Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử trong chọn tạo giống vật nuôi năng suất cao

BO KHOA HOC VA CONG NGHE Viện Chăn nuôi-Từ Liêm-Hà Nội BAO CAO TONG KET KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỂ TÀI KC 04.03 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG CHỌN, TẠO GIỐNG VẬT NUÔI NĂNG SUẤT CAO CHỦ NHIỆM ĐỂ TÀI PGS.TS NGUYỄN ĐĂNG VANG CG QUAN CHU QUAN: BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CO QUAN CHU TRI VIÊN CHĂN NUÔI 5743 29/03/2006 Hà Nội, 2005 Tài liệu chuẩn bị sở kết thực Đẻ tài cấp Nhà nước, mã số KC.04.03 DANH SÁCH CÁC CO QUAN VA CAN BỘ PHỐI HỢP THỰC HIÊN ĐỀ TÀI Chi nhiệm để tài: PGS.TS Nguyễn Đăng Vang TT | Cơ quan phối hợp | Viên Chãn nuôi Cán tham gia thực để tài - Phòng TN Di truyền Phan wr | TS Le Thy Thuý,TLưu Quang Minh, Nguyễn Trọng Bình, Nguyễn Văn Hậu, Phạm Dỗn lân, Phạm Thị Dung, Tela Thu Thuỷ, Nguyễn Văn Ba, Lê Quang Nam - Bộ môn Dĩ truyền Giống TS Nguyễn Van Dee, Ta Th Bíh Duyên, Giang Hồng Tuyến Nguyễn Thị Hạnh, Hồng Thị Thiên -Bộ mơn Cấy truyền phơi ThŠ Tưu Công Khánh, Nguyễn Văn Lý, Phan Lê Sơn ~ Bộ mơn snh hố TS Nguyễn Thạc Hồ, Nguyễn Xn Viết, Nguyễn Thị Soạn Trung tâm nghiên cứulợn — [PGS.TS Nguyễn Vân Đông, Nguyễn Ngọc Phục, Thuy Phương Nguyễn Văn Tuyên ~ TT NC BO đông cb Ba vi, | TS Lê Trọng Lạp, Tăng Xuân Lưu, Định Thị Công, Hà Tải Nguyễn Quốc Toản - TT chuyển giao tiến Kỹ [TS Nguyễn Quốc Đạt, Nguyễn Thanh Bình, Nguyễn thuật, Tp Hồ Chí Minh Ngọc Huân | Viên Cơng nghệ sinh học - Phịng ADN ứng dụng, PGS TS Nong Van Hai, Lé Thi Thu Hiện, Cao xuân Hiếu, Pham Thu Thuy, Trầu Phương Liêu - Phòng TẾ Bảo sinh sản TS.Triah Thi Kim Thoa, Nguyễn Anh, Đồ Vân Thu, Phùng Thị Bích Thuỷ, Lê Thị Hằng -Phơng DituyenPhântr — [PGS.TS Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Thu Thuý, Đậu Hùng Anh, Ngô Thị Kim, Phạm Thu Thuỷ | Trường Đạihọẹ NNI-Hà nội |OS.TS Dạng Vũ Bình, Phan Xn Hão, Nguyễn "Văn Thành [CTygiơngbbsữa Mộcchâu [YiệnKHNN miễn Nam |KS Trần Công Chiến, Phạm Hải Nam, Bùi Duy Minh KS Tế Thỉ Thu Hà, Nguyễn Ngọc Hùng, Chế Quang Tuyến, Đỉnh Thị Hạnh [TT phát triển chân nuôi Đức |KS Nguyễn Sinh Huy, Nguyễn Văn Quý, Nguyễn son, Son la Thuy BAITOM TAT Phuong tiga chit yéu dé cai tiến nãng suất vật ni chọn lọc dĩ truyền tính trạng đàn bố mẹ Hiệu chọn lọc phụ thuộc vào độ xác đánh giá di truyền Nhờ thành tựu chương trình giải mã gen vật ni phát triển mạnh mẽ kỹ thuật di truyền phân từ, có nhiều thị di tuyển phân tử liên quan đến tính trạng kinh tế xác định Trong tương lai, kỹ thuật trợ giúp quan trọng mà cịn giữ vai trị chọn giống vật nuôi để thay cho cách truyền thống chọn giống dựa vào hệ phả bay mối quan hệ hệ phả, tức cần phải theo dối dài qua nhiều hệ Mặc tiêu để tài ứng dụng kỹ thuật di truyền phân từ để xác định xác kiểu di truyền số gen đặc hữu liên quan tính trạng kinh tế, giúp cho công tác chọn lọc thông qua xác định gen mang lại lợi ích thương mại số lượng lớn quần thể Đây khoa học nhằm rút ngắn thời gian cho công tác chọn lọc, nâng cao đàn giống cao sản đồng thồi đóng góp nâng cao chất lượng sản phẩm vật nuôi nước ra, đưa ngành chãn nuôi phát triển lên bước chãn ni cơng nghiệp Kết quả: Đã xác định gen liên quan đến suất sữa tỉ lệ protein sữa: KCasein, gen B- Lactoglobulin, gen Œ- Casein S1, gen œ- Casein S2, gen Prolactin, gen liên quan đến tính trạng tỷ lệ nạc 30%, (GH, FATI (H-PABP), PITI, RYRI), 4gen liên quan đến tính trạng sinh sản đạt 12 con/lứa đẻ (ESR, OPN, Ha, GuRH) đăng ký Đã giải trình tự đăng ký quyền 29 đoạn gen Ngân hàng liệu gen quốc tế (EMBL/Genbank/DDBD Thơng qua phân tích liên kết chọn lọc đàn lợn hạt nhân 272 có khả kháng stress, sinh sản đạt 12 sinh ra/lứa đẻ, đàn lợn hạt nhân 212 đạt tỷ lệ nạc 50%, đàn bò sữa hạt nhân cao sản 313 đạt suất sữa 3000 lí, protein sữa 190 kg/chu kỳ - Đã xây dựng 13 quy trình cơng nghệ xác định 13 gen trên, ba quy trình cơng nghệ chọn lọc tham gia triển lãm Hơi chợ TechMark Thành phố Hỏ Chí Minh 11/2005 - Đã hoàn thiện phương pháp: tách chiết tỉnh ADN, điện di, PCR, RFLPs, Kỹ thuật tách dịng genvà giải trình tự để phân tích 13 đoạn gen đăng ký -Để tài xây dựng ngân hàng bảo quản 3028 mẫu tế bào Soma 3014 mẫu ADN giống bồ, lợn nuôi Việt nam, xây dựng tiềm lực khoa học thông qua đào tạo nghiên cứu sinh, cao học cửnhân Để tài có 17 cơng trình trình bầy hội nghị, hội thảo khoa học, trong nước: 1ố, Quốc tế l cơng trình Có 12 báo đăng ïa tạp chí Quốc gia chuyên ngành LOI CAM ON Chúng xia chân thành cảm ơn Bộ Khoa học Công nghệ, chương tành Nghiêu cứu +khoa học phát triển công nghệ sinh học KC-04, Bộ NN PTNT, Viện Châu ni, Phịng, ADN ứng dụng, Phòng Di truyền Phân từ, phòng Tế bào sinh sản-Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Nông Nghiệp Miễn nam, Trung tầm huấn luyện chãn ni Bình Thấng, Cơng ty giống bị sữa Mộc Châu, Trung tâm nghiên cứu bị Đồng cỏ Ba vì, Trung tâm chuyển giao tiến kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh, Nơng trường bị sữa Đức Trọng, Lâm đồng, Trung tâm lợn giống Cụ ky, ông bà (PIC), trung tam phát triển Chân nuôi Đức Sơn, nông trường Thành tô, nơng hộ ni bị sữa lợn giống khơng cung cấp kinh phí, điều hành mà cịn tạo điều kiện cầu thiết , tốt cho cán khơa học, kỹ thuật tham gia thực hiệu đểtài Chúng xiu đặc biệt cảmơn sở giống cho phép cán khoa học nghiên cứu thử nghiệm đàu giống để hoàu thành nội dung để tài Tập thể tác giả MUC LUC Trang Các quan phối hợp, cán tham gia thực hiên đề tài Bài tóm tắt II NGUYÊN VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 10 Tài cầm ơn Mục lục Tài mổ đầu Phần báo cáo Chương T: Kết ứng dụng kỹ thuật di tuyên Phân từ để xác định cdc gea | ký nghiên cứu 1.ĐẶT VẤN ĐỂ ° TL NGUYEN LY VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 Chương IE Kết nghiên cứu xác định gen liêu quan tối tính trạng nãng suất, chất lượng sữa: Kappa - casein (K-Ca), (-Lactoglobulia (B-Lg), œ S1 - casein, | 5) œ§2- casein, Prolactin L TONG QUAN IL KAT QUA XAC DINH CAU TRUC, DA HINH TINH TRANG SUA CAC GEN IL KET QUA XAC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐA HÏỈNH CÁC GEN 21 LIEN QUAN DEN | 23 Chương II: Kết nghiên cứu xác định § gen liên quan tới tính trạng tỷ lệ nạc số để ca/lứa lợn.( GH, EATI, PTI, RYRI, Hual, ESR, OPN, GNRHR) - |¿o TONG QUAN 3o Gen liên quan đến tỷ lệ nạc lợn 30 Gen liên quan đến số sinh ra/lứa để lợn 4L TINH TRANG TY LE NAC LIÊN QUAN ĐẾN Xác định cấu trúc, đa hình gen PTTI Xác định cấu trúc, đa hình gen EATI Xác định cấu trúc, đa hình gen RyR1 Xác định cấu trúc, đa hình gen GH TIL KẾT QUÁ XAC DINE CAU TRUC, DA HINH TINH TRANG SỐ CON SINH RA/LÚA 45 49 CAC GEN LIBN QUAN DEN Xác định cấu trúc, đa hình gen Oestrogen receptor-ESR Xác định cấu trúc, đa hình gen GaRHR Xác định cấu trúc, đa hình gen Halothane Xác định cấu trúc, đa hình gen OP 45 Chương TV: Kết ứng dụng kỹ thuật gen đàn bò sữa đàn lợn thực tiễn để xác định mối tương quan marker phân từ thu tính trạng sản xuất (Nang suất, hàm lượng protein sữa, tỷ lệ nạc, số sinh trên/lứa để) 57 60 65 68 4L CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CÁC TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG | 75 SỮA ỞBÒ Gea Kappa Casein (K-ca) Gen Beta Lactoglobulia (B-Lg) 15 đen Anpha S2 Casein (œ S2 Cn) Gen Prolactia (PRL) = Gen Anpha SI Casein (a S1 Ca) T7 IL CAC GEN LIEN QUAN IGICAC TINH TRANG TILB NAC GLON Geo 2.Gen Gen 4, Gea PITL FATI Ryanodine veceptor (RYR-1) Growth Hormone (GH) 33 TH CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CÁC TÍNH TEẠNG SỐ CON SINHRAAUA GLON | 36 Gen Oestrogen Receptor (ESR) Gen Gonadotropin Releasing Hormone Receptor (GNRHR) Gen Halothane (HAL) $6 87 38 4, Gen Osteopontin (OPN) 89 CHƯƠNG V: Đẻ xuất Chương trình chọn giống bị lợn mức độ phân tử qua thị gen (dựa vào kết nghiên cứu dé tài KC 04.03) % CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CÁC TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG | 90 SỮA Ở BÒ (2 GEN) Gen Kappa Casein (K-cn) Gen Beta Lactoglobulin (B-La) 90 - IL CAC GEN LIÊN QUAN TỚI CÁC TINH TRANG SO CON SINH RA/LUA G LON GE % ~” $ Gen tetothane (AL) 9L TL GEN LIEN QUAN TỚI CÁC TÍNH TBẠNG TÌ LỆ NẠC Ở LỢN (1 GEN) OL Gen Cestrogen Receptor (ESR) Gen Ryanodine receptor (RYR- 1) CHƯƠNG VI Kết đào tạo báo, báo cáo hội nghị khoa học Kết luận đề nghị Tài liệu tham khảo Phu Lue ol % 101 103 110 PHAN CHINH CUA BAO CAO A LOI MG DAU Trong khoảng 40 năm qua, nhà khoa học sử dụng nhiều biện pháp thay đổi điều kiện châm sóc, ni dưỡng, nâng cao chất lượng thức än chương trình lai tạo chọn giống dựa đạc điểm vẻ ngoại hình sinh lý, sinh hố Các biện pháp đạt nhiều thành tựu đáng kể, ứng chọn lọc tính trạng cịn biến động tốn tiêu đáp thời gian nhiều đặc điểm ngoại hình khơng tương ứng với kiểu gen Phương pháp chủ yếu để cải tiến suất vật nuôi chọn lọc đĩ truyền tính trạng đàn bố mẹ Hiệu chọa lọc phụ thuộc vào độ xác đánh giá di truyền Các phương pháp chọn lọc truyền thống chì yếu dựa vào kiểu hình nên tốn nhiều thời gian có độ xác không cao Dựa nghiên cứu vẻ chẽ, chất, yếu tố tham gia điều hoà hoạt động trình sống, nhà sinh học đại sâu nghiên cứu vẻ vai trò tác dụng nhân tố tham gia điều khiển gen So sánh đặc điểm sinh lý-sinh hoá vùng gen quan tâm cung cấp thông tỉa mối quan hệ cấu trúc chức nâng sinh học đơn gen Cụ thể đa hình cùa nueleotid (trình tự aucleotid) cho chứng ta sở có giá trị việc chọn lọc đàn gia súc Với phát triển mạnh mẽ sinh học phân từ, kỹ thuật di truyền phân tử dân nghiên cứu để áp dụng rộng rãi vào cơng tác chọn tạo giống lợn, bị giống vật nuôi trồng khác Các kỹ thuật PCR-RELP, Sequencing SSCP áp dụng để nghiên cứu tính đa xác định kiểu gen đơn giống vật ni nhằm tìm đặc trưng kiểu gen giống có suất cao, đồng thời phương pháp chọn lọc dựa vào thị phân từ cho phép chọn lọc nhanh, xác hiệu so với phương pháp truyền thống chọn giống dựa vào hệ phả hay mối quan hệ hệ phả, tức cần phải theo doi dai qua nhiều hệ Nhờ thành tựu chương trình giải mã gen giống vật ni phát triển mạnh mẽ kỹ thuật truyền phân từ, có nhiều chi thi di truyền phân từ liên quan đến tính trạng kinh tế như: tốc độ sinh trường, sản lượng, chất lượng sữa, tỷ lệ nạc số tính trạng sinh sản xác định công bố ngân hàng liệu gen Quốc tế [EMBL/Genbank/DDBI] Các thị thường gen mã hoá cho hommone sinh trưởng như: gen mã hoá thụ thể Gonadotropin Releasing Hormone, gen mã hoá thụ thể Oestrogen, gen mã hoá Prolactia, EAT, PITI v.v Một vùng gen quan trọng nghiên cứu: gen Kappa-casein, ð-Lactoglobulin, Prolactin va Anpha s2-casein (oS2-Ca) lién quan 16i nãng suất chất lượng sữa bò, x gen GH, PITI, EATI (H-PABP), RYRI liên quan đến chất lượng thịt, gen ESR, OPN, Hhal, GNRE liên quan đến tính trạng sinh sản (số sinh ralứa để ) Tại Việt nam, lĩnh vực nghiên cứu mối mẻ, số kết nghiên cứu gen hầu hết trêu doi tượng thực vật: lúa, đỗ tương, ngơ mrà chưa có nghiê cứu đối tượng gia súc Việc phân lập mã hoá gen quau trọng liên quan đến tính trạng sữa, thịt Việt nam cần thiết để khẳng định cách chấn độ tin cậy kỹ thuật, sở áp dụng để phân tích đa hình di truyền phục vụ cho công tác chọn giống Trong thời gian qua, với tham gia đông đảo cán khoa học từ phịng thí nghiệm Di truyền Phâu từ- Viện Chân ni, phịng ADN ứng dụng, phịng Tế bào sinh sản, phịng Di truyền Phân từ, viện cơng nghệ sinh học, việu KHKTNN miễn Nam, Trường Đại hoc NNI wv Các cán khoa học đào tạo kỹ thuật công nghệ gen từ nước tiến tiến: Nhật bản, Pháp, Đức, Mỹ, lại định hướng cụ thể chương tảnh khoa học công nghệ, Khoa học Công nghệ trong, xây dựng tiêm lực khoa học công nghệ gen, định hướng cho sản xuất, năm 2001, giao cho viện chãn nuôi chủ trì để tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử chon, tao giống vật nuôi suất cao“, Trong năm qua, nhóm nhà khoa học tích cực nghiên cứu phịng thí nghiệm, xác định gen liên qua đến tính trạng kinh tế, phối hợp chat chế với sở vẻ giống sản xuất, đạt thành định mục tiêu để Thay mật nhà khoa học thực để tài, xin báo cáo với ban nhiệm chương trình KC-04 Bộ khoa học Công nghệ thành qùa công trình nghiên cứu năm qua với mong muốn hy vọng tẳng, kết viên gạch đầu tiêu, đạt móng sở cho công tác chọc lọc cải tạo giống, gia súc mức phâu từ, góp phân nâng cao suất chất lượng sản phẩm vật nuôi nước ta, đáp ứng nhu cầu xuất khẩu, giảm giá thành, nâng cao lợi nhuận cho người chân nimà cịn góp phần đào tạo đội ngũ chun sâu công nghệ geu động vật, xây dựng tiêm lực khoa học, tạo sở cho việc phát triểu công nghệ sinh học châu nuôi Những kết nghiên cứu tư liệu ban đầu vẻ ứng dụng kỹ thuật gen đối tượng lợn bị Việt am, phục vụ cho cơng tác giảng dạy sinh viên, cao học, nghiên cứu sinh trường đại học viện nghiên cứu Chủ nhiệm đề tài KC 04-03 ĐSG.TS Nguyễn Đăng Vang B NOIDUNG CHINH BAO CAO Nội dung báo cáo gồm có chương: hương Kết ứng dụng kỹ thuật di truyền Phân từ để xác định gen đãng +ý nghiên cứu Chương .Kết nghiên cứu xác định gen liên quan tố fab tang Ang suất, chất lượng sữa: Kappa - casein (K-Ca), B-lactoglobulia (B-Lg), a S1 - casein, a: $2- casein, Prolactin Chương Kết nghiên cứu xác định gen lién quan tới tính trạng tỷ lệ nạc số để m/lứa lợn.( GH, EATI, PTI, RYRI, Hhal, ESR, OPN, GNRHR) Chương 4, Kết ứng dụng kỹ thuật geu đàn bò sữa đàn lợn thực tiễn để xác định rnối tương quan rnacker phân từ thu tính trạng sẵn xuất (Năng suất, hàm lượng protein sữa, tỷ lệ nạc, số sinh lứa để) Chương 5, Để xuất Chương trnh chọn giống bò lợn rnức độ phân từ qua thị gen (dựa vào kết nghiên cứu để tài KC 04.03) Chương 6, Kết Đào tạo báo cáo khoa học CHUONGI KET QUA UNG DUNG CAC KY THUAT DITRUYEN PHAN TU ĐỂ XÁC DINH CAC GEN BANG KY NGHIEN COU 1.ĐẶT VẤN ĐỀ: Yếu tố chìa khóa có tính định nãng suất vật nuôi sức sinh sản, mức độ tăng trường tỷ lệ nạc; đốt với ngành chãn ni bị sữa chất lượng sữa Đây kết tác động tổng hợp nhiều yếu tố di truyền có gen mã hóa cho số hornone sinh trưởng quan trọng vật nuôi như: ESR (ostrogen ceceplor), ESH (folliculac stimulating hormone), PRL (pmolacủa), GaRHR (gonadotropin releasing homone), GH (growth hormone) Do vay, phương pháp nghiên cứu trật hình thái (như khảo sát trọng lượng, tính hệ số di tuyển đo độ dày mỡ lưng), việc nghiên cứu chất gen mức độ phân tử, xác định đa hình, tần số kiểu gen, tần số aleo cần thiết Chùng với phát triển công nghệ sinh học, việc sử dụng thị phân từ cơng nghệ mang lại nhiều ứng dụng vị tứ locus tính trạng số lượng (QTL - Quantitative Trit Locus) yếu tố quan trọng Các QTL bao gồm số gen thị định Cho tới nay, có khoảng 1900 thị geu lợn lập đỏ (Archibald Rothschild, 1999) Nhiều nghiên cứu QTL chủ yếu tính trạng sinh trường tỷ lệ mỡ lợn định vị NST số (SSC4) Một số QTL khác định vị NST số Số lượng thị dao động từ đến NST số từ đến NST so Nam 1996, Wilkie cộng công bố vẻ locus tinh trạng số lượng có chiều đài từ cung tỷ lệ rụng trứng thuộc số NST khác nhau: NST số 4, NST số 6, NST số Kết khẳng định bổ sung với NST số 8, I3, L5 (Henderson et al., 1998; Rathje et al., 1997; Milan et al., 1998) NST số lợn bao gồm khoảng 105 locus chia thành hai cánh: cánh ngắn SSC4p cánh đài SSC4q Cánh ngắn SSC4p có độ tương đồng so với nhiễm sắc thể số người (HSA8), cánh dài SSC4q tương đồng với NST số l (HSAI) Trong đó, vùng QTL EATI thuộc cánh dài NST số QTL có ảnh hưởng lớn tới tỷ lệ mỡ thịt lợn Nằm NST số 8, locus OPN xác định locus có vai trị quan trọng đốivới nãng suất sinh sản đàn lợn Cụ thể s6 sinh rnột lứa để tỷ lệ sống sót Vì lý trên, hai locus mục tiêu để nghiên cứu nhằm tùm kiểu gen đặc trưng, góp phần nâng cao suất đàn lợn Muc dich ứng dụng kỹ thuật tách ADN, kỹ thuật nhân geu PCR kỹ thuật cất gen RELP (Rando cộng 1988), kỹ thuật giải mã gen gen v.v.v để xác định đa hình, cấu trúc 13 gen trêu mối tương quan chúng tới suất, chất lượng sữa, thịt làm sở cho công tác cải tạo, chọn giống đàn bị sữa, đàn lợn nước 1a mức di truyền phâu từ nhằm xây dựng đàn bò hạt nhân cao sản có sảu lượng chất lượng/chu kỳ cao, đầu lợn có tỷ lệ nạc, khả sinh sản tốt Cụ thể sau: Phân tích kiểu di truyền bị ni fại Việt nam Nghiên cứu xác định gen điều khiển tính trạng sữa protein sữa như: KCascin, gen B- Lactoglobulin, gea œ- Casein SI, gen œ- Casin 52, va gen Prolactin Xây dựng đàn bò sữa cao sản: sản lượng sữa 5000ft /chu kỳ, protein sita 190kg/chu ky Phân tích kiểu di truyền giống lợn nuôi fai Việt nam Nghiên cứu xác định gen khu vực geu điều khiển tính trạng tốc độ tầng, trọng chất lượng thịt lợn bao gồm: - Gen điều khiển tính trạng tỷ lệ nạc 50%, (GH, EATI (H-PABP), PITI, RYRI) - đen điều khiển tính trạng, sinh sản đạt 12 con/lda dé ESR, OPN, Hhal, GaRHR NGUYÊN VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu: Mẫu mơ, mẫu máu bị lợn giống nghiên cứu thu thập bio quan -20°C 10