CHẨN đoán BỆNH NEWCASTLE BẰNG kỹ THUẬT NUÔI cấy tế bào

ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH Bài Tiểu Luận: CHẨN ĐỐN BỆNH NEWCASTLE BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY TẾ BÀO GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: TRẦN THỊ THANH PHẤN MSSV: 06126110 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào MỤC LỤC I II ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN Bệnh Newcastle 1.1 Khái quát bệnh Newcastle 1.2 Virus gây bệnh 1.2.1 Hệ thống phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái lý hóa virus 1.2.3 Các đặc tính sinh học 1.3 Đặc điểm dịch tễ học bệnh Newcastle 12 1.3.1 Phân bố diễn biến bệnh 12 1.3.2 Vật chủ .12 1.3.3 Đường xâm nhập truyền lây virus 12 1.4 Đặc điểm bệnh học 13 1.4.1 Quá trình sinh bệnh 13 1.4.2 Triệu chứng bệnh tích 14 Phương pháp nuôi cấy tế bào 16 2.1 Khái niệm 16 2.2 Các loại tế bào nuôi cấy: Tế bào biểu mô, Nguyên sợi bào, Tế bào cơ, .16 2.3 Một số máy móc thiết bị cần thiết 16 2.4 Thành phần môi trường .16 2.5 Kiểm sốt việc ni cấp tế bào .17 2.6 Thu hoạch tế bào 18 2.7 Bảo quản tế bào 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2.8 Nguyên nhân gây nhiễm trùng nuôi cấy tế bào 18 2.9 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 18 Chẩn đoán bệnh Newcastle phương pháp nuôi cấy tế bào .19 Thu thập gởi mẫu chuẩn đoán bệnh 19 1.1 Mẫu .19 1.2 Mẫu huyết .19 Xử lý mẫu 21 Phương pháp chuẩn bị môi trường xơ phôi gà ( CEF) lớp 21 3.1 Nguyên liệu 21 3.2 Trypsin có tế bào .22 3.3 Cấy tế bào vào chai 23 Kiểm tra mẫu bệnh phẩm .23 IV KẾT LUẬN 25 V TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Newcastle mối quan tâm hàng đầu chăn nuôi gà bệnh lây lan nhanh, tỷ lệ chết cao làm ảnh hưởng trực tiếp đến kinh tế hộ gia đình Hơn bệnh cịn mối nguy bùng phát dịch diện rộng gây ô nhiễm môi trường sức khoẻ cộng đồng Ảnh hưởng bệnh Newcastle kinh tế gia cầm toàn cầu lớn, bệnh gây tác hại lớn đến phát triển ngành chăn nuôi gia cầm giới Ngoài thiệt hại liên tục bệnh Newcastle gây ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng chất lượng thực phẩm cho người dân Trong thực tế có nhiều người thường có tư tưởng chủ quan thấy thời gian dài gia đình nhà khơng bị bệnh Newcastle khơng thực quy trình nhỏ tiêm phịng vaccine Newcastle từ dẫn đến nguy mắc bệnh cao.Từ có dịch bệnh xảy cơng tác kiểm sốt dịch bệnh trở nên khó khăn Vì việc chẩn đốn mẫu bệnh phẩm để xác định nguyên nhân gây chết gia cầm có phải virus Newcastle gây hay khơng có ý nghĩa thực tế lớn nhằm góp phần làm giảm tối đa rủi ro xảy ngăn chặn không cho dịch bệnh lan tràn sang khu vực khác giới Vì cơng tác kiểm sốt dịch bệnh dễ dàng hiệu Hiện có nhiều kỷ thuật phân tử để chẩn đoán bệnh Newcastle dùng phôi gà, phương pháp huyết học, phương pháp thử thách, phương háp kháng thẻ huỳnh quang phương pháp chẩn đốn xác hiệu đặc trưng phương pháp ni cấy tế bào LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn bệnh Newcastle bắng kỹ thuật ni cấy tế bào II TỔNG QUAN Bệnh Newcastle 1.1 Khái quát bệnh Newcastle Bệnh Newcastle hay gọi bệnh dịch tả hay bệnh gà rù Bệnh virus avian paramyxovirus type (APMV-1) gây nên chủ yếu lồi gia cầm, gà lồi mẫn cảm Trong tài liệu chuyên môn trước đây, bệnh Newcastle gọi bệnh pseudo-poutry plague, avian pest, avian distemper… Virus newcastle đa dạng độc lực thường gây nhiều dạng bệnh với mức độ nghiêm trọng khác Sự đa dạng thường gây số khó khăn việc nhận dạng bệnh có virus Newcastle xâm nhập vào đàn gia cầm (Trần Đình Từ, 1995) Bệnh Newcastle phức tạp chỗ chủng virus khác gây biến động lớn mức độ nghiêm trọng bệnh, kể vật chủ biết rõ gà Để phân chia thể hay týp bệnh lý bệnh Newcastle dựa vào triệu chứng lâm sàng gà, Beard Hanson (1984) [72] tóm tắt sau: (1) Thể Doyle (1927) [99] thể bệnh Newcastle cấp tính, gây tử vong cho gà lứa tuổi Thường xuất huyết đường tiêu hóa thể bệnh gọi thể bệnh Newcastle độc lực cao hướng nội tạng ( VVND: Viscerotropic velogenic Newcastle disease) (2) Thể Beach ( Beach, 1942) [69] thể bệnh Newcastle cấp tính thường gây tử vong gà lứa tuổi Các triệu chứng hô hấp thần kinh thường xuất trội gọi bệnh Newcastle độc lực cao hướng thần kinh (NVND: Neurotropic velogenic Newcastle disease) (3) Thể Beaudette ( Beaudette and Black, 1946) [74] thể Newcastle nhẹ hơn, thường gây tử vong gà Virus gây týp bệnh thuộc nhóm virus có độc lực trung bình ( Mesogenic NDV) số chủng virus thuộc nhóm sử dụng làm vaccine virus sống dùng để tiêm chủng lặp lại LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn bệnh Newcastle bắng kỹ thuật ni cấy tế bào (4) Thể Hitchner ( Hitchner Johnson,1948) [127] thể bệnh đường hô hấp nhẹ gây nhóm virus có độc lực thấp ( Lentogenic NDV), thường sử dụng để sản xuất loại vaccine virus sống (5) Thể ruột, không triệu chứng ( asymptomatic-enteric form) ( Lancaster, 1981) [156] thể gây nhiễm đường ruột virus gần khơng có độc lực, khơng gây bệnh rõ ràng ( Apathogenic or avirulent NDV) 1.2 Virus gây bệnh 1.2.1 Hệ thống phân loại APMV-1 hay virus Newcastle xếp vào chi Rubulavirus thuộc họ phụ Paramyxovirinae họ Paramyxoviridae Các họ virus Paramyxoviridae, Filoviridae, Rhabdoviridae Bornaviridae tạo nên Mononegavirales, có gen RNA chuỗi đơn âm ( negative single strained RNA) khơng phân đoạn, với nucleocapside có cấu trúc đối xứng xoắn ( Murphy ctv, 1999) [176] Có chín nhóm huyết Avian Paramyxovirus công nhận ký hiệu từ APMV-1 đến APMV-9 (Alexander, 1988) [48] Trong số virus Newcastle ( APMV-1) tác nhân gây bệnh quan trọng gia cầm, APMV-2, APMV-3, APMV-6 APMV-7 có vai trị gây bệnh định LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn bệnh Newcastle bắng kỹ thuật ni cấy tế bào 1.2.2 Đặc điểm hình thái lý hóa virus Soi kính hiển vi điện tử tương phản âm thấy tiểu thể virus Newcastle có dạng đa hình thái, tiêu biểu cho thành viên chi Rubulavirus Các hạt dạng trịn có kích thước khoảng 100-500 nm, cịn dạng sợi có bề ngang khoảng 100 nm với chiều dài thay đổi quan sát Bề mặt hạt virus bao bọc với mấu lồi dài khoảng nm Trong hầu hết vi ảnh điện tử, Nucleocapside thường có “dạng xương cá trích” điển hình cho Paramyxovirus với chiều dài khoảng 18 nm, cấu trúc đối xứng xoắn, quan sát dạng sợi tự nhô từ tiểu thể virus bị đứt gãy ( Murphy ctv, 1999; Alexander, 2003) [176, 53] http://en.wikipedia.org/wiki/Paramyxovirus Bộ gen Avian Paramyxovirus chứa RNA đặc trưng nhất, chuỗi âm với trọng lượng phân tử khoảng 5.106 Da ( Kolakofsky ctv, 1974) [151], chiếm khoảng 0,5 % trọng lượng hạt virus Giải mã trình tự Nucleotide gen virus Newcastle cho thấy có độ dài bao gồm 15.186 Nucleotide ( Philips ctv, 1998) [188] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật ni cấy tế bào Hạt virus có khoảng 20-25% Lipid có nguồn gốc từ tế bào vật chủ khoảng 6% carbonhydrade Tổng trọng lượng phân tử hạt virus trung bình khoảng 5.108 Da, tỉ trọng đường Sucrose 1,18-1,2 g/l ( Alexander, 2003) [53] Điện di tiểu thể virus Newcastle tinh bị phá vỡ gel Polyacryamid thường cho thấy chuỗi Polypeptide Tuy nhiên chuỗi Protein actin vật chủ tích hợp vào hạt virus 1.2.3 Các đặc tính sinh học a Hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu Khả gây kết hồng cầu ( Haemagglutination: HA) virus Newcastle APMV khác Protein HN bám dính vào thụ thể nằm bề mặt hồng cầu Đặc tính ức chế ngưng kết đặc hiệu huyết miễn dịch chứng minh cơng cụ hiệu chẩn đốn bệnh Newcastle LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn bệnh Newcastle bắng kỹ thuật ni cấy tế bào Hồng cầu gà thường dùng phản ứng HA virus Newcastle gây ngưng kết hồng cầu lồi lưỡng thê, bị sát lồi chim khác ( Lancaster, 1966) [154] Avian Paramyxovirus cịn làm ngưng kết tế bào khơng phải hồng cầu chúng có thụ thể phù hợp a Hoạt tính Neuraminidase Enzyme neuraminidase thành phần phân tử HN Enzyme có khả lấy thụ thể từ tế bào vật chủ nhằm ngăn cản bám trở lại vào bề mặt tế bào hạt virus giải phóng ngưng tụ virus b Sự dung hợp tế bào tan huyết Virus Newcastle APMV khác làm tan vỡ hồng cầu hay dung hợp với tế bào khác chế Hiện tượng bám vào vị trí thụ thể tái sản tiếp nối dung hợp màng virus với màng tế bào dẫn đến dung hợp hai hay nhiều tế bào, hình thành tế bào khổng lồ tiểu thể virus mọc chồi từ màng tế bào Màng rắn hồng cầu thường bị vỡ dung hợp virus (Alexander, 2003) [53] c Sự tạo mảng virus Sự tạo mảng môi trường tế bào chủng virus Newcastle khác hình dạng lẫn kích thước có hai hình thái mảng: sang đỏ kích thước LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào mảng tương quan với độc lực chủng virus gà ( Reeve postr, 1971) [194] d Độc lực virus Khả mẫn cảm với virus Newcastle thay đổi theo loài vật chủ Gà nhạy cảm với virus Newcastle Ở gà khả mắc bệnh Newcastle chủ yếu định chủng virus, liều nhiễm, đường lây nhiễm, tuổi yếu tố môi trường có tác động Gà non thể bệnh cấp tính Giống gà khơng có ảnh hưởng nhiều đến tính mẫn cảm gà bệnh Con đường lây nhiễm tự nhiên ( mũi, mắt, miệng) thường dẫn đến triệu chứng hô hấp, tiêm vào bắp thịt, tĩnh mạch, màng não tăng triệu chứng thần kinh Hanson Bradly (1955) [121] xếp chủng virus Newcastle vào ba nhóm có độc lực khác nhau: virus Newcastle độc lực cao, virus Newcastle độc lực trung bình virus Newcastle độc lực thấp dựa vào ba mốc thời gian gây chết phôi gà sau virus tiêm vào túi niệu < 60 giờ, từ 60-90 90 Những nghiên cứu khả gây bệnh virus Newcastle dựa vào giá trị MDT ( Mean Death Time), ICPI ( Intracerebra Pathogenicity Index), IVPI ( Intravenous Pathogenicity Index) củng cố sáng tạo thêm phân nhóm ( bảng 1.2) Bảng 1.2: Phân loại nhóm độc lực virus Newcastle đánh giá qua số độc lực Nhóm độc lực Viscerotropic MDT (giờ) ICPI IVPI micron bị giữ lại kết mạc, niêm mạc mũi khí quản ( Kouwenhoven, 1993) [152] Trong khí quản, virus lan truyền cách nhiễm từ tế bào sang tế bào khác hoạt động lông tơ Hiệu giá virus cao phát 24 – 96h sau nhiễm, sau giảm dần kháng thể tạo thành từ ngày thứ 5, virus diện tới ngày thứ 12 Sự lan truyền phụ thuộc lớn vào độc lực chủng virus Trong chủng virus độc lực thấp diện hệ thống tuần hoàn với hiệu giá thấp, chủng độc lực trung bình xâm nhập vào thận, phổi, túi Fabricius lách Cịn chủng virus độc lực cao phát vòng 22 – 24h tất mô bào với hiệu giá cao tuyến ức ( Thymus) thấp mô não (Singh El – Zein, 1978) [214] Sau nhân lên ban đầu vị trí xâm nhập virus độc lực cao xâm nhập vào máu, tới lách, gan, thận phổi Từ thứ 36 sau nhiễm, nhân lên virus bị cản trở khoảng 12 – 24h hiệu giá virus tụt xuống Virus xâm nhập vào não sau trình nhân lên mơ ngồi hệ thống thần kinh ngừng lại từ thứ 60 sau nhiễm gà bắt đầu chết ( Asdell Hanson, 1960) [65] Đa số virus xâm nhập vào hệ thống 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thần kinh trung ương qua đường máu trước lượng kháng thể có ý nghĩa xuất hệ thống tuần hoàn Tuy nhiên số virus hướng thần kinh nằm hệ thống thần kinh thời điểm đường tiêu hóa hơ hấp xâm nhập vào trung ương thần kinh thông qua dây thần kinh khướu giác 1.4.2 Triệu chứng bệnh tích Thời gian nung bệnh khác nhau, trung bình 5-6 ngày.Hiên có dạng bệnh khác nhau: a Dạng gây chủng độc lực mạnh-nhóm velegenic * Triệu chứng: bệnh xuất đột ngột lây lan nhanh, chết cấp tính 3-4 ngày biểu rõ triệu chứng,bệnh tích Chỉ thấy số triệu chứng - Gà lờ đờ, hô hấp tăng, thở mạnh, ho - Đi tiêu chảy đơi có máu - Một số chảy dịch nhờ mũi, mặt - Mào, mồng, tích tím, phù quanh đầu - Sau 4-5 ngày khơng chết biểu triệu chứng thần kinh ( Mổ lung tung , quay tròn ) - Gà đẻ giảm số lượng trứng, vỏ mềm - Tỉ lệ chết 50%- 90% tùy đàn * Bệnh tích: - Đường tiêu hóa xuất huyết loét điểm 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn bệnh Newcastle bắng kỹ thuật ni cấy tế bào - Thực quản, dày tuyến, dày ( mề ), ruột tịt, ruột già, lỗ huyệt thấy xuất huyết - Mạch ruột viêm đỏ xuất huyết - Niêm mạc mũi, có dịch nhầy đơi xuất huyết lấm đỏ - Buồng trứng sung huyết đỏ số trứng bị teo - Mào, não bị xuất huyết điểm đỏ lấm b Dạng gây chủng độc lực vừa-Nhóm Mesogenic * Triệu chứng: Bệnh xuất đột ngột, lây lan nhanh - Giảm ăn, ho, tiêu chảy phân xanh vàng - Trạng thái run rẩy, sau tuần triệu chứng thần kinh nặng - Gà đẻ tỉ lệ trứng giảm, trứng non nhiều - Tỉ lệ chết từ 5%-50%, có đàn 50% * Bệnh tích: - Niêm mạc dày tuyến xuất huyết xuất huyết khí quản 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Niêm mạc đường hơ hấp có dịch nhờn, đơi có xuất huyết - Giai đoạn đầu lách sưng to c Dạng gây chuẩn độc lực yếu- nhóm Lenetogenic * Triệu chứng: Chủ yếu đường hô hấp ( ho, thở khò khò vào ban đêm ) - Trứng đẻ giảm sau vài tuần lại đẻ lại trở lại bình thường - Gà lớn khơng chết, có gà chết tỉ lệ 1%-10% * Bệnh tích: Chủ yếu đường hơ hấp, khí quản viêm nhẹ d Dạng mang trùng ( khơng có triệu chứng ) - Không gây chết nguy hiểm tồn trữ mầm bệnh làm lây lan cho đàn gà nhập Phương pháp nuôi cấy tế bào 2.1 Khái niệm Nuôi cấy tế bào kỷ thuật trì phát triển tế bào ngồi thể sống, tế bào điều kiện phòng thí nghiệm tự phân chia, thực đầy đủ chức biến dưỡng chức chuyên biệt tế bào 2.2 Các loại tế bào nuôi cấy: Tế bào biểu mô, Nguyên sợi bào, Tế bào cơ, Tế bào thần kinh, Lympho bào 2.3 Một số máy móc thiết bị cần thiết Tủ cấy vơ trùng chun nuôi cấy tế bào, tủ ấm thường tủ ấm CO2 tủ lạnh thường lạnh sâu, bình Nito lỏng, hệ thống nước cất hai lần, hệ thống lọc vô trùng hệ thống trypsin hóa, dụng cụ thủy tinh nhựa, kính hiển vi soi ngược số máy móc khác 2.4 Thành phần mơi trường 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Carbohydrate: Glucose cung cấp nguồn lượng - Aminoacid nồng độ 0,1- 0,2 mol tiền chất tổng hợp protein - Muối đẳng trương: Giữ cân tế bào - Bicarbonate: Hệ thống đệm kết hợp 5-10% CO2 ( tủ ủ ) - Vitamin, hormon: Nồng độ sử dụng khác tùy theo nhu cầu loại tế bào - Phenol red: Chất thị PH môi trường * Điểu kiện nuôi cấy - Nhiệt độ 37o C - PH 7,4 * Chất bổ sung vào môi trường - Huyết phải lọc qua lưới lọc 0.1µm ( vơ trùng ) huyết dễ bị nhiễm loại vi khuẩn, virus Đặt biệt Mycoplasma dễ nhiễm vào huyết lọt qua lưới lọc 0,2µm.Vì để khắc phục cần tìm hiểu rõ nguồn gốc huyết - Ngoài mơi trường ni cấy cịn bổ sung thêm kháng sinh nhằm ngăn cản tượng tạp nhiễm vi khuẩn ( Pennicyline+ Streptomycne+ Gentamycine ) 2.5 Kiểm soát việc nuôi cấp tế bào - Đưa tế bào vào môi trường nuôi cấy tiệt trùng - Mật độ lúc cấp 104- 105 tế bào tb/ml - Sau – ngày đạt 106 tế bào 105 tế bào/ cm2/bề mặt cứng - Sự sinh trưởng ngừng lại giới hạn chất dinh dưỡng, tích tụ sản phẩm độc, thiếu bề mặt tăng trưởng Lúc ta cần thay mơi trường hồn tồn hay phần sau ngày để đạt mật độ tối đa cao 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2.6 Thu hoạch tế bào 2.7 Bảo quản tế bào - Nhiệt độ: -700C: hàng tuần, hàng tháng - Nhiệt độ: -1960C: lâu 2.8 Nguyên nhân gây nhiễm trùng nuôi cấy tế bào - Là vi sinh vật từ nhiều nguồn khác nhau: khơng khí, tủ cấy, vật dụng, người thao tác, chất bổ sung vào môi trường - Cách nhận biết: + Giảm đột ngột pH môi trường + Tạo lớp mây môi trường + Môi trường đục, tạo cặn - Giảm nguồn nhiễm: + Sát trùng nơi làm việc + Sử dụng vật dụng nuôi cấy vô trùng + Vệ sinh cá nhân + Chọn nguồn huyết 2.9 Ứng dụng kỹ thuật ni cấy tế bào - Trong chẩn đốn bệnh - Chẩn đoán điều trị ung thư - Sản xuất kháng thể đơn dòng - Sản xuất vaccine 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Chẩn đoán biến đổi gen sản xuất sản phẩm sinh học ( hormon, enzyme trị liệu ) Chẩn đốn bệnh Newcastle phương pháp ni cấy tế bào - Việc chẩn đốn bệnh quan trọng lý sau đây: + Newcastle bệnh có danh mục kiểm dịch biên giới nước có dịch xảy phải thơng báo với tổ chức dịch tễ giới ( OIE) + Khi ổ dịch khẳng định cần phải giúp cho quyền địa phương hiểu biết dịch tễ học bệnh Newcastle nước họ phát triển chiến lược khống chế bệnh cách phù hợp + Cần tìm hiểu rõ nguyên nhân gây chết ta biết tiêm chủng vaccine phịng bệnh Newcastle khơng thể bảo vệ 100% đàn gà Thu thập gởi mẫu chuẩn đốn bệnh 1.1 Mẫu cơ: Dịng virus cường độc gây bệnh thường yếu chịu nhiệt nên gởi mẫu phải đóng gói cách đặc biệt với nước đá Điều kiện: - Mẫu tươi: Mẫu tùy tạng, lách, phổi đầu gà cịn ngun vẹn gói vào giấy plastic đặc vào hộp xốp vói đá nước đá - Nếu giữ lạnh mẫu không chắn mẫu đến phịng thí nghiệm vịng 24h Các mẫu lách, phổi, đầu nguyên vẹn đoạn xương dài bảo quản glycerine 50% muối giữ mức lạnh bảo quản thời gian đưa mẫu đến phịng thí nghiệm 1.2 Mẫu huyết -Độ tin cậy xét nghiệm huyết phụ thuộc phần lớn chất lượng mẫu Các mẫu bị tan máu bị nhiễm bẩn thường có kết khơng đáng tin cậy 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Kỹ thuật lấy mẫu máu: máu gia cầm thường lấy từ tĩnh mạch cánh Mỗi vật dùng kim tiêm riêng để tránh rủi ro tác nhân gây nhiễm lan truyền giới từ sang khác - Dán nhãn cho mẫu: Các mẫu phải dán nhãn theo thứ tự loại mực không thấm nước - Tránh tượng tan huyết mẫu: tan huyết xảy kỹ thuật lấy mẫu kém, trang bị bẩn kỹ thuật gởi mẫu Nguyên nhân tượng tan huyết bao gồm: + Máu chảy chậm tắt nghẽn, không trúng mạch + Mẫu bị nóng, thường để xe bị ánh nắng mặt trời chiếu trực tiếp lâu + Làm đông lạnh mẫu + Sự nhiễm bẫn mẫu nước + Sự nhiễm bẩn phân vật liệu khác + Dùng sức ép mạch máu chảy qua tim + Bị nhiễm khuẩn lấy mẫu + Dùng thùng không khử trùng để lấy mẫu lưu giữ mẫu - Bảo quản mẫu huyết trước đưa đến phịng thí nghiệm + Các mẫu máu huyết khơng để bình, thùng ống kim tiêm kèm theo chưa khử trùng + Để đông mẫu trước vận chuyển Mẫu cần để nơi ấm đông lại ( máu khơng đơng thời tiết lạnh mẫu làm lạnh sau lấy) + Khi máu đông mẫu cần bảo quản lạnh để giảm nhiễm bẫn, giảm tượng tan huyết vỡ hồng cầu 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào + Nếu mẫu không chuyển đến phịng nghiệm để lâu xét nghiệm nên chắt riêng huyết vào lọ nhựa 5ml 1.8ml vơ trùng có nút vặn chuyển huyết + Các mẫu máu dùng để huyết không làm đông lạnh trước huyết Các mẫu huyết bảo quản đơng lạnh với điều kiện khơng có tế bào máu bên Xử lý mẫu Huyễn dịch chuẩn bị trước tiến hành phân lập virus Não gà lấy ngâm vào dung dịch sinh lý vơ trùng có chứa 2000 UI penniciline/ ml 2000 µg streptomycine/ ml đĩa petri khoảng 30 phút – 80C Lấy khoảng 2g não gà nghiền nhuyễn với 0.5g nước cất vô trùng cối sứ, thêm 8ml dung dịch sinh lý vô trùng có chứa 1000 UI penniciline/ ml 1000µg streptomycine/ ml, nghiền trộn lần Để lắng hút 5ml dịch nghiền, ly tâm 3000 vòng/ phút 10 phút, thúc dịch bệnh phẩm cho vào ống nhựa eppendorf (1.5ml) ghi ký hiệu cho vào tủ lạnh (4 – 80C) chờ tiêm vào môi trường tế bào Phương pháp chuẩn bị môi trường xơ phôi gà ( CEF) lớp 3.1 Nguyên liệu - Trứng gà có phơi – 11 ngày tuổi Soi chọn trứng có phơi phát triển tốt, khỏe mạnh để làm tế bào 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật ni cấy tế bào - Hóa chất mơi trường: + Dung dịch PBS pH 7,2 có kháng sinh với nồng độ: penniciline 200 UI/ml, streptomycine 200µg/ml + NaHCO3 0.75% + trypsin 0.25%, MEM NCS - Tất dụng cụ, trang bị phòng làm tế bào phải vơ trùng 3.2 Trypsin có tế bào - Sát trùng toàn trứng cồn iode Dùng kéo cắt vỏ trứng nơi buồng - Dùng kẹp lấy phơi gà ngâm vào dung dịch PBS có kháng sinh Dùng kéo cắt bỏ đầu, cánh, chân phủ tạng lấy phần thân ngâm vào dung dịch PBS - Rửa thân phôi với dung dịch PBS lần - Cắt nhỏ phần thân phôi kéo Cho thân phôi cắt nhỏ vào bình có khía với khuấy từ - Cho dung dịch PBS vào bình khía: rửa mảnh phôi cắc nhỏ để yên cho lắng xuống, chắt bỏ phần nước Lập lại lần nước - Cho trypsin 0.25% làm ấm trước 370C 20ml/phơi, đặt bình khía lên máy khuấy từ khuấy 20 phút 370C để phân cách tế bào - Thu hoạch huyễn dịch tế bào thêm lượng MEM lạnh huyết để ngưng hoạt động trypsin - Lọc qua lớp vải màng bình ly tâm ly tâm lạnh với tốc độ 1500 vòng/ phút 10 phút Bỏ phần nước bên trên, phần tế bào bên đáy pha với thể tích mơi trường MEM thích hợp, đếm tế bào với 0.1% Trypan blue điều chỉnh lượng tế bào để số lượng 106 tế bào/ ml phôi gà pha với 100ml môi trường phát triển( MEM 5% NCS) 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3.3 Cấy tế bào vào chai - Pha môi trường phát triển: + Trong lít mơi trường có: - • 5% huyết bê sơ sinh ( NCS) • 200000 UI penniciline • 200 mg streptomycine • 50 mg Mycostatin • 0.75% NaHCO3 Pha tế bào vào môi trường chai: Pha trực tiếp số lượng tế bào thích hợp xác định vào môi trường phát triển Lắc tế bào mơi trường cách lắc bình xoay vòng nhiều lần chai: 0.2ml huyễn dịch tế bào/ cm3 bề mặt chai nuôi cấy Để tất chai tế bào vào tủ ấm 370C để tế bào tăng trưởng mọc đầy lớp nhiễm virus Kiểm tra mẫu bệnh phẩm Lấy mẫu bệnh phẩm cho vào môi trường xơ phôi gà Nếu thấy mảnh lớn đỏ kích thước từ 0.5-1.5-2.4 mm mơi trường tế bào kết luận bệnh phẩm bị nhiễm bệnh 23 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Chủng độc lực mạnh gây bệnh tích tế bào có kích thước 2-4 mm Chủng độc lực vừa nhóm Mesogenic gây bệnh tích tế bào với kích thước mảng nhỏ 0.6-1.5 mm Đối với chủng độc lực yếu ta phải bổ sung vào môi trường tế bào chất Mg DEAE thấy tế bào bị nhiễm 24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào IV KẾT LUẬN Bệnh Newcastle bênh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh, bệnh gây xáo trộn bệnh tích đường hơ hấp, tiêu hóa thần kinh Hiện bệnh mối nguy hiểm cho ngành chăn nuôi gia cầm, bệnh thường gây nhiễm ghép với bệnh khác tỉ lệ chết 100% Do bệnh Newcastle gây tổn thất to lớn cho kinh tế nước xảy dịch bệnh giới Ngồi cịn ảnh hưởng đến sức khỏe người, gây ô nhiễm môi trường gây vấn đề dinh dưỡng Vì vậy, việc chẩn đốn bệnh có ý nghĩa lớn phương diện kinh tế lẫn xã hội Phương pháp chẩn đốn ni cấy tế bào có độ xác cao phương pháp thu nhận virus cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp có nhược điểm chậm, đắt tiền, đòi hỏi tay nghề kỷ thuật cao Hiện nay, khơng có thuốc điều trị đặc hiệu Nên bổ sung thêm vitamin C vitamin nhóm B, chế phẩm K.C- Electrolyte, cải thiện phần thức ăn làm giảm bớt tỉ lệ tử vong giai đoạn cuối ổ dịch 25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào V TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Ngọc Hải Công nghệ sinh học thú y 2.Trần Thị Bích Liên Ni cấy mơ tế bào động vật Dương Quốc Nghĩa Nghiên cuuws bệnh Newcastle gà thả vườn tỉnh Đồng Tháp xây dựng quy trình tiêm chủng vaccine phịng bệnh phù hợp http://www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=284&detail=16&ucat=44 http://en.wikipedia.org/wiki/Paramyxovirus www.mcb.uct.ac.za/cann/335/Paramyxoviruses.html www.stanford.edu/ /1999/leanna/para-EM.html www.edu-graphics.com/ /TissueCulture.html www.microbelibrary.org/asmonly/details.asp?id 26 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... bắng kỹ thuật ni cấy tế bào 2.8 Nguyên nhân gây nhiễm trùng nuôi cấy tế bào 18 2.9 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 18 Chẩn đoán bệnh Newcastle phương pháp nuôi cấy tế bào .19 Thu... luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật ni cấy tế bào - Chẩn đốn biến đổi gen sản xuất sản phẩm sinh học ( hormon, enzyme trị liệu ) Chẩn đoán bệnh Newcastle phương pháp nuôi cấy tế bào -... pháp chẩn đốn xác hiệu đặc trưng phương pháp nuôi cấy tế bào LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào II TỔNG QUAN Bệnh Newcastle