Chuẩn đoán PRRS bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

TIỂU LUẬN 1    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nhiều năm gần đây, ngành chăn nuôi nước ta ngày chiếm vai trị quan trọng kinh tế nước ta nước Nông nghiệp.Nhưng từ đầu 2007 tới nay, nhà chăn nuôi người tiêu dùng vơ hoang mang lo lắng đàn heo bị chết biểu bệnh tai xanh.Và ngày bệnh heo tai xanh diễn biến phức tạp.Dưới số thông tin bệnh Bệnh tai xanh ghi nhận lần Mỹ vào năm 1987, chưa xác định bệnh nên gọi “bệnh bí hiểm” (MD: Mystery Swine) Năm 1992, hội nghi quốc tế sức khỏe gia súc tổ chức thú y giới trí cơng nhận bệnh bí hiểm Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS: Porcine reproductive and respiratory syndrome) Bệnh virus PRRS gây ra, tiến triển phức tạp, khó khống chế lại biểu triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy lứa tuổi Bệnh gây sảy thai thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết heo sơ sinh yếu, heo chết trước sinh, cịi cọc, chậm lớn.( “Nhà chăn ni cần biết”- Phan Bùi Ngọc Thảo,Phòng Di truyền Giống gia súc-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam) Dựa vào triệu chứng lâm sàng bệnh tích mơ tả phần để chẩn đốn Trong phịng thí nghiệm, dùng phản ứng Immunoperoxidase lớp (IPMA) để phát kháng thể 1-2 tuần sau nhiễm; phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) kiểm tra kháng thể IgM 5-28 ngày sau nhiễm kiểm tra kháng thể IgG 7-14 ngày sau nhiễm; phản ứng ELISA phát kháng thể vòng tuần sau tiếp xúc, nhiên xác định tỷ lệ nhiễm.Một phương pháp khác chẩn đốn ni cấy tế bào động vật sau dùng RTPCR để xác định( sử dụng phương pháp nhuộm miễn dịch, hóa miễn dịch), việc nuôi cấy phân lập virus môi trường tế bào khó, nhiên xác định diện virus từ mẫu huyết dương tính mẫu lâm sàng cần thiết để làm sở cho cơng tác phịng bệnh nghiên cứu sau (“Nhà chăn ni cần biết”- Phan Bùi Ngọc Thảo,Phịng Di truyền Giống gia súc-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam) II TỔNG QUAN Tìm hiểu bệnh virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome): Khái niệm Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo: Là bệnh virus gây nên với đặc điểm: - Gây chứng ăn khơng ngon, khó thở, sốt, sảy thai chậm lên giống trở lại với tăng số heo chết lúc sinh, tăng số heo chết trước cai sữa - Gây nên hơ hấp khó khăn, chậm tăng trưởng tăng tỷ lệ heo cai sữa chết (trên đàn mắc bệnh mãn tính) 1.1 Lịch sử bệnh: Năm 1987, bệnh phát lần Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí heo” (Mystery Swine Disease - MSD) 2    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS xảy Đức lan tràn nhanh chóng sang quốc gia khác Châu Âu Mùa đông năm 1990- 1991, quốc gia Châu Âu Hà Lan, Bỉ, Pháp Tây Ban Nha báo cáo hội chứng với nhiều tên gọi khác nhau: “Bệnh tai xanh” (Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp sảy thai heo” ( Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội chứng hô hấp vô sinh” (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRD) Năm 1991, lần Wenvoort cộng phân lập bệnh Viện thú y trung ương Lelytad – Hà Lan phân lập bệnh đặt tên cho loại virus “Lelystad” Năm 1992, Collins cộng Mỹ báo cáo việc phân lập virus gây bệnh sử dụng tên gọi VR-2332 để chủng phân lập Bắc Mỹ Cũng năm 1992, hội nghị quốc tế tổ chức dịch tễ giới (OIE) trí đặt tên cho bệnh “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006) Ở Việt Nam, bệnh phát vào năm 1997 đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 có huyết dương tính) Các nghiên cứu bệnh trại giống lớn tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết dương tính với bệnh khác nhau, từ 1,3% 68,29% Ở nước khác, tỷ lệ đàn vùng bệnh có huyết dương tính cao, Anh 6-75%, Mỹ 36%,… (Phòng Dịch tễ-Cục Thú y) 1.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc: 1.2.1 Phân loại Virus PRRS thuộc: Bộ Nidovirales Họ Arteriviridae Giống Arterivirus Hình 2.1 Virus PRRS (Nguồn: http//www agraroldal.hu) 1.2.2 Đặc điểm hình thái: Virus PRRS có cấu trúc RNA mạch đơn dương, có đường kính 40-70 nm, có vỏ bọc, kích thước genome dài 14,5 kb mã hoá cho việc tái tạo virus (Jeong-Ki Kim cs, 2005) 1.2.3 Đặc điểm cấu trúc: 3    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Virus structure Genome PRRSV Bộ gene virus PRRS gồm có khung độc mở (ORFs) mã hoá cho thành phần khác virus Tuy nhiên có khung ORFs có ý nghĩa quan trọng định danh virus, ORFs 7,6 quy định tổng hợp protein tương ứng: nucleocapsid (N) 15-kDa, matrix (M) 19-kDa glycoproteins envelope (protein GP5) 25-kDa Đây protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90-95% lượng protein cấu trúc virus • Protein N protein nhỏ (15 kDa) có tính kiềm cao, điều giúp tương tác dễ dàng với gen RNA Protein N diện mức độ cao tế bào bị nhiễm virus PRRS chiếm từ 20- 40% lượng protein phân tử virus Hiện protein N dùng kháng nguyên để phát kháng thể huyết heo • Protein M có trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa Mặc dù chức biết xem có vai trò kết hợp với thụ thể tế bào đích, protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể tế bào đích (Delputte cs, 2001) • Protein GP5 có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDA, nguyên nhân gây tượng apoptosis đóng vai trị quan trọng việc nhận diện thụ thể tế bào đích (Nathalie cs, 2003) Về mặt di truyền, phân tích gene dịng virus PRRS gây bệnh khác nhau, người ta xác định dòng virus riêng biệt: dòng Châu Âu (Lelystad) dòng Châu Mỹ (VR-2332) Hai dịng virus khơng khác biệt đặc tính gây bệnh mà khác mức độ định kiểu gene Qua phân tích gene theo dõi thay đổi trình tự Nu dòng PRRS, người ta xác định dòng Châu Mỹ, ORFs có tính ổn định cao, chúng gần không thay đổi suốt q trình tiến hố dịng virus này, nhiên, khác biệt dòng virus Châu Âu Châu Mỹ khung đọc mở rõ, chẳng hạn tương đồng trình tự axit amin ORFs dòng virus vào khoảng 57-59% ORFs 70-81% Trong đó, khung đọc mở ORFs lại biến đổi nhiều chủng dòng Châu Mỹ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59% Sự tương đồng trình tự axit amin quy định khung đọc mở ORFs 2, dòng Châu Mỹ Châu Âu tương ứng từ 63,58% 68% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) 4    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nghiên cứu virus mức độ phân tử cho phép xác định khả sản xuất sử dụng virus nhược độc để làm văcxin Người ta ghi nhận nhiều trường hợp hội chứng PRRS trở nên trầm trọng sau đàn heo tiêm vắcxin virus PRRS nhược độc cấu trúc gene virus nhược độc thay glycine arginine vị trí 151 ORFs hoàn nguyên nhanh gene chúng so với gene virus nguyên thuỷ sau xâm nhập vào thể vật chủ, độc lực chúng phục hồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) 1.3 Dịch tễ học: 1.3.1 Cơ chế sinh bệnh: 5    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.3.2 Tác nhân gây bệnh: Bình thường, đại thực bào tiêu diệt tất vi khuẩn, virus xâm nhập vào thể, riêng virus PRRS, virus nhân lên đại thực bào, sau phá huỷ giết chết đại thực bào (tới 40%) phòng Dịch tễ-cục Thú y) Đại thực bào bị giết làm giảm chức hệ thống bảo vệ thể làm tăng nguy bị nhiễm bệnh kế phát Virus xâm nhập vào tế bào đường nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor Người ta xác định heparan sulfate thụ thể đại thực bào phế nang virus(Delputte cs, 2001; Nathalie cs, 2003) MARC-145 vimentin, vimentin yếu tố quan trọng việc làm ổn định cấu trúc tế bào chất nhiều loại tế bào khác (Jeong-Ki Kim cs, 2005) Theo Jeong-Ki Kim cs, 2005 kháng thể kháng vimentin ngăn cản gây nhiễm virus tế bào MARC-145 Khi chuyển vimentin tái tổ hợp vào dòng tế bào BHK-21 CRFK (Crandall Rees feline kidney), không nhạy cảm với virus PRRS, dịng tế bào trở nên nhạy cảm với PRRSV, điều chứng tỏ cơng gây nhiễm virus liên quan tới vimentin, loại intermediate-filament protein (Jeong-Ki Kim cs, 2005) Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết chủng virus PRRS gây bệnh tích tế bào có số chủng virus PRRS khơng (Christianson Joo, 1994; Yoon cs, 1992) Bệnh tích tế bào virus PRRS gây là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau dày lên, nhân co lại cuối tách khỏi bề mặt nuôi cấy (dẫn liệu Hồng Văn Năm, 2001) Benfield cs (1992) mơ tả bệnh tích tế bào virus PRRS gây như: tế bào co trịn, trở nên thối hố (nhân kết đặc lại) tách khỏi tế bào lớp sau 2- ngày ni cấy Tồn lớp tế bào bong sau ngày Các dòng PRRSV Bắc Mỹ phát triển tốt MARC-145 dòng PRRSV Châu Âu phát triển nhanh PAM Nhiều phịng thí nghiệm Hàn Quốc Bắc Mỹ sử dụng MARC-145 khó khăn phải nuôi cấy PAM (Han-Kook Chung cs, 2002) Một nghiên cứu khác Bloemraad (1994) cho thấy sau 40 ni cấy, gần 40% tế bào PAM có bệnh tích tế bào Tuy nhiên, kết thay đổi phịng thí nghiệm (Yoon, 2003) 1.3.3 Sức đề kháng virus Virus PRRS tồn thời gian dài tháng -700C đến -200C khoảng 90% khả gây nhiễm virus bị vòng tuần 40C khả hồi phục virus báo cáo kéo dài đến 20 phút 560C, 24 370C ngày 210C Virus bền vững pH từ 6,5 -7,5 chết nhanh pH < hay pH >7,65 (Benfield cs, 1999) Như vậy, virus PRRS khơng bền với nhiệt độ pH Ngồi ra, virus dễ bị diệt chất sát trùng tia cực tím 6    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996) Các chất tẩy uế có tác dụng làm giảm khả lây nhiễm virus chất tan dầu mỡ chloroform eter đặc biệt hữu hiệu việc phá vỡ cấu trúc vỏ virus làm ngừng tái sản (Trần Đức Minh) 1.3.4 Triệu chứng lâm sàng: Lợn nái giai đoạn đẻ nuôi con: Biếng ăn, lười uống nước, sữa viêm vú, đẻ sớm khoảng 2-3 ngày, da biến màu, lờ đờ hôn mê, thai gỗ (10-15% thai chết 3-4 tuần cuối thai kỳ), lợn chết sau sinh (30%), lợn yếu, tai chuyển màu xanh Tỷ lệ chết đàn tới 70% tuần thứ 3-4 sau xuất triệu chứng Rối loạn sinh sản kéo dài 4-8 tháng trước trở lại bình thường Lợn đực giống: Bỏ ăn, sốt, đờ đẫn hôn mê, giảm hưng phấn tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh cho lợn sinh nhỏ Lợn theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt đường huyết không bú được, mắt có dử màu nâu, da có vết phồng rộp, tiêu chảy nhiều, giảm số lợn sống sót, tăng nguy mắc bệnh hơ hấp, chân chỗi ra, run rẩy Lợn cai sữa lợn choai: Chán ăn, ho nhẹ, lông xác xơ nhiên, số đàn khơng có triệu chứng Bệnh tích: Viêm phổi hoại tử thâm nhiễm đặc trưng đám chắc, đặc thuỳ phổi Thuỳ bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ đặc (nhục hoá) Trên mặt cắt ngang thuỳ bệnh lồi ra, khô Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hoá mủ mặt thuỳ đỉnh Điều trị: Hiện nay, chưa có thuốc đặc trị để điều trị bệnh Có thể sử dụng số thuốc tăng cường sức đề kháng, điều trị triệu chứng chủ yếu ngăn ngừa nhiễm bệnh kế phát Phòng bệnh: Có thể sử dụng vaccine biện pháp vệ sinh chuồng trại Vaccine bệnh heo tai xanh có bán Cơng ty thuốc thú y TW 29 Nguyễn Đình Chiểu Quận TP HCM Đây nơi nhập Vaccine phù hợp với bệnh heo tai xanh VN 1.4 Chẩn đoán PRRSV: 1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng 7    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Theo Benfiled (1999), đàn heo có dấu hiệu rối loạn hơ hấp hạng heo, sinh sản bất ổn suất đàn giảm bình thường nghi ngờ bệnh virus PRRS Mặt khác, theo Taylor (1995) dẫn liệu Hồng Văn Năm (2001) có sở nghi ngờ bệnh khi: • Tỷ lệ chết lúc sinh >20% • Tỷ lệ sảy thai >8% • Tỷ lệ heo chết trước cai sữa >26% • Tỷ lệ heo chết tuần vượt 25% Tuy nhiên, để xác định bệnh cần thực phương pháp chẩn đoán phi lâm sàng khác (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006) 1.4.2 Chẩn đoán phi lâm sàng: Dựa vào triệu chứng lâm sàng bệnh tích mơ tả phần để chẩn đốn Trong phịng thí nghiệm, dùng phản ứng Immunoperoxidase lớp (IPMA) để phát kháng thể 1-2 tuần sau nhiễm; phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) kiểm tra kháng thể IgM 5-28 ngày sau nhiễm kiểm tra kháng thể IgG 7-14 ngày sau nhiễm; phản ứng ELISA phát kháng thể vòng tuần sau tiếp xúc, nhiên xác định tỷ lệ nhiễm.Một phương pháp khác chẩn đốn ni cấy tế bào động vật sau dùng RTPCR để xác định( sử dụng phương pháp nhuộm miễn dịch, hóa miễn dịch), việc nuôi cấy phân lập virus mơi trường tế bào khó, nhiên xác định diện virus từ mẫu huyết dương tính mẫu lâm sàng cần thiết để làm sở cho cơng tác phịng bệnh nghiên cứu sau 1.4.2.1 Phương pháp phát kháng thể 1.4.2.1.1 Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay) Đây phản ứng sử dụng để phát kháng thể kháng virus PRRS gọi kỹ thuật miễn dịch peroxidase lớp Kỹ thuật thực dịng tế bào PAM, CL2621, MARC-145 Tế bào sau nuôi cấy 24 gây nhiễm với PRRSV ủ 370C 24 Sau tế bào gây nhiễm cố định tác dụng với huyết mẫu, ủ khoảng 370C cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase) Nếu mẫu huyết có chứa kháng thể kháng virus 3050% tế bào có màu đỏ cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch chromogen 30 phút Khơng có thay đổi màu tế bào kết âm tính IPMA sử dụng nhiều châu âu Trong chẩn đoán phát thú nhiễm sớm, người ta thường sử dụng IPMA xét nghiệm cho phép xác định thú nhiễm sau 7-15 ngày phát kháng thể đến tháng sau nhiễm PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Nhược điểm phương pháp xác định trực tiếp hàm lượng kháng thể bảo vệ 1.4.2.1.2 Phản ứng IFA (Indirect Immunhofloresence Assay) Giống kỹ thuật IPMA, kỹ thuật IFA (kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp) sử dụng ni cấy tế bào Q trình thực IFA giống với IPMA, khác kháng kháng thể heo sử dụng không cộng hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate) Việc đọc kết cần phải có kính hiển vi huỳnh quang diện 8    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com màu huỳnh quang mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus Phản ứng có độ đặc hiệu cao 99,5% cho phép phát kháng thể kháng virus đến tháng sau nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Nhược điểm IFA IPMA làm tự động nên khó thực với quy mơ lớn 1.4.2.1.3 Phản ứng SN (Serum Neutralizing) Đây phản ứng trung hòa virus, phản ứng có độ đặc hiệu cao nhất, sử dụng để phát định hiệu giá kháng thể kháng virus Nhược điểm phản ứng đắc tiền, khó thực tốn thời gian kháng thể trung hoà xuất chậm (1-2 tháng sau nhiễm) Tuy nhiên phản ứng tốt để xác định miễn dịch bảo hộ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007 dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006) 1.4.2.1.4 Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn kết enzyme) có độ nhạy độ đặc hiệu cao thực đơn giản so với IFA IPMA, phát kháng thể vòng tuần sau nhiễm bệnh Tuy nhiên hạn chế lớn phương pháp dễ cho kết dương tính giả Tỷ số S/P (sample/position)≥0,4 kết ghi nhận dương tính Các phản ứng IFA, SN, ELISA sử dụng nhiều phịng thí nghiệm miền Nam nước Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) 1.4.2.2 Các phương pháp phát kháng nguyên Phương pháp FA (florescent antibody staining-kháng thể huỳnh quang) IHC (immunohistochemistry staining-hố mơ miễn dịch) sử dụng để phát kháng ngun virus mẫu mơ Phương pháp FA thực trực tiếp mẫu đông lạnh Phương pháp cho kết nhanh chi phí thấp, nhiên lại có độ nhạy độ đặc hiệu khơng cao để đảm bảo kết chẩn đốn, mẫu cần lấy làm lạnh nhanh Phương pháp IHC thực mẫu mô cắt lát, nhiên phương pháp thực với mẫu mô cố định formol Điều quan trọng thuận lợi việc bảo quản mẫu bệnh phẩm IHC có độ nhạy cao so với FA nhiều thời gian tốn chi phí (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) 1.4.2.3 Phát gen virus PRRS Kỹ thuật PCR phát triển để phát RNA virus PRRS mẫu bệnh phẩm Kỹ thuật khơng có độ đặc hiệu độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực xét nghiệm ngắn so với phương pháp ni cấy tế bào sử dụng rộng rãi chẩn đoán phát virus Nhiều dạng khác PCR sử dụng, hầu hết chúng sử dụng để phát vùng ORFs 7, ORFs hay ORFs 1b virus Để gia tăng độ nhạy chẩn đoán PRRSV, để phân biệt dịng virus Han-Kook Chung cs (2002) sử dụng phương pháp multiplex reverse transcription-nested PCR (RT-nPCR) Fun in wang (1994) sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát tồn virus PRRS xác heo thương phẩm tinh dịch đực Tuy nhiên kết chẩn đoán chưa đủ làm 9    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sở để kết luận bệnh mà cho phép xác định tình trạng nhiễm đàn kỹ thuật đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình độ kỹ thuật cao Các quy trình thu nhận trữ mẫu, quy trình chiết tách tinh RNA phải thực cách nghiêm ngặt Do kết phản ứng PCR phịng thí nghiệm khác khác 1.4.2.4 Phân lập virus môi trường tế bào Trong phân lập virus, phương pháp chẩn đoán khác, khâu quan trọng cách lấy mẫu bảo quản mẫu Mẫu xét nghiệm huyết thanh, dịch tràn ổ bụng, dịch phế nang, dịch mẫu mô (hạch, phổi, lách) Trong số dịch phế nang huyết đánh giá mẫu tốt cho việc phân lập virus dịch bùng phát PRRSV tồn huyết lâu mô, thú già lại có nhiều PRRSV mơ máu Đối với trường hợp sảy thai thời kỳ cuối hay sinh sớm nên lấy mẫu heo sinh yếu, trước cho bú thai khô, thai chết lưu Việc phân lập virus thú nhiễm bệnh mãn tính hạch amiđan, dịch rữa khí quản mẫu có khả ni cấy tốt so với mẫu huyết phổi Một điểm quan trọng khác cần ý nhiệt độ bảo quản mẫu trình vận chuyển phân lập virus Các mẫu bệnh phẩm cần phải bảo quản 40C hay thấp q trình vận chuyển mẫu đến phịng thí nghiệm thời gian giữ mẫu nhiệt độ tốt không 48 Những mẫu bệnh phẩm lưu giữ thời gian dài bắt buộc phải bảo quản 700C, không đông rã đông mẫu nhiều lần Việc phân lập virus gặp nhiều khó khăn virus nhân lên hai loại tế bào, là: đại thực bào phế nang heo (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) tế bào thận khỉ (MARC-145, CL2621) Tuy nhiên theo Yoon Stevenson (1999) khơng phải tất virus PRRS phát triển hai loại tế bào mà PAM nhạy cảm với virus so với CL2621, đặc biệt mẫu dùng huyết Còn Han-Kook Chung cs (2002) cho PRRSV chủng Châu Mỹ phát triển tốt MARC145, ngược lại PRRSV chủng Châu Âu lại phát triển nhanh PAM Trong Tiểu luận Chẩn đốn PRRSV kỹ thuật ni cấy tế báo này, tìm hiểu kỹ phương pháp chẩn đốn PRRSV cách phân lập mơi trường tế bào MARC-145 xác định RT-PCR Chẩn đốn PRRSV cách phân lập mơi trường tế bào MARC-145 xác định RT-PCR 2.1 Tổng quan nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào kỹ thuật trì phát triển tế bào thể sống thực đầy đủ chức biến dưỡng chức chuyên biệt tế bào Q trình ni cấy tế bào cho phép tế bào đóng vai trị tế bào độc lập, phân chia nhờ trình nguyên phân quần thể tế bào tiếp tục phát triển bị giới hạn bề mặt nuôi cấy hay cạn kiệt dinh dưỡng Kỹ thuật nuôi cấy tế bào tiến hành lần vào năm 1907 Harrison Ngày kỹ thuật ứng dụng rộng rãi y học thú y học để nghiên cứu tác động chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết học, quan sát hình thái siêu cấu trúc virus đặc biệt sản xuất vaccine Q trình ni cấy thường gồm tế bào thuộc loại 10    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.1.1 Thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy tế bào Môi trường nuôi cấy tế bào phức tạp giàu chất dinh dưỡng để tạo điều kiện tốt cho phát triển tế bào Mơi trường cung cấp dạng dung dịch để sử dụng hay dạng dung dịch đậm đặc dạng bột Dạng dung dịch đậm đặc sử dụng sau pha lỗng với nước cất tiệt trùng, dạng bột phải hoà tan nước tiệt trùng cách lọc qua lưới lọc 0,22μm Thành phần mơi trường ni cấy: • Carbonhydrate: glucose (5-10mM) dùng hầu hết công thức để cung cấp nguồn lượng tiền chất cho tổng hợp sinh học, ribose cần cho tổng hợp acid nucleic • Amino acid (0,1-0,2mM) dùng nguồn tiền chất cho tổng hợp protein Người ta thường sử dụng glutamine, nhiên, ammoniac thành lập từ chuyển hoá glutamine ức chế sinh trưởng số q trình ni cấy • Muối dùng để làm cho mơi trường có tính đẳng trương, trì cân với phần bên tế bào • Bicarbonate (NaHCO3) dùng để đóng vai trị hệ thống đệm kết hợp với 5-10% CO2 cung cấp tủ ủ Điều cho phép mơi trường trì có pH từ 7,2-7,4 • Vitamin hormone diện nồng độ tương đối thấp dùng để kích thích sinh trưởng Lượng vitamin hormone thay đổi nhiều công thức môi trường khác Điều cho thấy nhu cầu vitamin dịng tế bào khác • Huyết thanh: bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cải thiện sinh trưởng tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh phát triển mạnh Huyết thai bò (Fetal Bovine Serum- FBS) thường sử dụng bổ sung vào cho môi trường nuôi cấy, lại đắt tiền Nồng độ huyết thường dùng từ 5- 20% Các protein huyết albumin, fibronectin, globulin giúp tế bào bám dính phát triển • Kháng sinh thường cho vào môi trường nuôi cấy thời gian ngắn nhằm làm giảm nguy tạp nhiễm Nồng độ tối ưu kháng sinh xác định theo kinh nghiệm người tiến hành nuôi cấy Kháng sinh thường dùng dạng kết hợp Có thể sử dụng Penicilin G, Streptomycin Amphotericin B để ức chế phát triển vi khuẩn Gram dương, Gram âm chống nấm (Butler, 2004) 2.1.2 Điều kiện nuôi cấy Hầu hết tế bào môi trường nuôi cấy sinh trưởng tốt nhiệt độ 370C pH 7,4 Nếu nhiệt độ thấp chút so với 370C tốc độ sinh trưởng giảm xuống tế bào không bị phá hủy Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 39- 400C phá huỷ tế bào Do vậy, việc đảm bảo nhiệt độ không tăng tủ cấy quan trọng (Butler, 2004) 2.1.3 Sự tạp nhiễm cách hạn chế Nguyên nhân thất bại nuôi cấy tế bào tạp nhiễm Sự tạp nhiễm thường tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu thường bắt nguồn từ tiếp xúc người từ bàn tay, thở, tóc Mơi trường thiết bị ngày cung cấp sẵn nhằm hạn chế tới 11    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mức tối đa nguy tạp nhiễm Nguy giảm bớt quan tâm cẩn thận tới chi tiết tiến hành nuôi cấy Nhằm giảm bớt nguồn tạp nhiễm, cần ý điểm sau: • Rửa tay với xà phịng diệt khuẩn trước sau q trình có liên quan đến cấy tế bào Có thể dùng găng tay nhựa • Hạn chế đường tới phịng thí nghiệm thí nghiệm tiến hành • Làm bề mặt làm việc trước sau q trình ni cấy • Dùng khơng gian tiệt trùng (ví dụ tủ cấy tiệt trùng) cho tất thao tác • Dùng ống nghiệm ni cấy plastic tiệt trùng dùng lần • Mua môi trường huyết từ nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm bảo tạp nhiễm không phát sinh từ nguồn (Butler, 2004) 2.2 Tổng quan phương pháp RT-PCR RT- PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) phương pháp dùng để khuyếch đại cDNA tạo từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược RT- PCR thường sử dụng để tạo thư viện cDNA (complementary DNA) lớn từ lượng nhỏ mRNA, sử dụng việc nhận biết đột biến đa hình dựa vào trình tự phiên mã ngược sử dụng việc định lượng mức độ phân tử gene Ngoài ra, RT- PCR cịn có ứng dụng quan trọng chúng sử dụng việc chẩn đoán bệnh virus RNA Nguyên tắc : Trong kỹ thuật RT-PCR có tham gia loại enzyme tổng hợp chuỗi oligonucleotide: enzyme phiên mã ngược ( reverse transcriptase) DNA polymerase Enzyme reverse transcriptase cần cho trình tổng hợp sợi cDNA từ RNA enzyme cần cho tổng hợp sợi DNA từ cDNA Do enzyme reverse transcriptase chịu nhiệt nên trình phiên mã ngược để tạo cDNA phải thực nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-450C) Điều gây trở ngại: • Sự tạo thành sản phẩm khuếch đại không mong muốn bắt cặp không đặc hiệu primers • Giảm hiệu kéo dài chuỗi gen hình thành RNA cấu trúc bậc hai • Tuy nhiên trở ngại giải nhờ vào việc sử dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus Enzyme điều kiện định, có đặc tính sinh học đặc biệt thực lúc chức năng: chức reverse transcriptase chức DNA polymerase 2.3 Phương pháp tiến hành: 2.3.1 Vật liệu dụng cụ • • • • • 2.3.1.1 Thiết bị dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào phân lập virus PRRS Các dụng cụ lấy mẫu: xilanh lấy mẫu, lọ đựng mẫu, túi nylon, bình đá… Tủ cấy; tủ ấm CO2 Kính hiển vi soi ngược Máy ly tâm.Ống ly tâm vô trùng Lọ nuôi cấy tế bào 25cm2 12    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com • Pipette 2.3.1.2 - Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC- 145 Dòng tế bào gốc virus chuẩn AAHL (Australian Animal Health Laboratory) cung cấp Môi trường phát triển: 100ml mơi trường gồm: • EMEM (Egle Minimun Essential Medium): 86,25 ml • Huyết thai bị (FBS): 8ml • Glutamine 2,92%: 1ml • Na Pyruvate 100mM: 1ml • LAH (Lactalbumin hydrolysate) 25%: 2ml • Sodium Bicarbonate 7%: 1ml • Kháng sinh (trong 1ml dung dịch có 40000UI Penicillin, 40000μg Streptomycin): 0,25ml • Kháng nấm (trong 1ml có 500μg Amphotericin B): 0,5ml • Mơi trường trì: giống mơi trường phát triển dùng 2% huyết thai bị • PBSA (Phosphate buffer saline solution A) • Trypsin X • Thuốc nhuộm Trypan Blue 0,22% 2.3.1.3 • • • • • • • • • • • • • • • • Thiết bị dụng cụ dùng cho phản ứng PCR Tủ cấy vô trùng Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C) Tủ -700C (Sanyo Ultra Low) Tủ -200C (CFC Free Sanyo Brandt) Tủ lạnh Máy vi sóng (Electrolux) Máy chụp gel (Biorad) Máy PCR (Biorad) Máy Vortex Bộ nguồn bồn điện di Micropipet, đầu tuýp eppendorf 2.3.1.4 Vật liệu hoá chất cho chiết tách RNA Vật liệu hoá chất phương pháp không sử dụng TRIzol - Dung dịch ly giải tế bào(guanidium isothicyanate 4M; sodium citrate 25mM; sarkosyl 0,5%; 2mercaptoethanol, pH 7.0) Phenolchloroform Isopropanol Ethanol 75% RNAse - free water 2.3.1.5 Vật liệu hố chất sử dụng cho RT-PCR • Nước khơng có Rnase • Tfl DNA Polymerase (Promega) 13    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com • • • • • • • dNTPs (Promega) Cặp mồi RNA mẫu chuẩn RNA thu từ mẫu ly trích AMV reverse transcriptase (Promega) MgSO4 (Promega) AMV/Tfl reaction buffer (Promega) 2.3.1.5 • • • • • Vật liệu hố chất cho điện di sản phẩm RT-PCR Agarose (Biorad) TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na2EDTA, nước cất hai lần khử ion hấp khử trùng) Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE) Ladder 100bp Ethidium bromide 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu • Huyết thanh: cố định heo, lấy máu khoảng 4- 5ml tĩnh mạch cổ (heo cai sữa), tĩnh mạch tai (heo nái) Sau cho vào bình đá vận chuyển phịng thí nghiệm chắt lấy huyết vào eppendorf vơ trùng • Hạch phổi, phổi (chỉ lấy heo chết sau sinh heo sau cai sữa): lấy mẫu hạch phổi, phổi cho vào bao nylon sạch, buộc chặt cho vào bình đá vận chuyển phịng thí nghiệm Mẫu sau lấy chuyển phịng thí nghiệm xử lý tiến hành phân lập virus Nếu mẫu chưa phân lập đem bảo quản -700C 2.3.3.Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC- 145 2.3.3.1.Hồi phục tế bào : Tế bào trữ dạng đông lạnh nitơ lỏng, muốn sử dụng phải hồi phục lại tế bào Các bước hồi phục tế bào: • • • • • • Lấy lọ đựng tế bào từ bình nitơ lỏng ra, ngâm vào nước ấm 370C, chờ đến nước đá tan hết lấy Dùng pipette chuyển lượng tế bào bên lọ sang ống ly tâm Cho thêm 10ml môi trường phát triển vào, chầm chậm giọt Dùng pipette trộn nhẹ để hỗn hợp hòa với Ly tâm 1500 vịng/phút phút Sau bỏ phần nước trên, búng vào đáy lọ ly tâm để tế bào tách rời Cho 3ml môi trường phát triển vào, dùng pipette trộn hút khoảng 0,1ml để đếm Cho tế bào vào lọ nuôi cấy có sẵn 8-10ml mơi trường phát triển Đưa lọ tế bào vào tủ ấm 370C có bổ sung 5% CO2 Sau 24 thay đổi mơi trường 14    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3.3.2 Cấy chuyển tế bào : Khi tế bào mọc đầy bề mặt nuôi cấy, tạo thành tế bào lớp tiến hành cấy chuyển Tách tế bào khỏi lọ : • Rút bỏ mơi trường lọ nuôi cấy, rửa lớp tế bào 8-10ml PBSA, rút bỏ • Cho vào 3ml trypsin, để tủ ấm phút sau cho tay cầm lọ tế bào đập nhẹ vào lòng tay để đảm bảo tách thành tế bào riêng lẻ • Bất hoạt trypsin 3ml môi trường phát triển, rút cho vào ống ly tâm (loại 15ml) Dùng thêm 7ml môi trường phát triển để rửa lại lọ ni cấy hút cho vào ống ly tâm • Ly tâm 1500 vịng/phút phút Sau đổ phần nước trên, búng vào đáy lọ ly tâm cho tế bào rời Cho vào ống ly tâm 3ml môi trường phát triển, trộn pipette lấy 0,1ml để đếm tế bào Đếm tế bào buồng đếm Neubauer : ™ Cách tiến hành : • Trộn 100μl huyễn dịch tế bào 900μl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha 1/10) • Đưa hỗn hợp thuốc nhuộm tế bào lên buồng đếm cách chạm đầu hút có chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp buồng đếm lamella • Chỉ đếm tế bào sống (màu vàng nhạt, có điểm sáng giữa), khơng đếm tế bào chết (bắt màu xanh) Vùng đếm ô vng lớn (ký hiệu L) ™ Cách tính kết : Trong đó: C: số tế bào 1ml n: số tế bào ô vuông d: nồng độ pha loãng 15    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com • Cho lượng tế bào cần cấy chuyển vào lọ ni cấy có 8-10 ml mơi trường phát triển • Đưa lọ tế bào vào ủ ấm 370C có bổ sung 5%CO2 • Theo dõi lần phát triển tế bào đầy bề mặt nuôi cấy lọ 25cm2 với lượng tế bào 7.105 106 Kết xử lý phần mềm staTGraphics Ver 7,0 2.3.4.Phương pháp phân lập virus Virus PRRS phân lập theo sơ đồ 3.1 2.3.4.1 Phương pháp xử lý mẫu để phân lập virus Mẫu hạch phổi, phổi nghiền dung dịch đệm phosphat PBS (cứ 1gam bệnh phẩm nghiền 5ml PBS) Sau đó, ly tâm huyễn dịch 5000vịng/phút 15 phút Hút phần nước cho vào eppendorf vô trùng bảo quản tủ -700C Huyết mẫu sau xử lý lọc qua lưới lọc 0,2μm trước đưa vào môi trường tế bào 2.3.4.2 Phương pháp gây nhiễm tế bào lần thứ với mẫu xử lý 16    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Khi tế bào phát triển đầy bề mặt lọ nuôi cấy tạo thành tế bào lớp tiến hành gây nhiễm tế bào • Lấy lọ tế bào ra, thay môi trường phát triển mơi trường trì • Gây nhiễm tế bào mẫu huyết thanh, phổi, hạch phổi xử lý với thể tích 1ml Lưu ý đưa mẫu vào môi trường tế bào cần đưa vào bề mặt khác bề mặt tế bào tăng trưởng lọ ni cấy • Cho lọ tế bào gây nhiễm vào tủ ấm 370C có 5%CO2 Sau 24 thay mơi trường trì • Theo dõi ghi nhận bệnh tích tế bào ngày Sau ngày thu hoạch dịch tế bào nuôi cấy 2.3.4.3.Phương pháp thu hoạch dịch tế bào • • Để lọ tế bào sau gây nhiễm ngày vào ngăn đá tủ lạnh tế bào môi trường đơng thành đá, sau lấy đánh nhẹ vào lòng bàn tay để tế bào bong hết để nhiệt độ phịng để rã đơng tế bào môi trường Lặp lại động tác thêm lần Hút tồn mơi trường lọ tế bào vào ống ly tâm Ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút Hút lấy phần nước bên cho vào eppendorf vô trùng bảo quản -700C 2.3.4.4.Phương pháp gây nhiễm lần hai dịch tế bào thu hoạch Các bước thực giống gây nhiễm lần thứ thay mẫu huyết thanh, phổi hạch phổi dịch tế bào thu hoạch 2.3.4.5.Phương pháp xác định diện virus kỹ thuật RT-PCR Phản ứng RT- PCR thực theo sơ đồ 3.2 với mẫu thu hoạch sau hai lần gây nhiễm 17    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Để thực phản ứng phiên mã ngược khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngược với độ nhạy độ đặc hiệu cao, thực kỹ thuật RT-PCR bước nhằm hạn chế lây nhiễm 2.4 Kết quả: 2.4.1 Kết sau lần gây nhiễm: 18    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 19    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Như vậy, sau lần gây nhiễm mơi trường tế bào MARC-145, có mẫu có biểu bệnh tích tế bào, chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11) mẫu hạch phổi mẫu phổi 2.4.2 Kết RT-PCR: III KẾT LUẬN 20    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Việc gây bệnh tích tế bào kết RT-PCR dương tính dã xác định diện virus mẫu xét nghiệm Điều cho thấy môi trường tế bào MARC-145 mơi trường thích hợp cho phát triển virus PRRS sử dụng cho phân lập Kết phù hợp với nhận định Jeong-Ki Kim cs (2005): tế bào MARC-145 dòng tế bào nhạy cảm với virus PRRS nên thích hợp cho việc phân lập virus Sự thành cơng việc chẩn đốn PRRSV kỹ thuật nuôi cấy tế bào ( MARC-145) sở thuận lợi cho việc nghiên cứu phương pháp điều trị bệnh IV TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồng Thanh Hải, 2005 Thử nghiệm ni cấy tế bào MARC-145, ứng dụng kỹ thuật ELISA nuôi cấy tế bào để chẩn đoán bệnh virus PRRS heo Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp HCM Hồng Văn Năm, 2001 Hội chứng sinh sản hô hấp lợn (bài dịch tổng hợp) Tạp chí khoa học thú y Số 1/2002 Tr 74- 87 Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y NXB Nơng Nghiệp, Tp.HCM Phịng Dịch tễ-Cục Thú y Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Trần Đức Minh Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Bài dịch từ “Theriogenology 66 (2006): 655-662”) Võ Thị Đan Thanh, 2006 Phân lập virus PRRS môi trường tế bào MARC-145 xác định virus kỹ thuật RT-PCR Luận văn tốt nghiệp, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, Tp HCM “Nhà chăn nuôi cần biết”- Phan Bùi Ngọc Thảo,Phòng Di truyền Giống gia súc-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus: Description of Persistence in Individual Pigs upon Experimental Infection (JOURNAL OF VIROLOGY) Benfield D.A., Collins J.E., Dee S.A., Halbur P.G., Joo H.S., Lager K.M., Mengelling W.L., Murtaugh M.P., Rossow K.D., Stevenson G.W., and Zimmerman J.J., 1999 Porcine reproductive and respiratory syndrome In disease of swine, 8th edition Ed.Straw B.E., D’Alleire S.D., Mengelling W.L., Taylor D.J Iowa State University Press, Ames- Iowa, USA p.201- 220 10 Tài liệu Internet http://www.aahc.com.au/ausvetplan/index.htm http://www.agraroldal.hu http://www.animal-health-online.de 21    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... quan nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào kỹ thuật trì phát triển tế bào ngồi thể sống thực đầy đủ chức biến dưỡng chức chuyên biệt tế bào Q trình ni cấy tế bào cho phép tế bào đóng vai trị tế bào. .. Chẩn đoán PRRSV kỹ thuật nuôi cấy tế báo này, tìm hiểu kỹ phương pháp chẩn đốn PRRSV cách phân lập môi trường tế bào MARC-145 xác định RT-PCR Chẩn đoán PRRSV cách phân lập môi trường tế bào MARC-145... luanvanchat@agmail.com 2.3.3.2 Cấy chuyển tế bào : Khi tế bào mọc đầy bề mặt nuôi cấy, tạo thành tế bào lớp tiến hành cấy chuyển Tách tế bào khỏi lọ : • Rút bỏ mơi trường lọ ni cấy, rửa lớp tế bào 8-10ml PBSA,