CHẨN đoán VIRUS cúm GIA cầm BẰNG kỹ THUẬT NUÔI cấy PHÔI TRỨNG

Chẩn đốn virus cúm gia cầm kỹ thuật ni cấy phôi trứng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC Seminar : Chẩn đốn bệnh CHẨN ĐỐN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY PHÔI TRỨNG Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải Hồ Bảo Quốc 06126117 DH06SH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng -1- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng A Đặt vấn đề Virus cúm đại dịch cúm gia cầm gây thiệt hại lớn kinh tế quốc gia giới chúng thách thức lớn cho ngành y tế năm qua Việt Nam quốc gia chịu ảnh hưởng nhiều đại dịch Mặc dù có nhiều biện pháp nỗ lực việc phòng chống chưa mang lại hiệu mong muốn Trong cơng tác phịng chống việc chẩn đốn để xác định xác virus gây bệnh khâu quan trọng Một kỹ thuật chẩn đốn virus cúm gia cầm có độ xác cao kỷ thuật ni cấy phơi trứng -2- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn virus cúm gia cầm kỹ thuật ni cấy phôi trứng B Tổng quan I Thông tin chung cúm gia cầm Cúm gia cầm ? Cúm gia cầm, gọi cúm gà, bệnh truyền nhiễm động vật, chủ yếu lồi chim, đơi thấy lợn virút cúm gia cầm týp A gây Chủng vi-rút cúm có độc tính cao, đơi vượt qua hàng rào bảo vệ lây nhiễm cho người Dựa kháng nguyên, người ta chia cúm gia cầm thành 16 phân nhóm H (Haemagglutinin: H1-H16) phân nhóm N (Neuraminidase: N1-N9), phân nhóm H5 H7 có độc tính cao Hiện có vi-rút H1N1 H3N2 lưu hành gây bệnh người -3- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn virus cúm gia cầm kỹ thuật ni cấy phôi trứng Vi-rút cúm gây dịch cúm gia cầm H5N1 chia làm nhóm: - Vi-rút cúm gia cầm có độc tính thấp (Low pathogenic avian virus: LPAV): thường lưu hành loài chim hoang dã, không gây bệnh hay gây bệnh nhẹ: xù lông, giảm sản lượng trứng thường không phát - Vi-rút cúm gia cầm có độc tính cao (Highly pathogenic avian virus: HPAV): nguy hiểm Chúng lan truyền nhanh đàn gia cầm, gây bệnh nặng ảnh hưởng đến nhiều quan cuối gây tử vong gần 100% vòng 48 kể từ nhiễm bệnh Bệnh lý LPAI ( low pathogenic avian influenza virus ) Những thương tổn thay đổi với giống, loài virus tuổi kí chủ Thơng thường, gà tây gà biểu lộ vài thay đổi đặc biệt lớn nhỏ với giống thích nghi với ký chủ ( Capua Mutinelli 2001) Trong gà tây, bệnh viêm xoang, viêm khí quản airsacculitis phát hiện, tiêm nhiễm vi khuẩn sơ cấp góp phần khơng có hại gì.Tuỵ gà tây mơ tả với gà bình thường, bọc nhẹ đường hơ hấp thường thấy Thêm vào, tổn thương tập trung quan sinh sản gà đẻ trứng ( buồng trứng, vịi trứng, viêm màng nỗn hồn.) HPAI (hightly pathogenic avian influentza viruses ) Những thay đổi lớn bệnh lý mô bệnh học HPAI bộc lộ phụ thuộc giống để ghi vào danh sách cho diện triệu chứng lâm sàn Bốn loại thay đổi tác nhân gây bệnh thăm dị ngun lí ( Perkins and Swayne 2003): (i) Có lẽ (chết khoảng thời gian 24- 36 hours tiêm nhiễm, phần lơn trơng thấy lồi galliforme) dạng cấp tính bệnh biểu lộ thay đổi bệnh tích khơng đặc thù: hydropericardium rời rạc, sung huyết nhẹ ruột -4- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng có đóm xuất huyết màng treo màng ngồi màng ói mơ tả khơng quán ( Mutinelly 2003a, Jones and Swayne 2004) Những gà bị tác động dòng H5N1 châu Á đôi lúc biểu xuất huyết mảng tổng lượng chất nhầy đáng kể khí quản ( Elbers 2004) Tiết dịch rỉ huyết khoang thể phù nề phổi trơng thấy khơng có hại Những đóm chảy máu màng nhầy dày tuyến, thường mơ tả phần sách phần trước, có khác biệt gặp gia cầm nhiễm với dòng H5N1 châu Á (Elbers 2004) Những tổn thương mô học khác gắn với kháng nguyên virus phát mơ khác ( Mo 1997) Virus trông thấy màng tế bào Vào giai đoạn sau tế bào bị nhiễm virus phát tim, tuyến thượng thận tuỵ tạng Những tế bàp thần kinh tế bào thần kinh đệm não bị nhiễm.Về bệnh lý, tiến trình tương tự virus màng khác thừa nhận nơi màng hoạt hoá bạch cầu dẫn đến hệ thống phân bào rời rạc phóng thích khả dễ mắc bệnh đến tim phổi nhiều quan hoạt động (Feldmann 2000, Klenk 2005) (ii) Ở động vật hữu nhũ chúng thể công kéo dài triệu chứng bệnh tiến trình kéo dài bệnh, triệu chứng thần kinh mô học, tổn thương não gây mưng mủ trội hẳn hình dung (Perkins and Swayne 2002a, Kwon 2005) Tuy nhiên, virus phân lập từ quan khác Quá trình mô tả ngỗng, vịt, đà diểu lồi khác tiêm thí nghiệm với dịng HPAI H5N1 châu Á Trong chim cho trứng, chứng viêm buồng trứng, vịi trứng, sau nang bị vỡ, gọi viêm phúc mạc lịng đỏ trứng, trông thấy -5- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng (iii) Ở vịt, mồng biển, chim sẻ, tái virus tìm thấy Những loài chim thể viêm phổi nhẹ, viêm khí quản tế bào bạch cầu viêm mô tim ( Perkins and Swayne 2002a, 2003) (iv) Trong thí nghiệm mơ tả Perkins Swayne (2003), chim bồ câu chim sáo biển chứng tỏ khả kháng lại tiêm nhiễm virus H5N1 Tuy nhiên, Werner cộng ( cơng bố) có khả gây bệnh thần kinh, thừa hưởng đến viêm não không làm mưng mủ (KlopBesch 2006), 5/16 chim bồ câu dùng chủng H5N1 HPAI phân lập cách đay không lâu Vi-rút cúm khuyếch tán lây truyền nào? Loài thủy cầm nguồn tất loại vi-rút cúm tự nhiên qua hàng kỷ, kể týp H5 H7 thường có độc tính thấp Tuy nhiên chủng độc tính thấp H5 H7 truyền cho gia cầm, chúng biến đổi, đột biến gen để trở thành chủng độc tính cao gây nên dịch Trong thời gian gần đây, người ta ghi nhận số loài chim di trú có khả khuyếch tán vi-rút H5N1 độc tính cao Hiện dịch cúm gia cầm xảy nào? - Dịch cúm gia cầm bắt đầu xảy vào năm 2003 Đông Nam Á, dịch cúm gia cầm lớn nghiêm trọng lịch sử loài người, làm chết hàng loạt loài chim Tác nhân gây bệnh vi-rút H5N1 tồn dai dẳng, giết chết hay khiến người tiêu hủy ước tính khoản 150 triệu chim gia cầm -6- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng Hiện vi-rút xem tác nhân gây dịch Indonesia, Việt Nam, số tỉnh Cambodia, Trung Quốc, Thái Lan Cộng Hoà Nhân Dân Lào Ngoài từ tháng 12/2003 – đầu tháng 2/2004, cúm gia cầm H5N1 báo cáo quốc gia Châu Á: Hàn Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Thái Lan, Cambodia, Cộng Hoà Nhân Dân Lào, Indonesia Trung Quốc Hầu hết quốc gia chưa xảy dịch cúm gia cầm lịch sử họ - Đầu tháng 8/2004: cúm gia cầm H5N1 lần bùng nổ Malaysia, Nga vào cuối tháng 7/2005, số tỉnh Cộng Hồ Kazakhtan Mơng Cổ vào đầu 8/2005 Vào đầu 9/2005 cúm ghi nhận Thổ Nhĩ Kỳ Romania Hiện Nhật Bản, Hàn Quốc Malaysia đưa khỏi danh sách quốc gia bị dịch - Tính đến 24/08/2006 có 59 quốc gia có gia cầm bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ người nào? (a) Sự lan rộng tồn lâu dài dịch cúm gia cầm gây mối nguy lớn sức khoẻ người: -7- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - Nguy lây nhiễm trực tiếp vi-rút cúm từ gia cầm bị bệnh, gây bệnh nặng, chủng vi-rút H5N1 gây bệnh nghiêm trọng có tỉ lệ tử vong cao (>50%), chủ yếu bệnh viêm phổi suy đa quan Đa số xảy bệnh nhân trước mắc bệnh hồn tồn khoẻ mạnh - Quan trọng hơn, nguy vi-rút bị đột biến, biến đổi gen nên dễ lây truyền từ gia cầm sang người, từ người sang người Sự biến đổi khởi phát đại dịch (b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy người: - 1997: có 18 trường hợp xảy Hong Kong, gây tử vong trường hợp (chiếm tỉ lệ 33,33%) - 2003: có trường hợp xảy Hong Kong gia đình có tiền sử du lịch Trung Quốc gần đây, gây tử vong trường hợp (chiếm tỉ lệ 50 %) - 2004: Thái-lan có 17 ca tử vong 12 (chiếm tỉ lệ 70,59%), Việt Nam có 29 ca tử vong 20 (chiếm tỉ lệ 68,97 %) - 2005: có quốc gia có bệnh nhân nhiễm, tổng cộng 95 ca tử vong 41 (chiếm tỉ lệ 43,16 %) - Tính đến 23/08/2006: trường hợp nhiễm vi-rút cúm H5N1 xác định xét nghiệm báo cáo quốc gia với 96 ca bị nhiễm tử vong 64 (chiếm tỉ lệ 66,67 %) khơng có Việt Nam Tóm lại, dịch cúm A (H5N1) người ghi nhận 10 quốc gia giới, với 232 trường hợp mắc bệnh có tổng cộng 134 trường hợp tử vong (chiếm 57,9%) - Riêng Việt Nam, từ ngày 14/11/2005 đến gần tháng không ghi nhận trường hợp mắc cúm A (H5N1) người Tính từ trường hợp mắc cúm A(H5N1) Việt Nam (26/12/2003) đến ghi nhận 93 trường hợp mắc 32 tỉnh/thành phố, có 42 trường hợp tử vong (xem chi tiết số liệu bảng 1) (c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trường hợp nào? - Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh, tiếp xúc với bề mặt hay vật dụng bị nhiễm phân gia cầm bị bệnh -8- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn virus cúm gia cầm kỹ thuật ni cấy phôi trứng - Hầu hết trường hợp xảy nơng thơn, ngoại hay nơi có ni gia cầm - Phân chất tiết chim nhiễm bệnh thảy môi trường chứa nhiểu vi-rút cúm gây bệnh xuống môi trường lớn - Nghiêm trọng người nuôi gia cầm vùng dịch tễ thấy gia cầm có triệu chứng nhiễm bệnh làm thịt, chế biến dùng hay bán thị trường Nguồn tiếp xúc có nguy cao người giết gia cầm, nhổ lông chế biến trước đem nấu chín Triệu chứng bệnh cúm gia cầm người gì? Dựa yếu tố triệu chứng sau: (a) Yếu tố dịch tễ: - Tiếp xúc với gia cầm bị bệnh vòng tuần trước (ni, bn bán, vận chuyển, giết mổ, ăn thịt gia cầm bị bệnh, ăn tiết canh v.v ), sống vùng có dịch cúm gia cầm - Tiếp xúc gần với người bệnh xác định cúm, người bệnh tử vong viêm phổi chưa rõ nguyên nhân (b) Lâm sàng: Bệnh diễn biến cấp tính có biểu sau đây: - Có dấu hiệu nhiễm khuẩn: sốt 38oC, rét run - Các triệu chứng hô hấp: o Ho, thường ho khan, đau ngực, gặp triệu chứng viêm long đường hơ hấp o Khó thở, thở nhanh, tím tái, o Ran nổ, ran ẩm nghe phổi o Có thể dẫn đến suy hơ hấp cấp tiến triển (ARDS) - Triệu chứng tuần hoàn: nhịp tim nhanh, đơi có sốc - Các triệu chứng khác: đau đầu, đau cơ, tiêu chảy, rối loạn ý thức - Suy đa tạng -9- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng (c) Cận lâm sàng: - X quang phổi: Tổn thương thâm nhiễm lan toả bên hai bên, tiến triển nhanh - Xét nghiệm máu: o Công thức máu: số lượng bạch cầu: bình thường giảm o Khí máu: giảm oxy máu bệnh tiến triển nặng + PaO2 giảm (< 85 mmHg), giảm nhanh (dưới 60 mmHg) Tỷ lệ PaO2/FiO2 300 có tổn thương phổi cấp (ALI), 200 có suy hơ hấp cấp tiến triển (ARDS) - Chẩn đoán vi sinh vật: o Làm RT-PCR để xác định vi rút cúm A/H5 o Phân lập vi khuẩn theo thường quy II Chẩn đoán bệnh phịng thí nghiệm Sự thu thập mẫu xét nghiệm Những mẫu xét nghiệm nên dược thu thập từ vài xác xúc vật chết tươi từ chim bị bệnh ßock Theo lý tưởng, lấy mẫu đầy đủ nhìn lại phương pháp thống kê chẩn đoán làm đế ßock Khi thu thập mẫu nghi nhiễm HPAI, tiêu chuẩn an toàn phải khảo sát để tránh phơi bày người sưu tập mẫu đến khả HPAIV (Bridges 2002), Nguyên tắc đạo đề nghị bỡi CDC (CDC 2005) Khi xét nghiệm virus, thấm thu từ lỗ huyệt vùng hầu thơng thường cho phép phịng thí nghiệm điều tra đầy đủ hoàn chỉnh Vật liệu thu thập mẫu nên trộn vào 2-3ml mẫu đại diện môi trường vận chuyển đẳng trương vô trùng bao gồm kháng sinh bổ sung protein nguồn (e.g 0,5%[ w/v] albumin huyết bò, 10% huyết bò dung dịch pha lấy não) - 10 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng Khi mổ xẻ để phân tích, mang ngồi điều kiện an toàn tránh phát tán mầm bệnh (xem trọng), mẫu bệnh phẩm não, khí quản/phổi, lách chứa ruột khơng bảo quản thu thập cho việc phân lập virus Mục đích huyết học, mẫu máu tự nhiên lấy Một số mẫu thu thập nên phát khoảng thời gian tin cậy 95% cho giới hạn với phổ biến 30% Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm Những mẫu thấm, mô máu nên giữ lạnh vận chuyển không cho phép đông đá Nếu trở ngại gặp phải đường vận chuyển làm thời gian kéo dài 48h, mẫu xét nghiệm nên đóng băng vận chuyển cacbondioxit đậm đặc Trong tất trường hợp, điều chỉnh an toàn vận chuyển (e.g IATA rules) nên khảo sát kỹ để tránh phát tán mẫu bệnh phơi nhiễm người suốt trình vận chuyển Nó thích hợp cao để tiếp xúc phịng thí nghiệm bổ nhiệm - 11 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng cho việc chẩn đốn trước gửi mẫu phân tích đến và, lý tưởng, troen tru trước thu thập chúng Phát trực tiếp tiêm nhiễm AIV Cơ bản, hai (parallel) đường phương pháp chẩn đoán chúng thử để phân lập kiểu phụ virus phương pháp ( xem sổ tay OIE 2005 ) phát phân tử đặc trưng gen virus Thông thường, AI virus phân lập bỡi tiêm miễn dịch miến gạt ướt mô đồng chất trứng gà có phơi từ 9- 11 ngày tuổi, thường màng đệm túi niệu ( Woolcock 2001 ) Phụ thuộc dạng tác nhân, phơi chết với ngày khảo sát , thừơng thương tổn đặc thù để trông thấy phôi màng túi niệu ( Mutinelli 2003b) Những trứng tiêm chủng với HPAIV bao gồm vật liệu thường chết vòng 48 Sự xuất tác nhân ngưng kết phát gạt túi niệu Sự ngưng kết (HA) kỹ thuật vơ tình u cầu 106.0 mảnh nhỏ ml Nếu tập trung lượng thấp virus diện chất để tiêm chủng, tuỳ vào hai qua đẩy mạnh trứng thụ tinh cần thiết cho vài giống LPAIV, kiểu để sản xuất đủ virus để phát HA Trong trường hợp HPAIV , qua thứ hai sử dụng chất để tiêm chủng pha lỗng thuận lợi cho sản xuất tối ưu ngưng kết Sự phân lập ngưng kết mô tả kháng nguyên thử nghiệm ức chế ngưng kết (HI) sử dụng (mono-) kháng kháng huyết loại phụ 16 H cho việc kiểm soát, kháng lại những type khác virus gia cầm, type thể hoạt động kết Lồi phụ NA được xác định sau thử nghiệm ức chế neuraminidase, mặc khác yêu cầu laọi phụ huyết dặc biệt ( Aymard 2003 ) Trong trường hợp phân lập dòng H5 H7 chạm trán, bảng liệt kê tác nhân động mạch gây bệnh (IVPI) cần thiết cho việc xác định để - 12 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng phân biệt kiểu LP HP (Allan 1977 ) Đó hồn thành tiêm chủng iv 10 gà tuần tuổi với virus phân lập trứng phát triển ( 0,1 ml 10dung dịch pha loãng dịch túi niệu bao gồm độ chuẩn lớn 16) Những gà khảo sát thời kỳ mười ngày có triệu chứng bệnh Những kết nhập bên bảng biểu thị virus HPAI tỷ lệ lớn 1.2 sử dụng Như lựa chọn, HPAI phân lập thử sức tối thiểu 10 ( 75% ) gà tiêm chủng chết với giai đoạn khảo sát Những thủ tục mơ tả đưa đến chẩn đoán HPAI khoảng thời gian ngày địi hỏi nhiều hai tuần để loại trừ có mặt AIV Trong tình thêm vào, cơng cụ chẩn đoán chất lượng cao ( SPF eggs, H- and N-subtype specific antisera) kỹ người điều kiện định trước hết Ngày nay, không ứng dụng nuôi cấy tế bào cho việc phân lập AIV, phân lập AIV đạt nhạy cảm trứng mái có phơi ( Seo 2001) ii) Một tiếp cận nhanh chóng, đặc biệt loại trừ tiêm nhiễm đòi hỏi, tận dụng kỷ thuật sinh học phân tử, nên theo kiểu phân tầng: diện RNA đặc biệt virus cúm phát thông qua kỹ thuật RT-PCR kỹ thuật nhằm vào đoạn gen M, hầu hết vùng genome bảo tồn cao virus cúm ( Fouchier 2000, Spackman 2002), gen mã hoá capsid (Dykaer 2004) Khi kết dương tính đạt được, RT-PCRs khuếch đại đoạn gen ngưng kết loài phụ H5 H7 chạy để phát có mặt AIVs khai báo ( Dybkear 2004, Spackman 2002) Khi đáp lại dương tính, chẩn đốn phân tử loại tác nhân gây bệnh (LP chống lại HP) thực sau giải trình tự đoạn gen HA trải dài vùng phân tách bỡi enzyme proteoza nội thích ứng Hiện phân lập với amino acid phức tạp có tính bazơ phân loại HPAI PCRs kỷ thuật DNA khác thiết kế cho việc phát dòng H5N1 châu Á (Collins 2002, Payoungporn 2004, Ng 2005) Loài phụ - 13 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật ni cấy phơi trứng Non-H5/ H7 nhận diện RT-PCR hợp với tiêu chuẩn phân tích trình tự sau đơn vị HA-2 (Phípp 2004).Đó primer cho lồi phụ NA Một đặc trưng đầy đủ đạt vòng ngày, đặc biệt kỷ thuật real time PCR sử dụng (Perdue 2003, Lee and Suarez 2004) Tuy nhiên chip DNA phát triển chúng xúc tiến việc xếp có hiệu loại virus AI (Li 2001, Kessler 2005) Một chẩn đốn loại trừ có khả thực khoảng ngày làm việc Những bất lợi phương pháp chẩn đốn phân tử giá thành để trả cho việc mua thiết bị thứ dùng, có sẵn, vài mẫu phân tích với người thời gian ngắn so với phân lập virus trứng Tuy nhiên, khơng nên giữ bí mật phản ứng PCR lai phân tử, ngược với phân lập virus trứng, chứa chấp chất không rõ ràng liên quan đến diện thay đổi đặc biệt việc phân lập vị trí liên kết primer và/hoặc probe chúng đưa đến thử nghiệm âm tính giả Do đó, kết hợp sinh học phân tử ( e.g kết sàng lọc) phương pháp phân loại (e.g đặc trưng không thay đổi phân lập xác nhận phương pháp chẩn đoán bảng phụ lục) giúp để đối trọng bất lợi hai nguyên lý Những phương pháp thử nghiệm nhanh thiết kế cho việc phát kháng nguyên virus vết mô phương pháp xét nghiệm kính phết cryostat section sử dụng miễn dịch phát huỳnh quang thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme bắt giữ kháng nguyên (ELISA) hệ thống que đo mực nước dòng chảy phần bên chất lưu miếng gạt Cho đến bây giờ, kỷ thuật có độ nhạy thấp kỷ thuật phân lập virus PCR,và gặp khó khăn để chấp nhận cho phương pháp chẩn đoán hợp lý, đặc biệt bảng danh mục ( Davision 1998, Selleck 2003, Cattoli 2004) Ứng dụng phương - 14 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng pháp xét nghiệm nhốt mắt phẳng lĩnh vực thú y cịn giai đoạn phơi thai cần đẩy mạnh việc phát triển Phân lập nhận dạng virus 4.1 Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trứng gà có phơi 4.1.1 Q trình vật liệu cho chẩn đốn virus 4.1.1.1 Miếng gạt lấy mẫu lỗ huyệt 30 miếng gạt lấy mẫu lỗ huyệt chia mẫu phân phối buffer chứa kháng thể 30 ml ( isotonic PBS, pH 7,2, penicilin 2000 IU/ml, streptomycin mg/ml fungizone 0,025mg/ml) Lấy miếng gạt trước tim chủng Sau đó, mẫu đối chứng dương tính nhóm tiêm chủng 200 µl avian influenza virus HA 107,5 Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl PBS 1x cho đối chứng âm Nhóm cuối tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu nồng độ virus Thể vẩn từ nhóm ly tâm 3000 vòng 30 phút máy ly tâm lạnh (4oC) để lắng mảnh mô tất vi khuẩn, chất lỏng thu thập, sau chất lỏng lọc màng lọc (0,45µm) Khi nhóm đối chứng dương âm thứ lấy 3ml vật liệu tiêm chủng cho vào ống siêu li tâm, nhóm cuối cho thể vẩn bước đầu nồng độ virus chia vào 10 phần giống hệt Cho dung dịch pha loãng tiếp (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9) thủ tục giống nói đén sử dụng 4.1.1.2 Mẫu mô (cơ quan phổi) 20 mẫu phổi thu thập từ từ 10 gà chia mẫu cho phân lập virus Nghiền mẫu mô cối chày tiệt trùng với thuỷ tinh tán vụn từ pipette tiệt trùng, tạo thể vẩn 10% với môi trường vận chuyển phân phối buffer bao gồm kháng thể 30 ml (PBS đẳng trương, pH 7,2, penicilin 2000 IU/ml, streptomycin 2mg/ml fungizone 0,025mg/ml), sau chuyển mẫu đồng với mơi trường vận chuyển vào bên ống li tâm Khi đối chứng dương nhóm đầu tiêm chủng 200µl vius cúm gia cầm HA7,5 Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl - 15 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn virus cúm gia cầm kỹ thuật ni cấy phơi trứng PBS 1x cho mẫu đối chứng âm Nhóm cuối tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu nồng độ virus Thể vẩn từ nhóm li tâm 3000 vòng 30 phút máy li tâm lạnh (4oC) để lắng mảnh mô hầu hết vi khuẩn, dịch lỏng bên thu thập, sau dịch lỏng lọc màng lọc (0,45µm), Sau nhóm đối chứng lấy 3ml vật liệu tiêm chủng vào ống siêu li tâm, nhóm thứ hai đối chứng âm lấy 3ml vật liệu tiêm chủng vào ống siêu li tâm, nhóm cuối cho thể vẩn bước đầu nồng độ virus chia vào 10 giống hệt Cho dung dịch pha loãng cận (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9) tiến trình giống đề cập sử dụng 4.1.1.3 Vật liệu • Những trứng gà đặc biệt với mầm bệnh (SPF), 9-11 ngày tuổi • Vật soi trứng • Ethanol 70% • Kim nhọn • 22 Máy đo • Ống tiêm 1ml, 1/1/2 • Cái thoi dùng để tạo lỗ thủng trứng • Keo hồ men trám • Chất để tiêm chủng • Khay để trứng 4.1.2 Thủ tục Soi trứng Khảo sát trứng với biện pháp soi trứng đặt đầu trứng quay lên vào bên khay trứng Loại bỏ trứng không thụ tinh, có vết nứt, phát triển khơng đày đủ, xuất lỗ thủng - 16 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng Sự tiêm chủng cho trứng Đặt trứng với đầu quay lên vào bên khay trứng đánh dấu trứng với số nhận dạng đặc biệc ( trứng cho mẫu bệnh phẩm) Lau mặt trứng ethanol 70% thọc lỗ nhỏ vào bên vỏ xuyên qua túi khí Ba trứng cho mẫu bệnh phẩm thường tiêm chủng túi niệu Hút 200µl mẫu xử lý vào bên ống tiêm vaccine với 22 gauge, kiêm tiêm 1/1/2 inch Lồng kiêm vào bên lỗ tạo trứng dừng máy đâm ngắn , tiêm chủng 200µl mẫu xử lý chúng chuẩn bị từ miếng gạt lỗ huyệt phổi dung dịch pha loãng cho tập trung virus bên khoang huyệt, 10 mẫu cho nồng độ pha loãng Rút kim Tim chủng hai trứng khác với cách giống với ống tiêm giống nhau, kim giống cho toàn trứng tiêm chủng mẫu xét nghiệm Vứt bỏ ống tiêm vào bên vật chứa an tồn riêng biệt Bịt kín lỗ thủng trứng giọt keo dáng Ấp trứng nhiệt độ 38-39oC độ ẩm 60%- 70% thời gian ngày - 17 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn virus cúm gia cầm kỹ thuật ni cấy phôi trứng khảo sát trứng tiêm chủng Trứng tiêm chủng soi đến ngày Ghi nhận trứng bị chết ghi chép thời gian làm cho phôi chết Những trứng chết ngày quan tâm không đặc biệt không cần để ý đến Vứt bỏ phôi Những trứng chết ngày sau thí có khả thừa hưởng virus cúm gia cầm.( hình 2) HPAI chết 1-2 ngày LPAI chết sau 2-4 ngày Thuận lợi: - Nguyên tắc vàng: Phương pháp tiến cử WHO, OIE - Chính xác : Độ xác cao - Hữu ích : cho phép nghiên cứu tiếp sau Bất lợi : - Tốn thời gian : thường ngày - Sự an tồn phịng thí nghiệm : BLS-3 - Chất lượng cao mẫu - Những tác nhân khác nên loại trừ - Sự nhiễm chéo Sự thu hoạch trứng gà tiêm chủng Những trứng giữ lạnh 4oC qua đêm khoảng trước thu hoạch Dáng nhãn ống plastic (15ml) cho trứng tương ứng với số ghi cho mẫu bệnh phẩm Lau chóp trứng ethanol 70% Với kiềm vô trùng, làm vỡ lớp vỏ bên túi khí đẩy màng túi niệu bên kiềm Sau sử dụng ống tiêm kim, chọc thủng túi ói - 18 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng rút kim số lượng lớn dịch túi ói chấp nhận Đặt kết ống tách rời, kết hợp dịch túi niệu từ trứng tiêm chủng mẫu xét nghiệm Ly tâm dịch thu hoạch thực xét nghiệm hemagglutination ủ 4oC/30 phút Xét nghiệm hemagglutination Vật liệu Sử dụng 96 đĩa vi chuẩn độ tốt với kiểu đáy chữ V Multichannel micropipette 5-50 µl.,single micropipette 1-200 µl Đồng hồ bấm Muối phosphate buffer (PBS) pH 7,2 1% tế bào máu đỏ gà Mẫu đối chứng dương huyết virus bệnh Newcastle Phương pháp Dùng khay dùng lần đáy chữ V Phân phối 50µl dịch túi niệu từ mẫu cho vào đĩa vi chuẩn độ tốt Dùng tip riêng biệt cho mẫu Kể chứng âm chứng dương kiểm soát mẫu dịch túi niệu đĩa Phân phối 50µl PBS vào đĩa Thêm 25 µl 1% red blood cell vào đĩa Mở nhẹ đĩa để trộn Đặt vỏ bọc lên đĩa Để cho đĩa đứng 45 phút phòng nhiệt khảo sát ghi chép kết Đọc a) kết Giải thích kết HI âm tính: Một nút nhọn tế bào máu màu đỏ đáy V- 19 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng botton well HI dương tính: hình ảnh mờ mờ tế bào máu đỏ, không nút nút nhỏ tế bào máu đỏ đáy V-botton well Đó thể kháng ngưng kết hồng cầu chứa đựng đơn vị kháng ngưng kết hồng cầu Nếu virus gây bệnh Newcastle (NDV) xét nghiệm ngưng kết hồng cầu âm tính Sau đó, chứng thực kiểu phụ với xét nghiệm nhanh trực tiếp việc sử b) dụng Xét smart® vet nghiệm nhanh sử dụng test smart® vet test Bộ kit xét nghiệm vet smart® test quảng cáo thị trường Rockeby Avian Influenza Virus Antigen sử dụng Bộ kít phát kháng nguyên Avian Influenza (Test Type A) cho việc chẩn đoán, Rockeby biomed Singapore.Pte.Ltd ) Phương pháp xét thiết kế để đo lường chất lượng kháng nguyên 200 µl mẫu lấy từ ống nghi ngờ kết avian influenza từ xét nghiệm kháng ngưng kết hồng cầu góp phần mẫu Lấy phần chia mẫu (dịch túi niệu) từ ống vi ly tâm với mẫu gạt thu thập chèn miếng gạt vào ống mẫu xét nghiệm chứa đựng dung dịch xét nghiệm pha loãng Trộn miếng gạt mẫu tan rã vào bên dung dich xét nghiệm pha loãng Để mặt ống xét nghiệm mẩu rộng đọng xuống đáy ống Thoát thiết bị chẩn đốn từ túi nền, đặt lên bề mặt nhẵn khô Dùng ống nhỏ giọt dùng lần cung cấp, giữ bề mặt từ mẫu phân tách ống Thêm giọt vào bên lỗ thủng mẫu ống (Hình Sự nhỏ 3) giọt Giải thích giải dùng kết thích sau kết lần 10 phút quả; C : band đối chứng tìm thấy band kết âm tính - 20 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng T : Kết Nhóm âm xét tính nghiệm từ xét nghiệm xét tìm thấy nghiệm band mẫu C Kết dương tính từ xét nghiệm tìm thấy band C T Xét nghiệm nhanh trực tiếp bỡi sử dụng vet smart® test bước trước để phát kháng nguyên thể vẩn nghiên cứa thí nghiệm dịch pha loãng nồng độ virus Kết dương tính xét nghiệm nhanh dùng để có khả thể ghi nhận kết ( Cho việc phân lập virus phát virus việc sử dụng trứng gà có phơi) - 21 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đốn virus cúm gia cầm kỹ thuật ni cấy phơi trứng C Kết luận - Chẩn đốn virus cúm gia cầm kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng cho kết xác - Phương pháp chẩn đốn kỷ thuật ni cấy phơi trứng tốn nhiều thời gian - Trong phương pháp chẩn đoán kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng việc đảm bảo trứng quan trọng - Để khắc phục nhược điểm phương pháp chẩn đoán kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng cần kết hợp với phương pháp khác : sinh học phân tử, huyết học,… D Tài liệu tham khảo: • www.influenzaReport.com • www.adb.org/Documents/Events/2007/HPAI-control-technologyCAREC/Detection-Avian-influe • www.vphcap.org • www.who.int - 22 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng ài liệu tham khảo A Đặt vấn đề B Tổng quan I Thông tin chung cúm gia cầm 1.Cúm gia cầm gì? .3 Vi-rút cúm khuyếch tán lây truyền nào? Hiện dịch cúm gia cầm xảy nào? Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ người .8 (a) Sự lan rộng tồn lâu dài dịch cúm gia cầm gây mối nguy lớn sức khoẻ người (b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy người .9 (c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trường hợp Triệu chứng bệnh cúm gia cầm người gì? 10 (a) Yếu tố dịch tễ 10 (b) Lâm sàng 10 (c) Cận lâm sàng 11 II Chẩn đoán bệnh phịng thí nghiệm 11 Sự thu thập mẫu xét nghiệm 11 Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm 12 Phát trực tiếp tiêm nhiễm AIV 13 Phân lập nhận dạng virus 16 4.1 Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trứng gà có phơi 16 4.1.1 Q trình vật liệu cho chẩn đoán virus 16 4.1.1.1 Miếng gạt lấy mẫu lỗ huyệt .16 4.1.1.2 Mẫu mô (cơ quan phổi) .16 4.1.1.3 Vật liệu 17 4.1.2 Thủ tục 17 Soi trứng .17 Sự tiêm chủng cho trứng 18 khảo sát trứng tiêm chủng 19 Sự thu hoạch trứng gà tiêm chủng 19 Xét nghiệm hemagglutination 20 - 23 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng Đọc kết 20 a) Giải thích kết .20 b) Xét nghiệm nhanh sử dụng vet smart® test .21 C Kết luận .23 D Tài liệu tham khảo .23 - 24 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng C Kết luận - Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỷ thuật ni cấy phơi trứng cho kết xác - Phương pháp chẩn đốn kỷ thuật ni cấy phôi trứng. .. Một kỹ thuật chẩn đoán virus cúm gia cầm có độ xác cao kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng -2- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi. .. luanvanchat@agmail.com Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng Vi-rút cúm gây dịch cúm gia cầm H5N1 chia làm nhóm: - Vi-rút cúm gia cầm có độc tính thấp (Low pathogenic avian virus: LPAV):