CHẨN đoán VIRUS lở mồm LONG MÓNG BẰNG kỹ THUẬT NUÔI cấy tế bào

Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận: CHẨN ĐỐN VIRUS LỞ MỒM LONG MĨNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: MSSV: Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Duy Lan 06126067 _Tháng 10/2009 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành chăn nuôi coi ngành hàng quan trọng để chuyển đổi cấu thúc đẩy tăng trưởng nông nghiệp Tuy nhiên, điều quan trọng hàng đầu q trình chọn giống ni dưỡng chăm sóc, đàn gia súc phải luôn khỏe mạnh, sức đề kháng cao thành phần chất dinh dưỡng tích lũy vào thịt có chất lượng tốt có giá trị sinh học Bệnh lở mồm long móng (tiếng Anh: Foot-and-mouth disease, viết tắt FMD; tiếng Latin: Aphtae epizooticae), loại bệnh nguy hiểm virus gây động vật móng guốc chẵn heo, bị, trâu, hươu, dê Bệnh nguy hiểm bệnh lây lan nhanh diện rộng qua nhiều đường khác tiếp xúc trực tiếp động vật với nhau, truyền qua khơng khí Mặc dù tỷ lệ gây chết cao heo con, bê nghé; gia súc lứa trưởng thành điều trị tốt thú phục hồi sau 1-2 tuần, song thiệt hại kinh tế lớn, tính lây lan q mạnh (8) Chính mà Tổ chức Y tế Thế giới xếp bệnh lở mồm long móng đứng đầu bệnh truyền nhiễm động vật danh mục kiểm dịch quốc tế Vì nước khống chế bệnh hạn chế nhập gia súc, sản phẩm động vật từ nước chưa khống chế bệnh LMLM, mối nguy hại cho đầu ngành chăn nuôi, phát triển LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TỔNG QUAN 2.1 Bệnh lở mồm long móng 2.1.1 Lịch sử phát bệnh Mô tả văn dịch có lẽ vào năm 1514, Fracastorius mô tả bệnh tương tự gia súc Italy Gần 400 năm sau, vào năm 1897 Friedrich Loeffler Frosch chứng minh tác nhân gây nên bệnh lở mồm long móng qua lọc Hình: Friedrich Loeffler Đây minh chứng cho thấy bệnh động vật tác nhân qua lọc gọi virus gây ra, mở kỷ nguyên cho ngành virus học (Virology) 1929: Những trường hợp cuối Mỹ 1953: Những trường hợp cuối Canada Mexico 1993: Italy 1997: Đài Loan (Taiwan) 2001: Anh (United Kingdom) Vài đợt dịch khác năm 1967-1968 and 1981 Dịch bệnh lở mồm long móng xảy nhiều châu lục châu Á, châu Phi, châu Âu Nam Mỹ (7) Ở châu Âu, bệnh bùng phát Anh, Hà Lan Pháp vào năm 2001 Hàng triệu gia súc bị thiêu hủy gây tổn thất lớn cho ngành chăn ni nói riêng kinh tế quốc gia nói chung Cùng năm đó, dịch xảy Hàn Quốc, Nhật Bản Đài Loan LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đến cuối năm 2003, dịch xảy vùng Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Myanma, Philippines Việt Nam Một năm sau, dịch lan tới Trung Quốc, Nga, Mông Cổ tiếp tục Myanma Hình: Các đợt dịch FMD năm 2003 Trong năm 2005 2006, dịch tràn tới Nam Mỹ quốc gia Brasil, Argentina Paraquay châu Phi (Nam Phi) (1) Việt Nam Năm 2006 năm bệnh dịch lở mồm long móng xảy mạnh hầu hết tỉnh thành Việt Nam với hàng chục nghìn gia sục bị nhiễm bệnh Tuy nhiên, điều kiện ý thức người dân, trình độ thiếu trách nhiệm cán thú y quyền địa phương mà dịch bệnh khơng thể khống chế dễ dàng Một số nơi, sử dụng vật chết làm thức ăn 2.1.2 Phân bố bệnh giới Các type huyết có phân bố khác giới Type huyết O, A nhận biết nhiều vùng khác giới Trái lại type huyết SAT1, SAT2, SAT3 giới hạn số nước thuộc châu Phi Typ huyết Asia tìm thấy nhiều nước thuộc châu Á Riêng type huyết C tồn vài nước Philippines LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Theo tài liệu Cục Thú y, dòng virus gây bệnh LMLM gia súc Việt Nam thuộc type O, gần có xuất virus type A miền Trung virus type Asia tỉnh miền núi phía bắc (5) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình: FMD type O virus từ phía Bắc Việt Nam Tính tới ngày 1/11/2009: Ở Tuyên Quang: Ngày 25/10/2009, dịch Lở mồm xảy địa bàn xã Công Đa huyện Yên Sơn làm 17 trâu mắc bệnh Kết xét nghiệm bệnh phẩm dương tính với chủng vi rút Lở mồm long móng type O Hiện tại, địa phương tiến hành biện pháp phòng, chống dịch theo quy định Hiện nay, nước 10 tỉnh là: Quảng Nam, Đăk Lăk, Yên Bái, Sơn La, Hà Giang, Quảng Ninh, Gia Lai, Hịa Bình, Lai Châu Tun Quang có dịch LMLM chưa qua 21 ngày 2.2 Giới thiệu virus lở mồm long móng 2.2.1 Đặc điểm cấu trúc, hình thái Virus lở mồm long móng ( Foot and Mouth Desease Virus) phát bao gồm sợi đơn RNA, kích thước khoảng 8500 base, bao bọc bốn protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4) tạo thành lớp vỏ capsid có 20 mặt (icosahedral) (1) VP1, VP2, VP3 tạo nên bề mặt khối 20 mặt đối xứng (phân tử 12S) VP4 protein bên capside, kết dính ARN virus với mặt capside LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình: Cấu trúc FMD Virus FMD Virus thuộc họ Picorna Viridae có type (O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 Asia 1, type cịn có nhiều phụ type, thí dụ tiểu type O1, O2, O3 …, A1, A2, A3, C1, C2, C3 … vào khác biệt gen cấu trúc kháng nguyên) Các type virus phân bố không giới, type O type phổ biến giới Các type giám định huyết miễn dịch chéo, ổ dịch, động vật mắc bệnh một lúc nhiều type huyết Vì thế, có biến đổi mặt di truyền dẩn đến biến đổi mặt kháng nguyên virus ổ dịch việc kiểm sốt bệnh vaccine cũ khơng có hiệu Virus type A nhóm có tính đa dạng kháng nguyên cao Type A có đến 32 type phụ Và người ta chưa thống với số lượng kiểu di truyền virus type A giải trình tự gen VP1 Với virus type C việc giải trình tự gen VP1 cho phép phân chúng thành nhóm di truyền Virus type Asia có đa dạng di truyền nhất, có nhóm di truyền Giải trình tự gen VP1, type SAT1 có nhóm, SAT2 có nhóm SAT3 có nhóm di truyền phân bố theo khu vực địa lý rõ ràng Sự biến đổi type huyết phức tạp, điều chưa hiểu biết rõ Do ngành thú y phải chọn vaccine với type gây bệnh để tiêm phòng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com (15) Sức đề kháng virus: Virus có sức đề kháng mạnh (8) + Ở 600C tồn 5-15 phút + Ở 1000C virus chết + Từ 0-40C tồn 425 ngày + Trong đất ẩm virus sống hàng năm, gặp điều kiện thuận lợi phát triển gây bệnh + Trong thịt ướp lạnh virus tồn lâu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Trong phân ủ thành đống virus tồn ngày + Nước tiểu virus tồn 39 ngày + Virus FMDV khơng có vỏ bọc, nên chúng có sức đề kháng cao dung môi hữu ( cồn, ete…) + Mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol, … + Virus bền vững khoảng pH = – 7,7 Nhanh chóng bị vơ hoạt độ pH cao thấp (pH 11) Ở pH = 6, virus khả gây nhiễm 2.2.2 Yếu tố độc tính (1) Function Adsorption and penetration Translation Viral factors Capsid proteins (VP1 to 3) Host factors Integrins, other receptors (?), entry factors (?) eIFs, PTBP, ITAF45 Cellular membranes, PCBP, PABP Lpro, IRES elements S region, poly(C), cre, 2B, 2C, 3A, 3B, RNA replication 3Cpro, 3Dpol Assembly and Capsid proteins (VP0, VP1, and VP3), Cellular membranes (?) maturation 3Cpro, 2A, viral RNA Bảng: Các yếu tố virus tế bào chủ định độc lực Các nghiên cứu cho thấy virus có trình tự RGD VP1 G-H loop đột biến khơng thể nhân lên nuôi cấy gây bệnh gia súc (11) Các biến thể virus type O thích hợp với thụ thể HS in vitro, cho thấy tầm quan trọng tương tác virus-intergrin in vivo (Integrin họ protein xuyên màng có màng tế bào động vật Chức tạo liên kết với extracellular matrix (ECM) truyền tín hiệu ECM với tế bào) Lpro cho thấy yếu tố định độc lực virus, dựa sở thí nghiệm động vật với kỹ thuật di truyền, virus type A12 xoá bỏ Lpro Độc lực virus yếu so với virus hoang dại (wild virus) thiếu Lpro dẫn đến khả ngừng tổng hợp protein tế bào (cellular protein) Vai trò protein 3A độc lực virus chứng minh qua nghiên cứu phân lập virus FMDV đáp ứng với dịch Đài Loan năm 1997 (designated O/Taw/97) Đó đợt dịch có heo bị bệnh, gây nên tỷ lệ chết cao, ngồi gia súc khác khơng bị ảnh hưởng Nghiên cứu mức độ phân tử phát virus chứa codon 10 delection (10codon deletion) nửa cuối đầu C protein 3A Vị trí tương tự với codon 19-20 delection (19- to 20-codon deletion) tìm thấy FMDV chuyển phơi gà (FMDV passaged in chicken embryos) Virus làm giảm độc tính bò (12) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3 Đặc điểm dịch tễ học 2.3.1 Động vật cảm nhiễm (5) Trong thiên nhiên: trâu bò mẫn cảm với bệnh nhất, đến heo, dê, cừu, loài dã thú hươu, nai, heo rừng…Loài ăn thịt người nhạy cảm với bệnh, lồi móng ngựa, gia cầm, chim khơng mắc bệnh Ở người, theo tài liệu Chung Văn Lẫm, 1997 Học viện kỹ thuật quốc gia Bình Đơng Đài Loan, người ăn thịt bị mắc bệnh nấu chín, cơng nhân giết mổ gia súc mắc bệnh lở mồm long móng khơng mắc bệnh Tuy nhiên, theo tài liệu BS Nguyễn Vĩnh Phước, người chăm sóc gia súc bệnh lở mồm long móng mắc bệnh virus xâm nhập qua vết thương da, đường tiêu hố, hơ hấp, thời gian nung bệnh khoảng 4-8 ngày, sau xuất triệu chứng: sốt, mụn nước mọc đầu ngón tay, bàn chân, cánh tay nơi khác Đặc biệt, mụn gây ngứa, gây triệu chứng gãi nhiều, đơi mụn mọc lợi răng, gây viêm miệng Bệnh kéo dài đến 10 ngày, sau hết bệnh Chất chứa virus: - Mụn nước nơi tập trung nhiều virus nhất, đặc biệt mụn nước sơ phát hình thành - Trên thể thú ngồi mụn nước, chất tiết nước bọt, nước tiểu, phân, sữa, nước mắt, nước mũi chưá nhiều virus Số lượng virus chất thải thay đổi tuỳ thuộc vào thời gian mắc bệnh, thường cao ngày đầu giảm dần Sau tuần khơng cịn thấy virus chất tiết Trung bình heo mắc bệnh thải khoảng tỉ virus ngày (gấp 3.000 lần bò) - Trên thú chết bị giết mổ, virus tập trung nhiều máu, bắp nội tạng Lượng virus bắp cao máu có mặt đến ngày thứ sau mắc bệnh 2.3.2 Đường xâm nhập cách truyền bệnh (5) Đường xâm nhập tiêu hố, virus vào thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống tiêu hố Ngồi ra, vết trầy da, đầu vú nơi virus xâm nhập vào thể Đường sinh dục hô hấp coi đường xâm nhập phụ Quá trình lây lan bệnh diễn theo cách thức sau: + Lây trực tiếp qua nước bọt chất tiết nhốt chung chăn thả chung gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi, chân tay, giầy dép người chăn nuôi, người tham gia điều trị bệnh lây lan việc bán chạy gia súc mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý mức thịt gia súc mắc bệnh vận chuyển gia súc mắc bệnh + Virus theo gió phát tán khơng khí cự ly 10km 2.3.3 Cơ chế gây bệnh (5) - Thời gian nung bệnh trung bình 2-4 ngày, đơi kéo dài đến ngày - Đầu tiên virus xâm nhập vào thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, qua thức ăn, nước uống… vết trầy bên thể Virus nhân lên vị trí xâm nhập lớp thượng bì miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, da, tạo nên mụn nước sơ cấp, thường mụn nước giai đoạn thú sinh hoạt bình thường, dễ dàng bị bỏ qua khơng phát Sau 1-2 ngày virus từ mụn nước sơ phát xâm nhập vào máu phủ tạng, tạo nên triệu chứng sốt cao Tuy nhiên, máu phủ tạng nơi thích hợp cho phát triển, virus quay ngược trở vị trí thể có vùng thượng bì non mơi, nướu răng, lưỡi, gờ móng, đầu vú để phát triển, tạo mụn nước thứ cấp Đặc điểm mụn nước mọc phần thượng bì, khơng ăn sâu vào lớp trung bì hạ bì, sau mụn nước mau lành lại, gây nhiễm trùng thành mụn mủ chăm sóc tốt - Mụn mọc miệng, lưỡi gây cảm giác đau nhức làm thú khơng nuốt được, nước bọt bị kích thích chảy đầy miệng Heo con, bê nghé bỏ bú chết sau vài ngày mắc bệnh - Mụn nước móng chân thường bị nhiễm trùng thú đứng phân, đất, vi trùng phụ nhiễm công sâu vào lớp bên gây hư hại nặng tổ chức da gờ móng, làm móng dễ bị bong tróc 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Móng bị bong tróc - Virus tạo mụn nước khí quản, phế quản cơng vào tim kéo theo phụ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus, tạo nên thể viêm tim, thoái hoá tim làm gia súc chết ngộp 2.3.4 Triệu chứng bệnh (8) Thời gian nung bệnh từ 2-7 ngày, trung bình 3-4 ngày, gồm thể bệnh Thể thông thường - Bệnh hay gặp vùng nhiệt đới, thú ủ rũ, lông dựng, da mũi khô, thú sốt cao 40-41 0C kéo dài ngày - Xuất mụn nước da, vành móng kẻ chân, lưỡi, vú làm thú ăn, nhai khó khăn 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chảy nước bọt góc miệng Thương tổn lưỡi bị Hình thành mụn nước quanh đầu vú, đầu vú bị thương tổn - Ở miệng: lưỡi có mụn to đầu lưỡi gốc lưỡi hai bên lưỡi, xoang miệng má, lỗ chân răng, mơi có mụn lấm hạt ké, hạt bắp Sau mụn vỡ tạo thành vết loét đáy nhỏ phủ màu xám Nước dãi chảy nhiều bọt xà phòng Virus LMLM gây thương tổn vùng miệng lưỡi - Ở mũi: niêm mạc có mụn nước, đặt biệt vành mũi có mụn loét, nước mũi lúc đầu sau đục dần 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Ở chân, kẽ móng có mụn nước từ trước sau, mụn vỡ làm long móng - Ngồi da: xuất mụn loét vùng da mỏng bụng, bẹn, vú, đầu núm vú … - Sau hàng loạt mụn nước vỡ dần dẫn đến nhiễm trùng máu, nhiễm trùng da, thú sốt cao, suy nhược dần chết Thể biến chứng - Những biến chứng xảy điều kiện vệ sinh, chăm sóc làm mụn vỡ dẫn đến nhiễm trùng, chân bị long móng, thối móng, thối xương làm thú què Vú bị viêm tắt sữa Các mụn khác vỡ gây nhiễm vi khuẩn kế phát, bại huyết chết Viêm loét gây thối Mụn vỡ gây viêm loét kẽ móng chân Viêm loét gây thối móng sứt móng - Bệnh lở mồm long móng ghép với bệnh ký sinh trùng hay vi khuẩn khác có sẵn máu làm vật mau chóng chết Thể ác tính 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Đối với heo con: sốt cao 40-41,5oC, ngày đầu thấy toàn thân đỏ ửng da niêm mạc Chảy nước mắt nước dãi, sau 3-4 ngày thấy da nhăn nheo nứt thành vết từ xuống có nước chảy Nhiều miệng viêm loét không bú nhiễm trùng máu chết Tốc độ lây nhiễm đàn heo nhanh Bệnh tích thường gặp bốn chân, mụn loét miệng gây tượng long móng, sau 7-10 ngày lây lan sang tồn đàn - Đối với heo nái: bệnh biểu nhẹ hơn, thấy mụn nước vú, kẽ móng chân, có nhiễm trùng sưng móng viêm có mủ, cà nhắc, có long móng 2.3.5 Bệnh tích (8) - Chủ yếu đường tiêu hóa miệng có vết loét lưỡi, lỗ chân răng, hầu, thực quản, dày… - Ở đường hô hấp gây viêm phế quản Bên phủ tạng: tim bị viêm cấp, van tim bị sùi loét (TIM CỌP), lách bị sưng đen, niêm mạc ruột non ruột già xuất huyết điểm, long móng, thối móng, rụng xương bàn chân Khi khỏi bệnh vết loét để lại sẹo miệng 2.4 Chẩn đốn virus lở mồm long móng 2.4.1 Chẩn đốn kỹ thuật nuôi cấy tế bào a Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là đơn vị nuôi cấy nhỏ nhất, kỹ thuật trì phát triển tế bào thể sống, tế bào điều kiện phịng thí nghiệm tự phân chia, thực đầy đủ chức biến dưỡng chức chuyên biệt tế bào Nuôi cấy tế bào Kỹ thuật nuôi cấy tế bào tiến hành lần đầu vào năm 1907 Harrison với tế bào thần kinh ếch Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy tế bào ứng dụng rộng rãi lĩnh vực thú y, nhân y, sinh học mục đích nghiên cứu tác động chất lên tế bào (dược học, độc tố học), chẩn đoán điều trị ung thư (ung thư học), chẩn đoán tác nhân gây bệnh, sản xuất kháng thể đơn dòng, sản xuất vaccine (miễn dịch học, virus học, vi khuẩn học), chẩn đoán biến đổi gen sản xuất sản phẩm sinh học hormone, enzyme trị liệu (công nghệ gen, công nghệ sinh học) Việc ni cấy tế bào động vật địi hỏi điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt môi trường nuôi cấy phức tạp, giàu chất dinh dưỡng Các loại tế bào nuôi cấy 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trong nuôi cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai trường hợp: tế bào bậc hay tế bào sơ cấp tế bào bậc hai hay tế bào thứ cấp - Tế bào bậc (Primary cells) tế bào thu trực tiếp từ quan hay mô động vật - Khi nuôi cấy chuyển tiếp tế bào điều kiện phịng thí nghiệm thu tế bào bậc hai (Secondary cells), tế bào nuôi chuyển tiếp nhiều lần, số có khả trì phát triển vài tuần vài tháng, số trì phát triển khơng hạn định Những tế bào giữ lại làm dòng tế bào giống phục vụ cho nghiên cứu tế bào Các loại tế bào nuôi cấy - Tế bào biểu mô (Epithelial cells) - Nguyên sợi bào (Firoblast cells) - Tế bào (Muscle cells) - Tế bào thần kinh (Nerve cells) - Tế bào lympho bào Tế bào động vật bảo quản nitơ lỏng nhiệt độ -196oC, nhiệt độ này, tế bào giữ khả sống khơng hạn định phát triển trở lại môi trường nuôi cấy tế bào rã đông (3) Các loại tế bào khác có khả phát triển khác Dịng tế bào Nguồn gốc Loại tế bào ni cấy BHK Thận chuột Hamster nhỏ Nguyên sợi bào MDCK Thận chó Tế bào biểu mơ Vero Thận khỉ Ngun sợi bào CHO Buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc Tế bào biểu mơ (Dịng tế bào: quần thể tế bào giống hệt nhau, bắt nguồn từ tế bào ban đầu) Một số phương tiện cần thiết - Phịng thí nghiệm: sạch, chiếu sáng tốt, người qua lại - Tủ cấy vô trùng chuyên nuôi cấy tế bào (hệ thống vô trùng) - Tủ ấm thường tủ ấm CO2 - Tủ lạnh thường tủ lạnh sâu - Bình nitơ lỏng để bảo quản tế bào 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Hệ thống cất nước hai lần hệ thống lọc loại trừ chất độc vô hữu - Hệ thống lọc vơ trùng hệ thống trypsin hố - Dụng cụ thuỷ tinh nhựa: đựng môi trường nước cất - Kính hiển vi soi ngược - Một số máy móc khác : autoclave, máy đếm tế bào, máy chụp hình, máy ly tâm, Kỹ thuật vơ trùng Có tầm quan trọng lớn ni cấy tế bào động vật - Xử lý chai nhựa nuôi cấy tế bào - Xử lý chai thuỷ tinh - Vô trùng khu vực thao tác - Vô trùng bề mặt khu vực làm việc : dọn cồn 70o, lau cồn dụng cụ, xếp dụng cụ, làm xong dọn dẹp nơi thao tác, sát trùng buồng sấy vơ trùng tia cực tím trước lần thao tác Môi trường yếu tố cần thiết cho nuôi cấy Yêu cầu: tế bào ống nghiệp gần giống động vật sống Các yếu tố quan trọng - Nền: tạo bề mặt đặc biệt để tế bào bám - Môi trường: đủ dưỡng chất cho tế bào phát triển (Carbonhydrate, Glucose, Amino acid, muối đẳng trương, Bicarbonate, Vitamin, Hormone, Phenol Red, ) Chất bổ sung vào môi trường : huyết 10% Điều kiện nuôi cấy - Nhiệt độ: 37oC Nhiệt độ thấp 37oC, tỷ lệ phát triển giảm, tế bào chưa bị tổn thương Nhiệt độ từ 39-40oC, tế bào bị phá huỷ - pH = 7,4 Sự cấy - Đưa tế bào vào môi trường nuôi cấy tiệt trùng - Mật độ lúc cấy 104- 105 tế bào tb/ml - Sau – ngày đạt 106 tế bào 105 tế bào/ cm2/bề mặt cứng 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Sự sinh trưởng ngừng lại giới hạn chất dinh dưỡng, tích tụ sản phẩm độc, thiếu bề mặt tăng trưởng (bề mặt cứng) Lúc ta cần thay mơi trường hồn tồn hay phần sau ngày để đạt mật độ tối đa cao Cách nhận biết phát triển tế bào - Trực tiếp: đếm tế bào lần ngày, thời điểm định Dùng buồng đếm hồng cầu, bổ sung Trypan Blue giúp đếm dễ dàng Ưu điểm : lúc đếm nhiều mẫu Hạn chế : số mẫu ít, sai số khoảng 10% - Gián tiếp: xác định sản phẩm tế bào để xác định phát triển tế bào Ví dụ: xác định protein, xác định DNA, xác định Glucose, Cấy chuyển - Cấy số tế bào vào môi trường ( tế bào ngừng tăng trưởng) - Ủ môi trường tủ ấm trước cấy chuyển: môi trường nhiệt độ phịng khơng nhiệt độ thích hợp cho tế bào - Tách tế bào khỏi bề mặt tăng trưởng trypsin 15 phút, hút bỏ môi trường, rửa lớp tế bào 5ml PBSA - Cho 3ml trypsin, để lọ tế bào tủ ấm phút Bất hoạt trypsin 5ml môi trường phát triển, rút cho vào ống ly tâm - Ly tâm 2000vòng/phút phút, đổ bỏ phần nước Cho 3ml môi trường phát triển, trộn đều, hút vào lọ nuôi cấy có sẵn 4ml mơi trường phát triển - Đưa lọ vào tủ ấm 37oC / 5% CO2 Thu hoạch tế bào - Dùng trypsin 37oC - Để bình ni cấy vào tủ lạnh - Cho trypsin 37oC vào, tế bào co trịn, bong khỏi bề mặt ni cấy b Chẩn đốn virus lở mồm long móng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Chọn mẫu Lấy mẫu đường hơ hấp, dịch họng, hay đường tiêu hố, biểu mô nghi ngờ nhiễm virus Thời gian lấy mẫu nên lúc biểu triệu chứng, hay lúc chết, không nên lấy mẫu lúc vật chết thời gian Cách bảo quản 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm virut phụ thuộc nhiều vào chất lượng bệnh phẩm, cơng tác thu thập bảo quản mẫu bệnh phẩm phải đảm bảo: + Đúng chủng loại + Đúng thời điểm + Đúng thao tác + Bảo quản vận chuyển bệnh phẩm cách Mẫu để bình, túi sạch, chuyển đến phịng thí nghiệm Nếu nơi lấy mẫu xa phải bảo quản đá khô, giữ -70oC Dùng glycerol 50% (50%glycerol + 50% nước muối sinh lý) giữ tủ lạnh 4oC Vật liệu phương pháp Dòng tế bào: tế bào Baby hamster kidney (BHK), strain 21, clone 13 Mẫu bệnh phẩm Mơi trường: • • DMEM (4,500 mg/L D-glucose, L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate) bổ sung 5% foetal calf serum (FCS) Penicillin G(100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml) • pH điều chỉnh lượng bicarbonate Vô trùng nơi thao tác, bàn làm việc, dụng cụ nuôi cấy Cách xử lý mẫu - Lấy mẫu bệnh phẩm: cắt mô nghi ngờ, lấy tương ứng 2g (đủ để tạo huyễn dịch 10-20%) Lấy 1g huyễn dịch cho vào 9ml nước muối sinh lý - Nghiền mẫu, sử dụng cát hay mảnh thuỷ tinh để nghiền nhuyễn hơn, sau cho nước muối sinh lý vào, bảo quản tủ lạnh - Lọc lấy nước hay ly tâm, cho vào lọ, dùng kháng sinh (penicillin streptomycin) để diệt khuẩn Sau 30 phút – giờ, lọc qua lưới có đường kính 0,2 μm - Đưa vào môi trường nuôi cấy tế bào Khi tế bào lớp tạo thành (phủ khoảng 70% nuôi cấy), đưa mẫu bệnh phẩm vào từ từ, tránh làm bong lớp tế bào Thu hoạch tế bào Kết 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com • Để xác định virus có gây bệnh tích tế bào hay không, dùng phương pháp nhuộm tế bào (dùng kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang) thực trực tiếp mơi trường tế bào • Nếu có virus, quan sát kính hiển vi, virus bắt màu thấy phát huỳnh quang màu xanh 2.4.2 Các kỹ thuật chẩn đoán khác - Chẩn đoán kỹ thuật gen - Chẩn đoán kỹ thuật Elisa - Phương pháp xét nghiệm miễn dịch - Phương pháp xét nghiệm trung hồ huyết - Chẩn đốn kỹ thuật PCR, RT-PCR, … KẾT LUẬN Bệnh lở mồm long móng bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh gia súc thuộc guốc chẵn Bệnh mối nguy hại lớn ngành chăn nuôi gia súc nước, ảnh hưởng lớn đến lợi ích kinh tế, xã hội, mơi trường Bệnh có triệu chứng lâm sàng khó phân biệt sớm với bệnh mụn nước khác như: Swine Vesicular Disease (SVD), Vesicular Stomatitis (VS), and Vesicular Exanthema (VE) (15) Do đó, việc chẩn đốn bệnh nhanh xác cần thiết, nhằm có biện pháp phịng trừ thích hợp, đồng thời giảm mức độ thiệt hại lây nhiễm bệnh xuống mức thấp Ni cấy tế bào có độ xác cao, phương pháp thu nhận virus cho nghiên cứu tiếp theo, nhiên phương pháp địi hỏi người thao tác có chun môn cao, cần nhiều thiết bị đại, TÀI LIỆU THAM KHẢO Marvin J Grubman* and Barry Baxt Foot-and-Mouth Disease Plum Island Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, North Atlantic Area, Greenport, New York Rueckert, R R., and E Wimmer 1984 Systematic nomenclature of picornavirus proteins J Virol 50:957-959 Nguyễn Ngọc Hải Công nghệ sinh học thú y Nhà xuất Nông nghiệp 2007 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com http://www.haiduongdost.gov.vn/nongnghiep/includes/main/news/print/?itemid=470&l ang=vn www.lrc.ctu.edu.vn/pdoc/35/37lomomlogmog.pdf http://www.docjax.com/search/index.shtml?q=foot-and-mouth%20disease%20virus Danelle Bickett-Weddle, DVM Foot and Mouth Desease Center for Food Security and Public Health Iowa State University – 2004 http://vi.wikipedia.org/wiki/L%E1%BB%9F_m%E1%BB%93m_long_m%C3%B3ng http://www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=265&detail=16&ucat=42 10 DANIEL SA-CARVALHO, ELIZABETH RIEDER, BARRY BAXT,1 RENATO RODARTE, AMILCAR TANURI, AND PETER W MASON Tissue Culture Adaptation of Foot-and-Mouth Disease Virus Selects Viruses That Bind to Heparin and Are Attenuated in Cattle Plum Island Animal Disease Center, Agricultural Research Service, North Atlantic Area, U.S Department of Agriculture, Greenport, New York 11944,1 and Departmento de Genetica, Instituto de Biologia, Universidade Federal Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil 11 Leippert, M., E Beck, F Weiland, and E Pfaff 1997 Point mutations within the ßGßH loop of foot-and-mouth disease virus O1K affect virus attachment to target cells J Virol 71:1046-1051.[Abstract] 12 Giraudo, A T., E Beck, K Strebel, P A de Mello, J L La Torre, E A Scodeller, and I E Bergmann 1990 Identification of a nucleotide deletion in parts of polypeptide 3A in two independent attenuated aphthovirus strains Virology 177:780-783 13 http://www.nghean.gov.vn/adnews/default.asp?m=7&act=view&id=6609&p=1 14 Jae Ku Oem1,*, Kwang Nyeong Lee1, In Soo Cho1, Soo Jeong Kye1, Jee Yong Park1, Jong Hyeon Park1, Yong Joo Kim1, Yi Seok Joo1, Hee Jong Song2 Identification and antigenic site analysis of foot-and-mouth disease virus from pigs and cattle in Korea J Vet Sci (2005), 6(2), 117–124 15 http://www.foot-and-mouth.org/fmd-csf-ca/about-the-project/about-classical-swinefever-virus-csfv 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 3 TỔNG QUAN 3.1 Bệnh lở mồm long móng 3.1.1 Lịch sử phát .4 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.1.2 Phân bố bệnh giới 3.2 Giới thiệu virus lở mồm long móng 3.2.1 Đặc điểm cấu trúc, hình thái .7 3.2.2 Yêú tố độc tính 3.3 Đặc điểm dịch tễ học .10 3.3.1 Động vật cảm nhiễm 10 3.3.2 Đường xâm nhập cách truyền bệnh .11 3.3.3 Cơ chế gây bệnh 11 3.3.4 Triệu chứng bệnh 12 3.3.5 Bệnh tích 15 3.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng .15 3.4.1 Chẩn đốn kỹ thuật ni cấy tế bào 15 • Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy tế bào 15 • Chẩn đốn virus lở mồm long móng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 19 3.4.2 Các kỹ thuật chẩn đoán khác 20 KẾT LUẬN 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 Phần tài liệu tham khảo đánh số, tài liệu tham khảo đặt dấu ngoặc đơn sau phần trích dẫn 23 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Chẩn đốn virus lở mồm long móng .15 3.4.1 Chẩn đoán kỹ thuật nuôi cấy tế bào 15 • Giới thiệu kỹ thuật ni cấy tế bào 15 • Chẩn đốn virus lở mồm long móng kỹ thuật nuôi cấy tế bào. .. long móng, thối móng, rụng xương bàn chân Khi khỏi bệnh vết loét để lại sẹo miệng 2.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng 2.4.1 Chẩn đốn kỹ thuật nuôi cấy tế bào a Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy tế. .. dưỡng chức chuyên biệt tế bào Nuôi cấy tế bào Kỹ thuật nuôi cấy tế bào tiến hành lần đầu vào năm 1907 Harrison với tế bào thần kinh ếch Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy tế bào ứng dụng rộng rãi lĩnh