LLuận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Nghiên cứu thành phần hạt Citrus

Từ kết quả phân tích LC-MS, đã nhận danh được 7 hợp chất limonoid trong dịch chiết hạt bưởi, bao gồm limonoate A-ring lactone, nomilinoate A-ring lactone, limonin, nomilin, nomilin

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DPPH: 2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl LC-MS: Sắc kí lỏng ghép khối phổ

GAE: gallic acid equivalent BHT: 3,5-Di-tert-4-butylhydroxytoluene MeOH: Methanol

GIỚI THIỆU CHƯƠNG 1

Quả chi Citrus thuộc họ Rutaceae, bao gồm nhiều loại quả như cam, chanh, quít, bưởi,…chứa nhiều thành phần dinh dưỡng như vitamin C, folic acid, potassium, flavonoid, carotenoid, limonoid, pectin và chất xơ Nước ta là một quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới nên sản lượng trái cây tương đối cao, đặc biệt là các loại quả thuộc chi Citrus

Các quả này được sử dụng dưới dạng ăn tươi hoặc sản xuất nước ép Trong quá trình sản xuất nước ép ở qui mô công nghiệp, phần bỏ đi từ quá trình này bao gồm vỏ, hạt và thịt quả (chiếm khoảng 45-58% nguyên liệu) là một sự lãng phí và tăng ô nhiễm môi trường

Thành phần của hạt Citrus chứa những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học như limonoid và hợp chất phenolic cải thiện sức khỏe con người như chống oxi hóa, kháng ung thư, làm giảm cholesterol, chống vi rút, kháng nấm và kháng khuẩn…được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, dược liệu và mỹ phẩm Vì thế, có rất nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về hạt Citrus Ở nước ta, nghiên cứu về hạt của quả Citrus bắt đầu từ những năm 90, nhưng chủ yếu về tách chiết và phân tích cấu trúc của các limonoid Trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung phân tích các thành phần dịch chiết của hạt Citrus Đồng thời hạt Citrus chứa một lượng dầu đáng kể, chúng tôi cũng phân tích thành phần của dầu hạt- góp phần nâng cao giá trị của nguồn phế liệu rẻ là hạt Citrus và đồng thời làm giảm lượng thải ra môi trường

Nội dung chính của luận văn này:

- Tách chiết những hợp chất tự nhiên từ hạt của một số giống Citrus, phân tích thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết hạt citrus

- Sử dụng 2 phương pháp: Phương pháp ép cơ học và phương pháp trích ly dung môi để thu được dầu hạt Citrus Phân tích thành phần của dầu hạt và đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của dầu hạt

PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

- Hạt cam Sành (Trà Vinh) - Bưởi Da Xanh (Đồng Nai) - Bưởi Đường Hồng (Đồng Nai) - Bưởi Dây (Bình Dương)

- Methanol, acetonitrile, ethanol, acid formic, Na 2 CO 3 (Merck) - Thuốc thử Folin-Ciocalteu, acid gallic, 3,5-Di-tert-4-butylhydroxytoluene (BHT),

2,2 Diphenyl-1-picryl-hydrazil radical (DPPH) (Sigma)

Dụng cụ và thiết bị

Bảng: Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

- Pipet - Đầu típ - Ống li tâm - Lọc 0.45àm

- Máy ép cơ học - Máy chiết Soxhlet - Máy xay mẫu - Cân phân tích - Máy đo quang UV-Vis - Máy li tâm

- Bể siêu âm - Máy sắc kí LC-MS

 Máy ép cơ học vận hành bằng tay và liên tục Có thể sử dụng với hạt có hàm lượng béo lớn hơn 25% Trọng lượng của máy 2.3 Kg

 Máy siêu âm Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thiết bị siêu âm Elmasonic S 100/(H), với thông số kĩ thuật cho ở bảng

Kích thước Công suất Thể tích tối đa Tần số siêu âm

Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực (Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS) bao gồm hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao LC1200, cột Apollo (C8, 4.6ì150mm, 5àm) và đõ̀u dũ khụ́i phụ̉ ba tứ cực với kiờ̉u ESI

Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Định tính các hợp chất flavonoid trong dịch chiết

- Tác dụng của FeCl 3 : Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu

3.2.2 Phương pháp trích ly các hợp chất tự nhiên:

 Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp trích ly dung môi có hỗ trợ sóng siêu âm để trích ly các hợp chất tự nhiên từ hạt citrus

 Ngoài ra, chúng tôi còn sử dụng phương pháp trích ly dung môi (Soxhlet) và phương pháp ép cơ học để thu được dầu hạt citrus

3.2.3 Phương pháp phân tích thành phần phenolic từ hạt Citrus

3.2.3.1 Phương pháp so màu Folin-Ciocalteu

Xác định hàm lượng phenolic tổng bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu

- Hợp chất phenolic bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin-Ciocalteu tạo thành hợp chất có màu xanh

- Thuốc thử Folin-Ciocalteu - Dung dịch Natri carbonate - Dung dịch chuẩn acid gallic: xây dựng dung dịch chuẩn có nồng độ 5, 10, 15,

 Xây dựng đường chuẩn:

52 - Pha các dung dịch chuẩn từ dung dịch gốc 500 ppm của acid gallic (0.05g định mức thành 100 ml) thành các dung dịch lần lượt có nồng độ xác định: 20, 40, 60, 80, 100 ppm tức là lấy từ dung dịch chuẩn gốc lần lượt các thể tích 2, 4, 6, 8, 10 ml định mức đến 50 ml bằng nước cất

- Natri carbonate rắn được hòa tan thành dung dịch có nồng độ 1M (lấy 26.5g natri carbonate hòa tan và định mức bằng nước cất trong bình 250 ml)

- Folin-Ciocalteu được pha loãng thành dung dịch 10% (1ml định mức thành 10 ml)

- Lấy 1 ml các dung dịch chuẩn tác dụng với 5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu, thêm 4ml Na 2 CO 3 , trộn đều hỗn hợp

- Sau 1 giờ, xác định độ hấp thu A ở bước sóng 750 nm

- Dựng đường chuẩn độ hấp thu A theo mg acid gallic/ml (ppm)

 Đo mẫu - Dùng 1 ml mẫu, xác định độ hấp thu A tương tự như trên

- Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định được hàm lượng phenolic tổng có trong mẫu nghiên cứu

3.2.3.2 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ (LC-MS)

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Định tính

Sự di chuyển của pha động vào máy khối phổ làm tăng đường nền một cách đáng kể TIC (total ion chromatography) biểu hiện sự biến đổi theo thời gian của tổng số ion được phát hiện bởi máy khối phổ

53 Những ion với m/z nhỏ nhưng có cường độ cao sinh ra bởi kĩ thuật ion hóa mềm như phun electron, có thể được bỏ qua Hệ thống dữ liệu có thể được sử dụng để trừ phổ của nền từ sắc kí đồ của mẫu Quá trình này cần thực hiện cẩn thận để đảm bảo những ion có m/z giống nhau xuất hiện trong sắc kí đồ của mẫu và của đường nền không bị mất Đường nền xuất hiện khi hai thành phần không hòa tan hoàn toàn vào nhau và góp phần đáng kể từ khối phổ của những chất được rửa giải sớm được tìm thấy trong khối phổ của chất rửa giải sau đó Với mục đích giải thích những hợp chất có mặt trong mẫu, loại đường nền rất quan trọng Định lượng Định lượng sử dụng kĩ thuật khối phổ không khác so với định lượng của các kĩ thuật khác, liên quan đến việc so sánh cường độ tín hiệu sinh ra bởi chất phân tích trong mẫu và chuẩn của chúng với hàm lượng đã biết Để định lượng, người phân tích cần xác định diện tích hoặc chiều cao peak của chất phân tích và một vài nội chuẩn có mặt để suy ra hàm lượng chất phân tích có mặt trong mẫu

Kết quả sử dụng phổ TIC, thông số của mỗi peak bao gồm: thời gian lưu, chiều cao và diện tích của peak Với mục đích định lượng, mỗi peak được phụ thuộc bởi 2 thông số: vị trí baseline của chúng, thời gian lưu, thu được bởi hệ thống máy tính Vị trí của baseline của chúng có ảnh hưởng đáng kể đến độ chính xác và độ đúng của quá trình định lượng, khi đường baseline không nằm ngang và tín hiệu của mỗi thành phần không được phân giải hoàn toàn

Thuận lợi của máy khối phổ là khối lượng có thể sử dụng như là đặc điểm khác biệt và có thể định lượng những thành phần chưa biết

Sử dụng EIC để xác định vị trí của một hợp chất mà không được phân giải sắc kí từ những thành phần của hỗn hợp và không có mặt rõ ràng trong phổ TIC Với phổ EIC, có thể định lượng tất cả các hợp chất mặc dù với độ chính xác khác nhau

NMR và MS là 2 phương pháp được sử dụng cho việc nhận danh các hợp chất tự nhiên Việc nhận danh các hợp chất cần sử dụng phổ NMR Tuy nhiên, kĩ thuật này cần vài miligram những hợp chất đã tinh chế và luôn là thử thách để thu được lượng mẫu cao hơn Gần đây, phương pháp ESI được phát triển và sử dụng trong việc nghiên cứu các hợp chất tự nhiên Kĩ thuật ion hóa mềm, với sự phân mảnh ít, có thể được sử dụng cho việc phân tích cấu trúc Sự phân mảnh MS nhiều lần của các flavonoid và limonoid được khảo sát ở các tài liệu, cho phép nhận danh ướm thử các hợp chất chưa biết nếu thiếu chuẩn[52-54]

Mẫu được trích ly bằng dung dịch methanol 70%, sau đó dịch chiết đươc lọc qua màng lọc 0.45àm Mõ̃u cõ̀n phõn tớch sau khi được tách trong hợ̀ thụ́ng sắc ký lỏng, mõ̃u sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu ESI Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion

3.2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết

Phân từ DPPH là gốc tự do không bền ở nhiệt độ phòng, nó có thể nhận một điện tử hoặc một gốc hydro để trở thành phân tử bền, có màu tím đậm, đặc trưng bởi độ hấp thu là 515-520 nm Phương pháp quét gốc DPPH dựa vào phản ứng khử của DPPH khi trộn với chất chống oxi hóa như polyphenol, mất màu tím của chúng và làm giảm độ hấp thu của chúng ở 520 nm Phần trăm của sự quét gốc tự do DPPH được tính toán dựa vào phương trình sau đây:

Trong đó A 1 và A o là độ hấp thu ở cuối phản ứng trong dung dịch DPPH với có hoặc khụng cú dịch chiết hạt [44] Giỏ trị phõ̀n trăm ức chế DPPH tương đương với àmol trolox(BHT)/ml Để cải thiện kết quả của phương pháp này, thông số khác được thêm và: giá trị IC 50 , là lượng cơ chất gây ra ức chế 50% gốc tự do DPPH [45, 46] Mỗi mẫu được đo ở vài nồng độ và giá trị IC50 (mg/ml) được tính toán dựa vào phần trăm ức chế tương ứng [47] Cả phần trăm ức chế DPPH và giá trị IC 50 tương quan âm với nồng độ cơ chất, mức độ chống oxi hóa càng cao thì phần trăm ức chế DPPH càng cao và giá trị IC 50 càng thấp

THỰC NGHIỆM CHƯƠNG 4

Nội dung nghiên cứu

Khảo sát quá trình trích ly các hợp chất tự nhiên từ hạt với hàm mục tiêu là hàm lượng phenolic tổng

Khảo sát thành phần của dịch chiết hạt bưởi (Citrus grandis) và đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết

So sánh hàm lượng phenolic tổng, thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học và hoạt tính chống oxi hóa trong dầu hạt theo các phương pháp tách chiết khác nhau

Tiến trình thí nghiệm

Hình 4.1: Quy trình thí nghiệm đối với dầu hạt Citrus

Trích ly hợp chất phenolic từ hạt và dầu hạt Citrus

Tách lấy hạt Ép cơ học

Trích ly hợp chất phenolic

Xác định hàm lượng phenolic tổng

Phân tích thành phần bằng LC-MS Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp DPPH

Dầu hạt Citrus Phơi khô

Trích ly dung môi

58 Hình 4.2: Sơ đồ trích ly hợp chất phenolic từ hạt và dầu hạt

4.3.1 Khảo sát quá trình trích ly các hợp chất tự nhiên từ hạt Citrus

Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các hợp chất tự nhiên từ hạt Citrus với hàm mục tiêu là hàm lượng phenolic tổng

Vì lí do tiết kiệm thời gian nên chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát trên nguyên liệu là hạt cam Sành

- Dung môi trích ly - Tỉ lệ mẫu và thể tích dung môi trích ly - Thời gian siêu âm

Thêm dung môi trích ly

Xác định hàm lượng phenolic tổng Phân tích các hợp chất bằng LC-MS

4.3.1.1 Ảnh hưởng của dung môi trích ly

1 g hạt cam Sành được hòa tan trong 5 ml dung môi Thông số khảo sát, loại dung môi dùng cho quá trình trích ly hợp chất phenolic: methanol; ethanol; acetronitrile

Thông số cố định:

- Thể tích dung môi trích ly: 5 ml - Thời gian siêu âm: 5 phút Hàm mục tiêu: Hàm lượng phenolic tổng

4.3.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi và nước

1 g hạt cam Sành được hòa tan trong 5 ml các hỗn hợp dung môi Thể tích dung môi và nước sử dụng: 100%, 90%, 80%, 70%, 60%

Thông số cố định:

- Loại dung môi sử dụng: giá trị tối ưu ở phần 4.3.1.1

- Thời gian siêu âm: 5 phút Hàm mục tiêu: Hàm lượng phenolic tổng

4.3.1.3 Ảnh hưởng của khối lượng mẫu và thể tích dung môi sử dụng

1g hạt cam Sành được hòa tan trong thể tích dung môi lần lượt là: 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml

Thông số cố định:

- Loại hỗn hợp dung môi trích ly: giá trị tối ưu ở phần 4.3.1.2

- Thời gian siêu âm: 5 phút Hàm mục tiêu: Hàm lượng phenolic tổng

4.3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm

Thời gian siêu âm: từ 5 phút, 10 phút, 20 phút

Các thông số cố định:

60 - Thể tích hỗn hợp dung môi trích ly: giá trị tối ưu ở phần 4.3.1.3

- Loại dung môi trích ly: loại dung môi tối ưu ở phần 4.3.1.2

Hàm mục tiêu: Hàm lượng phenolic tổng

4.3.2 Xác định độ ẩm các loại hạt Citrus

- Cân khoảng m 0 = 5g các giống hạt đem sấy ở nhiệt độ 102-105 0 C Sau khi sấy, cân lại khối lượng m 1 Sau đó tính độ ẩm của nguyên liệu bằng công thức:

4.3.3 Xác định hàm lượng phenolic

- Cân 1g dầu hạt hoặc 1g hạt cho vào ống li tâm, sử dụng dung môi sau khi đã khảo sát để trích ly hợp chất phenolic

- Xác định hàm lượng phenolic tổng của dịch chiết bằng phương pháp so màu Folin-Ciocalteu ở mục 3.2.3.1

4.3.4 Phân tích thành phần bằng LC-MS

Những hợp chất được tách bởi hệ thống sắc kí lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực (Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS) bao gồm hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC1200, cụ̣t Apollo (C8, 4.6ì150mm, 5àm) và đõ̀u dũ khụ́i phụ̉ ba tứ cực với kiờ̉u ESI

Pha động bao gồm dung dịch nước với 0.1% acid formic (dung môi A) và acetonitrile (dung môi B), sử dụng chương trình dung môi đẳng dòng với 60% A và 40% B, tốc độ dũng là 0.4 mL/phỳt Thờ̉ tớch tiờm mõ̃u 1àL

4.3.5 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp DPPH Đối với cao chiết: phương pháp DPPH được thực hiện như sau: cao chiết được pha với dung dịch methanol 70% với các nồng độ khác nhau: 0.5; 1; 2; 3; 5 g cao chiết/ 3mL

Hỗn hợp được thờm cựng thờ̉ tích dung dịch DPPH trong methanol (100àM) Sau 15 phỳt ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thu của mẫu trắng và mẫu ở 517 nm sử dụng máy quang phổ

UV-Vis Dung dịch kiểm soát bao gồm methanol và dung dịch DPPH

61 Đối với dầu hạt: phương pháp DPPH được thực hiện như sau, tùy thuộc vào hoạt tính, mẫu được pha loãng với dung dịch methanol 70% với các nồng độ khác nhau: 100, 200, 400 mg/mL Hỗn hợp được thêm cùng thể tích dung dịch DPPH trong methanol (100àM) Sau 15 phỳt ở nhiợ̀t đụ̣ phũng, đo đụ̣ hấp thu của mõ̃u trắng và mõ̃u ở 517 nm sử dụng máy quang phổ UV-Vis Dung dịch kiểm soát bao gồm methanol và dung dịch DPPH

Tiến hành thí nghiệm 3 lẫn Làm tương tự với chất chuẩn BHT

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN CHƯƠNG 5

COOH] - , 606.8[M-H-

Bảng 5.5: Thành phần dịch chiết hạt bưởi Da Xanh, Đường Hồng, Dây (tính theo phần trăm diện tích peak) kiểu ESI(+)

STT Tên hợp chất Thời gian lưu (phút)

Bưởi Da Xanh Bưởi Đường

70 Bảng 5.6: Thành phần dịch chiết hạt bưởi (tính theo phần trăm diện tích peak) kiểu ESI (-)

STT Tên hợp chất Thời gian lưu (phút)

Bưởi Đường Hồng

Có 6 hợp chất limonoid được nhận danh trong dịch chiết hạt bưởi bằng phương pháp LC-MS với thiết bị sử dụng là Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS Các limonoid aglycone và glucoside được phát hiện trong dịch chiết hạt, như được liệt kê ở bảng 5.4

Limonoid aglycone được phát hiện ở kiểu ESI (+) và glucoside được phát hiện ở kiểu ESI (-)

Hình 5.6: Cơ chế tạo vị đắng trễ và sự mất vị đắng của limonoid trong quả Citrus

Trong nước ép citrus, limonoid aglycone có vị đắng chỉ xuất hiện khi xảy ra phản ứng hóa sinh của hợp chất limonoid aglycone vòng A hở (không vị) (ví dụ limonate A- ring lactone (LARL)) thành hợp chất đắng limonoid aglycone (ví dụ limonin) với sự có mặt của enzyme limonin D-ring lactone hydrolase Phản ứng này xảy ra ở pH 6.5 hoặc thấp hơn[57] Theo kết quả thu được, trong dịch chiết hạt cũng có cả tiền chất limonoid aglycone như limonate A-ring lactone (LARL), nomilinate A-ring lactone (NARL) (không vị) và limonin, nomilin (vị đắng), nhờ vào phương pháp phân tích LC-MS có thể nhận danh các limonoid aglycone vòng A hở trong mẫu dịch chiết

Từ kết quả bảng 5.5, cho thấy lượng limonoid aglycone trong 3 giống bưởi Da Xanh, Đường Hồng và bưởi Dây được phân tích bởi kiểu ESI (+), limonin lần lượt là

20.64%, 18.34%, 11.47% tổng diện tích peak đối với mỗi loại dịch chiết bưởi, nomilin lần lượt là 12.11%, 16.56%, 22.1% tổng diện tích peak Trong 2 giống bưởi Da Xanh và Đường Hồng, limonin chiếm hàm lượng cao nhất trong các limonoid aglycone Trong khi đó, giống bưởi Dây, lượng nomilin cao hơn so với limonin Obacunone chiếm hàm lượng tương đối thấp so với limonin và nomilin, chiếm lần lượt 1.64%, 1.32%, 2.28% đối với 3 giống bưởi Da Xanh, Đường Hồng, Dây

Quá trình trưởng thành thông thường của citrus

72 Các hợp chất limonoid glucoside được phát hiện bởi kiểu ESI (-) trong dịch chiết hạt citrus như: nomilin glucoside, nomilinic acid glucoside, obacunone glucoside

Nomilin glucoside trong 3 giống bưởi Da Xanh, Đường Hồng, bưởi Dây chiếm lần lượt là 5.58%, 10.13%, 6.67%, nomilinic acid glucoside trong 3 giống bưởi trên lần lượt là

6.52%, 6.24%, 4.93%, obacunone glucoside trong 3 giống bưởi lần lượt là 2.27, 2.99,

1.23% tổng diện tích peak Khi so sánh diện tích peak, cho thấy bưởi Đường Hồng có hàm lượng nomilin glucoside, nomilinic acid glucoside, obacunone glucoside cao nhất so với 2 giống bưởi Da Xanh và bưởi Dây

Nghiên cứu về thành phần hạt Citrus trên thế giới tương đối nhiều, tuy nhiên ở

Việt Nam nghiên cứu này tương đối ít Vì thế, nghiên cứu của chúng tôi với mục đích khảo sát thành phần hóa học để chuẩn bị cho những bước nghiên cứu sâu hơn: phân đoạn và cô lập để thu được những hợp chất tinh khiết Có thể sử dụng chúng như chất chuẩn và tiến hành định lượng các hợp chất trong hạt Citrus

73 Bảng 5.7: Phổ TIC của dịch chiết hạt bưởi Da Xanh, Đường Hồng, Dây sử dụng ESI (+)

Bưởi Đường Hồng

74 Bảng 5.8: Phổ TIC của dịch chiết hạt bưởi Da Xanh, Đường Hồng, Dây sử dụng ESI (-)

Bưởi Đường Hồng

Thành phần dầu hạt citrus 5.6.

Bảng 5.9: Hàm lượng dầu thu được bằng phương pháp ép cơ học và phương pháp trích ly dung môi

Giống Citrus Hàm lượng dầu (%) Ép cơ học Trích ly sử dụng dung môi

Bưởi Đường Hồng 26.1 32.6

5.5.2 Hàm lượng phenolic của dầu hạt

Bảng 5.10: Phenolic tổng của các loại dầu hạt bằng phương pháp ép cơ học và phương pháp trích ly sử dụng dung môi

Giống Citrus Hàm lượng phenolic tổng của dầu hạt (mg GAE/kg dầu) Ép cơ học Trích ly sử dụng dung môi

Bưởi Đường Hồng 51.03 39.27

Số liệu trên được biểu hiện ở đồ thị hình 5.7 Hàm lượng phenolic tổng của các loại dầu hạt sử dụng phương pháp ép cơ học cao hơn hẳn so với phương pháp trích ly dung môi Bởi vì, phương pháp ép cơ học sử dụng lực cơ học để ép lấy dầu mà không tác dụng nhiệt hoặc có thể trong quá trình ép, sự ma sát giữa nguyên liệu và máy làm cho nguyên liệu nóng lên, cũng có thể gây ra mất mát một số hợp chất tự nhiên Đối với phương pháp trích ly dung môi bằng hệ Soxhlet, có gia nhiệt, dung môi sử dụng là

76 hexane (có nhiệt độ sôi 68 0 C), thời gian trích ly 3 giờ, như vậy quá trình trích ly này vừa tốn thời gian lâu, vừa bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ cao (khoảng 68 0 C) nên những hợp chất tự nhiên trong dầu thu được ít hơn hẳn so với phương pháp ép cơ học

Hình 5.7: Hàm lượng phenolic của dầu hạt bằng phương pháp ép cơ học và trích ly dung môi

Phương pháp ép cơ học Phương Pháp trích ly dung môi

5.5.3 Thành phần phân cực của dầu hạt citrus

Bảng 5.11: Phổ TIC (positive) của các loại dầu hạt bằng phương pháp ép cơ học

Cam Sành Bưởi Đường Hồng

78 Bảng 5.12: Bảng: Phổ TIC của dầu hạt bằng phương pháp trích ly dung môi

Bưởi Đường Hồng

79 Bảng 5.13: Các hợp chất được nhận danh trong dầu hạt citrus

Hợp chất Thời gian lưu (phút)

CO-H 2 O] + , 412.8[M+H-CO 2 -H 2 O] + , 369[M+H-CO 2 - CH 3 COOH] +

CH 3 COOH-CO 2 ] + , 393[M+H-H 2 O-CH 3 COOH-CO 2 ] + ,

3CH 3 ] + , 300[M+H-3CH 3 -CO] + , 297[M+H-CO-H 2 O] + , 211[ 1,3 A-2CH 3 ] + , 135[ 0,2 B 0 ] +

H 2 O] + , 391[M+H-CO-2H 2 O] + , 331[M+H-CO-2H 2 O- CH 3 COOH] + , 315[M+H-CO 2 -2H 2 O-CH 3 COOH] +

80 Bảng 5.14: Thành phần của dầu hạt citrus bằng phương pháp ép cơ học và trích ly dung môi (tính theo phần trăm diện tích peak)

(Thứ tự các chất trong phổ TIC được đánh thứ tự giống thứ tự trong bảng 5.14)

Phương pháp ép cơ học Phương pháp trích ly dung môi

Có 9 hợp chất được nhận danh trong dầu hạt bằng phương pháp LC-MS, trong đó có 3 flavonoid bao gồm: 5,6,7,8,3’,4’ - hexamethyoxyflavone (nobiletin) ; 3,3’,4’,5,6,7,8 -heptamethoxyflavone; tangeretin và 6 limonoid bao gồm: limonoate A-ring lactone; deacetylnomilin; nomilinoate A-ring lactone; limonin; nomilin; obacunone Từ kết quả phân tích trong bảng 5.14 cho thấy, flavonoid có mặt trong dầu hạt cam Sành và chanh Núm Các loại dầu hạt bưởi Da Xanh và Đường Hồng chứa rất ít flavonoid (peak rất nhỏ, bị che lấp bởi đường nền)

So sánh dầu hạt giữa 2 phương pháp, lượng flavonoid trong cam Sành bằng phương pháp cơ học nhiều hơn so với dầu hạt cam Sành bằng phương pháp trích ly dung môi (cụ thể 5,6,7,8,3’,4’-hexamethyoxyflavone (nobiletin); 3,3’,4’,5,6,7,8 – heptamethoxyflavone; tangeretin lần lượt với phần trăm diện tích peak là 2.48%, 5.05%,

2.04%, trong khi đó dầu hạt cam Sành bằng phương pháp trích ly dung môi chỉ chứa 3,3’,4’,5,6,7,8-heptamethoxyflavone với phần trăm diện tích tổng các peak là 3.84%)

Phù hợp với kết quả hàm lượng phenolic tổng ở trên, với dầu hạt cam Sành bằng phương pháp ép cơ học (88.21 mg/kg dầu) và dầu hạt cam Sành bằng phương pháp trích ly dung môi (45.57 mg/kg dầu) Dầu hạt chanh Núm bằng phương pháp ép cơ học chứa 5,6,7,8,3’,4’-hexamethyoxy flavone (nobiletin) chiếm 1.42% tổng diện tích các peak, trong khi đó dầu hạt chanh Núm bằng phương pháp trích ly không phát hiện thấy các flavonoid

Từ kết quả phân tích cho thấy dầu hạt Citrus chứa lượng limonoid tương đối cao, ngoài ra còn chứa một lượng nhỏ flavonoid, trong đó cam Sành và chanh Núm chứa lượng flavonoid nhiều hơn các giống khác Sử dụng phương pháp ép cơ học, thân thiện với môi trường, không sử dụng nhiệt và dung môi, thời gian nhanh và giữ lại được cả limonoid và flavonoid trong dầu hạt

Hiện nay trên thế giới hầu như rất ít nghiên cứu được công bố về thành phần hợp chất tự nhiên trích ly từ dầu hạt quả Citrus Thành phần phenolic tổng của dầu hạt Citrus

83 trong nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với dầu hạt Citrus trong bài báo Cassia và cộng sự [8] Tuy nhiên, chúng tôi dùng dung dịch methanol:nước (70:30, v/v) để trích ly hợp chất phenolic, trong khi đó trong bài báo Cassia và cộng sự [8] sử dụng methanol tinh khiết để trích ly hợp chất phenolic

Hoạt tính chống oxi hóa 5.7.

Bảng 5.15: Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết hạt

Giống Citrus Nồng độ (mg cao chiết/ 3mL)

Bưởi Đường Hồng

84 Hỡnh 5.8: Đụ̀ thị phõ̀n trăm ức chế của BHT (50-500àM) bằng phương pháp DPPH Nhận xét:

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Hàm lượng phenolic tổng của dịch chiết hạt bưởi Da Xanh, Đường Hồng, Dây lần lượt là 2537, 2649, 3617 mg GAE/kg chất khô Vì thế, ngoài lượng limonoid chiếm ưu thế, hợp chất phenolic cũng chiếm một lượng đáng kể Khả năng kháng oxi hóa của cao chiết từ hạt bưởi Da Xanh, Đường Hồng, Dây tương đối cao, với giá trị IC 50 lần lượt là

0.62, 0.55, 0.44 mg/mL (IC 50 của BHT là 0.064mg/mL) Chính vì vậy mà dịch chiết hạt citrus được ứng dụng như phụ gia thực phẩm, thành phần của mỹ phẩm, dược liệu…không độc, an toàn khi sử dụng, rẻ và có thể phân hủy sinh học

Thành phần hợp chất tự nhiên của dầu hạt citrus bị ảnh hưởng bởi phương pháp trích ly Hàm lượng phenolic tổng, limonoid, flavonoid và hoạt tính chống oxi hóa của dầu hạt citrus từ phương pháp ép cơ học cao hơn so với phương pháp trích ly dung môi

Bên cạnh đó, hàm lượng các hợp chất flavonoid được phát hiện trong dầu hạt cam Sành và chanh Núm nhiều hơn so với hạt giống bưởi Đường Hồng và Da Xanh

Hiện nay hầu như chưa có nghiên cứu được công bố về thành phần hợp chất tự nhiên trích ly từ dầu hạt quả citrus ở Việt Nam Vì thế, nghiên cứu này góp phần cung cấp các thông tin về thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của dầu hạt, nhằm mục đích tận dụng phế thải và nâng cao giá trị của nó Dầu hạt citrus trở thành một sản phẩm có giá trị kinh tế, có thể sử dụng làm nguyên liệu trong công nghệ dược phẩm và mỹ phẩm.

Kiến nghị

 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết hạt, dầu hạt

 Tiếp tục phân tích thành phần hóa học của phần bã thu được sau quá trình ép cơ học và quá trình trích ly dung môi, đánh giá hoạt tính sinh học của chúng

 Tối ưu chương trình sắc kí để tách , phát hiện và định lượng các hợp chất trong dầu hạt, dịch chiết hạt

 Phân tích trên các giống cam, chanh, quýt, bưởi đa dạng hơn để thu được số liệu về giống thuần và giống lai

 Phân tích thành phần hóa học của các giống ở các mùa thu hoạch khác nhau

 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của dầu hạt, phần phân cực và phần không phân cực của dầu hạt

 Ứng dụng dầu hạt trong những dược phẩm và mỹ phẩm với mục đích: giảm cholesterol, kháng ung thư, kháng oxi hóa, kháng khuẩn,…

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Sawamura, M., Citrus Essential Oils: Flavor and Fragrance 2011: Wiley

2 Đống, P.T.N.H., Cây ăn quả có múi, 2003, Viện Nghiên cứu và phổ biến kiến thức bách khoa

3 Scordino, M and L Sabatino, Chapter 9 - Characterization of Polyphenolic

Profile of Citrus Fruit by HPLC/PDA/ESI/MS-MS, in Polyphenols in Plants, 2014

4 Global fruit production in 2011 2011; http://www.statista.com/statistics/264001/worldwide-production-of-fruit-by-variety/

5 Rouseff, R.L and J.F Fisher, Determination of limonin and related limonoids in citrus juice by high performance liquid chromatography Analytical Chemistry,

6 Anwar, F., et al., Physico-Chemical Characteristics of Citrus Seeds and Seed Oils from Pakistan Journal of the American Oil Chemists' Society, 2008 85(4): p

7 Zhong, F.S.a.Y., Citrus oils and Essences, in Kirk-Othmer Chemical Technology of Cosmetics, 2013, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey p 409-425

8 Malacrida, C.R., M Kimura, and N Jorge, Phytochemicals and Antioxidant

Activity of Citrus Seed Oils Food Science and Technology Research, 2012 18(3): p 399-404

9 Bocco, A., et al., Antioxidant Activity and Phenolic Composition of Citrus Peel and Seed Extracts Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998 46(6): p

10 Herman, Z., C.H Fong, and S Hasegawa, Analysis of Limonoids in Citrus Seeds, in Seed Analysis, 1992 Springer Berlin Heidelberg p 361-375

11 Hasegawa, S., et al., Limonoid glucosides in citrus Phytochemistry, 1989 28(6): p 1717-1720

12 Bennett, R.D., S Hasegawa, and Z Herman, Glucosides of acidic limonoids in citrus Phytochemistry, 1989 28(10): p 2777-2781

13 Hasegawa, S., R.D Bennett, and C.P Verdon, Limonoids in citrus seeds: origin and relative concentration Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1980

14 Rouseff, R.L and S Nagy, Distribution of limonoids in citrus seeds

15 Ozaki, Y., et al., Limonoid Glucosides in Citrus Seeds(Food & Nutrition)

16 Herman, Z., et al., Limonoids in Citrus ichangensis Journal of Agricultural and

17 Hashinaga, F and S Hasegawa, Limonoids in Seeds of Sudachi Journal of the

Japanese Society for Horticultural Science, 1989 58(1): p 227-229

90 18 Hashinaga, F., Z Herman, and S Hasegawa, Limonoids in Seeds of Yuzu

19 Peterson, J and J Dwyer, Flavonoids: Dietary occurrence and biochemical activity Nutrition Research, 1998 18(12): p 1995-2018

20 Tripoli, E., et al., Citrus flavonoids: Molecular structure, biological activity and nutritional properties: A review Food Chemistry, 2007 104(2): p 466-479

21 Sahraoui, N., et al., Valorization of citrus by-products using Microwave Steam

Distillation (MSD) Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2011

22 Ortuno, A., et al., Flavanone and Nootkatone Levels in Different Varieties of

Grapefruit and Pummelo Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995

23 Li, B.B., B Smith, and M.M Hossain, Extraction of phenolics from citrus peels: I

Solvent extraction method Separation and Purification Technology, 2006 48(2): p 182-188

24 Khan, M.K., et al., Ultrasound-assisted extraction of polyphenols (flavanone glycosides) from orange (Citrus sinensis L.) peel Food Chemistry, 2010 119(2): p 851-858

25 He, D., et al., Simultaneous determination of flavanones, hydroxycinnamic acids and alkaloids in citrus fruits by HPLC-DAD–ESI/MS Food Chemistry, 2011

26 Kim, J.-W., et al., Effect of electron-beam irradiation on the antioxidant activity of extracts from Citrus unshiu pomaces Radiation Physics and Chemistry, 2008

27 Hayat, K., et al., Liberation and separation of phenolic compounds from citrus mandarin peels by microwave heating and its effect on antioxidant activity

28 Yusof, S., H.M Ghazali, and G.S King, Naringin content in local citrus fruits

29 Sun, Y., et al., Simultaneous Determination of Flavonoids in Different Parts of

Citrus reticulata ‘Chachi’ Fruit by High Performance Liquid Chromatography—

30 Castillo, J., O Benavente, and J.A del Rio, Hesperetin 7-O-glucoside and prunin in Citrus species (C aurantium and C paradisi) A study of their quantitative distribution in immature fruits and as immediate precursors of neohesperidin and naringin in Citrus aurantium Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1993

31 Sun, C., et al., Contents and antioxidant capacity of limonin and nomilin in different tissues of citrus fruit of four cultivars during fruit growth and maturation

32 Huang, R., et al., Antioxidant activity and oxygen-scavenging system in orange pulp during fruit ripening and maturation Scientia Horticulturae, 2007 113(2): p

91 33 Moulehi, I., et al., Variety and ripening impact on phenolic composition and antioxidant activity of mandarin (Citrus reticulate Blanco) and bitter orange (Citrus aurantium L.) seeds extracts Industrial Crops and Products, 2012 39(0): p 74-80

34 Galili, S and R Hovav, Chapter 16 - Determination of Polyphenols, Flavonoids, and Antioxidant Capacity in Dry Seeds, in Polyphenols in Plants, R.R Watson,

Editor 2014, Academic Press: San Diego p 305-323

35 Rostagno, M.A., M Palma, and C.G Barroso, Ultrasound-assisted extraction of soy isoflavones Journal of Chromatography A, 2003 1012(2): p 119-128

36 Chen, Y., et al., Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from litchi

(Litchi chinensis Sonn.) seed by response surface methodology and their structural characteristics Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2011 12(3): p 305-309

37 Ghafoor, K., et al., Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Phenolic

Compounds, Antioxidants, and Anthocyanins from Grape (Vitis vinifera) Seeds

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009 57(11): p 4988-4994

38 Rostagno, M.A and J.M Prado, Natural Product Extraction: Principles and

Applications2013: Royal Society of Chemistry

39 Berk, Z., Chapter 8 - Filtration and Expression, in Food Process Engineering and

Technology (Second Edition), Z Berk, Editor 2013, Academic Press: San Diego p 217-240

40 Van Hoed, V., Phenolic compounds in seed oils Lipid Technology, 2010 22(11): p 247-249

41 Benzie, I.F.F and J.J Strain, [2] Ferric reducing/antioxidant power assay: Direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration, in Methods in Enzymology, P Lester, Editor 1999, Academic Press p 15-27

42 Cao, G., H.M Alessio, and R.G Cutler, Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants Free Radical Biology and Medicine, 1993 14(3): p 303-

43 Cano, A., et al., An end-point method for estimation of the total antioxidant activity in plant material Phytochemical Analysis, 1998 9(4): p 196-202

44 Benariba, N., et al., Phytochemical screening and free radical scavenging activity of Citrullus colocynthis seeds extracts Asian Pacific Journal of Tropical

45 Bondet, V., W Brand-Williams, and C Berset, Kinetics and Mechanisms of

Antioxidant Activity using the DPPH.Free Radical Method LWT - Food Science and Technology, 1997 30(6): p 609-615

46 Brand-Williams, W., M.E Cuvelier, and C Berset, Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity LWT - Food Science and Technology, 1995

92 47 Jothy, S.L., Z Zuraini, and S Sasidharan, Phytochemicals screening, DPPH free radical scavenging and xanthine oxidase inhibitiory activities of Cassia fistula seeds extract J Med Plants Res, 2011 5: p 1941-1947

48 Xu, B.J and S.K.C Chang, A Comparative Study on Phenolic Profiles and

Antioxidant Activities of Legumes as Affected by Extraction Solvents Journal of

49 Dande, S and R Manchala, Antioxidant and phenolic content of nuts, oil seeds, milk and milk products commonly consumed in India Food and Nutrition

50 Norshazila Jr, S., et al., Antioxidant levels and activities of selected seeds of malaysian tropical fruits Malaysian journal of nutrition, 2010 16(1): p 149-159

51 Wang, S and J Clements Antioxidant activities of lupin seeds in Lupins for

Health and Wealth, Proceedings of the 12th International Lupin Conference

52 Breksa Iii, A.P., M.B Hidalgo, and M.L Yuen, Liquid chromatography– electrospray ionisation mass spectrometry method for the rapid identification of citrus limonoid glucosides in citrus juices and extracts Food Chemistry, 2009

53 Tian, Q and S.J Schwartz, Mass Spectrometry and Tandem Mass Spectrometry of

54 Zhou, D.-Y., et al., Characterization of polymethoxylated flavones in Fructus aurantii by liquid chromatography with atmospheric pressure chemical ionization combined with tandem mass spectrometry Journal of Pharmaceutical and

55 Breksa Iii, A.P., A.A Zukas, and G.D Manners, Determination of limonoate and nomilinoate A-ring lactones in citrus juices by liquid chromatography– electrospray ionization mass spectrometry Journal of Chromatography A, 2005

56 Jayaprakasha, G.K., et al., Simultaneous separation and identification of limonoids from citrus using liquid chromatography-collision-induced dissociation mass spectra Journal of Separation Science, 2011 34(1): p 2-10

57 Manners, G.D., Citrus Limonoids: Analysis, Bioactivity, and Biomedical

Prospects Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007 55(21): p 8285-

58 Kim, H.G., et al., Determination of the change of flavonoid components as the defence materials of Citrus unshiu Marc fruit peel against Penicillium digitatum by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry Food

59 Wang, D., et al., Identification of polymethoxylated flavones from green tangerine peel (Pericarpium Citri Reticulatae Viride) by chromatographic and spectroscopic techniques Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007 44(1): p

93 60 Barreca, D., et al., Elucidation of the flavonoid and furocoumarin composition and radical-scavenging activity of green and ripe chinotto (Citrus myrtifolia Raf.) fruit tissues, leaves and seeds Food Chemistry, 2011 129(4): p 1504-1512

61 Del Río, J.A., et al., Citrus Polymethoxylated Flavones Can Confer Resistance against Phytophthora citrophthora, Penicillium digitatum, and Geotrichum Species Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998 46(10): p 4423-4428

62 Abad-García, B., et al., A general analytical strategy for the characterization of phenolic compounds in fruit juices by high-performance liquid chromatography with diode array detection coupled to electrospray ionization and triple quadrupole mass spectrometry Journal of Chromatography A, 2009 1216(28): p

63 Tuberoso, C.I.G., et al., Determination of antioxidant compounds and antioxidant activity in commercial oilseeds for food use Food Chemistry, 2007 103(4): p

64 Valavanidis, A., et al., Comparison of the Radical Scavenging Potential of Polar and Lipidic Fractions of Olive Oil and Other Vegetable Oils under Normal Conditions and after Thermal Treatment Journal of Agricultural and Food

65 Zhou, K and L Yu, Effects of extraction solvent on wheat bran antioxidant activity estimation LWT - Food Science and Technology, 2004 37(7): p 717-

PHỤ LỤC

Phổ MS/MS của các hợp chất nhận danh ướm thử trong dịch chiết hạt và dầu hạt

0 20 40 60 80 100 120 Đường chuẩn acid galic (ppm)