BO KHOA HOC VA CONG NGHE
Viện Chăn nuôi-Từ Liêm-Hà Nội
BAO CAO TONG KET KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT
ĐỂ TÀI KC 04.03
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG CHỌN, TẠO GIỐNG VẬT NUÔI
NĂNG SUẤT CAO
CHỦ NHIỆM ĐỂ TÀI PGS.TS NGUYỄN ĐĂNG VANG
CG QUAN CHU QUAN: BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
Trang 2DANH SÁCH CÁC CO QUAN VA CAN BỘ PHỐI HỢP THỰC HIÊN ĐỀ TÀI
Chi nhiệm để tài: PGS.TS Nguyễn Đăng Vang
TT | Cơ quan phối hợp Cán bộ tham gia thực hiện để tài 1 | Viên Chãn nuôi
- Phòng TN Di truyền Phan wr | TS Le Thy Thuý,TLưu Quang Minh, Nguyễn Trọng Bình, Nguyễn Văn Hậu, Phạm Doãn lân, Phạm Thị Dung, Tela Thu Thuỷ, Nguyễn Văn Ba, Lê Quang Nam
- Bộ môn Dĩ truyền Giống TS Nguyễn Van Dee, Ta Th Bíh Duyên, Giang Hồng Tuyến Nguyễn Thị Hạnh, Hoàng Thị Thiên -Bộ môn Cấy truyền phôi ThŠ Tưu Công Khánh, Nguyễn Văn Lý, Phan Lê Sơn ~ Bộ mơn snh hố TS Nguyễn Thạc Hoà, Nguyễn Xuân Viết, Nguyễn
Thị Soạn
Trung tâm nghiên cứulợn — [PGS.TS Nguyễn Vân Đông, Nguyễn Ngọc Phục,
Thuy Phương Nguyễn Văn Tuyên
~ TT NC BO và đông cb Ba vi, | TS Lê Trọng Lạp, Tăng Xuân Lưu, Định Thị Công,
Hà Tải Nguyễn Quốc Toản
- TT chuyển giao tiến bộ Kỹ [TS Nguyễn Quốc Đạt, Nguyễn Thanh Bình, Nguyễn thuật, Tp Hồ Chí Minh Ngọc Huân
2 | Viên Công nghệ sinh học
- Phòng ADN ứng dụng, PGS TS Nong Van Hai, Lé Thi Thu Hiện, Cao xuân Hiếu, Pham Thu Thuy, Trầu Phương Liêu
- Phòng TẾ Bảo sinh sản TS.Triah Thi Kim Thoa, Nguyễn Anh, Đồ Vân Thu, Phùng Thị Bích Thuỷ, Lê Thị Hằng -Phông DituyenPhântr — [PGS.TS Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Thu Thuý, Đậu Hùng Anh, Ngô Thị Kim, Phạm Thu Thuỷ
3 | Trường Đạihọẹ NNI-Hà nội |OS.TS Dạng Vũ Bình, Phan Xuân Hão, Nguyễn "Văn Thành 4 [CTygiôngbbsữa Mộcchâu |KS Trần Công Chiến, Phạm Hải Nam, Bùi Duy Minh 5 [YiệnKHNN miễn Nam KS Tế Thỉ Thu Hà, Nguyễn Ngọc Hùng, Chế
Quang Tuyến, Đỉnh Thị Hạnh
6 [TT phát triển chân nuôi Đức |KS Nguyễn Sinh Huy, Nguyễn Văn Quý, Nguyễn son, Son la Thuy
Trang 3BAITOM TAT
Phuong tiga chit yéu dé cai tiến nãng suất vật nuôi là chọn lọc dĩ truyền các tính trạng của đàn bố mẹ Hiệu quả chọn lọc phụ thuộc vào độ chính xác của sự đánh giá di truyền Nhờ thành tựu của chương trình giải mã gen vật nuôi và sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật di truyền phân từ, cho đến nay có rất nhiều chỉ thị di tuyển phân tử liên quan đến các tính trạng kinh tế đã được xác định Trong tương lai, kỹ thuật này không những chỉ là trợ giúp quan trọng mà còn giữ vai trò chính trong chọn giống vật nuôi để thay thế cho cách truyền thống là chọn giống dựa vào hệ phả bay các mối quan hệ trong hệ phả, tức là cần phải theo
dối dài hơn qua rất nhiều thế hệ
Mặc tiêu của để tài là ứng dụng các kỹ thuật di truyền phân từ để xác định chính xác kiểu di truyền một số gen đặc hữu liên quan các tính trạng kinh tế, giúp cho công tác chọn lọc thông qua xác định các gen mang lại lợi ích thương mại số lượng lớn trên quần thể Đây là căn cứ khoa học nhằm rút ngắn thời gian cho công tác chọn lọc, nâng cao đàn giống cao sản đồng thồi sẽ là một đóng góp nâng cao chất lượng sản phẩm của vật nuôi nước ra, đưa ngành chãn nuôi phát triển lên một bước đó là chãn nuôi công nghiệp
Kết quả: Đã xác định được 5 gen liên quan đến năng suất sữa và tỉ lệ protein sữa: K- Casein, gen B- Lactoglobulin, gen Œ- Casein S1, gen œ- Casein S2, và gen Prolactin, 4 gen liên quan đến tính trạng tỷ lệ nạc trên 30%, (GH, FATI (H-PABP), PITI, RYRI), 4gen liên quan đến tính trạng sinh sản đạt 12 con/lứa đẻ (ESR, OPN,
Ha, GuRH) như đăng ký Đã giải trình tự và đăng ký bản quyền 29 đoạn gen trên Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế (EMBL/Genbank/DDBD Thông qua phân tích liên kết đã chọn lọc đàn lợn hạt nhân 272 con có khả năng kháng stress, sinh sản đạt trên 12 con sinh ra/lứa đẻ, đàn lợn hạt nhân 212 con đạt tỷ lệ nạc trên 50%, đàn bò sữa hạt nhân cao sản 313 con đạt năng suất sữa trên 3000 lí, protein sữa 190 kg/chu kỳ
- Đã xây dựng 13 quy trình công nghệ xác định 13 gen trên, trong đó ba quy trình công nghệ được chọn lọc tham gia triển lãm Hôi chợ TechMark tại Thành
phố Hỏ Chí Minh 11/2005
- Đã hoàn thiện các phương pháp: tách chiết và tỉnh sạch ADN, điện di, PCR, RFLPs, Kỹ thuật tách dòng gen và giải trình tự để phân tích 13 đoạn gen đăng ký -Để tài đã xây dựng được ngân hàng bảo quản 3028 mẫu tế bào Soma và 3014 mẫu
ADN của các giống bồ, lợn nuôi tại Việt nam, xây dựng tiềm lực khoa học thông
qua đào tạo 2 nghiên cứu sinh, 3 cao học và 7 cử nhân
Trang 4LOI CAM ON
Chúng tôi xia chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, chương tành Nghiêu cứu +khoa học và phát triển công nghệ sinh học KC-04, Bộ NN và PTNT, Viện Châu nuôi, Phòng, ADN ứng dụng, Phòng Di truyền Phân từ, phòng Tế bào sinh sản-Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Nông Nghiệp Miễn nam, Trung tầm huấn luyện chãn nuôi Bình Thấng, Công ty giống bò sữa Mộc Châu, Trung tâm nghiên cứu bò và Đồng cỏ Ba vì, Trung tâm chuyển giao tiến bộ kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh, Nông trường bò sữa Đức Trọng, Lâm đồng, Trung tâm lợn giống Cụ ky, ông bà (PIC), trung tam phát triển Chân nuôi Đức Sơn, nông trường Thành tô, các nông hộ nuôi bò sữa và lợn giống đã không những cung cấp kinh phí, điều hành mà còn tạo điều kiện cầu thiết và , tốt nhất cho các cán bộ khơa học, kỹ thuật tham gia thực hiệu để tài này Chúng tôi xiu đặc biệt cảmơn các cơ sở giống đã cho phép cán bộ khoa học được nghiên cứu và thử nghiệm trên đàu giống để hoàu thành nội
dung để tài
Trang 5
MUC LUC Trang
Các cơ quan phối hợp, cán bộ tham gia thực hiên đề tài 2
Bài tóm tắt 3
Tài cầm ơn 4
Mục lục 5
Tài mổ đầu 6
Phần chính của báo cáo 3
Chương T: Kết quả ứng dụng các kỹ thuật di tuyên Phân từ để xác định cdc gea | 9 đang ký nghiên cứu
1.ĐẶT VẤN ĐỂ °
II NGUYÊN VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 10
TL NGUYEN LY VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
Chương IE Kết quả nghiên cứu xác định 5 gen liêu quan tối tính trạng nãng suất, chất lượng sữa: Kappa - casein (K-Ca), (-Lactoglobulia (B-Lg), œ S1 - casein, | 5) œ§2- casein, Prolactin
L TONG QUAN 21
IL KAT QUA XAC DINH CAU TRUC, DA HINH CAC GEN LIEN QUAN DEN | 23 TINH TRANG SUA
Chương II: Kết quả nghiên cứu xác định § gen liên quan tới tính trạng tỷ lệ nạc và số con để ca/lứa ở lợn.( GH, EATI, PTI, RYRI, Hual, ESR, OPN, GNRHR) - |¿o
1 TONG QUAN 3o
1 Gen liên quan đến tỷ lệ nạc của lợn 30
2 Gen liên quan đến số con sinh ra/lứa để của lợn 4L
IL KET QUA XAC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐA HÏỈNH CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN
TINH TRANG TY LE NAC 45
1 Xác định cấu trúc, đa hình gen PTTI 45
2 Xác định cấu trúc, đa hình gen EATI 49
3 Xác định cấu trúc, đa hình gen RyR1 8
4 Xác định cấu trúc, đa hình gen GH 57
TIL KẾT QUÁ XAC DINE CAU TRUC, DA HINH CAC GEN LIBN QUAN DEN
TINH TRANG SỐ CON SINH RA/LÚA 2
1 Xác định cấu trúc, đa hình gen Oestrogen receptor-ESR 60
2 Xác định cấu trúc, đa hình gen GaRHR 65
3 Xác định cấu trúc, đa hình gen Halothane 68
4 Xác định cấu trúc, đa hình gen OP 4L
Chương TV: Kết quả ứng dụng các kỹ thuật gen trên đàn bò sữa và đàn lợn trong thực tiễn để xác định mối tương quan giữa các marker phân từ thu được và các tính trạng sản xuất
(Nang suất, hàm lượng protein sữa, tỷ lệ nạc, số con sinh ra trên/lứa để)
1 CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CÁC TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG | 75
SỮA ỞBÒ
Trang 61 Gea Kappa Casein (K-ca)
2 Gen Beta Lactoglobulia (B-Lg) 15
3 Gen Anpha SI Casein (a S1 Ca) T7
4 đen Anpha S2 Casein (œ S2 Cn) 7
3 Gen Prolactia (PRL) =
IL CAC GEN LIEN QUAN IGICAC TINH TRANG TILB NAC GLON 9
1 Geo PITL 9
2.Gen FATI 3
3 Gen Ryanodine veceptor (RYR-1) 33
4, Gea Growth Hormone (GH) 8
TH CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CÁC TÍNH TEẠNG SỐ CON SINHRAAUA GLON | 36
1 Gen Oestrogen Receptor (ESR) $6
2 Gen Gonadotropin Releasing Hormone Receptor (GNRHR) 87
3 Gen Halothane (HAL) 38
4, Gen Osteopontin (OPN) 89
CHƯƠNG V: Đẻ xuất Chương trình chọn giống bò và lợn ở mức độ phân tử qua chỉ thị gen (dựa vào kết quả nghiên cứu của dé tài KC 04.03) %
1 CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CÁC TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG | 90
SỮA Ở BÒ (2 GEN) 90
1 Gen Kappa Casein (K-cn) %
2 Gen Beta Lactoglobulin (B-La) - 0
IL CAC GEN LIÊN QUAN TỚI CÁC TINH TRANG SO CON SINH RA/LUA G LON ~”
2 GE
$ Gen tetothane (AL) 9L
2 Gen Cestrogen Receptor (ESR) ol
TL GEN LIEN QUAN TỚI CÁC TÍNH TBẠNG TÌ LỆ NẠC Ở LỢN (1 GEN) OL
1 Gen Ryanodine receptor (RYR- 1)
CHƯƠNG VI Kết quả đào tạo và các bài báo, báo cáo trong hội nghị khoa học %
Kết luận và đề nghị 101
Tài liệu tham khảo 103
Phu Lue 110
Trang 7PHAN CHINH CUA BAO CAO
A LOI MG DAU
Trong khoảng 40 năm qua, các nhà khoa học đã sử dụng rất nhiều biện pháp như thay đổi điều kiện châm sóc, nuôi dưỡng, nâng cao chất lượng thức än cũng như các
chương trình lai tạo và chọn giống dựa trên các đạc điểm vẻ ngoại hình và các chỉ tiêu
sinh lý, sinh hoá Các biện pháp này đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể, tuy vậy sự đáp
ứng chọn lọc các tính trạng đó vẫn còn biến động do tốn kém thời gian và nhiều khi các
đặc điểm ngoại hình không tương ứng với kiểu gen
Phương pháp chủ yếu để cải tiến năng suất vật nuôi là chọn lọc đĩ truyền các tính
trạng của đàn bố mẹ Hiệu quả chọa lọc phụ thuộc vào độ chính xác của sự đánh giá di
truyền Các phương pháp chọn lọc truyền thống chì yếu dựa vào kiểu hình nên tốn nhiều
thời gian và có độ chính xác không cao Dựa trên các nghiên cứu vẻ cơ chẽ, bản chất, và
các yếu tố tham gia điều hoà và hoạt động các quá trình sống, các nhà sinh học hiện đại
đã đi sâu nghiên cứu vẻ vai trò tác dụng của các nhân tố tham gia điều khiển gen So sánh đặc điểm sinh lý-sinh hoá của các vùng gen quan tâm đã cung cấp những thông tỉa
về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức nâng sinh học của các đơn gen Cụ thể là sự đa hình cùa các nueleotid (trình tự aucleotid) cho chứng ta cơ sở có giá trị trong việc chọn lọc đàn gia súc
Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân từ, các kỹ thuật di truyền phân tử đang dân được nghiên cứu để áp dụng rộng rãi vào công tác chọn tạo giống lợn, bò cũng như các giống vật nuôi và cây trồng khác Các kỹ thuật PCR-RELP, Sequencing và SSCP được áp dụng để nghiên cứu tính đa hình cũng như xác định kiểu gen đơn của các giống vật nuôi nhằm tìm ra những đặc trưng trong kiểu gen của các giống có năng suất cao, đồng thời phương pháp chọn lọc này dựa vào các chỉ thị phân từ có thể cho phép chọn lọc nhanh, chính xác và hiệu quả hơn so với các phương pháp truyền thống là chọn giống dựa vào hệ phả hay các mối quan hệ trong hệ phả, tức là cần phải theo doi dai
hơn qua rất nhiều thế hệ
Nhờ thành tựu của chương trình giải mã gen các giống vật nuôi và sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật đi truyền phân từ, cho đến nay có rất nhiều chi thi di truyền phân từ liên quan đến các tính trạng kinh tế như: tốc độ sinh trường, sản lượng, chất lượng sữa,
tỷ lệ nạc cũng như một số tính trạng sinh sản đã được xác định và công bố trên ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế [EMBL/Genbank/DDBI] Các chỉ thị này thường là gen mã hoá
cho các hommone sinh trưởng như: gen mã hoá thụ thể của Gonadotropin Releasing Hormone, gen mã hoá thụ thể của Oestrogen, gen mã hoá Prolactia, EAT, PITI v.v Một trong các vùng gen quan trọng đã được nghiên cứu: gen Kappa-casein, ð-Lactoglobulin, Prolactin va Anpha s2-casein (oS2-Ca) lién quan 16i nãng suất và chất lượng sữa ở bò,
Trang 8gen GH, PITI, EATI (H-PABP), RYRI liên quan đến chất lượng thịt, gen ESR, OPN, Hhal, GNRE liên quan đến tính trạng sinh sản (số con sinh ralứa để )
Tại Việt nam, lĩnh vực nghiên cứu này còn hết sức mối mẻ, một số kết quả nghiên cứu về gen hầu hết chỉ ở trêu doi tượng thực vật: lúa, đỗ tương, ngô mrà chưa có nghiê cứu trên đối tượng là gia súc Việc phân lập và mã hoá các gen quau trọng liên quan đến các tính trạng sữa, thịt Việt nam là cần thiết để khẳng định một cách chắc chấn độ tin cậy của kỹ thuật, trên cơ sở đó có thể áp dụng để phân tích đa hình di truyền của các trên phục vụ cho công tác chọn giống
Trong thời gian qua, với sự tham gia của đông đảo các cán bộ khoa học từ các phòng thí nghiệm Di truyền Phâu từ- Viện Chân nuôi, phòng ADN ứng dụng, phòng Tế bào sinh sản, phòng Di truyền Phân từ, viện công nghệ sinh học, việu KHKTNN miễn Nam, Trường Đại hoc NNI wv Các cán bộ khoa học đều được đi đào tạo các kỹ thuật về công nghệ gen từ các nước tiến tiến: Nhật bản, Pháp, Đức, Mỹ, lại được sự định hướng cụ thể của chương tảnh khoa học công nghệ, bộ Khoa học và Công nghệ trong, xây dựng tiêm lực khoa học công nghệ gen, định hướng cho sản xuất, năm 2001, giao cho viện chãn nuôi chủ trì để tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử trong chon, tao giống vật nuôi năng suất cao“, Trong 3 năm qua, nhóm các nhà khoa học đã tích cực nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, xác định các gen liên qua đến các tính trạng kinh tế, phối hợp chat chế với các cơ sở vẻ giống và sản xuất, đã đạt được những thành quả nhất định và mục tiêu để
Thay mật các nhà khoa học thực hiện để tài, tôi xin báo cáo với ban chỉ nhiệm chương trình KC-04 và Bộ khoa học Công nghệ các thành qùa của công trình nghiên cứu trong 3 năm qua với mong muốn và hy vọng tẳng, các kết quả này sẽ không những là
những viên gạch đầu tiêu, đạt nền móng và cơ sở cho công tác chọc lọc và cải tạo giống, gia súc ö mức phâu từ, góp phân nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm của vật nuôi nước ta, đáp ứng nhu cầu xuất khẩu, giảm giá thành, nâng cao lợi nhuận cho người chân nuôimà còn góp phần đào tạo đội ngũ chuyên sâu về công nghệ geu động vật, xây dựng tiêm lực khoa học, tạo cơ sở cho việc phát triểu công nghệ sinh học trong châu nuôi Những kết quả nghiên cứu cũng sẽ là những tư liệu ban đầu vẻ ứng dụng kỹ thuật gen trên đối tượng là lợn và bò của Việt am, phục vụ cho công tác giảng dạy sinh viên, cao học, nghiên cứu sinh trong các trường đại học và các viện nghiên cứu
Chủ nhiệm đề tài KC 04-03
Trang 9B NOIDUNG CHINH BAO CAO
Nội dung chính báo cáo gồm có 4 chương:
hương 1 Kết quả ứng dụng các kỹ thuật di truyền Phân từ để xác định các gen đãng
+ý nghiên cứu
Chương 2 .Kết quả nghiên cứu xác định 5 gen liên quan tố
fab tang Ang suất, chất lượng sữa: Kappa - casein (K-Ca), B-lactoglobulia (B-Lg), a S1 - casein, a: $2- casein, Prolactin
Chương 3 Kết quả nghiên cứu xác định 8 gen lién quan tới tính trạng tỷ lệ nạc và số con để m/lứa ở lợn.( GH, EATI, PTI, RYRI, Hhal, ESR, OPN, GNRHR)
Chương 4, Kết quả ứng dụng các kỹ thuật geu trên đàn bò sữa và đàn lợn trong thực tiễn để xác định rnối tương quan giữa các rnacker phân từ thu được và các tính trạng sẵn xuất (Năng suất, hàm lượng protein sữa, tỷ lệ nạc, số con sinh ra trên lứa để)
Chương 5, Để xuất Chương trnh chọn giống bò và lợn ở rnức độ phân từ qua chỉ thị gen (dựa vào kết quả nghiên cứu của để tài KC 04.03)
Chương 6, Kết quả Đào tạo và báo cáo khoa học
CHUONGI
KET QUA UNG DUNG CAC KY THUAT DITRUYEN PHAN TU ĐỂ XÁC DINH CAC GEN BANG KY NGHIEN COU
1.ĐẶT VẤN ĐỀ:
Yếu tố chìa khóa có tính quyết định nãng suất của vật nuôi là sức sinh sản, mức độ tăng trường và tỷ lệ nạc; đốt với ngành chãn nuôi bò sữa là chất lượng sữa Đây là kết quả của sự tác động tổng hợp của nhiều yếu tố di truyền trong đó có các gen mã hóa cho một số hornone sinh trưởng quan trọng ở vật nuôi như: ESR (ostrogen ceceplor), ESH (folliculac stimulating hormone), PRL (pmolacủa), GaRHR (gonadotropin releasing homone), GH (growth hormone) Do vay, ngoài các phương pháp nghiên cứu về trật hình thái (như khảo sát trọng lượng, tính hệ số di tuyển và đo độ dày mỡ lưng), việc nghiên cứu bản chất các gen này ở mức độ phân tử, xác định sự đa hình, tần số kiểu gen, tần số aleo là rất cần thiết
Trang 101900 chỉ thị và geu của lợn đã được lập bản đỏ (Archibald và Rothschild, 1999) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các QTL chủ yếu đối với các tính trạng sinh trường và tỷ lệ mỡ ở lợn định vị trên NST số 4 (SSC4) Một số QTL khác định vị trên NST số 7 Số lượng các chỉ thị này dao động từ 5 đến 8 trên NST số 4 và từ 5 đến 7 trên NST so 7 Nam 1996, Wilkie và cộng sự đã công bố vẻ các locus tinh trạng số lượng có thể có đối với chiều đài của từ cung và tỷ lệ rụng trứng thuộc một số NST khác nhau: NST số 4, NST số 6, NST số 7 Kết quả này được khẳng định và bổ sung với các NST số 8, I3, L5 (Henderson et al., 1998; Rathje et al., 1997; Milan et al., 1998) NST số 4 của lợn bao gồm khoảng 105 locus được chia thành hai cánh: cánh ngắn SSC4p và cánh đài SSC4q Cánh ngắn SSC4p có độ tương đồng so với nhiễm sắc thể số 8 của người (HSA8), còn cánh dài SSC4q tương đồng với NST số l (HSAI) Trong đó, vùng QTL EATI thuộc cánh dài của NST số 4 là QTL có ảnh hưởng lớn tới tỷ lệ mỡ của thịt lợn Nằm trên NST số 8, locus OPN cũng được xác định là locus có vai trò quan trọng đối với nãng suất sinh sản đàn lợn Cụ thể đó là s6 con sinh ra trong rnột lứa để và tỷ lệ sống sót Vì những lý do trên, đây là hai locus mục tiêu để nghiên cứu nhằm tùm ra những kiểu gen đặc trưng, góp phần nâng cao năng suất đàn lợn
Muc dich ứng dụng các kỹ thuật tách ADN, kỹ thuật nhân geu PCR và kỹ thuật cất gen RELP (Rando và cộng sự 1988), kỹ thuật giải mã gen gen v.v.v để xác định sự đa hình, cấu trúc của 13 gen trêu và mối tương quan giữa chúng tới năng suất,
chất lượng sữa, thịt làm cơ sở cho công tác cải tạo, chọn giống đàn bò sữa, đàn lợn nước 1a ö mức di truyền phâu từ nhằm xây dựng đàn bò hạt nhân cao sản có sảu lượng và chất lượng/chu kỳ cao, đầu lợn có tỷ lệ nạc, khả năng sinh sản tốt Cụ thể như sau:
1 Phân tích kiểu di truyền trên bò nuôi fại Việt nam Nghiên cứu xác định các gen điều khiển tính trạng sữa và
protein sữa như: K- Cascin, gen B- Lactoglobulin, gea œ- Casein SI, gen œ- Casin 52, va gen Prolactin Xây dựng đàn bò sữa cao sản: sản lượng sữa 5000ft /chu kỳ, protein sita 190kg/chu ky 2 Phân tích kiểu di truyền trên các giống lợn nuôi fai Việt nam
Nghiên cứu xác định các gen và khu vực geu điều khiển tính trạng về tốc độ tầng, trọng và chất lượng thịt của lợn bao gồm:
- Gen điều khiển tính trạng tỷ lệ nạc trên 50%, (GH, EATI (H-PABP), PITI, RYRI) - đen điều khiển tính trạng, sinh sản đạt 12 con/lda dé ESR, OPN, Hhal, GaRHR
1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
1 Nguyên vật liệu:
Mẫu mô, mẫu máu bò và lợn các giống nghiên cứu được thu thập và bio quan -20°C
Trang 112 Hoa chat
- Các hoá chất dùng để tách DNA tổng số, DNA plasmid, các euzyrne hạn chế của các hãng Merck (Đức), Sigma, BioLab Hoa Ky), Amecsham Pharmacia Biotech (Thụy Điển)
- Hoá chất dùng cho PCR của hãng Eeanentas, BioLab
- BO hod chat TOPO TA Cloning® Kit cita hãng Sepageu và Invitcogea™
-Bộ hóa chất sinh chuẩn BigDye” Terminator v3.1 Cycle Sequencing; ®etformance Optimized Polymer (POP) của hãng Applied Biosystems (Hoa Ky)
- Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: LB lòng, LB đặc, SOC 3 Thiết bị
Tu lạnh sâu -20°C, -84°C (Sanyo, Nhat Ban); Pipetman céc loại (Gilson, Pháp); Cân phân tich (Mettler Toledo, Thụy Điển); Máy đo gH (Menlee, Thụy Điển); Máy li tam (Sorvall, Hoa Kỳ); Máy li tâm Eppendodf 5415C (Eppendorf, CHLB Đức); Máy điện di PowerBac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ); Máy chụp ảnh Gel Doc (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển); Máy GeueAmp” PCR System 9700 (Applied Biosystems, Hoa Ky); Máy xác định trình tự ABI PRISMP 3100-Avant Generic Aualyzer (Applied Biosystems, Hoa Ky),
Il NGUYEN LY VA PHUONG PHÁP NGHIÊN CÚU
1 Phương pháp thu thập mẫu
- Mẫu mô tai các giống bò, lợn được thu thập bằng cách dùng kìm bấm một mắu khoảng 30mg và bảo quản trong cồn tuyệt đối ở -20°C
- Mẫu máu các giống bò, lợn được thu thập khoảng 5ml dùng bộ kim và ống hút châu không chuyên dụng Bảo quả trong dung dịch EDTA 0.5M và lưu giữ trong tù lạnh sâu
-2ữC cho đến khi sử dụng
2 Phương pháp tách ADN từ các nguyên liệu di truyền khác nhau 2.1 Giới thiện
ADN (Acid Deoxyribore Nucleic) là một đại phân từ được cấu thành từ các đơn phân tà nucleotide Trong cơ thể tất cả những tế bào có nhân đều chứa phân từ ADN Phân tir này mang toàn bộ thông tỉn dĩ truyền của cá thể Nguồn thông tin đó được ổn định nhờ hoạt động tự sao chép của ADN theo nguyên tác “bán bảo tồn” Đỏng thời thông qua hoạt động của bộ máy tế bào, nguồn thông tin di truyền này được chuyển sang các phân từ ARN thông tỉa, đi vào tế bào chất tổng hợp nên phân từ proteia Trên cơ sở đó, sinh học phân tử đã phát triển và ứng dụng các kỹ thuật di truyền phân từ vào nghiên cứu và
chẩn đoán một số bệnh Để thực hiện kỹ thuật này đòi hòi phải có nguồn nguyên liệu
Trang 12quan trong trong céc quy iciah thao téc te€a ADN Digu quan trong là cầu có những phương pháp thích hợp để tách chiết các thành phần này từ các nguồn tế bào khác nhau 2.2 Nguyên tắc chung
- Bước I; Phá võ màng tế bào, ràng nhân của các tế bào động, thực vật, vì khuẩn, vieus Phương pháp sử dụng để phá vỡ mmàng tế bào, màng nhân càng nhẹ nhàng càng tốt (tốt nhất nên sử dụng enzyrm phân huỷ) Nếu cầu phải sử dụng các phương pháp rrạnh hơn, chẳng hạn như dùng máy aghiễn như đối với trường hợp các tế bào thực vật, thì các phâu từ ADN lớn có nguy cơ bị đứt gẫy cơ học và điều đó có thể gây trở ngại trong quá trình sử lý tiếp theo
- Bước 2: Tình sạch ADN Bước này được thực hiện bằng cách chiết xuất dung dịch tế bào mot lần hoặc vài lẩu sử dụng Protenase K, RNase, phenol và hỗn hợp phenol/chlorofoan nhằm loại bò các tạp chất, proteia, ARN
- Bước 3: Kết tùa và làm khô ADN Bước uày được thực hiệu bằng cách sử dụng isopropanol hoac ethanol tuyệt đối để kết tùa ADN Sau đó, rửa tia bang ethanol 70% để loại bò các thành phần muối còn sót lại Cuối cùng là làm khơ ADN và hồ tau trong đệm TE để bảo quản lâu đài ở -20C
2.3 Các phương pháp cụ thể để tách ADN từ các nguyên liệu di truyền khác nhau 2.3.1, Quy trình tách ADN từ máu
Rửa mẫu;
Cho vào ống lấy mẫu eppendoft 500uL đệm TE (pH: 8.0) và 500g máu (được bảo quản bằng chất chống đông EDTA 0.5%) Tiến hành ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút Dùng pipet hút nhẹ loại bd phần dung dich ở trêu Rừa 2 lần
1 Phá màng tế bào, màng nhân:
- Cho 5001 dung địch SDS 10%, 70u:L NP40 và (0u dụng dich proteinase K (L0mg/ml) vào ống trên, ù mẫu qua đêm ở 56°C trong Waterbath U 70°C trong 5 phút
2 Tỉnh sạch ADN:
= Cho Sul dung dich RNAse (20mg/ml) vio, it 6 37°C trong tù ấm 2 giờ để phân huỷ ARN
- Thêm 600, phenol Trộn kỹ bằng máy Vortex Ly tâm 15.000v/phút trong 10 phút ở 4°C Dùng piper hút nhẹ nhàng phần dịch trong ở trêu sang ống vô trùng mới, đây là phần chứa ADN Loại bò phần cận
- Thêm 600uL phenol-chloroforrn vào (thé tich phenol : chloroform ta 24:1) Lac maah côi ly tâm 15.000v/phút trong 10 phút ö 4°C Thu dich trong ở trên đưa sang ống mới 3 Kết tủa ADN
- Thêm khoảng lml cồn tuyệt đối (thể tích cồn: mẫu là 2,5:1) Lắc nhẹ, để trong lạnh - 20°C khoảng 30 phút sẽ thấy kết tùa ADN
Trang 13
- Ly tam 15.000v/phiit, trong 10 phat 6 4°C Thu tila 4 Ria tila ADN:
- Thêm Lml cồn 70°, Ly tâm 10.000v/phút trong 10 phút Thu từa Làm 2 lần 5, Hoà tan ADN:
- Làm khô tùa ADN qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc dùng rráy làm khô ADN
- Hoà tan với 1000 đệm TE, để qua đêm ở nhiệt độ phòng Tuỳ theo thời gian sử dụng, mà có thể bảo quan & 4°C hoặc là -20°C
Ảnh kết quả tách chiết A DN từ mẫu máu 2 3.2 Quy trình tách ADN từ mô
1 Phá màng tế bào, màng nhận
= Cho 5 - L0mg mé tai thdi ahd vio Gag 1,5ml, thêm 50041 dung địch SDS 10%, 704L dung dich NP-40, 10 ul dung dich proteinase K (10mg/ml) U qua dém & Watecbath 56°C Sau đó 8 70°C trong 5 phit
2 Tinh sach ADN:
- Cho Sul dung dich RNAse (20mg/ml) vio, it 6 37°C trong tù ấm 2 giờ để phân huỷ ARN
- Thêm 600, phenol Trộn kỹ bằng máy Vortex Ly tâm 15.000v/phút trong 10 phút ở 4°C Dùng giper hút nhẹ nhàng phần dịch trong ở trêu sang ống vô trùng mới, đây là phần chứa ADN Loại bò phần cận
- Thêm 600uL phenol-chloroforrn vào (thé tich phenol : chloroform tA 24:1) Lac mah côi ly tâm 15.000v/phút trong 10 phút ö 4°C Thu dich trong ở tên đưa sang ống mới 3 Kết từa ADN
- Thêm khoảng lml cồn tuyệt đối (thể tích cồn: mẫu là 2,5:1) Lắc nhẹ, để trong lạnh - 20°C khoảng 30 phút sẽ thấy kết tùa ADN
- Ly tâm 15.000x/phút, tong 10 phút ở 4°C Thu tùa 4 Rữa tha ADN:
- Thêm Iml cồn 70° Ly tâm 10.000v/phút trong 10 phút Thu từa [àm 2 lần
Trang 145 Hoà tan ADN:
- Làm khô tủa ADN qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc dùng ráy làm khô ADN
- Hoà tan với 100L đệm TE, để qua đêm ở nhiệt độ phòng Tuỳ theo thời gian sử dụng, mà có thể bảo quan & 4°C hoặc là -20°C
Ảnh kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô 2 3 3 Quy trình tách chiết ADN từ lông Chuẩu bị mẫu: Cất phần chân lông thành những mẩu nhỏ, nghiễu nát và đưa vào ống vô trùng 1.5 ml 1 Phá màng tế bào, màng nhân - Them 480, Nucleic Lysis Solution va 120 ul EDTA (0.5M, pH: 8.0) vào ống - Thém 10uL proteinase K (10mg/ml) ~ Ủ hỗn hợp ít nhất 3 giờ ở 56°C trong waterbath hoặc để qua đêm (sau mỗi giờ lắc nhẹ một lần) 2 Tĩnh sạch ADN: - Thém 200 Protein Precipition Solution, sau đó lắc bằng máy lắc - Làm lạnh trong đá khoảng 5 phút - Ly tâm 13,000 vòng khoảng 5 phút Thu phần nước trong adi bên trên đưa sang ống vô trùng 1,5ml mối
3 Ket tha ADN:
= Thém 600L Isoptopanol Trộn nhẹ dung dịch bằng cách đảo ngược ống cho tới khi những sợi DNA tùa thành khối hữu hình
- Ly tâm khoảng 1 phút với tốc độ 13.000 vòng Loại bò phân dich nồi bên trên, Thu tùa 4 Rữa tha ADN:
- Them 600 ul ethanol 70%
- Ly tam 1 phét & 13.000 vong Thu tia ADN - Làm 2 lần
5 Hoà tan tùa ADN
- lâm khô tùa ADN qua đêmở nhiệt độ phòng hoặc dùng máy làm khô ADN
Trang 15
- Thêm 50.1 ADN Rehydratation Solution (L0mM Tris-HCl/LmM EDTA, PH7,4), sau d6 để qua đêm ở nhiệt độ phòng để hoà tan DNA
- Tuỳ theo mục dich sử dụng có thể bảo quảu ADN ở 2-8°C hoặc 20% 3 Phương pháp nhân gen PCR
3.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng enzyme ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp các đoạn DNA mới từ mmạch khuôn trong môi trường có các DNTP va cập mỗi đặc hiệu Các đoạn ADN mới được tạo thành lại được sử dụng làm khuôn Sau at
kỳ, số lượng đoạn ADN khuôn được nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể có đủ số lượng phục vụ cho những rnục đích nghiên cứu tiếp theo PCR là kỹ thuật đòi hòi các điều kiện cất nghiêm ngặt về thành phần và nổng độ các chất tham gia phản ứng (đệm, mỏi NTPs, MgCl), do đó cầu tính chính xác cao Hơn nữa, việc thiết lập một chu trình nhiệt thích hợp là yếu tố quan trọng, đảm bảo cho sự giãn xoắn của DNA rạch kép, việc gắn
êu chủ
môi và kéo đài chuỗi trong méi chu ky Chu trình nhiệt được xây dựng trên cơ sở chiều
đài của môi, tỷ lệ % (G + C) và (A + T) của đoạn DNA cầu nhân và nhiệt độ nóng chảy của cập môi được sử dụng
3.2 Thành phân chung của một phần tig PCR
Phân ứng PCR được tiến hành với thể tích là 25 iÍ gồm các thành phần sau: 100 ng ADN tổng số; I0 pM mii primer; 2 unit Taq DNA polymerase; 2,5ul dNTPs 2mM; 2,5ul Buffer 10X chia MgCL,S va dia autic 161.25 pL
3.3 Chu trink nhiét cho một phần ứng PCR thường gôm các giai đoạn sau:
~ Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép ban đầu tách thành hai mmạch đơn nhờ nhiệt độ cao (94C)
- Giai đoạn gắn môi: ö nhiệt độ thích hợp, hai môi sẽ tự bám vào hai đầu của đoạu DNA dich theo nguyên tắc bổ sung (khoảng từ 50 - 60°C)
~ Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ của hỗn hợp phẫu ứng được tầng lên khoảng 72"%C là nhiệt độ thích hợp để cho Taq DNA polyrerase kéo đài chuỗi
4 Phương pháp cất gen RFLP (Restietion Eragmeut Length Polymorphisrn) 4.1 Nguyên tắc:
Tựa vào đặc tính nhân biết và cất tại những trình tự ngắn, đặc hiệu xác định trên phân từ ADN của các ezym giới hạn (Restriction Buzyme) ký hiệu là RE (ở các điều kiện thích hợp bao gồm nhiệt độ, thời gian, thành phân môi trường ) nhằm xác định đa
hình các đoạn gen nghiên cứu
4.2 Enzym giới han (restriction enzyme)
Trang 16Với ứng dụng đặc biệt của mình, các euzym giới hạn hiện nay được sử dụng như một "cái kéo sắc bén" có thể cất nhỏ bộ gen của một sinh vat Chiah vi vay, enzym
hạn đã trở thành "chìa khoá" cho nhiều nghiên cứu, ứug dụng trong sinh-y học
Enzym gidi hạn được sử dụng trong phương pháp tạo dòng với mục đích thu nhận được các bản sao của một tành tự ADN xác định với số lượng lớn thông qua kỹ thuật PCR
Kể từ khi enzyrn giới bạn được phát hiện đến nay, các nhà nghiên cứu đã có thể xác định được trình tự của những đoạn polyaucleotid Từ đó tạo điều kiện cho việc xác định trình tự ADN, lập bản đỏ giới han, tạo điều kiện cho các kỹ thuật xây dựng ngân hàng gen, sàng lọc phâu dòng các đoạn ADN cần nghiên cứu Các euzym giới hạu được
sử dụng để nghiên cứu những đoạn polyaucleotid khởi đầu quá trình sao mã của gen thường là các enzym giới hạn Hae II, Hợa II
Enzym giới hạn còn được dùng trong việc phân tích so sánh bộ gen giữa các loài sinh vật khác nhau thông qua kỹ thuật RELP Kỹ thuật này dựa trên tính đa hình về ADN, nghĩa là ADN của những sinh vật khác nhau thì khác nhau ít nhiều vẻ trình tự sắp xếp các bazø nitơ Do đó, sử dụng enzym giới hạn người ra có thể nhận biết được đặc tính đa hình của chúng Kỹ thuật RELP cho phép phát hiện những sai lệch về đi truyền: trong các loài sinh vật, từ đó thiết lập rnối quan hệ họ hàng giữa các loài sinh vật khác nhau
Như vậy, những thành tựu liêu quan đến kỹ thuật ADN tái tổ hợp và kỹ thuật di chuyển geu đều yêu cầu sử dụng các endonucleaza giới han Có thể adi cing sinh- y học nói chung và đi truyền phân từ nói ciêng gấu liễu với nghiên cứu và sử dụng các euzym giới bạn Khả nâng cất ADN tại những vị tí đặc hiệu bởi các eazym giới hạn có ý nghĩa quyết định đối với sự nảy sinh cũng như sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật di Truyền
+ Nhóm I: gồm những nucleaza chỉ cất liêu kết phosphodieste từ hai đầu chuỗi polyaucleotit và từ đó cất dâu từ nucleotid được gọi là các zonuclzazz Một trong những, exonucleaza cất đầu 3' của chuỗi polyaucleotid là exonucleaza III tìm thấy trong Escherichia coli Dac điểm:
- Phân từ lượng cao vào khoảng 300 000, các bán đơn vị không giống nhau - Cần ATP, Mpˆ' và nói chung cầu 2-adeoxyl-methionin làm coÊactoww
- Do không có tính đặc hiệu trong cất đoạn nên sản phẩm thuỷ phân kiểu I là không đồng, nhất, không có những đoạn aulceotid đặc hiệu phát hiện được bằng điệu di trong gel, vì vậy các enzym kiểu lút có tác dụng trong việc phâu tích hoá sinh đối với ADN
+ Nhóm II: gồm các aucleaza không đòi hồi nhóm -OH tự do ở đầu chuỗi, chúng thuỷ: phan céc liêu kết phosphodieste ở vị trí 3 hoặc 5' bất kỳ trong chuỗi polyaueleotide, giải phóng các oligonucleotid được gọi là các endnueleaza Đặc điểm:
- Phân từ lượng thấp hơn kiểu I khoảng 20 000-100 000
Trang 17- Chỉ cần Mg” tam cofacto
- Do có tính đặc hiệu vẻ cất đoạn ADN nên sảa phẩm thuỷ phân gồm những đoạn aucleotid dac hiệu có thể phát hiện được bằng điện di trong gel Vì vậy, các enzyrn kiểu TĨ được sử dụng rất nhiều trong các phương pháp phân tích ADN
hạu được định nghĩa như sau: "Endoaucleaza giới bạn" hay
Do vậy, endoaucleaza gì
cồn gọi là cnzym giới ạu là những eazym có khả năng nhận biết những tảnh tự nucletid đặc hiệu trên chuỗi xoắn kép ADN và cắt cả hai chuỗi ADN kép tại những vị trí đặc biệt 4.3 Thành phân chung cho một phần ứng RFLP
Thành phần phản ứng với tổng thể tích 25 ul bao gồm: L5uL sản phẩm PCE; 2,5u Buffer; 5 unit enzyrm giới han va din nước tới 25 ul Sau đó ù hỗn hợp phản ứng qua đêm ở 37°C (tuỳ từng loại enzyme giới han)
Š Phương pháp điện di
5.1 Nguyên tắc
Nguyên tác của phương pháp điện di dựa vào đãc tính cấu trúc của các axit
aucleic Đó là các đại phân từ tích điện âm đồng đều trên khấp bẻ mặt nêm khi chịu tác
động của một điện trường chúng sẽ di chuyển vẻ cực dương cùa điện trường Tính linh động của phân từ trong bản gel dưới tác động của một điện trường được tính theo công
thức:
Log u = Log up -K,C
Log uy: là tính linh động của phân tử trong môi trường lòng
K,: là hằng số chậm do cấu trúc geL đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lượng phân từ của phân từ axit nucleic
C: nông độ geL
Qua đó, ta thấy rằng tính linh động của phân từ phụ thuộc vào hai chỉ tiêu:
+ Khối lượng phân từ tức là số lượng aucleotid hay cập aucleotid (ADN mạch đôi)
+ Nông độ các chất cấu thành gel
Hai loại gel được sử dụng nhiều trong công việc nghiên cứu công nghệ sinh học là gel Agasose va Polyacrylamid Việc lựa chọn loại gel cũng như nông độ các chất tạo thành gel tuỳ thuộc vào tuỳ từng đối tượng mrà ra cần nghiên cứu
5.2 Các phương pháp điện di 3.2.1 Điện di trén gel agarose
Tựa vào cấu trúc của agarose người ta có thể xác định được nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ đông đặc của agarose Agarose nóng chảy ở nhiệt độ từ 90-100C và ở nhiệt độ bình thường trong phòng thí nghiệm thì agarose bi dong dac lại Dựa vào tính chất này
Trang 18của gel agatose mà ta có thé lựa chọu nhiệt độ thích hợp với từng nông độ của gel dé có thể điện di được các phân từ có khối lượng phâu từ khác nhau
Bảng: Nông độ của gel agarose và hiệu quả phân tách các phân tử ADN Nông độ agarose trong gel Hiệu quả phân tách các phân từ ADN (Eb) 03 5-60 06 120 07 08-10 09 0.57 12 046 15 023 2.0 012
Sự đi chuyển của ADN trong gel điện di có được hiệu quả hay không được quyết định bởi một phân rất lớn của nồng độ ion, thành phần các chất có trong đệm điệu di Trong trường hợp nếu không có sự có mật của các ion thì sự đẫn điệu là rất nhỏ và tốc độ di chuyển của ADN cũng rất thấp Trong trường hợp nồng độ các ion trong đệm diga di cao thì độ đẫn điệu tất hiệu quả, nhưng lượng nhiệt sinh ca rất lớn và vì vậy trong ruột số trường hợp xấu có thể xây ra là gel sẽ bị nóng chảy còa ADN sẽ bị biếu tính
Có một số loại đệm được sử dụng trong điện di ADN Tất cả các loại đệm này đẻu có EDTA (pH 8.0) và các hoá chất khác nhau thì có các tên gọi khác nhau ví dụ như: đệm TAE thi bao gém Tris-acetate va EDTA, dim TBE thì gồm Tris-bas và EDTA, đệm TPE gồm Tris-phorphat và EDTA ở nông độ khoảng 50:nM (pH 7,5-7,8)
Bằng 2: Các loại đệm thường hay sử dụng trong điện di
Tên đệm [ Nông độ dung dich làm việc Nông độ dung địch bảo quản Tris-acetate | Lx: 0,04 MTais-acetate 50x: 242g Tris base
(TAE) 0,001 MEDTA 57,4 ml glacial acetic acid 100ml 0,5M EDTA (pH 8,0) Tris-phosphat |x: 0,09MTeis-phosphat | 10x: 108g Tris base
(IPE) 0,002 MEDTA 15,5ml 85% phosphoric acid (1,679 g/ml)
40ml 0,5M EDTA (pH 8,0) TRs- 0;5x: 0,045 M Teis-borat 5%: Sdg Teis base
borat 0,001 MEDTA 27,5g boric acid
20 ml 0,5MEDTA (pH 8,0)
+ Ví dụ quy trình đổ gel agarose 1%:
- Hoa 1 g agarose trong 100 ml TBE 1X, dua s6i trong lò vi sóng cho tan hoàn toàn Để cho nhiệt độ bạ xuống khoảng 5'C, đổ vào khuôn có đặt sấn răng lược thích
Trang 19hợp Đợi cho thạch đông và ổn định trong vòng 1 giồ Sau đó bò răng lược ra và đặt gel vào hộp điệu di Đồ đệm TBE LX sao cho mức đệm cao hơ rmật gel từ | - 2 mmm
- Trộn một lượng rnẫu thích hợp với đệm tra mẫu (glyxeroL 20%; Tris-CL0,LM pH 8; EDTA 0,01 M pH 8; bromophenol blue 0,25%) Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điệu thế 100V, dòng 60 - 80 mA, trong thời gian khoảng 30 phút
- Nhugm gel bang Ethidium bromide 10 jig/ml tong khodag 10 phút và đặt trên ay lắc, sau đó rửa sạch ruẫu
- Quan sát và chụp ảnh trên máy GeL Doc 3.22 Điện di trên gel Polyacrylamid
Với sự có mật của các gốc tự do, được cung céip boi ammonium persulfat và chất fam ổn định được cung cấp bởi TEMED (N,V,N',N' tetramethylenthylsne điamine), thì mot chuỗi phản ứng bất đầu bằng việc các monorner của acrylamid được polyme hoá thành các chuỗi dài Khi có mật của các téc ahaa NN’-methylenebisacryamid tác động vào phản ứng polyrme hoá, các liêu kết trở thành các dạng liêu kết của gel, độ xốp của geL phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi liên kết và mức độ liêu kết của gel
Chiểu dài của các chuỗi được quyết định bởi nồng độ acylamid trong phản ứng polyme hoá (khoảng giữa 3,5% và 20%); l phân từ liêu kết chéo (crosslinker) cầu đến 29 monomer cita accylamid Higu quả phâu tách bằng gel polyacrylamid ở các nồng độ khác
nhau được thể hiện ở bảng sau:
Bang 3: Hiéu qud phan tach ADN trong gel polyacrylamid
‘Accylamid Hiệu quả phân Xylene Bromophenol
(® 1#} tách (bp) cyanol EE® blue! 35 1000-2000 460 100 50 30-500 260 65 $0 60-400 160 4 120 40-200 70 20 150 25-150 60 15 200 6-100 45 bì
@ N,N’ methylenebisacrylamid bao gồm 1/30 nông độ của accylamid
Bang 4: Thé tich gidi han sit dung trong cdc gel polyacrylamid
Néag 49 gel polyacrylamid (%)
Trang 206 Phương pháp giải trình tự gen
Quy mình đã áp dụng để giải trình tự các đoạn gen như sau:
Tảnh tự của các đoạn gen được xác định trên máy tự động ABI PRISMP 3100
Avant Genetic Analyzer bang céch sir dung BO héa chéit sinh chuẩn BigDye® Teminatoc v3.1 Cycle Sequencing
- Thành phần của phản ứng PCR đọc trình tự gdm: 3,2 pM mdi, 200 ag DNA plasmid, BigDye, dem tong tng trong tng thể tích 5 wl
- Chu trình nhiệt trên máy luân nhiệt GenAmp® PCR System 9700 như sau: 96°C - L phit; (96°C - 10 giay, 50°C - 5 giây, 60°C - 4 phir) x 25 chu ky; giữ ở 4C
- Sản phẩm PCR duoc tinh sach bang phong phép tila EtOH/EDTA: bé sung 5 wLEDTA 125 mM va 60 kÍ EIOH 100%; để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu các đoạn DNA có trong đó, loại bỏ EIOH; bổ sung 60 ul E1OH 70%; ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Làm khô kết từa DNA, bổ sung 10 ut
Hi-Di Fommamide và biến tính tại 95°C trong 5 phút Các mẫu được cho vào các giếng
của khay đựng mẫu sau đó điện dĩ trong ống vì mao quản 80 cm x 50 ¡im có chứa POP-
4
- Trình tự nucleoride của mỗi mẫu được xác định từ cả 2 chiêu xuôi và ngược, được xử lý
bằng các phần mềm ABI PRISMP 3100-A vant Data Collection vI.0 và DNA Sequencing Analysis
So sánh, đối chiếu trình tự nucleotide đã xác định với các trình tự nucleotide
chuẩn đã công bố trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế để xác định độ tương đồng, đột biến điểm trên các đoạn gen nghiên cứu
7 Đăng ký bần quyên trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế EMBL
Tảnh tự các đoạn gen đặc trưng đã được đăng ký trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế EMBL theo địa chỉ hitp://wvw.ebi.ac.uk/secvices/index.html (submission EMBL via Webin)
8 Các kỹ thuật dùng cho tách đồng gen
8.1 Phần ứng ghép nối gen vào vector tách dòng pCR® 2.1-T0PO®
Phản ứng ghép nối được thực hiệu theo TOPO TA Cloning® Kit cita hãng Tavitrogeu”“, Đây là phương pháp và bộ sinh hoá tiêu chuẩn được thiết kế đặc biệt để tách đồng gen mong rnuốn được nhân lên bằng Taq DNA polymerase và trong thời gian ngắn (khoảng 10 phút Phương pháp này cho phép gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector ahd hoat dong cita topoisomerase
Trang 21Thaah phiia phan (ng bao gém: 4 ul sin phdém PCR, | yl dung dich muci (g6m NaCl 200 mM; MgCl, 10 mM) va J ul vector Dé hda hgp phan dng 6 abigt độ phòng từ 30 giây tới 30 phút
8.2 Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt
Bổ sung 3 uL sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến đã được để trong đá khoảng 30 phút sau khi lấy ra từ -84°C, giữ trong đá 30 phút Sốc nhiệt ở 42°C trong 2 phút sau đó chuyển ngay xuống ỨC và giữ trong vòng 5 phút Bổ sung 0.3 ml môi trường SOC, nuôi lắc ở 37% trong lgiờ Sau đó cấy trải trên đĩa môi trường bao gém: LB dgc, Amp (50 pg/ml), X-gal (40 ugéml), IPTG (40 jig/ml), nuôi qua đêm ở 37C,
Thành phần các môi trường audi cay vi sinh vật:
- Môi trường LB lòng: Bacro - Tryptone 10 g/l; Yeast exteact 5 g/l; NaCl 10 gil; 1, NaOH 2 mM
- Môi trường LB đặc Bacto - Tryptone 10 g/l; Yeast exteact 5 g/l; NaCl 10 gi; 1, NaOH 2 mM; Bacto - Agar 15 gil
- Môi trường SOC: Tryptone 5%; Yeast exteact 0,5%; NaCl 10 mM; KCL2,5 mM; MgC, 10 mM; MgSO, 10 mM: Glucose 20 mM
8.3 Phutong phdp téch DNA plasmid
Khuẩ lạc trắng thu được sau khi biến nạp được cấy chuyển vào 2 ml môi trường, 1B lòng có bổ sung Amp (50 g/ml), nuôi lắc ö 37°C, 200 vòng/phút trong 12-16 gid Ly tâm dịch nuôi cấy ở 6000 vòng/phút trong 7 phút Hoà tan cận tế bào vi khuẩn trong 150 ul duag dich I để lạnh Bổ sung 150 ul dung dich I, đảo đầu ống eppendod nhẹ nhàng Thêm 200 il dung dich II dé lạnh, đảo nhẹ và giữ trong đá 5 phút Thêm 500 yl dung dich phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) c6i ly tâm 12000 vòng/phút trong, 15 phút Hút dịch pha trêu sang ống eppedorf rnối và chiết tiép bang chloroform: iscamyl alcohol (24: 1) Bé sung 50 pl CH;COONa 3 M pH 5,2 va 1 ml E1OH 100%, dé & -20°C trong 3 giờ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu DNA Rita chất kết tùa bằng EIOH 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 7 phút, làm khơ và hồ trong 30 ul TE 0,01 M DNA plasmid sau đó được loại RNA và kiếm ra trên geLagarose 0,8%
Thành phần các dung dịch téch chiét DNA plasmid
- Dung dich E Glucose 50 mM; Tris-Cl 25 mM; EDTA 10 mM pH 8 (khử trùng, giữ ð 4'C)
- Dung dich I: NaOH 0,2 M; SDS 1 % (pha méi trước khi sử dụng) - Dung địch II: CH,COOK, CH,COOH 0,115 % (khử trùng, giữ ö 4°C) 8.4 Phan ting cdt DNA plasmid bang enzyme han ché
Trang 22
Để khẳng định rõ các plasmid tái tổ hợp đã lựa chọn có mang sản phẩm PCR +không, cầu sử dụng enzyme hạu chế để kiểm tra
Thành phần phản ứng bao gồm: 20 ag DNA plasmid, 2 uni EeøRI và dung địch đệm thích hợp cho eazyme đó Tổng thể tích phản ứng là 8 ul Hôn hợp phản ứng được ù 37°C trong 3 giờ Sau đó điện di sảu phẩm trên gel agarose 0,8%
9 Một số cơng thức tính tốn
9.1 Công thức tính tần số kiểu gen và alen 9.1.1, Tân số kiểu gen
X(®)=ax 100/A X: Tân số kiểu gen cầu tính (%) a: số mẫu mang kiểu gen cầu tính A: sO miu mang tat cả các kiểu gen 9.1.2, Tan salen X (%)= ax L00/A X: Tân số alen cần tính (%) a: Tổng số từng alen cần tính A: Tổng số các alen
9.2 Phương pháp tính hệ số tương quan (R)
9.2.1, Công thức tính tương quan giữa hai tính trạng Trong đó COV„x„ là hiệp phương sai kiểu hình và có công thức tính là : x?>y sv EXEY ” COV,„„= df
x: các giá tự của tính trạng thứ x, y : các giá trị của tính trạng thứ y a: miu do, df số bậc tự do bang a-L
ØŸ, là phương sai của tính trạng x
7, là phương sai của tính trạng y
9.2.2, Sử dụng phân mêm Excel để tính hệ số tương quan giữa hai tính trạng (R) 9.3 Phương pháp xác định sẵn lượng sữa
Trang 23'Thu thập số liệu từ các cơ số:
- _ Theo dõi lý lịch giống của các cá thể lấy mẫu
- _ Theo đối sản lượng sữa/chu kỳ bao gồm tháng cho sữa (thời gian cho sữa/chu kỳ) thông qua sản lượng sữa hàng ngày và lứa để (chu kỳ sữa)
9.4 Phương pháp xác định chất lượng sữa
Phân tích mẫu sữa thu thập được bằng máy Lacto Star (Funke Gerber 1998 và 2000) tại Trung tâm nghiên cứu bò & đồng cô Ba vì và Trum thú y Đông Anh
9.5 Phương pháp xác định số con sinh rallứa để 'Thu thập số liệu từ các cơ sở bao gồm:
- Theo doi lý lịch giống của từng cá thể lấy mẫu
= Theo doi khả năng sinh sản (số con sinh ra/lứa) và số lứa để 9.6 Phương pháp xác định độ dày mỡ lưng
Sử dụng máy do độ dày mỡ lưng RENCO LEAN-MEATER” để xác định độ dày mố lưng ở các mẫu lợn nghiêu cứu
9.7 Phương pháp xác định tỷ lệ nạc thông qua độ đầu mỡ lưng và khối lượng của lợn (Nguyễn Văn Đức và cộng sự 2004) 9.7.4, Lon not TLN = 69.75 DML, + 0.06(50-P) (trọng lượng của lợn từ 45-55 kg) 9.7.2 Lon ngoại (các giống) TLN= 71.69 DML, + 0.03(160-P) (trọng lượng của lợn từ 100-220 kg ) Trong đó: - TLN: ty lệ nạc và được tính bang %
- DML: dày mỡ lưng tại điểm B (xương sườn cuối cùng) bằng máy RENCO LEAN MEATER, đơn vị là mm
- P: khối lượng lợa hơi tại thời điểm do, đơn vị tính là kg 10 Ứng dụng tin học trong fhu thập và phân tích số liêu
Trinh tr nucleotide cia cae đoạn gen nghiêu cứu đã được thu thập từ Ngân hàng, EMBL tại địa chỉ bto:/scs.ebLac.uk với sự hỗ trợ của công cụ từm kiếm BLAST Các trình tự đó được chuyển về dạng formai thích hợp của CluslalX (dạng Fasta) và PCKSENE (dùng tiện ích REEORM của PC/GENE) để dùng làm dữ liệu đầu vào của các phầu mềm này phục vụ cho việc thiết kế cập mỏi (dùng tiệu ích PCRPLAN của ĐC/GENE) khuếch đại các đoạn gen tir DNA genome
Các pha mém ABI PRISM? 3100-Avaat Data Collection vi.0 va DNA Sequencing Analysis dugc sir dung dé thu thập và xử lý các tình tự trong quá trình xác
Trang 24định tình tự tren méy ty dong ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer Các kết quả trình tự nghiên cứu được phân tích bằng 69 phiin mém SeqScape® v2.0 dé xdc dink céc điểm đột biến/ đa hình so với các trình tự đã được công bố trên các Ngân hàng trình tự gen quốc tế EMBL(EBI)/GenBank/DDBI Các phần mềm ClustalX, BioEdii v5.0.9 được sử dụng để đưa œ các hình, bằng so sánh, thống kê các điểm đột biếu/ đa hình
Sau khi xử lý, các trình tự được gùi đãng ký tại Ngân hàng trình tự geu Quốc tế EMBL theo địa chỉ hitp://wvw.ebi.ac.uk/secvices/index.himl (submission EMBL via Webin)
CHƯƠNG II
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH 5 GEN LIÊN QUAN TỚI TÍNH
TRANG NANG SUAT, CHẤT LƯỢNG SỮA
Kappa - casein (K-Ca), f-lactoglobulin (B-Lg), œ S1 - casein, œ S2- casein,
Prolactin
I TONG QUAN
1 Thanh phan protein sita ba
Những nghiên cứu ở mmức độ nhóm, quần thể trên nhiều giống bò đã chứng minh cảng sản lượng và thành phần các proteia sữa có quan hệ cất chật chẽ với các biến thể di truyều mã hoá ptotein sữa
Phân tích qué tah sao mã ở các hệ thống sao trñ inviteo chỉ œ rằng: các trình tự biểu hiện điều khiển gen nằm trong khoảng 1 kb của đầu 5 của gen mã hoá protein sữa Vùng 5' ADN của các gen mã hóa cho 6 protein sữa chính của bò đã được tách dòng và phân tích tảnh tự
So sánh đặc điểm sinh lý-sinh hoá của các vùng gen quan tâm đã cung cấp những thông tỉa về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng sinh học của các don gen, cụ thể là sự đa hình của các nucleotid cho chúng ta cơ sở có giá trị trong việc chọn lọc đàn gia súc Mặc đù thành phân và chất lượng sữa của các giống bò khác nhau có khác nhau đáng kể , nhưng protein sữa bò được chia ca hai loại chinh: Protein Caseia Ca (0,8, K- Ca) và protein nước sữa (œ-Ta,B-1g)
Trang 25lượng protein sữa rung bình của bò được tiết ra khoang 32mg/lit sita Troag dé protein Ca chiém khoảng 80% và được chia thành bai nhóm chính Nhóm protein Cu nhạy cảm với calcium (œsl, os2,B-Cn) và nhóm K-Cn
Trong sữa Cu được tổng hợp từ các tế bào biểu mô tiết của động vật, chúng tồn tại dưới dạng các hạt mixen (rnicell) của 4 loại protein trên với calciurnphorphat nhưng chủ yếu là 3 loại œsI, œs2, Ð-Cu (36) chức nãng sinh học của chúng chưa được hiểu biết
nhiều nhưng cấu trúc phân từ được nghiê cứu khá kỹ 2 Vai tro protein casein sita bo
Trong số các Cu sữa thì K-Cn được quan tim aghiéa céfu ahiéu abst vi vai trò tác dụng của nó K-Cn duy trì tính ổn định của các hạt mixen, ngân ngừa sự kết tha của các Cu sữa khác Cùng với K-Cu, các Ca nhạy cảm với calcium là nguồn dinh dưỡng giàu axitamia, protein va đặc biệt là nguồn nguyên liệu chính cho công nghiệp phoma (36)
Nhóm thứ 2 gồm (s-La, B-Lg) là hai protein nước sữa chính của bò Trong đó (œ- 1a) là các protein có cấu trúc bậc 4, hình cầu nhưng [ai dé bị biến tính dưới tác động của nhiệt Cấu trác phân từ của œ-la là một chuỗi peptid gồm 123 acid amin véi 4 cầu đisutfit La là một trong hai tiểu đơn vị tham gia vào quá tành tổng hợp Lactose, trong sữa o-Ta được tiết ra với nơng độ Í,2 mg/ml
Cấu trúc B-Lg A dang dimer gém 162 acid amin, chứa 2 cầu disulfid va mot nhóm SH-tự do gắn ở vị tí 121 Những nghiên cứu gần đây cho thấy, B-Lg thuge vé nhóm proteia có khả năng vận chuyển những phân từ ky nước nhỏ như (cetinol), có vai trồ trong việc sử dụng và vận chuyển vitamin À ở bê non (35)
Ngoài ra trong sữa bò còn tìm thấy một số proteia khác có hèm lượng nhỏ hơn: ysozym, lactoperoxidase, lactoferin, xanthiaoxidase, các globulin rniễn dịch Cho đến nay, gen cấu trúc protein sữa chính của bò đã được nhân dòng và phân tích trình tự
Gen ma hod Kappa - casein (K-Cn) va Plactoglobulin (P-Lg) sữa bò được tập trung nghiên cứu nhiều vì mmang tính điều hoà cao với lứa tuổi, giới tính và mô đặc hiệu và có ảnh hưởng chính đếu sản phẩm sữa và phornat Các geu khác nhau của protein sữa trong bò sữa có ảnh hưởng quan trọng trong thành phần và khả nãng tạo sữa (Grosclaude,L988).Trong số các gen Cu và P-Lg protein sữa kích thước của các đơn vị sao chép ( transcriptioa unit) rất khác nhau Chúng có độ lớn khoảng 8,5- 18,5 kb chứa tir 4- 18 iateon
Vai trò của các biến thể di truyền của geu protein sữa như (K-Cn ), (B-Lg) dirge đặc biệt quan tam
Trang 26sữa cao hơn alen A, tần số alen B ở bò đực là 10,5%, ở các bò đực có kiểu gen AB có khả năng di truyền về khả năng sản suất protein, mé sữa, nâng suất sữa cao hơn kiểu geu AA + Medrano và Codova Calfornia.L990, đã phâu tích bằng kỹ thuật PCR và RELPs cất bằng HaeIII Xác định được độ đài đoạn geu P-Lactoglobulin là 248 bp gồm 2kiểu alen B-LgA vap-Lg B Cét ö 3 vị trí là 148, 99 và 74 bp Có 3 kiểu geu AA cất ở 2 điểm 148 và 99 bp, kiểu gen AB cất & 3 vị trí là 148,99,74, kiểu geu BB cất ở 2vị trí 99 và 74
Gen œs-cascin và gen đŠ;- Ch
+Gen as,-casein va gen oS, -Ca là2 trong 4 casin có trong sữa bò Gen œ5, -Cn là một trong những caseia được phosphodil hoá cao nhất, cho tới 13 nhóm photphất có trong gen œ8; - Ca của bò Gen 25, - Cu có kích thước 1,3 kb và gồm 4 biếu thể, đó là những biến thể A, B, C, D, Hàng loạt các công trình công tảnh nghiên cứu vẻ ảnh hưởng, của các biến thể di truyền của gen œs¡- caseia và œ5; - C lên năng suất sữa, thành phần hoá học cùng các tính chất hoá lý, các chỉ tiêu công nghệ trong sản suất phó mnất từ sữa bò đã xuất
Hầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng, œ- casein được sử dụng như những chỉ thị chọn lọc phân từ bổ sung để kiểm tra, đánh giá chất lượng giống trong, công tác lai tạo bò và đẻ sữa
Gen md hod Prolactin
Đrolactia của các động vật có vú là một trong những hocmone đa chức tãng được sản xuất chủ yếu bởi hai loại tế bào ưa acid (somatoteop và maamrmotrop) của thuỳ trước tuyến yên Cùng với GH, TSH, ESH, LH và ACTH, PRL (Prolactia) tuyến yêu có tác dụng kích thích các tuyến khác sản xuất hocmone hoặc điều hoà các cơ quau dích Ngoài ra PRL cũng được tổng hợp bởi một số cơ quan khác như các tế bào màng rụng nhau thai, nội trạc từ cung, cơ và tế bào sợi từ cung Cho đến nay, hơn 100 chức nãng của PRL đã được phát hiện Trong đó, vai trò chủ yếu của PRL là kích thích quá tảnh sản xuất sữa của tuyến vú và điều hoà quá trình tiết các hormoae sinh dục của buồng trứng và tỉnh hoàn Vì vậy, PRL có ý nghữa vô cùng quan trọng đối với quá trình sinh sảu và được coi là một trong những homnone nội tiết chính
Cấu trúc bậc một của proteia PRL lầu đầu tiêu được xác định vào uãm 1970 ở cừu (Liet al., 1970) Cho 16i nay, trình tự amino acid hoàn chỉnh của PRL ở trên 25 loài đã đuợc xác định PRL của hầu hết các động vật có vú bao gồm một chuỗi don amino acid gồm 197-199 gốc Trong đó, 32 gốc được xác định là có mức độ bảo thù cao giữa các loài Các gốc này được chia thành 4 dornaia khác biệt: PDI-PD4 Các domain này hình thành các cụrn biệt hoá liên kết với thụ thể nằm trên màng tế bào đích và do vậy đóng vai ted quan trọng trong hoạt tính của PRL
Nam 1984, nhà nghiên cứu Camper SA đã có công tình nghiên cứu về gen Prolactin & bd Tiếp đến vào những nãm 1987, (989 và 200L đã có nhiều nhà khoa học
Trang 27trên thế
Prolactin dong vai trò nâng cao chất lượng và nâng suất sữa ở bò Sử dụng kỹ thuật Di
¡ mnở rộng nghiêu cứu về geu này Qua đó, các tác giả đều công nhậu rằng gen truyền phân từ để xác định gen Prolactin là gen ầm trong nhóm gen điểu khiển tính trạng năng suất và chất lượng sữa bò đã được áp dụng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới Các ge liên quan đến tính trạng năng suất và chất lượng sữa ö bò sữa đã được phân lập, mã hố và cơng bố tại ngân hàng gen thế giới từ nâm [ 993-1998
Cụ thể, ð bò, gen mã hoá PRL được xác định nằm trên NST số 23 trong khi ở người là NST so 6 (Creighton ¢t zi., 1992) Đó là một geu đơn có chiều dài 9388 bp, bao gồm 5 exon và 4 intron (Cao et al., 2002) PRI cita bd durge tiết ra dưới dạng protein tiển honnone với chuỗi peptide tía hiệu gồm 30 amino acid Chudi peptide trưởng thành có chiều đài 199 amiao acid Cấu trúc bậc rnột của PRL có độ tương đồng cao so với GH và PL (Prolactin Lactogen) Cấu trúc không gian ba chiều của PRL bò chưa được xác định Tuy nhiên, dựa trên cấu trúc không giau ba chiều của GH, Goffia và cộng sự đã xây dựng mnô hình cấu trúc không gian ba chiều của PRL (Sinha, 1995) Theo mô hình này, PRL bò bao gồm 4 xoắn œ có chiều ngược nhau tạo nên một cuộn xoắn Vị trí liên kết thụ thể được xác định âm trên cùng một phía của protein
Tính đa hình của PRL đã được khảo sát ở cả 4 thành viên trong họ gen này (PRPI, PRP3, PRP6, aud PRPI0) RELP được thực hiện với céc dong bd Bos indicus, Bos taucus và Holsgeins của Mỹ cho thấy có sự khác biệt đáng kể khi xử lý các geu này bằng enzyme han ché MspI, trong khi đốt véi BamHI thì không thấy có khác biệt ào Xử lý bằng EcoRI, HindIII, Taql, và Pstl ciing tạo ma một số khác biệt nhỏ (Dietz et al., 1992)
T.KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐA HÌNH CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN
TINH TRANG SUA
1 Xác định cấu trúc, đa hình gen Kappa-Casein-(K-cn) 1.1 Phương pháp thu thập và bảo quần mẫu
Như đã tình bày ở Chương I
1.2 Phương pháp tách chiết và tỉnh sạch ADN hệ gen Như đã tình bày ở Chương I
Ảnh kết quả tách chiết ADN tổng số từ các mẫu nghiên cứu
Trang 281.3 Phương phap nhan gen PCR
Sử dụng cập
Mỗi xuôi: 5 GTGCTGAGATGGTATCCTAG 3
Môi ngược: 5 GTAGAGTGGATCAACACTGG 3*để nhân lên đoạn gen Kappa-Casin có kích thước 874bp
Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25ul bao gồm 2,5u( đÑTPs 2mM; 2,5uL Buffer I0X; I0pM mỗi loại môi; 2 unit Taq poymerase; khoảng 100 ng ADN Ảnh kết quả nhân gen Kappa-Casein Chu trình tối ưu nhiệt của phản ứng PCR như sau:
Thời gian — | Nhiệt độ Chu ky Giai đoạn tiên biến tính | 5 phút 94°C 1 Giai đoạn chính -_ Biếntính 1 phút 94°C - Gao mii 1 phút 55°C 30 - Kéo đầL 1 phút RC Giai đoạn kết thúc 7 phút TRC 1
1⁄4 Phương pháp cất gen bằng kỹ thuật RELP
Sản phẩm PCR được cất bang enzyme giới han HindIII
Thành phần phẫu ứng với tổng thể tích 25 uL bao gồm: 15ul sản phẩm PCR; 2,5ul Buffer; 5 uait HiadII, Sau đó ù hỗn hợp phản ứng qua đêm ö 37C
1.5 Điện di kiém tra kết quả
Sản phẩm phân ứng RELP được điện di trên thạch agarose 2% Hiệu điện thế 100V trong thời gian 30 phút Sau đó nhuộm với Ethidium Brornide 10% trong 30 phút và đọc kết quả dưới đèn từ ngoạiUV
Trang 29Kiểu gen AA cho 1 bãng với kích thước: 874bp
Kiểu gen AB cho 3 bảng với kích thước: 874bp, 521 bp và 353bp Kiểu gen BB cho 2 bãng với kích thước: 521 bp và 353bp
1.6 Phương pháp giải trình tự gen
Tảnh tự của các đoạn gen được xác định trên ruáy tự động ABIPRISMP 3100 Avant Genetic Analyzer bằng cách sử dụng Bộ hóa chất sinh chuẩn BigDye” Terrninator v3.L Cycle Sequencing
Thành phần của phản ứng PCR đọc trình tự gồm: 3,2 pM môi, 200 ag DNA plasmid, BigDye, đệm tương ứng trong tổng thể tích L5 ki với chu trình nhiệt trên rnấy luân nhiệt GenA mp” PCR System 9700 như sau: 96°C - 1 phút; (96°C - 10 giây, 50°C - 5 giay, 60°C - 4 phút) x 25 chu kỳ; giữ ở 4°C
Sản phẩm PCR được tỉnh sạch bằng phương pháp tùa EIOH/EDTA: bổ sung 5 yl EDTA 125 mM và 60 wl EtOH 100%; để ở nhiệt độ phòng trong L5 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu các đoạn DNA có trong đó, loại bò EIOB; bỏ sung 60 ul E1OH 70%; ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Làm khô kết từa DNA, bổ sung 10 il Hi-Di Formamide va bien tiah tại 95'C trong 5 phút Các mẫu được cho vào các giếng
của khay đựng mẫu sau đó điện dĩ trong ống vi mmao quản 80 cm x 50 turn có chứa POP- 4
Tein ty nucleotide của mỗi rnẫu được xác định từ cả 2 chiều xuôi và ngược, được xử lý bằng các phần mém ABI PRISM® 3100-Avaat Data Collection v1.0 va DNA Sequencing Analysis
Sử dụng phương pháp nhân geu PCR, sau đó sản phẩm PCR được tỉnh sạch và biến nạp vào tế bào E,Coli và sử dụng máy giải trình tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzec, chúng tôi đã xác định được trình tự đoạu gen Kappa Casein ở một số giống bò HE, El Các thông số vẻ trình tự aucleotide và chất lượng đỉnh (peak) thu được được phân tích và kiểm định bằng các phầu mềm ABI Data Collection va ABI SeqScape v.2.0 Tất cả các đoạn gen CNS3 phân tích đã được ngân hàng dữ liệu gen quốc tế công nhận bản quyển và đã được so sánh với trình tự gen Kappa-casein chuẩn công bố trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế ngày l6 tháng 3 năm 1989 của tác giả Mackilay AG (mã số dang ky X14908)
Chúng tôi có một kết quả đạc trình tự này như sau:
a Đoạn gen Kappa Casin nghiêu cứu có độ dài 874bp bao gồm exon 4 (vùng mã hoá) va intron 5 (vùng không rrã hoá)
6 Trong hai mẫu bò Cóc số 14 và 18 tương ứng với mã số đãng ký AI84194I và A]849456 xuất hiện:
Trang 30Đa hình A353C khiến enzym HindIII abin biet và cất tại vị trí 350 tạo thành kiểu allen đột biếu B Đột biếu này đẫn đến sự thay đổi trình tự bộ ba mã hoá GAT (mã
hoá axit amia Asparic) thành GCT (mã hoá axit amia Alania)
- _ Đa hình A414G làm thay đổi vị trí cất của ezym PsI Đột biếu này không làm thay đổi trình tự axit amin mà geu mã hoá
-_ Đột biếu mất IG tại vị trí 464 Tuy nhiên đột biến này không làm thay đổi trình tự axit amin vi vi tei đột biến thuộc vùng iniron 5
c Trong các mẫu bò Cóc số l7 (mã số đãng ký AJ841942), bò HE số 318 (mã số đăng ký A1841946) và mẫu bò EL số 160 (mã số đãng ký AJ84 1944):
-_ Không có đột biến A353C vì vậy enzym AindIIT khong cét trình tự tại vị tá 350 Được xác định là alen A bình thường
- 2 mẫu bò I60EL và 3I§HF xuất hiện đa hình A414G làm thay đổi vị trí cất của enzym PsiL Tuy nhiên, đột biếu này không làm thay đổi trình tự axit amin mà gen xã hoá Trong khi đó, mẫu bò số [7 không mang đột biến này
-_ Đột biếu mất IG tại vị tá 464 Tuy nhiên đột biến này không làm thay đổi trình tự axit amin vi vi trí đột biến thuộc vùng iniroa 5
d Mẫu bò EL số 22 (mã số đăng ký AJ841943) và mẫu bò HE số 315 (mã số đãng ký AI841945)
- Không xuất hiện đa hình A353C Đây là allen A bình thường
- _ Không xuất hiện da hình A414G, không làmthay đổi vị trí cất của euzym Pel
= Dot bien mat 1 G tại vị trí 464 Tuy nhiên đột biến này không làm thay đổi trình tự axit amia vi vi trí đột biến thuộc vùng iniron 5
Điều này có thể cho rằng có xuất hiện đột biến thay thế nueleotide trên trình tự gen K-cn dẫn đến thay sự thay đổi trình tự axit amin và sự đa hình kiểu gen Chính điều này đã ảnh hưởng tới nãng suất cũng như chất lượng sữa của các giống bò khác nhau nuôi tại
Việt nam
1.7 Đăng ký bân quyên trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế EMBL
Tảnh tự các đoạn gen đặc trưng đã được đang ký trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế
EMBL theo dia chi bitp://www.ebiac.uk/services/index.timl (submission EMBL via
Webia)
Mã số các đoạn gen này được công nhận trên ngdn hang dit liéu gen Quoc t&
AJ841941, AJ849456, AJ84 1942, AJ841944, AT841946 , AT841943 , AT841945
Trang 31
\ a i hat lữ Hn \ìubillyÐ LAI ¡II th lh eval Kq giải trình tạ gón Kapps \ sulla, Ì
Ảnh kết quả xác định trình tự gen Kappa-Casein
2 Xác định cấu trúc, đa hình gen Beta Lactoglobulin 2.1 Phương pháp thu thập và bảo quần mẫu
Như đã tình bày ở Chương I
2.2 Phương pháp tách chiết và tỉnh sạch ADN hệ gen Như đã trình bày ở Chương I
2.3 Phương pháp nhân gen PCR Sử dụng cập môi:
L3: 5° TAC GCT GGA CÁC CGA CTA CAA AAAG 3°
Trang 32BLA: 5’ GCT CTT GGT ATA TGA CCA CCC TCT 3°4é nhân đoạn gea Beta 1aetoglobulin có kích thước 247bp
Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25ul bao gồm 2,5ul dNTPs 2mM; 2,5ul Buffec 10X; 10pM mii loại méi; 2 unit Taq polymerase; khoảng 100 ng ADN Chư tảnh nhiệt của phản ứng ĐCR như sau:
Thời gan — [Nhiệt độ Chu ky Giai đoạn tiên biến tính | 5 phút 94°C 1 Giai đoạn chính - Biếntính 30 giây 94°C - Gấn mỏi 40 giây 55C 30 -— Kéo đài 30 giây 7C Giai đoạn kết thúc 7 phút TRC 1
Ảnh kết quả nhân gen Beta Lactoglobulin
2.4 Phương pháp cắt gen bằng kỹ thuật RELP
Sản phẩm PCR được cất bằng enzyme giới hạn HaeTIL
Thành phần phẫu ứng với tổng thể tích 25 uL bao gồm: 15ul sản phẩm PCR; 2,5ul Buffer; 5 wait HaelIL Sau đó ù hỗn hợp phản ứng qua đêm ở 372C
2.5 Điện di kiểm tra két quả
Sản phẩm phân ứng RELP được điện di trên thạch agarose 3% Hiệu điện thế 100V trong thời gian 45 phút Sau đó nhuộm với Ethidium Brornide 10% trong 30 phút và doc ket quả dưới đèn từ ngoạiUV
Kết quả cho thấy:
Kiểu gen AA cho 2 bãng với kích thước: 148bp và 99bp
Kiểu gen AB cho 3 bảng với kích thước: L48bp, 99bp và 74bp Kiểu gen BB cho 2 bãng với kích thước: 99bp và 74bp
Ảnh kết quả cất gen Beta Lactoglobulin bing enzyme Healll
Trang 33
2.6.Phương pháp giải trình tự gen
Tảnh tự của các đoạn gen được xác định trên rráy tự động ABIPRISMP 3100 Avant Genetic Analyzer bằng cách sử dụng Bộ hóa chất sinh chuẩn BigDye” Terrninator v3.L Cycle Sequencing
Thành phần của phản ứng PCR đọc trình tự gồm: 3,2 pM môi, 200 ag DNA plasmid, BigDye, đệm tương ứng trong tổng thể tích 15 jl voi chu trình nhiệt trên rnấy luân nhiệt GenAmp” PCR System 9700 như sau: 96°C - 1 phút; (96°C - 10 giây, 50°C - 5 giay, 60°C - 4 phút) x 25 chu kỳ; giữ ở 49C
Sản phẩm PCR được tỉnh sạch bằng phương pháp tùa EIOH/EDTA: bổ sung 5 ụÍ EDTA 125 mM và 60 ul EtOH 100%; để ở nhiệt độ phòng trong L5 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu các đoạn DNA có trong đó, loại bò EIOB; bỏ sung 60 ul EIOH 70%; ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Làm khô kết từa DNA, bổ sung 10 ul Hi-Di Formamide va bien tiah tại 95'C trong 5 phút Các mẫu được cho vào các giếng của khay dựng mẫu sau đó điện dĩ trong ống vi mmao quản 80 cm x 50 turn có chứa POP- 4
Tảnh tự nucleotide của rỗi mrẫu được xác định từ cả 2 chiều xuôi và ngược, được xử lý bằng các phần mẻm ABI PRISMP 3100-Avanr Data Collection vI.0 và DNA Sequencing Analysis
Sử dụng phương pháp nhâu geu PCR, sau đó sản phẩm PCR được tỉnh sạch, được biến nạp vào tế bào E.Coli và sử dụng máy giải tành tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, chúng tôi đã xác định được tảnh tự đoạn gen Beia-Lacoglobulin ở một số giống bò HE, EL nuôi tại Việt am Các thông số về trình tự aucleotide và chất lượng đỉnh (peak) thu được được phâu tích và kiểm định bằng céc phin mim ABI Data Collection va ABI SeqScape v.2.0 Tat c& céc doan gea BLg phân tích đã được so sánh với trình tự geu Beta-Lacoglobulin chuẩn công bố trêu ngân hàng dữ liệu gen quốc tế ngày 15 tháng 2 năm 1995 của tác giả Hynineu TM và cộng sự (mã số đãng ky 248305)
Trang 34weststo Pests i St ig 130620 ABI: PROM este 3U Ul Phong DTPT-VCN Kt giai trinh iu gen Beia-Lactoglobulin
Ảnh kết quả giải trinh ne gen Beta-Lactoglobulin
'Từ kết quả đọc trình tự này, chúng tôi có một số kết luận sau:
a Đoạn gen B-Lg nghiên cứu có độ đài 247 bp thuộc exon 4 và intron 4
b Không thấy xuất hiện đột biến điểm trong các mẫu bò được xác định là mang kiểu geu AA Điêu này hoàn oàu phù hợp với lý thuyết Tuy nhiên, trong bai mẫu bò HE và EI mang kiểu gen AA nghiên cứu , chúng tôi thấy xuất hiện độ biếu chèn thêm Í aucleotide A vào vị trí 46 Điều này rất quan trọng vì nếu đột biếu này là có thực thì sẽ ảnh hưởng rất lớu tối sự biểu hiệu gen BLg (do vị trí 46 nằm trong vùng mã hoá - exoa 4) Do vậy, để có thể khẳng định có hay không đột biến này, chúng tôi cầu thêm mẫu, cũng như thời gian để nghiên cứu
Tiêu những mẫu bò mang kiểu geu BB, chúng tôi thấy xuất hiện đột biến T74C Đa hình này đã khiếu eazyme HaeTH nhận biết và cất tại vị trí 74 tạo ra kiểu gen độ biến BB, Đột biến này cũng làm thay đổi axit amin Valine (do bộ ba GTC mã hoá) thành Alanine (do bộ ba GCC mã hoá), Chúng tôi cho rằng, có thể chính sự thay đổi này đã ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và chất lượng sữa ở bò nuôi hướng sữa Không thấy xuất hiện đột biến chèn thêm Í nucleotide A ở vị trí 46 như ở những mẫu rnang kiểu geu ÀA
Trang 353 Xaic dinh da hinh gen Prolactin (PRL) 3.1 Phương pháp thu thập và bảo quần mẫu
Như đã tình bày ở Chương I
3.2 Phương pháp tách chiết và tình sạch ADN hệ gen Như đã tình bày ở Chương I
3.3.Phương pháp nhân gen PCR Sử dụng cập môi:
Mỗi xuôi: 5' CCAAATCCTCTGAATTATGCTT 3' Mỗi ngược: 5' ACAGAAATCAGATCTCTCATTCA 3' để nhân lên đoạn gen Prolactin có kích thước 294bp
Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25ul bao gồm 2,5ul đÑTPs 2mM; 2,5uL Buffer L0X; I0pM mỗi loại môi; 2 uait Taq polymerase; khoảng 100 ng ADN
Chu trình nhiệt của phản ứug PCR như sau:
Thời gian | Nhiệt độ Chu kỳ Giai đoạn tiên biến tính | 5 phút 94°C 1 Giai đoạn chính -_ Biến tính 30 giây 94°C -_ Gần mỗi 30 giây 5C 30 -_ Kéo đài 30 giây TC Giai doạn kết thúc 7 phút TC 1
Ảnh kết quả nhân gen Prolactin
3.4 Phương pháp cất gen bằng kỹ thuật RFLP Sản phẩm PCR được cất bằng enzyme giới hạn Real
Thành phần phẫu ứng với tổng thể tích 25 uL bao gồm: 15ul sản phẩm PCR; 2,5ul Buffer; 5 uait enzyme giới hạn Sau đó Ì hỗn hợp phản ứng qua đêm ở 3C
3 S Điện di kiểm tra kết quả
Sản phẩm phản ứng RELP được điện di trêu thạch agarose 2,5% Hiệu điện thể 100V trong thời gian 25 phút Sau đó nhuộm với Ethidium Bromide 10% trong 30 phút và đọc kết quả dưới đèn từ ngoạiUV
Trang 36Ảnh kết quả cất sản phẩm PCR gen Prolacbn_ bằng Rsal
Kiểu gen GG: I bãng 294bp
Kiểu gea GA: 3 bag 294bp, 162bp và 132bp Kiểu gen AA: 2 bang 162bp va 132bp
4 Xác định đa hình gen Alpha S1-Casein (aS1-Cn) 4.1 Phương pháp thu thập và bảo quần mẫu
Như đã tình bày ở Chương I
4.2 Phương pháp tách chiết và tình sạch ADN hệ gen Như đã tình bày ở Chương I
4.3 Phương pháp nhân gen PCR
Sự đa hình của đoạu gen này được xác định bởi 2 cập môi đặc biệt được thiết kế để nhân lên2 alen B và C
Phân ứng nhân gen PCR và xác định đa hình gen Anpha SI-Casein Sử dụng cập môi đặc hiệu:
Môi xuôi: 5’ TGTGTATTAAATTGAGCCAC 3” Môi ngược: 5 TGATTTCTCCATTCGTCACC 3 để nhân lên alen B có kích thước 87bp và cập mỏi đặc hiệu:
Môi xuôi: 5 TGTGTATTCTCTTGAGCCAC 3” Mỗi ngược: 5 TGATTTCTCCATTGCTCATC 3' để nhân lên alen C có kích thước 87bp
Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25ul bao gồm 2,5ul dNTPs 2mM; 2,5ul Buffer 10X; 10pM mỗi loại mồi; 2 uait Taq poymerase; khoảng 100 ng ADN
Chu trình nhiệt của phản ứug PCR như sau:
Trang 37Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên thach agarose 3% Higu diga th 100V trong thời gian 45 phút Sau đó nhuộm với Eihidium Brornide 10% trong 30 phút và đọc kết quả dưới đèn từ ngoạiUV
Ảnh kết quả nhén doan gen 87 bp gen oS)-ca sein
Be BC i
a eae ar
Kết quả cho thấy
Đối với từng mẫu riêng biệt, ta chạy 2 phản ứng PCR để nhân đặc hiệu 2 alen B và C Sau đồ chạy điện di trên 2 đường chạy
- Kiểu ge BC: xuất hiệu cả 2 bãng có kích thước 87bp trên 2 đường chạy điện di - Kiểu geu BB: xuất higa 1 bang có kích thước 87bp trên đường chạy của alen B - Kiểu geu CC: xuất higa 1 bang có kích thước 87bp trên đường chạy của alen C 5 Xác định cấu trúc, đa hình gen Anpha S2-Casein
5.1 Phương pháp thu thập và bảo quần mẫu Như đã tình bày ở Chương I
5.2 Phương pháp tách chiết và tình sạch ADN hệ gen Như đã tình bày ở Chương I
5.3 Phương pháp nhân gen PCR Sử dụng cập mỗi:
Môi xuôi: 5 TGTGTATTCTTGGGAGCCAC 3' Mỗi ngược: # TGATTTCTCTACTGCTCACC 3
để nhân lên đoạn gen Anpha S2-Casein có kích thước 395bp
Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25ul bao gồm 2,5ul đÑTPs 2mM; 2,5uL Buffer 10X; 10pM mỗi loại mồi; 2 uait Taq polymerase; khoảng 100 ng ADN
Chu trình nhiệt của phản ứug PCR như sau:
Trang 38
Error S==eeeeeee
5.4 Phương pháp cất gen bằng kỹ thuật RELP
Sản phẩm PCR được cất bằng enzyme giới hạn Mail (đối với môi cap As2-1 va As2-2) và enzyrm giới hạn MseT (đối với mi cap As2-3 va As2-4)
Thành phần phẫu ứng với tổng thể tích 25 uL bao gồm: 15ul sản phẩm PCR; 2,5ul Buffer; 5 uait enzyme Sau đó ù hỗn hợp phân ứng qua đêm ở 32C
5.5 Điện di kiểm tra lết quả
Sản phẩm phản ứng RELP được điện di trêu thạch agarose 2,5% Hiệu điện thể 100V trong thời gian 35 phút Sau đó nhuộm với Ethidiun Bromide 10% trong 30 phút và đọc kết quả dưới đèn từ ngoạiUV
Ảnh kết quả cất doan gen oS2-casein béng enzym MnL I
2820p
Kiểu gea DD cho 1 bang véi kích thước: 395bp
Kiểu gen AD cho 3 bãng với kích thước: 395bp, 282bp va L13bp Kiểu gen AA cho 2 băng với kích thước: 282bp và LI3bp
5.6 Phương pháp giải trình tự gen
Trang 39Tảnh tự của các doan gea duye xic dinh cea méy we dong ABI PRISM® 3100 Avaat Genetic Analyzer bằng cách sử dụng Bộ hóa chất sinh chuẩn BigDye” Terrninatoc v3.L Cycle Sequencing
Thành phần của phản ứng PCR đọc trình tự gồm: 3,2 pM môi, 200 ag DNA plasmid, BigDye, đệm tương ứng trong tổng thể tích 15 jl voi chu trình nhiệt trên rnấy luân nhiệt GenAmp® PCR System 9700 abur sau: 96°C - 1 phút; (96°C - 10 giây, 50°C - 5 giay, 60°C - 4 phút) x 25 chu kỳ; giữ ở 4°C
Sản phẩm PCR được tỉnh sạch bằng phương pháp tùa EIOH/EDTA: bổ sung 5 yl EDTA 125 mM va 60 wl EtOH 100%; để ở nhiệt độ phòng trong L5 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu các đoạn DNA có trong đó, loại bò EIOH; bỏ sung 60 il E1OH 70%; ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Làm khô kết từa DNA, bổ sung 10 0L Hi-Di Formamide va bien tiah tại 95'C trong 5 phút Các mẫu được cho vào các giếng
của khay đựng mẫu sau đó điện dĩ trong ống vi mmao quản 80 cm x 50 turn có chứa POP- 4
Trinh tự nucleotide của rỗi mrẫu được xác định từ cả 2 chiều xuôi và ngược, được xử lý bằng các phần muẻm ABI PRISMP 3100-Avanr Data Collection vI.0 và DNA Sequencing Analysis
Chúng tôi sử dụng cap mdi dic hiệu để nhân đoạu gen œS;-Cn bằng phương pháp nhân gen PCR, sau đó sản phẩm PCR được tỉnh sạch, được biến nạp vào tế bào E,Coli và sử dụng máy giải trình tự ABI PRISM 3100 Avamt Genetic Aualyzer, chúng tôi đã xác định được trình tự đoạn gen oS;-Cu ở một số giống bò HE, Fl, F2, Cóc Các thông số vẻ trình tự aucleotide va chất lượng đỉnh (peak) thu được được phân tích và kiểm định bằng các phần mẻm A BI Data Collection và ABI SeqScape v.2.0 Từ kết quả đọc trình tự này, chúng tôi có một số kết luận sau:
a Đối với cập môi thứ nhất, đoạn geu oŠ;-Cu được nhân lên có kích thước 395bp bao g6m intcon 7, exon 8 va intron 8 (di so sinh, doi chiếu với trình tự gen Anpha S,-
caseia công bố trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế ngày 28 tháng 10 năm [992 của tác gid Bounial C, Printz C va Mercier J C với mã số X68972)
- Ba miu bd Fl s6 22 (mi sO dang ký AJ849537), Cóc số L5 (mã số đăng ký AJ849538) va HF số 318 (mã số đãng ký AJ849539) đều có chung kiểu gen đồng, hợp AA (thé dot biến) Nguyên nhân là do xuất hiện đột biến T282G dẫn đến sự thay đổi trình tự bộ ba mã hoá GAT (mã hoá axit amin Asp) thành GAG (mã hoá axit amia Glu) Đột biến này khiến euzym MizT nhận biết và cất trình tự tại vị trí 282
b Doi với cập mổi thứ hai, đoạn gen oŠ;-Cn được nhân lên có kích thước 1300p Sau khi so sánh với trình tự gen œŠ;-Cu mà tác giả Groenen MA đã công bố trên ngân
Trang 40
tàng dữ liệu gen quốc tế nãm 1993 với mã số M94327, chúng tôi thấy rằng trình tự aucleotide đoạn gen œ5,-Cu từ bò HE thuần có độ tương đồng 100%, trong khi đó ö bò lai 1/2 máu HE và bò lai 3/4 máu HE nuôi tại Việt am có độ tương đồng rất cao, tương ứng là 99,9976% va 99,9992%
Từ kết quả so sánh tảnh tự nucleotide trên, chúng tôi khẳng định đoạn gen được nhân lên chính là gen oS;-Cn Sự khác nhau tại một số vị trí trong trình tự có thể là kết quả của các biến thể theo vùng địa lý, đồng thời có thể phụ thuộc vào các giống bò khác nhau Day là một trong những công tảnh đâu tiên rrở đầu cho việc xác định đa dạng di truyền kiểu gen œ5;-Cu ở bò sữa nuôi tại Việt nam,
S.7 Đăng ký bắn quyên trên ngân hàng đữ liệu gen quốc tế EMBL
Tình tự các đoạn gen đặc trưng đã được đang ký trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế
EMBL theo dia chi buip://www.ebiac.uk/services/index.timl (submission EMBL via
Webia)
Bản quyền được chấp nhận trên ngân hang gen quéc té wwew.ncbi.nlm.nih.gov