục 10 lần.Các mẫu pha lỗng trước sau ly trích RNA Tính nhạy cho mẫu bệnh phẩm nghiên cứu việc phân tích dịch độ pha lỗng 10 lần lọc từ mẫu mô đồng hay huyết từ thú thí nghiệm bị bệnh mẫu khu chăn nuôi Những mẫu bệnh phẩm pha loãng liên tục trước ly trích RNA 3.6 Các yếu tố cản trở Các primer probe thí nghiệm mutiplex RT-PCR tác động qua lại làm giảm tính nhạy thí nghiệm Probe kiểm tra riêng biệt, tính nhạy so sánh với thử nghiệm mutiplex TaqMan Sự tồn type EU US PRRSV vật điều cản trở cho việc phát type virus này.Điều tìm thấy thực nghiên cứu phát lúc type virus việc trộn RNA type EU US PRRSV vào ống thí nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.4 Kết Dữ liệu lần chạy TaqMan phân tích nhờ sử dụng phần mềm SDS 1.7 ( Applied Biosystem ) Kết ∆Rn ,khi số chu kỳ tăng tín hiệu đặc trưng phát nhờ thuốc nhuộm ( đầu 5’), giá trị CT , ngưỡng chu kỳ mà tín hiệu huỳnh quang xuất nghĩa biểu thị kết dương tính, sử dụng làm đặc điểm nhận biết mẫu RNA PRRSV (+) hay (-) Việc phân tích mẫu RNA virus type PRRSV EU US việc phân tích mẫu mơ huyết từ thú thí nghiệm chứa số lượng RNA khác chứng tỏ probe đặc trưng cho lồi cao, chưa scó tượng dương tính giả với RNA PRRSV khác loài, cho dù kiểm tra nồng độ cao Tính chuyên biệt thí nghiệm kiểm tra cách kiểm tra virus có triệu chứng lâm sàn liên quan tất âm tính Và mẫu hoang dã thu thập từ lợn hoang dã Switzerland đợt dịch sốt heo ( chọn ngẫu nhiên ), mẫu từ đàn heo ni hộ gia đình Switzerland tất cho âm tính với PRRSV Pha loãng liên tục 10 lần để phân lập US VR2332 từ vaccine PRRS MLV EU Lelystad M 96262 đo độ chuẩn thí nghiệm TaqMan RNA virus tương ứng với liều TCID50 phát cho dù mẫu pha lỗng trước hay sau ly trích RNA Tuy nhiên, phát RNA pha lỗng sau ly trích có 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com độ nhạy cao số chu kỳ cần để phát ( CT ) Chu kỳ ngưỡng ( CT ) sử dụng đơn vị biểu thị cho số chu kỳ PCR mà tín hiệu huỳnh quang phát Hiệu khuếch đại sản phẩm phụ thuộc vào độ dốc đường chuẩn tạo dựa vào việc pha loãng mẫu liên tục 10 lần.Đường chuẩn thiết lập từ giá trị logarit TCID50 /tube tương ứng với nồng độ mẫu với giá trị chu kỳ ngưỡng thu 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đường chuẩn đồ thị cho thấy độ dốc đường đồ thị huỳnh quang type EU 3,51 type US 3,58 Kết gần với độ dốc lý tưởng theo lý thuyết 3,32, giá trị mà hiệu khuếch đại tăng gấp đôi sau chu kỳ Giá trị CT cho việc phát với liều TCID50 27,87 (US) 32,36(EU) Dịch tế bào nuôi cấy chứa VR 2332 M 96262, nơi RNA ly trích sau mẫu pha lỗng 10 lần, hiệu phát hiên TaqMan RT-PCR ORF RT-PCR Cả phương pháp RT-PCR 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com phát liều TCID50 có tính nhạy với phương pháp phân lập virus So sánh việc sử dụng probe TaqMan phản ứng riêng biệt với việc kết hợp chúng ống thi thấy tính nhạy probe việc kết hợp chung giảm khơng đáng kể liều TCID50 phát 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Khi type có mặt mẫu nghiên cứu, việc phát PRRSV US , theo dõi nhờ probe đánh dấu FAM tìm thấy hiệu tính nhạy độc lập với kết hợp liều 1000 TCID50 PRRSV EU ống Trong đó, phát PRRSV EU probe đánh dấu VIC tính nhạy RNA PRRSV US với 1000 TCID50 ống có diện thêm RNA PRRSV EU Tất mẫu đối chứng âm ln có kết âm tính thí nghiệm TaqMan 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com III KẾT LUẬN Mục đích nghiên cứu để phát triển tính : nhanh, chắn, nhạy đặc hiệu kiểm tra để phát phân biệt type EU US PRRSV mẫu mô huyết dịch tế bào ni cấy.tính chắn việc phát PRRSV quan trọng thay đổi triệu chứng lâm sàn không đặc trưng bệnh PRRS heo Hơn nữa, PRRS thường quan tâm chuẩn đoán phân biệt bệnh lây nhiễm virus.Một chiến lược chọn sử dụng cặp primer đơn có khả gắn kết với type RNA PRRSV EU US Ở vùng mà chọn để thiết kế probe primer có trình tự dịng EU US mang tính ổn định cao.Những kết thí nghiệm xác nhận tính đặc trưng tuyệt đối cho dù lượng PRRSV khác loài thêm vào nhiều Phương pháp TaqMan có tiến so với ORF RT-PCR thơng thường : - thời gian cần cho q trình phát - giảm rủi ro cho việc bị nhiễm bẩn - khơng cần có q trình RT PCR - khơng địi hỏi bước sau PCR - biết trước lượng mẫu cho vào - Tính nhạy tính chuyên biệt cao Thí nghiệm TaqMan thực với thành phần phản ứng , chu kỳ nhiệt độ tiêu chuẩn hóa, cho phép phát dòng EU hoang dã dòng vaccine US đáng tin cậy, kết so sánh hy vọng với dịng PRRS US hoang dã TaqMan RT-PCR phát sau vài tháng nhiễm bệnh quan phổi hay hạch bạch huyết RT-PCR định lượng công cụ thành 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cơng cho việc chuẩn đốn bệnh nghiên cứu theo dõi trình tiến triển bệnh lây nhiễm thú Ưu điểm TaqMan Probe độ đặc hiệu cao, tỷ lệ huỳnh quang phát cao, khả thực phản ứng Mutiplex Tuy nhiên có hạn chế : giá thành đắt việc thiết kế phản ứng khó khăn IV TÀI LIỆU THAM KHẢO : Cơng nghệ sinh học thú y, Nguyễn Ngọc Hải, Nhà xuất Nông nghiệp Ias.cnsh.org Real time PCR : kỹ thuật ứng dụng (Bio-rad) www.elsevier.com/locate/jviromet Journal of Virological Methods 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... , nested PCR , cắt phân đoạn đa hình (RFLP), ELISA Với kỹ thuật trên, kỹ thuật RT-PCR định lượng với thuốc nhuộm TaqMan xem thành công cho việc nghiên cứu chuẩn đốn bệnh Kỹ thuật phát cho thấy... sử dụng để chuẩn đoán PRRS Tùy thuộc vào thời gian nhiễm bệnh mẫu thí nghiệm có sẵn mà lựa chọn phương pháp chuẩn đốn thích hợp Để chẩn đốn phân biệt type virus PRRS ta dùng kỹ thuật RTPCR , nested... độ gây bệnh nguy hiểm Vì viêc chuẩn đốn phân biệt type điều cần thiết ta áp dụng việc sử dụng nguồn vaccine có hiệu quả, sử dụng phương pháp phịng chống bệnh thích hợp Phát kháng thể, phân lập