Chuẩn đoán virus PMWS bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC         GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: LÂM THIÊN NGỌC 1      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Hội chứng còi cọc sau cai sữa bệnh phổ biến heo Những triệu chứng quan sát lần đầu Canada vào năm 1991, từ nhiều nghiên cứu ghi nhận heo nhiễm PMWS trở nên cịi cọc sau cai sữa có khơng có biểu khó thở,tiêu chảy, xanh xao, vàng da có nhiều thay đổi đặc tính mơ bệnh học Dòng circovirus heo dạng , khác với dạng mặt kháng nguyên di truyền, gây nhiễm bệnh liên tục cho nhiều dòng tế bào heo, lúc đầu cho PMWS Tuy nhiên nghiên cứu sau cho thấy nhiễm trùng PCV2 thường khơng gây PMWS hầu hết heo thí nghiệm tiêm dịng PCV2 bị lây nhiễm cận lâm sàng Hơn nữa, khảo sát cho thấy tỷ lệ cao heo với kháng thể PCV2 nông trại mà PMWS không ghi nhận Việc phát PCV2 khơng đủ thuyết phục để thiết lập cách chẩn đoán PMWS việc xác định trường hợp bị PMWS tranh cãi Sự chẩn bệnh xác cho heo dựa tất điều kiện sau: dấu hiệu lâm sàng điển hình gồm cịi cọc sau cai sữa; bệnh tích vi thể; phát PCV2 bệnh tích tương ứng Ở nơng trại kinh doanh, PMWS cho thấy gia tăng liên tục số lượng heo tăng trưởng chậm hiệu kinh tế Do chết heo tăng cao mức so với khứ nên trường hợp xác định bệnh mức độ đàn gia súc xem chết tiêu chuẩn quan trọng Sự phát sinh bệnh PMWS cịn khó hiểu Những đồng tác nhân gây nhiễm, kết hợp, cho nhân tố nguy hiểm cho phát triển kịch phát PMWS Những thí nghiệm với lây nhiễm kép xác định porcine parvovirus (PPV), virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo ( PRRS), mycoplasma hyopnemoniae đồng tác nhân Cũng có chứng cho thấy việc sử dụng 2      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vaccin hay kích thích miễn dịch định ảnh hưởng đến phát triển PMWS Những khác biệt phổ biến PMWS nước góp phần vào hiểu biết phát sinh bệnh tình trạng Đến nay, nhiều nghiên cứu bệnh báo cáo Có nhiều phương pháp để xác định có mặt PCV2, đề cập đến việc phát PCV2 môi trường nuôi cấy tế bào.Việc phát PCV2 cho phép kết luận thú bị nhiễm PCV2 kết luận thú bị PMWS TỔNG QUAN GIỚI THIỆU PMWS ( Hội chứng còi cọc heo sau cai sữa) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phổ biến, ảnh hưởng đến cơng nghiệp ni heo tồn cầu Bệnh phát tây Canada 1991, với triệu chứng trọng lượng liên tục, bệnh hô hấp vàng da Những triệu chứng tương tự xuất heo Mỹ, Pháp, bắc Ireland, Tây Ban Nha, Đan Mạch Đức Việc xác định kháng nguyên PCV nucleic acid bệnh tích đưa đến khả virus PCV độc hại xuất đàn heo nước Tất PCV phân lập từ PMWS có nhóm có liên hệ trình tự nucleotide, 96% trình tự nucleotide intragroup xác định có vài khác biệt với PCV phân lập từ dịng tế bào PK15, 80% trình tự nucleotide xác định Người ta cho PCV gây PMWS nên xem PCV loại PCV gây bệnh môi trường tế bào PK15 PCV loại Khi chưa có nghiên cứu dịch tễ phân tử, có giả thiết liên quan đến PCV2: một, PCV2 PCV1 thay đổi kỹ thuật chăm sóc ni dưỡng heo yếu tố môi trường khác tạo điều kiện cho PCV1 trở 3      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nên có độc lực gây bệnh tương tự số loài vi sinh vật khác sống cộng sinh thể vật chủ; hai, PCV1 tác động thay đổi điều kiện chăm sóc ni dưỡng mơi trường biến đổi trở thành loài virus gây bệnh Do PCV1 PCV2 diện heo chúng có tương đồng định gen nên dịch tễ học phân tử cần phân biệt chúng với để có đánh giá xác tình hình dịch tễ PMWS Porcine circovirus dạng ( PCV 2) thuộc họ Circoviridae, giống Circovirus, DNA virus chuỗi đơn vòng PCV lan tràn khắp giới đàn heo nuôi hóa, với nhiều triệu chứng bệnh Porcine circovirus (PCVD), hội chứng còi cọc heo sau cai sữa ( PMWS), hội chứng viêm da va viêm thận heo (PDNS) rối loạn khả sinh sản PCV phát năm 1974 chất gây nhiễm không gây bệnh tế bào liên tiếp dòng tế bào thận heo ( PK15) Kháng thể huyết PCV gây bệnh môi trường tế bào PK15 chứng minh nhiều đàn heo giới Tuy nhiên, xâm nhiễm cho heo phịng thí nghiệm với virus thất bại việc tạo bệnh lâm sàng Theo phịng thí nghiệm chẩn đoán thú y trường đại học bang Iowa, trường hợp PCV2 gây bệnh heo tăng nhanh chóng Mỹ giai đoạn năm 1998-2000 PCV2 kết hợp với bệnh viêm phổi biểu phổ biến nhiễm PCV2 PMWS biểu phổ biến thứ nhiễm PCV2 Chẩn đốn PMWS dựa vào tiền sử cịi cọc, lympho viêm u hạt hạch lympho nhờ kiểm tra mô bệnh học chứng minh kháng nguyên PCV2 kết hợp với bệnh tích lympho Dạng phổ biến thứ PCV2 kết hợp với nhiễm hệ thống, chẩn đoán dựa trường hợp có tiền sử cịi cọc vỡ tế bào bạch cầu viêm u hạt quan sát nhiều quan có liên quan với kháng nguyên 4      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PCV2 Sự thiếu hụt tế bào bạch cầu không quan sát mô lympho không chấp nhận trường hợp Có vài dấu hiệu bệnh lâm sàng PMWS làm tiền đề cho chẩn đoán lâm sàng bệnh bao gồm sưng hạch lympho, cịi cọc, khó thở, tiêu chảy, vàng vọt, vàng da Những dấu hiệu không xuất riêng lẻ heo, đa số heo trang trại bị nhiễm bệnh có biểu lâm sàng bệnh Để xác định bệnh cần: diện dấu hiệu lâm sàng bệnh, bệnh tích mơ học diện PCV bệnh tích Dấu hiệu lâm sàng PMWS bị giới hạn tuổi cai sữa heo PMWS xuất heo tuổi từ 25 đến 120 ngày, tập trung cao khoảng tuổi từ 60 đến 80 ngày tuổi CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY PMWS ( POSTWEANING MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROME) II.1 Phát DNA PCV2 nuôi cấy tế bào Để phát DNA PCV2 nuôi cấy tế bào, 5g phận (phổi, hạch lympho, hạch amidan) thu thập, hòa lẫn 10 ml PBS (phosphate – buffered saline) đồng Ly tâm dung dịch 1,500×g 30 phút 4°C, dịch thu thập lại lọc (0.45 μm, Sartorius,Göttingen, Germany) Dịch lỏng ủ số 24 giếng đĩa nuôi cấy ( Corning Inc., NY, USA ), chứa lớp NSK( dòng tế bào thận heo sơ sinh), tăng trưởng môi trường EMEM ( Eagle minimal essential medium ) Sau 2h ủ 22°C , giếng thêm vào ml EMEM làm giàu với 5% huyết thai bò (BioWhittaker Inc., MD, USA) 5      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Môi trường nuôi cấy NSK kiểm tra âm tính thường xuyên với PCV1, PCV2, virus pseudorabies, virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp Đối chứng dương chuẩn bị từ mơi trường tế bào NSK bị nhiễm virus dịng PCV2, phân lập từ đàn heo Italy Môi trường tế bào NSK khơng có PCV1 PCV2 sử dụng làm đối chứng âm Tất đĩa nuôi cấy ủ 10 ngày 37°C 10% CO2 Thực lần cấy chuyển, sau ủ, dịch dùng để xác định có mặt DNA PCV2 real- time PCR, theo protocol Olvera et al (2004) II.2 Hóa mơ miễn dịch ( Immunohistochemistry ) Ngun tắc: Hóa mơ miễn dịch kết hợp phản ứng miễn dịch hoá chất để làm rõ kháng nguyên (KN) diện mô (bào tương, màng tế bào, nhân) Vì kháng ngun khơng thể quan sát hình thái nên người ta phải xác định vị trí tế bào phản ứng miễn dịch hóa học Có hai kỹ thuật: miễn dịch huỳnh quang miễn dịch men Nguyên tắc: Cho kháng thể (KT) đặc hiệu lên mô, mơ có kháng ngun có phản ứng kết hợp KN - KT Có cách để quan sát phức hợp này: Miễn dịch huỳnh quang: cho gắn với chất phát huỳnh quang quan sát kính hiển vi huỳnh quang Miễn dịch men: Cho gắn với loại men (peroxidase alkaline phosphatase) gắn với chất màu (chromogen), quan sát kính hiển vi quang học 2.2 Cách thực 6      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Hóa mơ miễn dịch tiến hành mơ, mẫu bị đông lạnh −20°C Mẫu mô thu nhận từ heo có dấu hiệu lâm sàng pmws giảm cân liên tục, bệnh đường hô hấp, vàng da, sưng hạch lympho - Mẫu mô dày khoảng 4-μm nhuộm hematoxylin eosin (HE) với thuốc nhuộm hóa mơ miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng chống PVC2 - Sau làm khô loại bỏ chất nhờn mẫu, peroxidase nội sinh ức chế với peroxide hydrogen 0.3% methanol 30 phút, phục hồi kháng thể nhờ protease XIV (0.05%) 37°C - Kháng huyết thỏ đa dịng đưa vào mẫu mơ mức pha lỗng 1:2000 PBS (phosphate –buffered saline) (pH 7.2) 1h 37°C - Sau rửa mẫu PBS, phút, thêm vào biotinylated anti-rabbit IgG 30 phút, 37°C - Sau đó, lại rửa PBS, streptavidin-biotin-peroxidase đưa vào để phát có mặt PCV 10 phút nhiệt độ phòng - Sau phút rửa PBS, mẫu ủ enzyme diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) phút nhiệt độ phòng ( DAB sử dụng chất tạo màu), rửa nhuộm với haematoxylin phút nhiệt độ phòng - Mẫu làm nhờ cồn xylene, đặt lamen làm tiêu - Mẫu mô nhuộm tương phản papanicoleu hematoxyline, làm khô nước cố định với dibutyl phthalate xylene Mô lympho heo nhiễm PMWS ngẫu nhiên , diện PCV2 xác định nhờ PCR lai in situ, sử dụng đối chứng dương Đối chứng âm kháng thể có isotype (IgG1) với kháng thể sơ cấp có đặc hiệu khơng phù hợp Kết Hầu hết động vật kiểm tra cho thấy điều kiện thể kém, với mức độ teo bên biến đổi Những bệnh tích mức độ lớn quan sát chủ yếu 7      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thùy đỉnh phổi, viêm phổi, với đốm xuất huyết hạch lympho phế quản, bị sưng tái (bảng 1) Mô học cho thấy diện tổn thương phổi, hạch, mô lympho ( tế bào đa nhân lớn, sợi phế quản, viêm u hạt , hoại tử đơng tụ, xuất huyết ) Khơng có chứng mô học nhiễm vi khuẩn, PCR từ quan bệnh đồng cho thấy có DNA PCV2 số 16 heo đực Về phân lập virus, khơng có tác động gây bệnh tế bào quan sát môi trường ni cấy NSK Tuy nhiên, có mặt DNA PCV2 chứng minh từ tất 16 heo hoang dã Real Time PCR gen Cap (Capsip protein gene) thực dịch môi trường nuôi cấy NSK Kết xác nhận kính hiển vi điện tử cho thấy có mặt tụ porcine circovirus phân tử, với hình trịn đường kính khoảng 17 nm mơi trường tế bào ( hình 1) 8      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Fig Electron microphotograph of small circovirus particles from supernatant of newborn swine kidney cell culture on pooled organs (bronchial lymph nodes, lungs, tonsils) from wild boars with PCV2 infection Negative staining Bar 50 nm 9      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Khơng có virus khác giống phân tử quan sát môi trường khơng nhiễm đối chứng Chỉ có mẫu cho kết dương tính với nhuộm kháng nguyên IHC tế bào chất nhân tế bào nang hạch lympho phổi (hình 2) 10      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.3 Lai chỗ (In situ hybridization) 3.1 Nguyên tắc: Lai chỗ kiểu lai phân tử trình tự đích cần tìm nằm tế bào, mơ Q trình lai với mẫu dị đánh dấu phát phân tử lai thực lát cắt mô 3.2 Cách thực Mẫu mô thu nhận từ heo có dấu hiệu lâm sàng PMWS giảm cân liên tục, bệnh đường hô hấp, vàng da, sưng hạch lympho Mẫu mô heo bệnh cố định 10% formalin trung tính gắn tiêu paraffin nhờ sử dụng kỹ thuật tiêu chuẩn µm mẫu mơ từ heo bị PMWS heo đối chứng cắt vào slide, xử lý với 3-amino-propyltriethoxysilane (APES) Ủ 600 C 30 phút, loại bỏ chất nhờn xylene làm khô cồn peroxidase nội sinh bị ức chế Probe chuyên biệt cho PCV2 tạo với kit có sẵn thị trường Probe đưa vào với 20-30 ml hỗn hợp lai gồm 50% formamide, 10% dextran sulphate, x dung dịch đệm muối natri citrate ( ssc), x dung dịch Denhardt, 200 mg/ml DNA tinh trùng 0.05% probe cho PCV Mẫu mô lặp lại loại bỏ paraffin nhờ thay đổi xylene thay đổi cồn tuyệt đối, làm khô PBS có 70-95% ethanol Giữa bước, mơ rửa lần mM PBS 10 phút Hoạt động enzyme nội sinh peroxidase bị ức chế ủ 20 phút 0.5% H2O2 methanol Những mẫu cắt môi trường tế bào cố định formalin ủ 0.5% protease XIV 0.05 M tris- HCL 15 phút, 37°C, rửa qua với nước cất rửa lại lần mM PBS (để tối ưu cho thí nghiệm ISH IHC, mẫu đưa vào 11      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com enzyme tiêu hóa protein sử dụng protease XIV proteinase K nồng độ 0.5 mg/ml cho 10, 20, 30 40 phút 37°C.) 50 µl hỗn hợp lai đưa vào đặt lamen DNA mục tiêu mơ mẫu dị PCV2 hỗn hợp lai bị biến tính ủ 90°C, 10 phút sau làm lạnh túi đá Sự lai thể khoảng 18-22h, 37°C môi trường ẩm Sau lai, slide kính rửa lần muối natri citrate Slide rửa lại lần PBS sau ủ buffer maleic acid 20 phút, 37°C Những mẫu cắt sau chuyển vào buffer maleic acid, chứa 1% tác nhân ức chế, sau ủ kháng thể anti-digoxygenin POD, pha loãng 1:200 1% chất ức chế/ buffer maleic acid Mẫu rửa buffer maleic acid đến 5mM PBS Cuối cùng, đưa DAB vào ( 3,3 diaminobenzidine) Slide nhuộm tương phản nhẹ với Harris hematoxylin, làm khô cồn cố định làm tiêu để quan sát kính hiển vi quang học 3.3 Kết quả: Hình thái học tế bào bị khử mô cố định formalin ethanol so sánh với mẫu cắt nhuộm hematoxylin eosin (HE) mẫu mô phương pháp cố định formalin Mơ cố định ethanol có giảm rõ ràng hình thái học ISH so sánh với HE ISH mô cố định formalin Cả hai phương pháp cố định ethanol formalin tạo dạng nhuộm mô dương tính PCV2 Khi cố định ethanol, mẫu tuyến ức hạch lympho âm tính PCV2 khơng chứa tế bào dương tính ISH Mẫu nhiễm PCV2 chứa mơ heo bị PMWS bảo quản formalin ethanol Mẫu cắt tuyến ức bị PMWS cố định ethanol cho thấy có phân hủy sản phẩm phản ứng DAB tạo thành 12      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thể vùi riêng biệt tích đọng tế bào chất đến hòa nhập chất nhuộm tế bào chất cho thấy có mặt DNA virus tế bào chất đại thực bào Thỉnh thoảng nhân mơ bào dương tính khi tế bào có nhân thối hóa cho thấy nhân nhuộm ISH Hạch lympho bị PMWS cố định ethanol cho thấy nhuộm tế bào chất DNA virus đại thực bào thể vùi riêng biệt kết tụ tế bào chất virus Tế bào dương tính phân bố tủy ức, mơ vỏ Hạch lympho bị PMWS cố định formalin cho thấy vật chất tế bào chất dương tính mạnh tế bào chất mô bào tế bào thực bào hoạt hóa Khơng có khác biệt dạng tế bào nhuộm nhuộm nội bào hai phương pháp cố định Ở hạch lympho, nhiều đại thực bào dương tính ISH, so sánh với vài tế bào rải rác mô vỏ 13      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 14      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hạn chế ưu điểm phương pháp IHC Chậm Đặc hiệu, nhạy Đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thấp Thuận lợi việc bảo quản mẫu bệnh phẩm Hạn chế ưu điểm phương pháp lai chỗ Đặc hiệu cao Độ nhạy cao, không ổn định Phức tạp, giá thành cao Phân lập virus Để phân lập virus, khoảng 15% dịch mẫu mô thu nhận từ MEMSA (Môi trường thiết yếu tối thiểu chứa muối earle peniciline streptomycin) 15      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cách nghiền mẫu với cối, chày vô trùng thêm vào cát vơ trùng Sau hịa tan với MEM-SA ly tâm 3,000 x g 30 phút 40C, loại bỏ dịch trước ủ với mơi trường tế bào, 100 µl chloroform thêm vào đến 2ml dịch trộn lẫn liên tục khoảng 10 phút nhiệt độ phòng Hỗn hợp chuyển vào ống ly tâm ly tâm 3000 x g 10 phút, loại bỏ dịch Dịch sử dụng nguyên liệu cấy cho nghiên cứu phân lập virus Tất nghiên cứu phân lập virus thực môi trường tế bào PK15, không nhiễm PCV, pestivirus, adenovirus heo, parvovirus heo Tế bào PK15 lấy khỏi môi trường sử dụng trypsin versene hòa tan lại MEM-SA chứa 15% huyết bị khơng có pestivirus ( MEM-G) nồng độ x 105 tế bào/ml 10ml mẫu đại diện dịch tế bào trộn lẫn với 2ml mẫu đại diện nguyên liệu cấy trên, hỗn hợp thu phân chia vào bình ni cấy mô khoảng 25ml Những môi trường ủ 370C 18h 10% CO2 Sau đó, lớp tế bào lớp xử lý với 300 mM D-glucosamine ủ 370C 48-72h Sau đó, bình ni cấy ngun liệu cấy được đơng lạnh rã đơng lần Bình cịn lại nguyên liệu cấy cấy chuyển cách tách tế bào PK15 sử dụng trypsin versene, tái hòa tan tế bào tách 20 ml MEM-G, đưa chúng vào bình ni cấy 75 ml nồng độ x 105 tế bào/ ml Bình ni cấy sau “siêu gây nhiễm” cách thêm ml tế bào ly giải thích hợp sau đông lạnh/rã đông lần ml dịch siêu gây nhiễm lấy đưa vào đĩa petri ( đường kính 55mm) có lamen khử mỡ vơ trùng Bình ni cấy lamen ủ 370C xử lý với glucosamine Sau xử lý glucosamine 24-48h, Lamen lấy cố định acetone 10 phút nhiệt độ phòng 10% buffer formalin trung tính 4h Sau cố định, tất lamen dự trữ -700C gel silica trước sử dụng cho hóa miễn dịch ISH 16      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.4 Các phương pháp khác Ngoài sử dụng phương pháp hóa mơ miễn dịch lai in situ, số phương pháp khác sử dụng để chẩn đoán PMWS virus phương pháp PCR, phương pháp ELISA, miễn dịch huỳnh quang gián tiếp… 4.1 Phương pháp PCR: PCR thực để xác định diện PCV2 DNA phổi, hạch bạch huyết hạch amidan DNA virus ly trích với kit QIAmp DNA mini, thu thập từ động vật đồng dung dịch PBS ( phosphate buffer solution) tỉ lệ 1:5 Phản ứng PCR thực máy chu trình nhiệt mastercyler gradient (eppendorf, Hamburg, Germany) µl DNA trích sử dụng cho khuếch đại trình tự CAP (capsid protein gene) Sự khuếch đại thực 25 µl hỗn hợp phản ứng với thành phần sau: MgCl2 (1 mM), Buffer GoTaq® 1X (Promega, Madison, WI, USA), dNTPs (0.2 mM), primers 150 (5′ACTGTCAAGGCTACCACAGTCA-3′) PMWS-1443 (5′CGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3′; μM), GoTaq® (1.25 U), and 2.5 μL of DNA Điều kiện phản ứng : biến tính 94°C phút, 35 chu kỳ 94°C phút, 55°C phút, 72°C phút , kéo dài 72°C 10 phút sản phẩm PCR (481) chạy điện di gel 2% agarose quan sát nhờ chế geldoc2000 (Bio-Rad Laboratories Inc., France) Đối chứng dương chuẩn bị từ 100 μL môi trường tế bào thận heo sơ sinh (NSK) nhiễm virus dòng PCV2 phân lập từ đàn heo Italy Với lượng mơi trường tế bào NSK, khơng có virus PCV dạng sử dụng đối chứng âm 4.2.Phương pháp huyết học Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: huyết heo kiểm tra nhờ IIF Huyết heo pha loãng 1:50 1:250 PBS ( phosphate buffered 17      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com saline) cung cấp dòng tế bào PK15 nhiễm PCV2 cố định aceton Huyết heo âm dương tính đối chứng khơng có huyết sử dụng IIF Sau ủ 370C 1h, lamen rửa PBS, fluorosceinisothiocyanate phức với rabbit anti swine IgD đưa vào 1h 370C Dung dịch chuẩn bị rửa PBS làm tiêu buffer muối glycerol trước quan sát tia UV Huyết coi dương tính tế bào nhuộm cho tín hiệu huỳnh quang mạnh quan sát ELISA cạnh tranh: c- ELISA thực đĩa vi chuẩn, có bước ủ trước phản ứng với chất enzyme Ngoại trừ bước thứ 2, chu kỳ rửa thực tay sau bước, sử dụng PBS có 0.05% tween 20f đĩa ni cấy phủ qua đêm độ C với 100ml kháng nguyên PCV2 0.85 mg/ml pha loãng 0.05M dung dịch đệm carbonate- bicarbonate pH 9.6 Huyết heo pha loãng 1:125 PBST 50ml thêm vào để nhân đôi giếng mẫu huyết nhân đôi giếng đối chứng huyết thanh, ủ 370C 45 phút Dung dịch đệm phosphate saline chứa tween 20 thêm vào đến giếng tiếp hợp mẫu giếng tiếp hợp đối chứng riêng Không loại bỏ huyết thanh, giếng mẫu nhận 50ml kháng thể đơn dịng chun biệt cho PCV2, 12B6, pha lỗng đến 42 mg/ml PBS-T, giếng chuẩn nhận PBS-T, sau ủ 30 phút 370C Kết hợp với HRP-GAM, pha loãng 1:8000 PBS-T chứa 5% huyết dê, thêm vào 100ml vào tất giếng, ủ 1h 370C Ezyme 3,3-5,5-tetramethylbenzidine thêm vào nhiệt độ phòng phản ứng dừng sau 10 phút với M H2SO4 Độ hấp thu đọc bước song 450nm Kết mật độ quang OD giải thích việc tính tốn PI sử dụng cơng thức sau: PI = 100 - [(serum OD/control OD) X 100] 18      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Huyết OD( cho huyết thanh) = huyết trung bình giếng mẫu – huyết trung bình chuẩn OD đối chứng= trung bình giếng mẫu tiếp hợp trung bình giếng chuẩn tiếp hợp (0% ức chế) Kết dãy âm dương tính tính tốn từ trung bình phần trăm ức chế dãy âm IIF cộng độ lệch chuẩn giá trị trung bình Sự tính tốn có độ tin cậy 95% 96% mà tất giá trị âm tính rơi vào phạm vi giới hạn Độ nhạy tính chun biệt ELISA tính tốn cơng thức sau: Độ nhạy = dương tính thật x 100/ dương tính thật + dương tính giả Độ chuyên biệt = âm tính thật x 100/ âm tính thật + âm tính giả Sự thay đổi thử nghiệm liên tiếp c-ELISA đánh giá tái kiểm tra lần 24 dãy, với PIs 24% 100% KẾT LUẬN Sự hiểu biết nhân tố ảnh hưởng đến phổ biến nghiêm trọng PMWS chưa hiểu hết, nhiên rõ ràng có liên quan đến lượng cao PCV2 mơ Vì biến đổi điều hịa PCV2 mơ cần thiết cho biểu bệnh Sự hiểu biết dịch tễ học nhân tố khởi động tiềm ẩn nâng cao, đặc biệt vai trò tá dược, vaccin đồng gây nhiễm Cho đến vaccin sử dụng rộng rãi Canada, điều quan trọng để điều khiển PMWS ngăn chặn khuếch đại dòng virus Trong dòng PCV2 xuất nhận ý Đông Canada, công nghiệp nên nhận thức dòng virus trội chưa chứng minh Sau phát PCV2, nghiên cứu huyết học chứng minh nhiễm PCV2 phổ biến heo nuôi heo hoang dã Đến nay, nhiều nghiên cứu cho thấy kết hợp PCV2 với bệnh tích nhiều mơ heo ni dấu hiệu lâm sàng PCVD, PMWS, PDNS rối loạn sinh sản PCV2 19      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com gây u hạt tế bào lympho kẽ phổi, u hạch lympho, phổ biến hơn, tế bào lympho u hạt viêm gan,bệnh viêm thận Những kết dẫn đến kết luận PCV2 đại diện cho tác nhân gây bệnh heo hoang dã, nơi mà dễ dàng gây bệnh tích trực tiếp tạo ảnh hưởng bệnh học tương tự heo nuôi, gây ức chế miễn dịch kích thích xuất lây nhiễm thứ hai Những nghiên cứu xa cần thực để hiểu rõ vai trò dịch tễ học heo hoang dã việc dẫn truyền nhiễm PCV2, đặc biệt nơi chứa tiềm tàng heo nuôi sống khu vực địa lý Trong chẩn đoán xác định nguyên nhân gây PMWS cần phải sử dụng kỹ thuật liên quan trực tiếp virus bệnh tích mơ, kỹ thuật hóa mơ miễn dịch lai chỗ khuyến khích sử dụng đáng tin cậy TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y F McNeilly et al,1999 Journal of virological methods 80, p 123-128 Alexander Hamberg, Susan Ringler, Steven Krakowka, 2007 Method for detection of porcine circovirus type 2, p 135-141 G M Alan et al, 1998 PCV-like viruses in diseased pigs, p 3-10 S Petrini et al, 2009 Detection of PCV2 from wild boars in central Italy, p 465469 20      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………….3 TỔNG QUAN………………………………………………………… Giới thiệu ……………………………………………………… Phương pháp chẩn đoán………………………………………… II.1 Phát DNA PCV2 nuôi cấy tế bào……………… II.2 Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch………………………………… II.2.1 Ngun lý…………………………………………… II.2.2 Cách tiến hành…………………………………………7 II.2.3 Kết quả……………………………………………… II.3 Kỹ thuật lai chỗ………………………………………… 11 II.3.1 Nguyên lý…………………………………………… 11 II.3.2 Cách tiến hành…………………………………………11 II.3.3 Kết quả……………………………………………… 13 II.4 Các phương pháp khác………………………………………18 II.4.1 Phương pháp PCR…………………………………… 18 II.4.2 Phương pháp huyết học……………………… 18 KẾT LUẬN…………………………………………………………….20 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 21 21      LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... vật chất tế bào chất dương tính mạnh tế bào chất mơ bào tế bào thực bào hoạt hóa Khơng có khác biệt dạng tế bào nhuộm nhuộm nội bào hai phương pháp cố định Ở hạch lympho, nhiều đại thực bào dương... lympho bị PMWS cố định ethanol cho thấy nhuộm tế bào chất DNA virus đại thực bào thể vùi riêng biệt kết tụ tế bào chất virus Tế bào dương tính phân bố tủy ức, mô vỏ Hạch lympho bị PMWS cố định... vùi riêng biệt tích đọng tế bào chất đến hịa nhập chất nhuộm tế bào chất cho thấy có mặt DNA virus tế bào chất đại thực bào Thỉnh thoảng nhân mơ bào dương tính khi tế bào có nhân thối hóa cho